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Perché le proteine ​​denaturate tendono ad essere meno solubili della proteina nativa?

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Perché le proteine ​​denaturate tendono ad essere meno solubili della proteina nativa? In termini di effetti idrofobici, qualcuno potrebbe spiegarmi questo fenomeno?


Informazioni di base

Una proteina nativa ha i suoi amminoacidi idrofobici ripiegati verso l'interno, quindi ha un nucleo idrofobo. perché? Perché è termodinamicamente favorito. Quando una proteina viene denaturata, gli amminoacidi idrofobici non saranno più all'interno del nucleo della proteina, ma saranno invece esposti all'ambiente idrofilo (supponendo che si parli di una proteina all'interno di un organismo). Ma questo non è favorito termodinamicamente perché le parti idrofobe non possono formare legami H con l'acqua e quindi non sono molto solubili in acqua:

Quindi, quando ciò accade, molte molecole proteiche si aggregano come micelle di sapone (perché sono favorite le interazioni idrofobiche). Ciò ridurrà la superficie totale degli amminoacidi idrofobici a contatto con l'acqua, quindi ridurrà il disturbo nel legame H nelle molecole d'acqua.

Ecco la mia rappresentazione fatta da me dell'effetto della molecola organica sul legame H in acqua (è piuttosto ruvido, quindi non preoccuparti dei dettagli).

Riassunto gli amminoacidi idrofobici saranno esposti all'ambiente idrofilo --> le proteine ​​si aggregheranno insieme --> placca insolubile.


Denaturazione (biochimica)

Denaturazione è un processo in cui proteine ​​o acidi nucleici perdono la struttura quaternaria, la struttura terziaria e la struttura secondaria che è presente nel loro stato nativo, mediante l'applicazione di qualche stress esterno o composto come un acido o una base forte, un sale inorganico concentrato, un solvente organico (ad es. alcool o cloroformio), radiazioni o calore. [3] Se le proteine ​​in una cellula vivente vengono denaturate, ciò provoca l'interruzione dell'attività cellulare e possibilmente la morte cellulare. La denaturazione delle proteine ​​è anche una conseguenza della morte cellulare. [4] [5] Le proteine ​​denaturate possono presentare un'ampia gamma di caratteristiche, dal cambiamento conformazionale e dalla perdita di solubilità all'aggregazione dovuta all'esposizione di gruppi idrofobici. Le proteine ​​denaturate perdono la loro struttura 3D e quindi non possono funzionare.

Nota 1: Modificato dalla definizione data in rif. [1]

Nota 2: La denaturazione può verificarsi quando le proteine ​​e gli acidi nucleici sono soggetti a temperature elevate o a valori di pH estremi oa concentrazioni non fisiologiche di sale, solventi organici, urea o altri agenti chimici.

Nota 3: Un enzima perde la sua attività catalitica quando viene denaturato. [2]

Il ripiegamento delle proteine ​​è la chiave per stabilire se una proteina globulare o di membrana può svolgere correttamente il suo lavoro, deve essere piegata nella forma giusta per funzionare. Tuttavia, i legami idrogeno, che svolgono un ruolo importante nel ripiegamento, sono piuttosto deboli e quindi facilmente influenzati da calore, acidità, concentrazioni di sale variabili e altri fattori di stress che possono denaturare la proteina. Questo è uno dei motivi per cui l'omeostasi è fisiologicamente necessaria in molte forme di vita.

Questo concetto non è correlato all'alcol denaturato, che è l'alcol che è stato miscelato con additivi per renderlo inadatto al consumo umano.


La risposta proteica spiegata e lo stress cellulare, parte B

Daisuke Oikawa, Yukio Kimata, in Metodi in Enzimologia, 2011

4.3 In vitro test antiaggregazione

Come substrati di proteine ​​denaturate modello, sono stati impiegati luciferasi (Promega) e citrato sintasi (Roche). La citrato sintasi è stata dializzata contro tampone stock (20 mm HEPES (pH 7,0), 150 mm KCl, 2 mm MgCl2, e 10% (v/v) glicerolo) e conservati a -80 °C. Per la denaturazione, luciferasi (25 μm concentrazione finale) e citrato sintasi (50 μm concentrazione finale) sono stati incubati in soluzione denaturante guanidina HCl (guanidina-HCl (6 m per luciferasi o 4 m per citrato sintasi), 20 mm HEPES (pH 7,2), 50 mm KCl e 2 mm MgCl2) per 30 min a temperatura ambiente. Le miscele di proteine ​​denaturate sono state quindi diluite (diluizione 50 volte per luciferasi o diluizione 33 volte per citrato sintasi) con tampone di dosaggio (20 mm HEPES (pH 7,2), 50 mm KCl e 2 mm MgCl2) in presenza o assenza delle proteine ​​ricombinanti in esame. L'aggregazione proteica dopo la diluizione è stata monitorata mediante assorbanza ottica a 320 nm con uno spettrofotometro (DU640 Beckman Coulter) a temperatura ambiente.


Scienza della denaturazione delle proteine ​​mediante calore

I cambiamenti maggiori nelle strutture secondarie, terziarie e quaternarie senza scissione dei legami peptidici della spina dorsale sono considerati come "denaturazione". Sottili cambiamenti nella struttura, che non alterano drasticamente l'architettura molecolare della proteina, sono generalmente considerati come “adattabilità conformazionale”. La scomposizione dei legami peptidici delle proteine ​​in peptidi o amminoacidi è “digestione"

La struttura di una proteina dipende da varie interazioni attrattive e repulsive risultanti da varie forze intramolecolari nonché dall'interazione di vari gruppi proteici con l'acqua solvente circostante. Lo stato nativo (di una singola molecola proteica) è termodinamicamente il più stabile con la più bassa energia libera possibile in condizioni fisiologiche. Qualsiasi cambiamento nel suo ambiente, come pH, forza ionica, temperatura, composizione del solvente, ecc., costringerà la molecola ad assumere una nuova struttura di equilibrio.

Capire la struttura delle proteine

Come misuriamo la denaturazione delle proteine?

La denaturazione comporta la trasformazione di una struttura ben definita e ripiegata di una proteina, formata in condizioni fisiologiche, in uno stato non ripiegato in condizioni non fisiologiche. Come sappiamo, non possiamo misurare direttamente la struttura, cioè la misurazione diretta delle frazioni di proteina nativa e denaturata in una soluzione non è possibile. Ma i cambiamenti conformazionali nelle proteine ​​influenzano invariabilmente molte delle sue proprietà chimiche e fisiche, come l'assorbanza dell'ultravioletto (UV), la fluorescenza, la viscosità, il coefficiente di sedimentazione, la rotazione ottica, il dicroismo circolare, la reattività dei gruppi sulfidrilici e l'attività enzimatica. Pertanto, la denaturazione delle proteine ​​può essere studiata monitorando i cambiamenti di queste proprietà fisiche e chimiche.

Calore come denaturante

Il calore è l'agente più comunemente usato nella lavorazione e conservazione degli alimenti. Quando una soluzione proteica viene gradualmente riscaldata al di sopra di una temperatura critica, subisce una brusca transizione dallo stato nativo allo stato denaturato. La temperatura nel punto medio di transizione, dove il rapporto di concentrazione degli stati nativi e denaturati è 1, è nota come temperatura di fusione Tm o temperatura di denaturazione Td.

Il meccanismo di denaturazione indotta dalla temperatura è molto complesso e coinvolge principalmente la destabilizzazione delle principali interazioni non covalenti. Il legame a idrogeno, le interazioni elettrostatiche e di van der Waals sono di natura esotermica (guidata dall'entalpia). Pertanto, sono destabilizzati ad alte temperature e stabilizzati a basse temperature. Tuttavia, poiché i legami idrogeno peptidici nelle proteine ​​sono per lo più sepolti all'interno, rimangono stabili in un'ampia gamma di temperature. D'altra parte, le interazioni idrofobiche sono endotermiche (guidate dall'entropia). Sono stabilizzati ad alte temperature e destabilizzati a basse temperature. Pertanto, all'aumentare della temperatura, i cambiamenti nelle stabilità di questi due gruppi di interazioni non covalenti si oppongono l'uno all'altro. Tuttavia, la stabilità delle interazioni idrofobiche non può aumentare all'infinito con l'aumentare della temperatura, perché al di sopra di una certa temperatura, la rottura graduale della struttura dell'acqua finirà per destabilizzare anche le interazioni idrofobiche. La forza delle interazioni idrofobiche raggiunge un massimo a circa 60–70°C.

Un'altra forza importante che influenza la stabilità conformazionale delle proteine ​​è l'entropia conformazionale, –T DSConf, della catena polipeptidica. All'aumentare della temperatura, l'aumento dell'energia cinetica termica della catena polipeptidica facilita notevolmente lo spiegamento della catena polipeptidica.

Denaturazione proteica e composizione aminoacidica
La denaturazione delle proteine ​​mediante calore dipende anche dalla composizione amminoacidica delle proteine. Le proteine ​​che contengono una proporzione maggiore di residui di amminoacidi idrofobici, in particolare Val, Ile, Leu e Phe, tendono ad essere più stabili delle proteine ​​più idrofile. Le proteine ​​degli organismi termofili di solito contengono grandi quantità di residui di amminoacidi idrofobici. Si dice anche che altri fattori, come i legami disolfuro e la presenza di ponti salini sepolti in fessure idrofobiche, possano anche contribuire alla termostabilità.

Denaturazione delle proteine ​​e contenuto di acqua
L'acqua facilita notevolmente la denaturazione termica delle proteine ​​[37,95]. Le polveri proteiche secche sono estremamente stabili alla denaturazione termica. Il valore di Td diminuisce rapidamente all'aumentare del contenuto di acqua da 0 a 0,35 g di acqua/g di proteine. L'effetto dell'idratazione sulla termostabilità è fondamentalmente correlato alla dinamica delle proteine. Allo stato secco, le proteine ​​hanno una struttura statica, cioè la mobilità dei segmenti polipeptidici è limitata. All'aumentare del contenuto di acqua, l'idratazione e la parziale penetrazione dell'acqua nelle cavità superficiali causano il rigonfiamento della proteina. Il rigonfiamento della proteina aumenta la mobilità e la flessibilità della catena e la molecola proteica assume una struttura fusa più dinamica. Quando riscaldata, questa struttura flessibile dinamica fornisce un maggiore accesso dell'acqua ai ponti salini e ai legami peptidici idrogeno rispetto a quanto è possibile allo stato secco, con conseguente riduzione TD.

Denaturazione indotta dal freddo
Si dice che più bassa è la temperatura, maggiore sarà la stabilità di una proteina. Ci sono delle eccezioni a questa regola. Quelle proteine ​​in cui le interazioni polari dominano sulle interazioni non polari sono più stabili alle temperature di refrigerazione o inferiori rispetto a quelle più alte. D'altra parte, le proteine ​​che sono principalmente stabilizzate da interazioni idrofobiche sono più stabili a circa temperatura ambiente che a temperatura di refrigerazione.

  • La stabilità del lisozima aumenta con l'abbassamento della temperatura, mentre quelli della mioglobina e di un lisozima T4 fago mutante mostrano una stabilità massima a circa 30°C e 12,5°C, rispettivamente. Al di sotto e al di sopra di queste temperature, la mioglobina e il lisozima T4 sono meno stabili. Se conservate al di sotto di 0°C, queste due proteine ​​subiscono denaturazione indotta dal freddo.
  • Quando il latte scremato viene conservato a 4°C, la b-caseina si dissocia dalle micelle di caseina e questo altera le proprietà fisico-chimiche e cagliate delle micelle.

La denaturazione delle proteine ​​è reversibile.
Quando il denaturante viene rimosso dalla soluzione proteica (o il campione viene raffreddato), la maggior parte delle proteine ​​monomeriche (in assenza di aggregazione) si ripiegano alla loro conformazione nativa in condizioni di soluzione appropriate, come pH, forza ionica, potenziale redox e concentrazione proteica .

  • La glicinina, una delle proteine ​​di conservazione della soia, si aggrega e precipita quando conservata a 2°C, quindi diventa solubile quando viene riportata a temperatura ambiente.
  • Diversi enzimi oligomerici, come lattato deidrogenasi e gliceraldeide fosfato deidrogenasi, perdono la maggior parte della loro attività enzimatica se conservati a 4°C, e questo è stato attribuito alla dissociazione delle subunità. Tuttavia, se riscaldati e tenuti a temperatura ambiente per alcune ore, si riassociano e riprendono completamente la loro attività
  • La denaturazione termica delle proteine ​​globulari monomeriche è per lo più reversibile. Ad esempio, quando molti enzimi monomerici vengono riscaldati al di sopra delle loro temperature di denaturazione, o anche mantenuti brevemente a 100°C, e quindi vengono immediatamente raffreddati a temperatura ambiente, riprendono completamente le loro attività. Tuttavia, la denaturazione termica può diventare irreversibile quando la proteina viene riscaldata a 90–100°C per un periodo prolungato anche a pH neutro. Questa irreversibilità si verifica a causa di diversi cambiamenti chimici nella proteina, come la deammidazione dei residui di Asn, la scissione dei legami peptidici ai residui di Asp, la distruzione di Cys e dei residui di cistina e l'aggregazione.

Conferenza consigliata sulla denaturazione delle proteine

Riferimento : Chimica degli alimenti l1996 l 3a Ed l Di O R Fennema l Marcel Dekker


Perché le proteine ​​denaturate tendono ad essere meno solubili della proteina nativa? - Biologia

Le proteine ​​sono polimeri di amminoacidi. Venti diversi tipi di amminoacidi si trovano naturalmente nelle proteine. Le proteine ​​differiscono tra loro a seconda del tipo, del numero e della sequenza di amminoacidi che compongono la struttura polipeptidica. Di conseguenza hanno diverse strutture molecolari, attributi nutrizionali e proprietà fisico-chimiche. Le proteine ​​sono costituenti importanti degli alimenti per una serie di ragioni diverse. Sono una fonte importante di energia, oltre a contenere aminoacidi essenziali, come lisina, triptofano, metionina, leucina, isoleucina e valina, che sono essenziali per la salute umana, ma che l'organismo non è in grado di sintetizzare. Le proteine ​​sono anche i principali componenti strutturali di molti alimenti naturali, spesso determinando la loro consistenza complessiva, ad esempio la tenerezza della carne o dei prodotti ittici. Le proteine ​​isolate sono spesso utilizzate negli alimenti come ingredienti a causa delle loro proprietà funzionali uniche, ovvero la loro capacità di fornire aspetto, consistenza o stabilità desiderabili. Tipicamente, le proteine ​​vengono utilizzate come agenti gelificanti, emulsionanti, agenti schiumogeni e addensanti. Molte proteine ​​alimentari sono enzimi in grado di aumentare la velocità di determinate reazioni biochimiche. Queste reazioni possono avere un effetto favorevole o dannoso sulle proprietà complessive degli alimenti. Gli analisti alimentari sono interessati a conoscere la concentrazione totale, il tipo, la struttura molecolare e le proprietà funzionali delle proteine ​​negli alimenti.

6.2. Determinazione della concentrazione proteica complessiva

Il metodo Kjeldahl è stato sviluppato nel 1883 da un birraio chiamato Johann Kjeldahl. Un alimento viene digerito con un acido forte in modo che rilasci azoto che può essere determinato mediante un'opportuna tecnica di titolazione. La quantità di proteine ​​presenti viene quindi calcolata dalla concentrazione di azoto dell'alimento. Lo stesso approccio di base è ancora utilizzato oggi, sebbene siano stati apportati numerosi miglioramenti per accelerare il processo e ottenere misurazioni più accurate. Di solito è considerato il metodo standard per determinare la concentrazione proteica. Poiché il metodo Kjeldahl non misura direttamente il contenuto proteico, è necessario un fattore di conversione (F) per convertire la concentrazione di azoto misurata in una concentrazione proteica. Per molte applicazioni viene utilizzato un fattore di conversione di 6,25 (equivalente a 0,16 g di azoto per grammo di proteine), tuttavia questo è solo un valore medio e ogni proteina ha un fattore di conversione diverso a seconda della sua composizione amminoacidica. Il metodo Kjeldahl può essere convenientemente suddiviso in tre fasi: digestione, neutralizzazione e titolazione.

Il campione alimentare da analizzare viene pesato in un pallone da digestione e quindi digerito riscaldandolo in presenza di acido solforico (un agente ossidante che digerisce il cibo), solfato di sodio anidro (per accelerare la reazione alzando il punto di ebollizione) e un catalizzatore, come rame, selenio, titanio o mercurio (per accelerare la reazione). La digestione converte qualsiasi azoto nel cibo (diverso da quello che è sotto forma di nitrati o nitriti) in ammoniaca e altre sostanze organiche in C0 2 e H 2 0. Il gas di ammoniaca non viene liberato in una soluzione acida perché l'ammoniaca è in la forma dello ione ammonio (NH 4 + ) che si lega allo ione solfato (SO 4 2- ) e rimane quindi in soluzione:

Dopo che la digestione è stata completata, il pallone di digestione è collegato a un pallone di ricezione tramite un tubo. La soluzione nel pallone da digestione viene quindi resa alcalina mediante aggiunta di idrossido di sodio, che converte il solfato di ammonio in gas di ammoniaca:

(NH 4 ) 2 SO 4 + 2 NaOH ® 2NH 3 + 2H 2 O + Na 2 SO 4 (2)

Il gas di ammoniaca che si forma viene liberato dalla soluzione e si sposta dal pallone di digestione e nel pallone di ricezione, che contiene un eccesso di acido borico. Il basso pH della soluzione nel pallone ricevente converte il gas ammoniaca nello ione ammonio e converte simultaneamente l'acido borico nello ione borato:

NH 3 + H 3 BO 3 (acido borico) ® NH 4 + + H 2 BO 3 - (ione borato) (3)

Il contenuto di azoto viene quindi stimato mediante titolazione del borato di ammonio formato con acido solforico o cloridrico standard, utilizzando un opportuno indicatore per determinare il punto finale della reazione.

H 2 BO 3 - + H + ® H 3 BO 3 (4)

La concentrazione di ioni idrogeno (in moli) richiesta per raggiungere il punto finale è equivalente alla concentrazione di azoto che era nel cibo originale (Equazione 3). La seguente equazione può essere utilizzata per determinare la concentrazione di azoto di un campione che pesa m grammi utilizzando una soluzione acida x M HCl per la titolazione:

Dove vs e vb sono i volumi di titolazione del campione e del bianco e 14 g è il peso molecolare dell'azoto N. Un campione bianco viene solitamente eseguito contemporaneamente al materiale da analizzare per tenere conto dell'eventuale azoto residuo che può essere in i reagenti utilizzati per eseguire l'analisi. Una volta determinato il contenuto di azoto, questo viene convertito in contenuto proteico utilizzando il fattore di conversione appropriato: %Protein = F %N.

6.2.1.4. Vantaggi e svantaggi

Vantaggi. Il metodo Kjeldahl è ampiamente utilizzato a livello internazionale ed è ancora il metodo standard per il confronto con tutti gli altri metodi. La sua universalità, alta precisione e buona riproducibilità lo hanno reso il metodo principale per la stima delle proteine ​​negli alimenti.

Svantaggi. Non fornisce una misura della vera proteina, poiché tutto l'azoto negli alimenti non è sotto forma di proteine. Proteine ​​diverse necessitano di fattori di correzione diversi perché hanno sequenze di amminoacidi diverse. L'uso di acido solforico concentrato ad alte temperature pone un rischio considerevole, così come l'uso di alcuni dei possibili catalizzatori. La tecnica richiede tempo per essere eseguita.

6.2.2. Metodo Dumas migliorato

Recentemente è stata sviluppata una tecnica strumentale automatizzata in grado di misurare rapidamente la concentrazione proteica di campioni alimentari. Questa tecnica si basa su un metodo descritto per la prima volta da uno scienziato chiamato Dumas oltre un secolo e mezzo fa. Sta cominciando a competere con il metodo Kjeldahl come metodo standard di analisi delle proteine ​​per alcuni prodotti alimentari grazie alla sua rapidità.

Un campione di massa nota viene bruciato in una camera ad alta temperatura (circa 900 o C) in presenza di ossigeno. Questo porta al rilascio di CO 2 , H 2 O e N 2 . La CO 2 e l'H 2 O vengono rimosse facendo passare i gas su apposite colonne che li assorbono. Il contenuto di azoto viene quindi misurato facendo passare i gas rimanenti attraverso una colonna che ha un rilevatore di conducibilità termica all'estremità. La colonna aiuta a separare l'azoto da eventuali residui di CO 2 e H 2 O che potrebbero essere rimasti nel flusso di gas. Lo strumento viene calibrato analizzando un materiale puro ea concentrazione di azoto nota, come l'EDTA (= 9,59%N). Così il segnale dal rivelatore di conducibilità termica può essere convertito in un contenuto di azoto.Come per il metodo Kjeldahl è necessario convertire la concentrazione di azoto in un campione in contenuto proteico, utilizzando opportuni fattori di conversione che dipendono dalla precisa sequenza amminoacidica della proteina.

6.2.2.2. Vantaggi e svantaggi

Vantaggi: È molto più veloce del metodo Kjeldahl (meno di 4 minuti per misurazione, rispetto a 1-2 ore per Kjeldahl). Non ha bisogno di sostanze chimiche tossiche o catalizzatori. Molti campioni possono essere misurati automaticamente. È facile da usare.

Svantaggi: costo iniziale elevato. Non fornisce una misura della vera proteina, poiché tutto l'azoto negli alimenti non è sotto forma di proteine. Proteine ​​diverse necessitano di fattori di correzione diversi perché hanno sequenze di amminoacidi diverse. La piccola dimensione del campione rende difficile ottenere un campione rappresentativo.

6.2.3. Metodi che utilizzano la spettroscopia UV-visibile

Sono stati ideati numerosi metodi per misurare la concentrazione proteica, che si basano sulla spettroscopia UV-visibile. Questi metodi utilizzano la capacità naturale delle proteine ​​di assorbire (o disperdere) la luce nella regione UV-visibile dello spettro elettromagnetico, oppure modificano chimicamente o fisicamente le proteine ​​per farle assorbire (o disperdere) la luce in questa regione. Il principio alla base di ciascuno di questi test è simile. Innanzitutto si prepara una curva di calibrazione dell'assorbanza (o torbidità) in funzione della concentrazione proteica utilizzando una serie di soluzioni proteiche a concentrazione nota. L'assorbanza (o torbidità) della soluzione in analisi viene quindi misurata alla stessa lunghezza d'onda e la sua concentrazione proteica determinata dalla curva di calibrazione. La principale differenza tra i test sono i gruppi chimici responsabili dell'assorbimento o della dispersione delle radiazioni, ad esempio legami peptidici, gruppi laterali aromatici, gruppi basici e proteine ​​aggregate.

Di seguito sono evidenziati alcuni dei metodi UV-visibili più comunemente utilizzati per determinare il contenuto proteico degli alimenti:

Misura diretta a 280 nm

Il triptofano e la tirosina assorbono fortemente la luce ultravioletta a 280 nm. Il contenuto di triptofano e tirosina di molte proteine ​​rimane abbastanza costante, quindi l'assorbanza delle soluzioni proteiche a 280 nm può essere utilizzata per determinarne la concentrazione. I vantaggi di questo metodo sono che la procedura è semplice da eseguire, non è distruttiva e non sono necessari reagenti speciali. Il principale svantaggio è che gli acidi nucleici assorbono fortemente anche a 280 nm e potrebbero quindi interferire con la misurazione della proteina se sono presenti in concentrazioni sufficienti. Anche così, sono stati sviluppati metodi per superare questo problema, ad esempio misurando l'assorbanza a due diverse lunghezze d'onda.

Un colore viola-violaceo viene prodotto quando gli ioni rameici (Cu 2+) interagiscono con i legami peptidici in condizioni alcaline. Il reagente biureto, che contiene tutte le sostanze chimiche necessarie per effettuare l'analisi, può essere acquistato in commercio. Viene miscelato con una soluzione proteica e quindi lasciato a riposo per 15-30 minuti prima di leggere l'assorbanza a 540 nm. Il principale vantaggio di questa tecnica è che non c'è interferenza da materiali che adsorbono a lunghezze d'onda inferiori e la tecnica è meno sensibile al tipo di proteina perché utilizza l'assorbimento che coinvolge legami peptidici comuni a tutte le proteine, piuttosto che gruppi laterali specifici. Tuttavia, ha una sensibilità relativamente bassa rispetto ad altri metodi UV-visibili.

Il metodo di Lowry combina il reagente del biureto con un altro reagente (il reagente fenolico di Folin-Ciocalteau) che reagisce con i residui di tirosina e triptofano nelle proteine. Questo dà un colore bluastro che può essere letto da qualche parte tra 500 - 750 nm a seconda della sensibilità richiesta. C'è un piccolo picco intorno a 500 nm che può essere usato per determinare alte concentrazioni di proteine ​​e un grande picco intorno a 750 nm che può essere usato per determinare basse concentrazioni di proteine. Questo metodo è più sensibile a basse concentrazioni di proteine ​​rispetto al metodo del biureto.

Un eccesso noto di un colorante (anionico) caricato negativamente viene aggiunto a una soluzione proteica il cui pH è regolato in modo che le proteine ​​siano caricate positivamente (cioè < il punto isoelettrico). Le proteine ​​formano un complesso insolubile con il colorante a causa dell'attrazione elettrostatica tra le molecole, ma il colorante non legato rimane solubile. Il colorante anionico si lega ai gruppi cationici dei residui amminoacidici basici (istidina, arganina e lisina) e ai gruppi amminoterminali liberi. La quantità di colorante non legato che rimane in soluzione dopo che il complesso proteina-colorante insolubile è stato rimosso (ad esempio mediante centrifugazione) viene determinata misurandone l'assorbanza. La quantità di proteine ​​presenti nella soluzione originale è proporzionale alla quantità di colorante che si è legato ad essa: colorante legato = colorante iniziale-senza colorante.

Le molecole proteiche che sono normalmente solubili in soluzione possono essere fatte precipitare mediante l'aggiunta di alcune sostanze chimiche, ad esempio acido tricloroacetico. La precipitazione delle proteine ​​fa diventare torbida la soluzione. Così la concentrazione di proteine ​​può essere determinata misurando il grado di torbidità.

6.2.3.2. Vantaggi e svantaggi

Vantaggi: le tecniche UV-visibili sono abbastanza rapide e semplici da eseguire e sono sensibili a basse concentrazioni di proteine.

Svantaggi: per la maggior parte delle tecniche UV-visibili è necessario utilizzare soluzioni diluite e trasparenti, che non contengono sostanze contaminanti che assorbono o diffondono la luce alla stessa lunghezza d'onda della proteina da analizzare. La necessità di soluzioni trasparenti significa che la maggior parte degli alimenti deve essere sottoposta a quantità significative di preparazione del campione prima di poter essere analizzata, ad esempio omogeneizzazione, estrazione con solvente, centrifugazione, filtrazione, che possono richiedere molto tempo e laboriose. Inoltre, a volte è difficile estrarre quantitativamente le proteine ​​da alcuni tipi di alimenti, soprattutto dopo che sono stati lavorati in modo che le proteine ​​si aggregano o si leghino covalentemente con altre sostanze. Inoltre l'assorbanza dipende dal tipo di proteina analizzata (diverse proteine ​​hanno differenti sequenze di amminoacidi).

6.2.4. Altre tecniche strumentali

Esiste un'ampia varietà di diversi metodi strumentali disponibili per determinare il contenuto proteico totale dei materiali alimentari. Questi possono essere suddivisi in tre diverse categorie in base ai loro principi fisico-chimici: (i) misurazione delle proprietà fisiche di massa, (ii) misurazione dell'adsorbimento della radiazione e (iii) misurazione della diffusione della radiazione. Ogni metodo strumentale ha i suoi vantaggi e svantaggi e la gamma di alimenti a cui può essere applicato.

Misurazione delle proprietà fisiche in serie

  • Densità: La densità di una proteina è maggiore di quella della maggior parte degli altri componenti alimentari, quindi c'è un aumento della densità di un alimento all'aumentare del suo contenuto proteico. Così il contenuto proteico degli alimenti può essere determinato misurando la loro densità.
  • Indice di rifrazione: l'indice di rifrazione di una soluzione acquosa aumenta all'aumentare della concentrazione proteica e quindi le misurazioni RI possono essere utilizzate per determinare il contenuto proteico.

Misurazione dell'assorbimento delle radiazioni

  • UV-visibile: la concentrazione di proteine ​​può essere determinata misurando l'assorbanza della radiazione ultravioletta visibile (vedi sopra).
  • Infrarossi: le tecniche a infrarossi possono essere utilizzate per determinare la concentrazione di proteine ​​nei campioni di cibo. Le proteine ​​assorbono l'IR naturalmente a causa delle vibrazioni caratteristiche (stiramento e flessione) di alcuni gruppi chimici lungo la struttura polipeptidica. Le misurazioni dell'assorbanza della radiazione a determinate lunghezze d'onda possono quindi essere utilizzate per quantificare la concentrazione di proteine ​​nel campione. IR è particolarmente utile per una rapida analisi in linea del contenuto proteico. Richiede anche una piccola preparazione del campione ed è non distruttivo. I suoi principali svantaggi sono il suo alto costo iniziale e la necessità di una calibrazione estesa.
  • Risonanza Magnetica Nucleare: La spettroscopia NMR può essere utilizzata per determinare la concentrazione proteica totale degli alimenti. Il contenuto proteico è determinato misurando l'area sotto un picco in uno spettro di spostamento chimico NMR che corrisponde alla frazione proteica.

Misurazione della dispersione delle radiazioni

  • Light scattering: La concentrazione di aggregati proteici in soluzione acquosa può essere determinata utilizzando tecniche di light scattering poiché la torbidità di una soluzione è direttamente proporzionale alla concentrazione di aggregati presenti.
  • Diffusione ultrasonica: la concentrazione degli aggregati proteici può anche essere determinata utilizzando tecniche di diffusione ultrasonica poiché la velocità ultrasonica e l'assorbimento degli ultrasuoni sono correlati alla concentrazione degli aggregati proteici presenti.

6.2.4.2. Vantaggi e svantaggi

Alcuni di questi metodi strumentali presentano importanti vantaggi rispetto alle altre tecniche sopra menzionate perché non sono distruttivi, richiedono poca o nessuna preparazione del campione e le misurazioni sono rapide e precise. Uno dei principali svantaggi delle tecniche che si basano sulla misurazione delle proprietà fisiche di massa degli alimenti è che deve essere preparata una curva di calibrazione tra la proprietà fisica di interesse e il contenuto proteico totale, e ciò può dipendere dal tipo di proteina presente e dall'alimento matrice in cui è contenuto. Inoltre, le tecniche basate sulle misurazioni delle proprietà fisico-chimiche di massa possono essere utilizzate solo per analizzare alimenti con composizioni relativamente semplici. In un alimento che contiene molti componenti diversi la cui concentrazione può variare, è difficile districare il contributo che la proteina apporta alla misurazione complessiva da quello degli altri componenti.

6.2.5. Confronto di metodi

Come scienziati dell'alimentazione possiamo spesso trovarci nella posizione di dover scegliere una tecnica particolare per misurare la concentrazione proteica di un alimento. Come decidiamo quale tecnica è la più appropriata per la nostra particolare applicazione? La prima cosa da determinare è per cosa verranno utilizzate le informazioni. Se l'analisi deve essere eseguita per scopi ufficiali, ad esempio requisiti legali o di etichettatura, è importante utilizzare un metodo ufficialmente riconosciuto. Il metodo Kjeldahl, e sempre di più il metodo Dumas, sono stati ufficialmente approvati per un'ampia gamma di applicazioni alimentari. Al contrario, solo un piccolo numero di applicazioni della spettroscopia UV-visibile è stato ufficialmente riconosciuto.

Per scopi di controllo della qualità, è spesso più utile disporre di misurazioni rapide e semplici del contenuto proteico e quindi le tecniche IR sono le più adatte. Per gli studi fondamentali in laboratorio, dove spesso vengono analizzate proteine ​​pure, le tecniche spettroscopiche UV-visibili sono spesso preferite perché forniscono misurazioni rapide e affidabili e sono sensibili a basse concentrazioni di proteine.

Altri fattori che possono essere considerati sono la quantità di preparazione del campione richiesta, la loro sensibilità e la loro velocità. I metodi Kjeldahl, Dumas e IR richiedono una preparazione del campione molto ridotta. Dopo che un campione rappresentativo dell'alimento è stato selezionato, di solito può essere testato direttamente. D'altra parte, i vari metodi UV-visibili richiedono un'ampia preparazione del campione prima dell'analisi. La proteina deve essere estratta dall'alimento in una soluzione diluita trasparente, che di solito comporta lunghe procedure di omogeneizzazione, estrazione con solvente, filtrazione e centrifugazione. Inoltre, può essere difficile isolare completamente alcune proteine ​​dagli alimenti perché sono fortemente legate ad altri componenti. Le varie tecniche hanno anche diverse sensibilità, cioè la più bassa concentrazione di proteine ​​che possono rilevare. I metodi UV-visibili sono i più sensibili, essendo in grado di rilevare concentrazioni di proteine ​​fino allo 0,001% in peso. La sensibilità dei metodi Dumas, Kjeldahl e IR è intorno allo 0,1% in peso. Anche il tempo richiesto per l'analisi e il numero di campioni che possono essere analizzati contemporaneamente sono fattori importanti da considerare quando si decide quale tecnica analitica utilizzare. Le tecniche IR sono in grado di analizzare rapidamente (< 1 minuto) la concentrazione proteica una volta calibrate. Il moderno metodo strumentale Dumas è completamente automatizzato e può misurare la concentrazione proteica di un campione in meno di 5 minuti, rispetto al metodo Kjeldahl che richiede dai 30 minuti alle 2 ore per essere eseguito. I vari metodi UV-visibili vanno da un paio di minuti a un'ora (a seconda del tipo di colorante utilizzato e del tempo necessario per reagire), sebbene abbiano il vantaggio di poter eseguire più campioni contemporaneamente. Tuttavia, di solito è necessario eseguire un'ampia preparazione del campione prima dell'analisi per ottenere una soluzione trasparente. Altri fattori che possono essere importanti quando si seleziona una tecnica appropriata sono: l'attrezzatura disponibile, la facilità d'uso, l'accuratezza desiderata e se la tecnica è o meno non distruttiva.

6.3. Separazione e caratterizzazione delle proteine

Nella lezione precedente sono state discusse le tecniche utilizzate per determinare la concentrazione totale di proteine ​​in un alimento. Gli analisti alimentari sono spesso interessati anche al tipo di proteine ​​presenti in un alimento perché ogni proteina ha proprietà nutrizionali e fisico-chimiche uniche. Il tipo di proteina viene solitamente determinato separando e isolando le singole proteine ​​da una complessa miscela di proteine, in modo che possano essere successivamente identificate e caratterizzate. Le proteine ​​vengono separate in base alle differenze nelle loro proprietà fisico-chimiche, come dimensione, carica, caratteristiche di adsorbimento, solubilità e stabilità al calore. La scelta di una tecnica di separazione appropriata dipende da una serie di fattori, inclusi i motivi per eseguire l'analisi, la quantità di campione disponibile, la purezza desiderata, l'attrezzatura disponibile, il tipo di proteine ​​presenti e il costo. Sono disponibili metodi su larga scala per isolamenti grezzi di grandi quantità di proteine, mentre metodi su piccola scala sono disponibili per proteine ​​costose o disponibili solo in piccole quantità. Uno dei fattori che devono essere considerati durante la procedura di separazione è la possibilità che la struttura tridimensionale nativa delle molecole proteiche possa essere alterata.

Una conoscenza preliminare degli effetti delle condizioni ambientali sulla struttura e le interazioni delle proteine ​​è estremamente utile quando si seleziona la tecnica di separazione più appropriata. In primo luogo perché aiuta a determinare le condizioni più adatte da utilizzare per isolare una particolare proteina da una miscela di proteine ​​(ad es. pH, forza ionica, solvente, temperatura ecc.), e in secondo luogo perché può essere importante scegliere condizioni che non influisca negativamente sulla struttura molecolare delle proteine.

6.3.1. Metodi basati su diverse caratteristiche di solubilità

Le proteine ​​possono essere separate sfruttando le differenze nella loro solubilità in soluzioni acquose. La solubilità di una molecola proteica è determinata dalla sua sequenza di amminoacidi perché questa ne determina le dimensioni, la forma, l'idrofobicità e la carica elettrica. Le proteine ​​possono essere selettivamente precipitate o solubilizzate alterando il pH, la forza ionica, la costante dielettrica o la temperatura di una soluzione. Queste tecniche di separazione sono le più semplici da utilizzare quando si tratta di grandi quantità di campione, perché sono relativamente veloci, poco costose e non sono particolarmente influenzate da altri componenti alimentari. Sono spesso utilizzati come primo passo in qualsiasi procedura di separazione perché la maggior parte dei materiali contaminanti può essere facilmente rimossa.

Le proteine ​​vengono precipitate da soluzioni acquose quando la concentrazione salina supera un livello critico, che è noto come salatura, perché tutta l'acqua è "legata" ai sali, e quindi non è disponibile per idratare le proteine. Il solfato di ammonio [(NH 4 ) 2 SO 4 ] è comunemente usato perché ha un'elevata solubilità in acqua, sebbene possano essere usati anche altri sali neutri, ad esempio NaCl o KCl. Generalmente viene utilizzata una procedura in due fasi per massimizzare l'efficienza di separazione. Nella prima fase, il sale viene aggiunto ad una concentrazione appena inferiore a quella necessaria per far precipitare la proteina di interesse. La soluzione viene quindi centrifugata per rimuovere eventuali proteine ​​meno solubili della proteina di interesse. La concentrazione di sale viene quindi aumentata fino a un punto appena superiore a quello necessario per provocare la precipitazione della proteina. Questo fa precipitare la proteina di interesse (che può essere separata mediante centrifugazione), ma lascia in soluzione più proteine ​​solubili. Il problema principale di questo metodo è che grandi concentrazioni di sale contaminano la soluzione, che deve essere rimossa prima che la proteina possa essere risolubilizzata, ad esempio mediante dialisi o ultrafiltrazione.

Il punto isoelettrico (pI) di una proteina è il pH in cui la carica netta sulla proteina è zero. Le proteine ​​tendono ad aggregarsi e precipitare al loro pI perché non c'è repulsione elettrostatica che le tiene separate. Le proteine ​​hanno punti isoelettrici diversi a causa delle loro diverse sequenze di amminoacidi (cioè, numeri relativi di gruppi anionici e cationici), e quindi possono essere separate regolando il pH di una soluzione. Quando il pH è regolato al pI di una particolare proteina, precipita lasciando le altre proteine ​​in soluzione.

La solubilità di una proteina dipende dalla costante dielettrica della soluzione che la circonda perché questa altera l'entità delle interazioni elettrostatiche tra gruppi carichi. Quando la costante dielettrica di una soluzione diminuisce, l'entità delle interazioni elettrostatiche tra specie cariche aumenta. Questo tende a diminuire la solubilità delle proteine ​​in soluzione perché sono meno ionizzate, e quindi la repulsione elettrostatica tra di esse non è sufficiente ad impedire loro di aggregarsi. La costante dielettrica delle soluzioni acquose può essere abbassata aggiungendo solventi organici solubili in acqua, come etanolo o acetone. La quantità di solvente organico necessaria per provocare la precipitazione dipende dalla proteina e quindi le proteine ​​possono essere separate su questa base. La quantità ottimale di solvente organico richiesta per precipitare una proteina varia da circa 5 a 60%. Il frazionamento del solvente viene solitamente eseguito a 0 o C o meno per prevenire la denaturazione delle proteine ​​causata dagli aumenti di temperatura che si verificano quando i solventi organici vengono miscelati con l'acqua.

Denaturazione delle proteine ​​contaminanti

Molte proteine ​​vengono denaturate e precipitano dalla soluzione quando vengono riscaldate al di sopra di una certa temperatura o regolando una soluzione a pH altamente acidi o basici. Le proteine ​​che sono stabili ad alta temperatura o a valori di pH estremi sono più facilmente separate da questa tecnica perché le proteine ​​contaminanti possono essere precipitate mentre la proteina di interesse rimane in soluzione.

6.3.2. Separazione dovuta a diverse caratteristiche di adsorbimento

La cromatografia ad adsorbimento comporta la separazione dei composti mediante adsorbimento-desorbimento selettivo in una matrice solida contenuta all'interno di una colonna attraverso la quale passa la miscela. La separazione si basa sulle diverse affinità delle diverse proteine ​​per la matrice solida. La cromatografia di affinità e di scambio ionico sono i due principali tipi di cromatografia ad adsorbimento comunemente usati per la separazione delle proteine. La separazione può essere eseguita utilizzando una colonna aperta o la cromatografia liquida ad alta pressione.

Cromatografia a scambio ionico

La cromatografia a scambio ionico si basa sull'adsorbimento-desorbimento reversibile di ioni in soluzione su una matrice solida carica o su una rete polimerica. Questa tecnica è la tecnica cromatografica più comunemente usata per la separazione delle proteine. Una matrice carica positivamente è chiamata scambiatore di anioni perché lega ioni caricati negativamente (anioni). Una matrice carica negativamente è chiamata scambiatore di ioni cationico perché lega ioni caricati positivamente (cationi). Le condizioni tampone (pH e forza ionica) sono regolate per favorire il massimo legame della proteina di interesse alla colonna a scambio ionico. Le proteine ​​contaminanti si legano meno fortemente e quindi passano più rapidamente attraverso la colonna. La proteina di interesse viene quindi eluita utilizzando un'altra soluzione tampone che ne favorisca il desorbimento dalla colonna (es. diverso pH o forza ionica).

La cromatografia di affinità utilizza una fase stazionaria costituita da un ligando legato in modo covalente a un supporto solido. Il ligando è una molecola che ha un'affinità reversibile altamente specifica e unica per una particolare proteina. Il campione da analizzare viene fatto passare attraverso la colonna e la proteina di interesse si lega al ligando, mentre le proteine ​​contaminanti passano direttamente. La proteina di interesse viene quindi eluita utilizzando una soluzione tampone che ne favorisce il desorbimento dalla colonna. Questa tecnica è il mezzo più efficiente per separare una singola proteina da una miscela di proteine, ma è il più costoso, a causa della necessità di avere colonne con specifici ligandi ad esse legati.

Sia la cromatografia a scambio ionico che quella di affinità sono comunemente utilizzate per separare proteine ​​e amminoacidi in laboratorio. Sono usati meno comunemente per le separazioni commerciali perché non sono adatti per separare rapidamente grandi volumi e sono relativamente costosi.

6.3.3. Separazione a causa di differenze di dimensioni

Le proteine ​​possono anche essere separate in base alla loro dimensione. Tipicamente, i pesi molecolari delle proteine ​​variano da circa 10.000 a 1.000.000 dalton. In pratica, la separazione dipende dal raggio di Stokes di una proteina, piuttosto che direttamente dal suo peso molecolare. Il raggio di Stokes è il raggio medio che una proteina ha in soluzione e dipende dalla sua struttura molecolare tridimensionale. Per proteine ​​con lo stesso peso molecolare il raggio di Stokes aumenta nel seguente ordine: proteina globulare compatta < flessibile a spirale casuale < proteina simile a bastoncello.

La dialisi viene utilizzata per separare le molecole in soluzione mediante l'uso di membrane semipermeabili che consentono il passaggio di molecole più piccole di una certa dimensione, ma impediscono il passaggio di molecole più grandi. Una soluzione proteica viene posta in un tubo per dialisi che viene sigillato e posto in un grande volume di acqua o tampone che viene agitato lentamente. I soluti a basso peso molecolare fluiscono attraverso la sacca, ma le molecole proteiche di grande peso molecolare rimangono nella sacca. La dialisi è un metodo relativamente lento, che richiede fino a 12 ore per essere completato. È quindi più frequentemente utilizzato in laboratorio. La dialisi viene spesso utilizzata per rimuovere il sale dalle soluzioni proteiche dopo che sono state separate mediante salatura e per cambiare i tamponi.

Una soluzione di proteine ​​viene posta in una cella contenente una membrana semipermeabile e viene applicata una pressione. Le molecole più piccole passano attraverso la membrana, mentre le molecole più grandi rimangono nella soluzione. Il principio di separazione di questa tecnica è quindi simile alla dialisi, ma poiché viene applicata la pressione, la separazione è molto più rapida. Sono disponibili membrane semipermeabili con punti di cutoff compresi tra circa 500 e 300.000. Quella parte della soluzione che viene trattenuta dalla cellula (molecole grandi) è detta retentata, mentre quella parte che attraversa la membrana (molecole piccole) fa parte dell'ultrafiltrato. L'ultrafiltrazione può essere utilizzata per concentrare una soluzione proteica, rimuovere sali, scambiare tamponi o frazionare proteine ​​in base alle loro dimensioni. Le unità di ultrafiltrazione sono utilizzate in laboratorio e su scala commerciale.

Cromatografia ad esclusione STERICA

Questa tecnica, nota anche come filtrazione su gel, separa anche le proteine ​​in base alla loro dimensione. Una soluzione proteica viene versata in una colonna che è riempita con perline porose costituite da un materiale polimerico reticolato (come destrano o agarosio). Le molecole più grandi dei pori nelle perle sono escluse e si muovono rapidamente attraverso la colonna, mentre il movimento delle molecole che entrano nei pori è ritardato. Quindi le molecole vengono eluite dalla colonna in ordine decrescente di dimensione. Sono disponibili perline di diversa dimensione media dei pori per separare proteine ​​di diverso peso molecolare. I produttori di queste perle forniscono informazioni sull'intervallo di peso molecolare che sono più adatti per la separazione. I pesi molecolari di proteine ​​sconosciute possono essere determinati confrontando i loro volumi di eluizione Vo, con quelli determinati utilizzando proteine ​​di peso molecolare noto: un grafico del volume di eluizione rispetto a log (peso molecolare) dovrebbe dare una linea retta. Un problema con questo metodo è che il peso molecolare non è direttamente correlato al raggio di Stokes per proteine ​​di forma diversa.

6.3.4. Separazione per elettroforesi

L'elettroforesi si basa sulle differenze nella migrazione delle molecole cariche in una soluzione quando viene applicato un campo elettrico attraverso di essa. Può essere utilizzato per separare le proteine ​​in base alla loro dimensione, forma o carica.

Nell'elettroforesi non denaturante, una soluzione tamponata di proteine ​​native viene versata su un gel poroso (solitamente poliacrilammide, amido o agarosio) e viene applicata una tensione attraverso il gel. Le proteine ​​si muovono attraverso il gel in una direzione che dipende dal segno della loro carica e ad una velocità che dipende dall'entità della carica e dall'attrito con il loro movimento:

Le proteine ​​possono essere caricate positivamente o negativamente in soluzione a seconda dei loro punti isoelettrici (pI) e del pH della soluzione. Una proteina è caricata negativamente se il pH è superiore al pI e carica positivamente se il pH è inferiore al pI. L'entità della carica e del voltaggio applicato determinerà quanto lontano migreranno le proteine ​​in un certo tempo. Maggiore è la tensione o maggiore è la carica sulla proteina, più si muoverà. L'attrito di una molecola è una misura della sua resistenza al movimento attraverso il gel ed è in gran parte determinato dalla relazione tra la dimensione effettiva della molecola e la dimensione dei pori nel gel. Minore è la dimensione della molecola, o maggiore è la dimensione dei pori nel gel, minore è la resistenza e quindi più velocemente una molecola si muove attraverso il gel. Gel con porosità diverse possono essere acquistati da fornitori chimici o preparati in laboratorio. Dimensioni dei pori più piccole si ottengono utilizzando una maggiore concentrazione di reagente di reticolazione per formare il gel. I gel possono essere contenuti tra due piastre parallele o in tubi cilindrici. Nell'elettroforesi non denaturante le proteine ​​native vengono separate in base a una combinazione della loro carica, dimensione e forma.

Nell'elettroforesi denaturante le proteine ​​vengono separate principalmente in base al loro peso molecolare. Le proteine ​​vengono denaturate prima dell'analisi mescolandole con mercaptoetanolo, che rompe i legami disolfuro, e sodio dodecilsolfato (SDS), che è un tensioattivo anionico che si lega idrofobicamente alle molecole proteiche e le fa aprire a causa della repulsione tra tensioattivi carichi negativamente capogruppo. Ogni molecola proteica lega approssimativamente la stessa quantità di SDS per unità di lunghezza. Quindi, la carica per unità di lunghezza e la conformazione molecolare sono approssimativamente simili per tutte le proteine. Poiché le proteine ​​viaggiano attraverso una rete di gel, vengono principalmente separate in base al loro peso molecolare perché il loro movimento dipende dalla dimensione della molecola proteica rispetto alla dimensione dei pori nel gel: le proteine ​​più piccole si muovono più rapidamente attraverso la matrice rispetto a quelle più grandi molecole. Questo tipo di elettroforesi è comunemente chiamato elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide o SDS-PAGE.

Per determinare di quanto si sono spostate le proteine, alla soluzione proteica viene aggiunto un colorante di tracciamento, ad esempio blu di bromofenolo. Questo colorante è una piccola molecola carica che migra prima delle proteine. Dopo che l'elettroforesi è stata completata, le proteine ​​sono rese visibili trattando il gel con un colorante proteico come Coomassie Brilliant Blue o colorante argento. La mobilità relativa di ciascuna banda proteica è calcolata:

L'elettroforesi viene spesso utilizzata per determinare la composizione proteica dei prodotti alimentari. La proteina viene estratta dal cibo in soluzione, che viene quindi separata mediante elettroforesi. SDS-PAGE viene utilizzato per determinare il peso molecolare di una proteina misurando R m, e quindi confrontandolo con una curva di calibrazione prodotta utilizzando proteine ​​di peso molecolare noto: un grafico di log (peso molecolare) contro la mobilità relativa è solitamente lineare. L'elettroforesi denaturante è più utile per determinare i pesi molecolari rispetto all'elettroforesi non denaturante, poiché l'attrito al movimento non dipende dalla forma o dalla carica originale delle molecole proteiche.

Elettroforesi di focalizzazione isoelettrica

Questa tecnica è una modifica dell'elettroforesi, in cui le proteine ​​vengono separate mediante carica su una matrice di gel che ha un gradiente di pH attraverso di essa. Le proteine ​​migrano nella posizione in cui il pH è uguale al loro punto isoelettrico e poi smettono di muoversi perché non sono più cariche. Questo metodo ha una delle risoluzioni più alte di tutte le tecniche utilizzate per separare le proteine. Sono disponibili gel che coprono un intervallo di pH ristretto (2-3 unità) o un ampio intervallo di pH (3-10 unità) e si dovrebbe quindi selezionare un gel più adatto alle proteine ​​da separare.

Elettroforesi bidimensionale

La focalizzazione isoelettrica e SDS-PAGE possono essere utilizzati insieme per migliorare la risoluzione di miscele proteiche complesse. Le proteine ​​vengono separate in una direzione in base alla carica utilizzando la focalizzazione isoelettrica, e quindi in una direzione perpendicolare in base alla dimensione utilizzando SDS-PAGE.


F4. Interazioni idrofobiche: introduzione

  • Contributo di Henry Jakubowski
  • Professore (Chimica) presso il College of St. Benedict/St. John's University

Abbiamo studiato il ruolo dell'effetto idrofobico (che comporta il favorevole rilascio entropico di molecole d'acqua ingabbiate sui gruppi idrofobici esposti al solvente) nel guidare la formazione di micelle e doppio strato. Questo guida anche il ripiegamento delle proteine? Per esplorare queste domande, studieremo la termodinamica di piccole molecole non polari, in particolare il benzene, con l'acqua e ci chiederemo se i parametri termodinamici associati alla solubilità del benzene sono simili a quelli associati alla stabilità delle proteine. Se questa analogia è valida, tutto ciò che promuove la solubilità del benzene porterà ad una maggiore esposizione della catena laterale degli amminoacidi idrofobici all'acqua e quindi alla denaturazione delle proteine. Quali sono le prove a sostegno di ciò?

un. strutture cristalline: queste strutture mostrano che la maggior parte delle catene laterali non polari sono sepolte all'interno di una proteina, che è strettamente imballata e che esclude l'acqua. Gli studi dimostrano che all'aumentare della superficie delle catene laterali degli amminoacidi, l'energia libera di trasferimento degli amminoacidi dall'acqua all'etanolo diventa più negativa.

Figura: Trasferimento di aminoacidi dall'acqua

(Rivedere le energie libere di trasferimento dei gruppi idrofobici nel Capitolo 1D: Lipidi nell'acqua - Termodinamica)

B. denaturazione delle proteine ​​a bassa temperatura - È stato osservato che le proteine ​​possono denaturarsi a basse temperature (meno di 0oC), suggerendo che i residui non polari diventano più "solubili" in acqua a basse temperature (cioè si spostano dall'interno più idrofobo di una proteina a quello più polare esterno). Confronta la solubilità dei gas non polari come CO2 o N2, che sono più solubili a bassa temperatura. Quando si riscaldano soluzioni di gas non polari in acqua, i gas diventano meno solubili, come evidenziato dalla formazione di bolle (cioè separazione di fase dei gas disciolti quando diventano più insolubili). Se il comportamento delle proteine ​​è governato da questo stesso comportamento (maggiore solubilità dei gruppi non polari a basse temperature), suggerirebbe che le proteine ​​potrebbero denaturarsi a basse temperature (portando ad una maggiore esposizione all'acqua delle catene laterali non polari). Questo fenomeno è stato osservato.

C. stabilità proteica influenzata da diverse specie di sale - Oltre 100 anni fa, Hofmeister ha determinato l'efficacia di diversi cationi e anioni di sali per precipitare le proteine ​​del siero del sangue negli intervalli di concentrazione 0,01 - 1 M. La serie è mostrata di seguito:

NH4+ > K+ > Na+ > Li+ > Mg2+ > Ca2+ > guanidinio

SO42- > HPO42- > acetato > citrato > Cl- > NO3- > ClO3- > I- > ClO4- > SCN-

  • Un sale da coppie dei primi ioni di queste serie (ad esempio, (NH4)2SO4), quando aggiunto a soluzioni acquose di proteine, precipita la forma nativa della proteina. Dobbiamo spiegare il fatto che precipita la proteina e che la proteina è precipitata nello stato nativo, non denaturato. Maggiori informazioni sul perché precipita le proteine ​​in un attimo. Il primo ione in ogni serie aumenta la tensione superficiale dell'acqua (rendendo più difficile creare una cavità nell'acqua per adattarla alla molecola non polare). Ciò riduce la solubilità delle molecole non polari. Queste molecole non polari "salt-out" promuovono non la dissoluzione in acqua ma l'aggregazione seguita da una separazione di fase. Per analogia, stabilizzeranno lo stato nativo poiché le catene laterali idrofobe sepolte avrebbero una ridotta propensione a spostarsi nell'ambiente acquoso.
  • Gli ultimi ioni della serie hanno un effetto minore sulla tensione superficiale, e quindi aumentano la solubilità delle molecole non polari ("salt-in"). Per analogia, destabilizzeranno lo stato nativo poiché le catene laterali idrofobe sepolte avrebbero una maggiore propensione a spostarsi nell'ambiente acquoso.
  • Serie Hofmeister

La solubilità del benzene nelle soluzioni saline acquose di questa serie aumenta da sinistra a destra, proprio come la stabilità della proteina nativa diminuisce da sinistra a destra (cioè i residui del nucleo non polare della proteina diventano più "solubili" in acqua, portando alla sua denaturazione).

D. conservazione dei residui del nucleo idrofobico - Questi residui sono altamente conservati e correlati con la struttura.

e. L'urea denatura le proteine ​​- Un altro additivo, l'urea, ad alte concentrazioni viene spesso utilizzato per denaturare le proteine. La gente pensava che l'urea competesse con i legami H intracatena e quindi disfacesse la proteina. Gli argomenti di cui sopra con i legami H contestano questa tesi poiché l'acqua dovrebbe quindi denaturare le proteine. In che modo l'urea denatura le proteine? È stato dimostrato che l'energia libera di trasferimento degli amminoacidi non polari nell'urea 8M aumenta in negativo man mano che le catene laterali diventano più grandi e più non polari.

Figura: energia libera di trasferimento degli amminoacidi non polari in 8 M urea

Questo vale anche per la denaturazione da parte della guanidina cloridrato. L'urea aumenta anche la solubilità delle molecole non polari in modo proporzionale alla loro superficie.


Caratteristiche fisiche del detergente

La concentrazione alla quale le micelle iniziano a formarsi è la concentrazione micellare critica (CMC). La CMC è la massima concentrazione di monomero e costituisce una misura dell'energia libera di formazione delle micelle. Più basso è il CMC, più stabile è la micella e più lentamente le molecole vengono incorporate o rimosse dalla micella. La struttura della regione idrofoba del detergente può influenzare la struttura delle micelle. Un aumento della lunghezza della catena idrocarburica idrofoba dei detergenti ionici determina un aumento delle dimensioni delle micelle e una minore CMC, poiché sono necessarie meno molecole per costruire una micella.

Il numero medio di monomeri in una micella è il numero di aggregazione. I valori di CMC e del numero di aggregazione dipendono fortemente da fattori quali temperatura, pH, forza ionica e omogeneità e purezza del detergente. Lievi discrepanze nei valori riportati per CMC e numero di aggregazione possono essere il risultato di variazioni nei metodi analitici utilizzati per determinare i valori. Anche i valori del numero di aggregazione vengono spostati in base alla concentrazione, poiché il numero di molecole di detergente per micella può aumentare se la concentrazione è superiore alla CMC.

La facilità di rimozione o sostituzione è un fattore importante nella scelta di un detersivo. Alcuni dei metodi di rimozione del detersivo più comuni includono:

  • Dialisi
  • Cromatografia con filtrazione su gel
  • Cromatografia ad adsorbimento idrofobico
  • Precipitazione delle proteine

Il valore CMC associato al detergente è un'utile guida alla forza di legame idrofobico. I detersivi con valori di CMC più elevati hanno un legame più debole e sono successivamente più facili da rimuovere mediante metodi di dialisi o spostamento. I detersivi con bassi valori di CMC richiedono meno detersivo per formare micelle e solubilizzare proteine ​​o lipidi.

Un altro parametro utile nella valutazione dei detergenti per la rimozione a valle è il peso molecolare delle micelle, che indica la dimensione relativa delle micelle. Le micelle più piccole vengono rimosse più facilmente e sono solitamente desiderabili quando i complessi proteina-detergente devono essere separati in base alla dimensione molecolare della proteina. Il peso molecolare della micella può essere calcolato moltiplicando il numero di aggregazione per il peso molecolare del monomero.

Il punto di nuvola è la temperatura alla quale la soluzione detergente vicina o superiore alla sua CMC si separa in due fasi. Le micelle si aggregano, formando tipicamente una fase torbida ad alta concentrazione di detergente, mentre il resto della soluzione si impoverisce di detergente. La soluzione a due fasi risultante può essere separata, con la proteina estratta che si trova nella fase ricca di detersivo. Detergenti con basse temperature di intorbidamento, come TRITON ® X-114 (punto di intorbidamento

23 °C) sono raccomandati per l'uso con le proteine ​​poiché temperature elevate del punto di intorbidamento possono denaturare le proteine ​​solubilizzate. Il punto di intorbidamento può essere influenzato dai cambiamenti nella concentrazione del detergente, dalla temperatura e dall'aggiunta di sale o polimeri come destrano e glicole polietilenico. Si noti che la fase ricca di detersivo dipende anche dal/ai detersivo/i specifico/i e dalla concentrazione di sale in alcune condizioni, la fase può essere limpida anziché torbida e trovarsi come fase superiore o inferiore della soluzione. Nei detergenti non ionici, questo comportamento è stato applicato nella separazione di fase e nella purificazione delle proteine ​​di membrana. 2


Co-espressione di chaperon e/o foldasi.

Due classi di proteine ​​svolgono un ruolo importante nella in vivo ripiegamento proteico.

  • Chaperon molecolari promuovere la corretta isomerizzazione e il targeting cellulare interagendo transitoriamente con gli intermedi di piegatura. Il meglio caratterizzato E. coli i sistemi sono:
    • GroES-GroEL
    • DnaK-DnaJ-GrpE
    • ClpB
    • peptidil prolile cis/trans isomerasi (PPI'S)
    • disolfuro ossidoreduttasi (DsbA) e disolfuro isomerasi (DsbC)
    • proteina disolfuro isomerasi (PDI) - una proteina eucariotica che catalizza sia l'ossidazione della cisteina proteica che l'isomerizzazione del legame disolfuro. Esibisce anche attività di accompagnatore.

    La co-espressione di una o più di queste proteine ​​con la proteina bersaglio potrebbe portare a livelli più elevati di proteine ​​solubili. I livelli di co-espressione dei diversi chaperon/foldasi devono essere ottimizzati per ogni singolo caso. DsbA e DsbC hanno anche mostrato effetti positivi sui livelli di espressione quando usati come partner di fusione.


    L'effetto idrofobico e il suo ruolo nella denaturazione a freddo ☆

    L'effetto idrofobico è considerato la principale forza trainante per il ripiegamento delle proteine ​​e svolge un ruolo importante nella stabilità di tali biomolecole. Anche la denaturazione a freddo, in cui lo stato nativo della proteina perde la sua stabilità dopo il raffreddamento, è attribuita a questo effetto. Non sorprende quindi che siano stati spesi molti sforzi per comprendere questo fenomeno. Nonostante questi sforzi, rimangono molti aspetti fondamentali irrisolti. In questo articolo esaminiamo e riassumiamo la termodinamica delle proteine, l'effetto idrofobico e la denaturazione a freddo. Iniziamo tenendo conto di questi fenomeni macroscopicamente, quindi passiamo alla loro descrizione a livello atomico. Ci auguriamo che questa recensione possa aiutare il lettore a comprendere il ruolo svolto dall'effetto idrofobico nella denaturazione a freddo.


    Contenuti

    Molti dispositivi e prodotti medici entrano in contatto con le superfici interne del corpo, come strumenti chirurgici e impianti. Quando un materiale non nativo entra nel corpo, ha luogo il primo passo della risposta immunitaria e la matrice extracellulare e le proteine ​​plasmatiche si aggregano al materiale nel tentativo di contenere, neutralizzare o isolare l'agente dannoso. [1] Queste proteine ​​possono facilitare l'attaccamento di vari tipi di cellule come osteoblasti e fibroblasti che possono favorire la riparazione dei tessuti. [2] Facendo un ulteriore passo avanti, i dispositivi impiantabili possono essere rivestiti con un materiale bioattivo per incoraggiare l'assorbimento di proteine ​​specifiche, la formazione di capsule fibrose e la guarigione delle ferite. Ciò ridurrebbe il rischio di rigetto dell'impianto e accelererebbe il recupero selezionando le proteine ​​e le cellule necessarie per l'endotelizzazione. Dopo la formazione dell'endotelio, il corpo non sarà più esposto al materiale estraneo e fermerà la risposta immunitaria.

    Le proteine ​​come il collagene o la fibrina spesso fungono da impalcature per l'adesione e la crescita cellulare. Questa è una parte integrante dell'integrità strutturale dei fogli cellulari e della loro differenziazione in strutture di tessuti e organi più complesse. Le proprietà di adesione delle proteine ​​alle superfici non biologiche influenzano notevolmente se le cellule possono o meno attaccarsi ad esse indirettamente tramite scaffold. Un impianto come la sostituzione dello stelo dell'anca richiede l'integrazione con i tessuti ospiti e l'assorbimento delle proteine ​​facilita questa integrazione.

    Gli strumenti chirurgici possono essere progettati per essere sterilizzati più facilmente in modo che le proteine ​​non rimangano adsorbite su una superficie, rischiando la contaminazione incrociata. Alcune malattie come la malattia di Creutzfeldt-Jakob e il kuru (entrambe legate al morbo della mucca pazza) sono causate dalla trasmissione di prioni, che sono forme erranti o piegate in modo improprio di una proteina normalmente nativa. Gli strumenti chirurgici contaminati da prioni richiedono uno speciale metodo di sterilizzazione per eliminare completamente tutti gli oligoelementi della proteina mal ripiegata, poiché sono resistenti a molti dei metodi di pulizia normalmente utilizzati.

    Tuttavia, in alcuni casi, l'adsorbimento di proteine ​​nei biomateriali può essere un evento estremamente sfavorevole. L'adesione dei fattori della coagulazione può indurre trombosi, che può portare a ictus o altri blocchi. [3] Alcuni dispositivi hanno lo scopo di interagire con l'ambiente corporeo interno come sensori o veicoli per la somministrazione di farmaci e l'assorbimento di proteine ​​ne ostacolerebbe l'efficacia.

    Le proteine ​​sono biomolecole composte da subunità di amminoacidi. Ogni amminoacido ha una catena laterale che acquista o perde carica a seconda del pH dell'ambiente circostante, nonché delle sue qualità individuali polari/non polari. [4]

    Le regioni cariche possono contribuire notevolmente al modo in cui quella proteina interagisce con altre molecole e superfici, nonché con la propria struttura terziaria (ripiegamento proteico). A causa della loro idrofilia, gli amminoacidi carichi tendono a trovarsi all'esterno delle proteine, dove sono in grado di interagire con le superfici. [5] È la combinazione unica di amminoacidi che conferisce a una proteina le sue proprietà. In termini di chimica di superficie, l'adsorbimento proteico è un fenomeno critico che descrive l'aggregazione di queste molecole all'esterno di un materiale. La tendenza delle proteine ​​a rimanere attaccate a una superficie dipende in gran parte dalle proprietà del materiale come l'energia superficiale, la struttura e la relativa distribuzione di carica. Le proteine ​​più grandi hanno maggiori probabilità di adsorbire e rimanere attaccate a una superficie a causa del maggior numero di siti di contatto tra gli amminoacidi e la superficie (Figura 1).

    Energia dell'adsorbimento proteico Modifica

    L'idea fondamentale alla base dell'adsorbimento spontaneo delle proteine ​​è che l'adsorbimento si verifica quando viene rilasciata più energia di quella ottenuta secondo la legge di Gibbs dell'energia libera.

    Questo è visto nell'equazione:

    • Annunci è la variazione netta dei parametri
    • G è energia libera di Gibbs?
    • T è la temperatura (unità SI: kelvin)
    • S è l'entropia (unità SI: joule per kelvin)
    • h è l'entalpia (unità SI: joule)

    Affinché l'adsorbimento proteico avvenga spontaneamente, AnnunciG deve essere un numero negativo.

    Effetto Vroman Modifica

    Le proteine ​​e le altre molecole sono costantemente in competizione tra loro sui siti di legame su una superficie. L'effetto Vroman, sviluppato da Leo Vroman, postula che le molecole piccole e abbondanti saranno le prime a rivestire una superficie. Tuttavia, nel tempo, le molecole con maggiore affinità per quella particolare superficie le sostituiranno. Questo si vede spesso nei materiali che entrano in contatto con il sangue dove la fibrina, che di solito è abbondante, si legherà per prima alla superficie e nel tempo sarà sostituita da proteine ​​più grandi. [6]

    Tasso di assorbimento Modifica

    Affinché le proteine ​​vengano adsorbite, devono prima entrare in contatto con la superficie attraverso uno o più di questi principali meccanismi di trasporto: diffusione, convezione termica, flusso di massa o una combinazione di questi. Quando si considera il trasporto delle proteine, è chiaro come i gradienti di concentrazione, la temperatura, la dimensione delle proteine ​​e la velocità di flusso influenzeranno l'arrivo delle proteine ​​su una superficie solida. In condizioni di flusso basso e gradienti di temperatura minimi, la velocità di adsorbimento può essere modellata in base all'equazione della velocità di diffusione. [5]

    Equazione della velocità di diffusione Modifica

    • D è il coefficiente di diffusione
    • n è la concentrazione superficiale delle proteine
    • Co è la concentrazione di massa delle proteine
    • T è tempo

    Una maggiore concentrazione di massa e/o un coefficiente di diffusione più elevato (inversamente proporzionale alla dimensione molecolare) determina un numero maggiore di molecole che arrivano in superficie. Le conseguenti interazioni della superficie proteica determinano elevate concentrazioni locali di proteine ​​adsorbite, raggiungendo concentrazioni fino a 1000 volte superiori a quelle della soluzione sfusa. [5] Tuttavia, il corpo è molto più complesso, contiene flusso e diffusione convettiva, e questi devono essere considerati nella velocità di assorbimento delle proteine.

    Flusso in un canale sottile Modifica

    • C è concentrazione
    • D è il coefficiente di diffusione
    • V è la velocità del flusso
    • X è la distanza lungo il canale
    • ? è la velocità di taglio del muro?
    • B è l'altezza del canale

    Questa equazione [5] è particolarmente applicabile all'analisi dell'adsorbimento proteico nei dispositivi biomedici nelle arterie, ad es. stent.

    Le quattro classi fondamentali di forze e interazioni nell'adsorbimento proteico sono: 1) interazione ionica o elettrostatica, 2) legame idrogeno, 3) interazione idrofobica (in gran parte guidata dall'entropia) e 4) interazioni di tipo donatore/accettore di elettroni a trasferimento di carica o particellare . [7]

    Interazioni ioniche o elettrostatiche Modifica

    La carica delle proteine ​​è determinata dal pKa delle sue catene laterali di amminoacidi, e dall'aminoacido terminale e dall'acido carbossilico. Le proteine ​​con punto isoelettrico (pI) al di sopra delle condizioni fisiologiche hanno una carica positiva e le proteine ​​con pI al di sotto delle condizioni fisiologiche hanno una carica negativa. La carica netta della proteina, determinata dalla somma delle cariche dei suoi costituenti, determina la migrazione elettroforetica in un campo elettrico fisiologico. Questi effetti sono a corto raggio a causa dell'elevata costante dielettrica dell'acqua, tuttavia, una volta che la proteina è vicina a una superficie carica, l'accoppiamento elettrostatico diventa la forza dominante. [8]

    Legame idrogeno Modifica

    L'acqua ha la stessa propensione a formare legami idrogeno di qualsiasi gruppo in un polipeptide. Durante un processo di ripiegamento e associazione, i gruppi peptidici e aminoacidi scambiano legami idrogeno con l'acqua. Pertanto, il legame idrogeno non ha un forte effetto stabilizzante sull'adsorbimento delle proteine ​​in un mezzo acquoso. [9]

    Illustrazione di due molecole d'acqua che interagiscono per formare un legame idrogeno

    Interazioni idrofobiche Modifica

    Le interazioni idrofobiche sono essenzialmente interazioni entropiche dovute essenzialmente a fenomeni di ordine/disordine in un mezzo acquoso. L'energia libera associata alla minimizzazione delle aree interfacciali è responsabile della riduzione al minimo della superficie delle gocce d'acqua e delle bolle d'aria nell'acqua. Questo stesso principio è la ragione per cui le catene laterali degli amminoacidi idrofobici sono orientate lontano dall'acqua, riducendo al minimo la loro interazione con l'acqua. I gruppi idrofili all'esterno della molecola determinano la solubilità in acqua delle proteine. La caratterizzazione di questo fenomeno può essere effettuata trattando queste relazioni idrofobiche con concetti di energia libera interfacciale. Di conseguenza, si può pensare alla forza trainante di queste interazioni come alla minimizzazione dell'energia libera totale dell'interfaccia, cioè alla minimizzazione dell'area superficiale. [10]

    Interazioni di trasferimento di carica Modifica

    Le interazioni di trasferimento di carica sono importanti anche nella stabilizzazione delle proteine ​​e nell'interazione di superficie. Nei processi generali donatore-accettore, si può pensare alla presenza di una densità elettronica in eccesso che può essere donata a una specie elettrofila. Nei mezzi acquosi, queste interazioni tra soluti sono principalmente dovute agli effetti degli elettroni orbitali pi. [11]

    Modifica temperatura

    La temperatura ha un effetto sia sullo stato di equilibrio che sulla cinetica dell'adsorbimento delle proteine. La quantità di proteine ​​adsorbite ad alta temperatura è solitamente superiore a quella a temperatura ambiente. La variazione di temperatura provoca cambiamenti conformazionali nell'adsorbimento che influenzano le proteine. Questi riarrangiamenti conformazionali nelle proteine ​​determinano un guadagno di entropia che agisce come una delle principali forze trainanti per l'adsorbimento delle proteine. L'effetto della temperatura sull'adsorbimento delle proteine ​​può essere osservato nei processi di produzione degli alimenti, in particolare alimenti liquidi come il latte che provoca gravi incrostazioni sulle superfici delle pareti delle apparecchiature in cui viene effettuato il trattamento termico. [12] [13]

    Forza ionica Modifica

    La forza ionica determina la lunghezza di Debye che è correlata alla distanza di smorzamento del potenziale elettrico di una carica fissa in un elettrolita. Quindi, maggiore è la forza ionica, più brevi sono le interazioni elettrostatiche tra entità cariche. Di conseguenza, l'adsorbimento di proteine ​​cariche a substrati con carica opposta è ostacolato mentre l'adsorbimento a substrati con carica simile è potenziato, influenzando così la cinetica di adsorbimento. Inoltre, l'elevata forza ionica aumenta la tendenza delle proteine ​​ad aggregarsi. [12]

    Sistema multiproteico Modifica

    Quando una superficie è esposta a una soluzione multiproteica, l'adsorbimento di alcune molecole proteiche è favorito rispetto alle altre. Le molecole proteiche che si avvicinano alla superficie competono per i siti di legame. Nel sistema multiproteico può verificarsi attrazione tra le molecole, mentre nelle soluzioni monoproteiche dominano le interazioni repulsive intermolecolari. Inoltre, esiste una diffusione proteica dipendente dal tempo, in cui le molecole proteiche inizialmente entrano in contatto con siti di legame minimi sulla superficie. Con l'aumento del tempo di permanenza della proteina sulla superficie, la proteina può svilupparsi per l'interazione con ulteriori siti di legame. Ciò si traduce in un aumento dipendente dal tempo dei punti di contatto tra proteina e superficie. Ciò rende ulteriormente meno probabile il desorbimento. [5]

    Tecnica di esaurimento della soluzione Modifica

    Questa tecnica misura un cambiamento di concentrazione delle proteine ​​nella soluzione sfusa prima e dopo l'adsorbimento, cP. Qualsiasi variazione della concentrazione proteica è attribuita allo strato adsorbito, ΓP.

    Questo metodo richiede anche un materiale ad alta area superficiale come adsorbenti particolato e perline. [14]

    Ellissometria Modifica

    L'ellissometria è stata ampiamente utilizzata per misurare la cinetica di adsorbimento delle proteine ​​e la struttura dello strato proteico adsorbito. È una tecnica ottica che misura il cambiamento della polarizzazione della luce dopo la riflessione da una superficie. Questa tecnica richiede superfici planari riflettenti, preferibilmente quarzo, silicio o silice, e una forte variazione dell'indice di rifrazione all'adsorbimento delle proteine. [12]

    Microscopia a forza atomica Modifica

    La microscopia a forza atomica (AFM) è una potente tecnica di microscopia utilizzata per studiare campioni su scala nanometrica e viene spesso utilizzata per visualizzare la distribuzione delle proteine ​​su una superficie. Consiste in un cantilever con una punta per scansionare la superficie. È uno strumento prezioso per misurare l'interazione proteina-proteina e proteina-superficie. Tuttavia, il fattore limitante di molti studi AFM è che l'imaging viene spesso eseguito dopo l'essiccazione della superficie, il che potrebbe influenzare il ripiegamento delle proteine ​​e la struttura dello strato proteico. Inoltre, la punta a sbalzo può rimuovere una proteina o corrugare lo strato proteico. [12] [15]

    Risonanza plasmonica di superficie Modifica

    La risonanza plasmonica di superficie (SPR) è stata ampiamente utilizzata per misurare l'adsorbimento di proteine ​​con elevata sensibilità. Questa tecnica si basa sull'eccitazione di plasmoni di superficie, onde elettromagnetiche longitudinali originate all'interfaccia tra metalli e dielettrici. La deposizione sulla superficie conduttiva di molecole e strati sottili entro 200 nm modifica le proprietà dielettriche del sistema e quindi la risposta SPR, segnalando la presenza di molecole su una superficie metallica. [16]

    Microbilancia in cristallo di quarzo Modifica

    La microbilancia a cristalli di quarzo (QCM) è un sensore acustico costruito attorno a un cristallo di quarzo a forma di disco. Sfrutta l'effetto piezoelettrico inverso. QCM, e versioni estese come QCM-D, è stato ampiamente utilizzato per studi di adsorbimento proteico, in particolare per il monitoraggio in tempo reale dell'adsorbimento proteico senza etichetta. Oltre agli studi di adsorbimento, QCM-D fornisce anche informazioni su moduli elastici, viscosità e cambiamenti conformazionali [17]

    Spettroscopia in modalità luce a guida d'onda ottica Modifica

    La spettroscopia ottica a guida d'onda lightmode (OWLS) è un dispositivo che si basa su una guida d'onda ottica a film sottile, che racchiude un numero discreto di onde elettromagnetiche guidate. La guida è ottenuta per mezzo di un accoppiatore a griglia. Si basa sulle misurazioni dell'indice di rifrazione effettivo di uno strato di film sottile sopra la guida d'onda. Questa tecnica funziona solo su superfici altamente trasparenti. [17]

    Altri metodi ampiamente utilizzati per misurare la quantità di proteine ​​adsorbite sulle superfici includono la marcatura radioattiva, il saggio di Lowry, la riflettometria dell'angolo di scansione, la fluorescenza a riflessione interna totale, il saggio dell'acido bicinconinico ecc.

    Composizione chimica Modifica

    Il legame metallico si riferisce al legame specifico tra gli ioni metallici positivi e le nuvole di elettroni di valenza circostanti. [18] Questa forza intermolecolare è relativamente forte e dà origine al ripetuto orientamento cristallino degli atomi, noto anche come sistema reticolare. Esistono diversi tipi di formazioni reticolari comuni e ognuna ha la sua densità di imballaggio e vicinanza atomica uniche. Le nubi di elettroni caricate negativamente degli ioni metallici ostacoleranno stericamente l'adesione di regioni proteiche caricate negativamente a causa della repulsione di carica, limitando così i siti di legame disponibili di una proteina a una superficie metallica.

    La formazione del reticolo può portare alla connessione con potenziali siti di adesione dipendenti dagli ioni metallo (MIDAS) che sono siti di legame per il collagene e altre proteine. [19] La superficie del metallo ha proprietà diverse rispetto alla massa poiché le normali subunità ripetitive cristalline terminano in superficie. Questo lascia gli atomi di superficie senza un atomo vicino su un lato, il che altera intrinsecamente la distribuzione degli elettroni. Questo fenomeno spiega anche perché gli atomi di superficie hanno un'energia maggiore della massa, spesso indicata semplicemente come energia di superficie. Questo stato di maggiore energia è sfavorevole e gli atomi di superficie cercheranno di ridurlo legandosi alle molecole reattive disponibili. [20]

    Ciò è spesso ottenuto mediante l'adsorbimento di proteine, in cui gli atomi di superficie vengono ridotti a uno stato energetico più vantaggioso.

    L'ambiente interno del corpo è spesso modellato come un ambiente acquoso a 37 ° C a pH 7,3 con molto ossigeno disciolto, elettroliti, proteine ​​e cellule. [5] Se esposti all'ossigeno per un lungo periodo di tempo, molti metalli possono ossidarsi e aumentare il loro stato di ossidazione superficiale perdendo elettroni. [21] Questo nuovo stato cationico lascia la superficie con una carica netta positiva e una maggiore affinità per i gruppi laterali proteici caricati negativamente. All'interno della vasta gamma di metalli e leghe metalliche, molti sono suscettibili alla corrosione quando impiantati nel corpo. Gli elementi che sono più elettronegativi vengono corrosi più velocemente se esposti a un ambiente acquoso ricco di elettroliti come il corpo umano. [22] Sia l'ossidazione che la corrosione abbasseranno l'energia libera, influenzando così l'adsorbimento delle proteine ​​come visto nell'Eq. 1. [23]

    Effetti della topografia Modifica

    La ruvidità e la consistenza della superficie hanno un'innegabile influenza sull'adsorbimento delle proteine ​​su tutti i materiali, ma con l'ubiquità dei processi di lavorazione dei metalli, è utile affrontare il modo in cui questi influiscono sul comportamento delle proteine. L'assorbimento iniziale è importante, così come l'adesione e l'integrità mantenute. La ricerca ha dimostrato che la rugosità superficiale può favorire l'adesione delle proteine ​​dell'impalcatura e degli osteoblasti e determina un aumento della mineralizzazione superficiale. [24] Le superfici con più caratteristiche topografiche e rugosità avranno una superficie più esposta con cui le proteine ​​possono interagire. [5] In termini di applicazioni di ingegneria biomedica, le tecniche di microlavorazione sono spesso utilizzate per aumentare l'adesione delle proteine ​​agli impianti nella speranza di accorciare i tempi di recupero. La tecnica del laserpatterning introduce scanalature e rugosità superficiale che influenzeranno l'adesione, la migrazione e l'allineamento. La sabbiatura, un metodo analogo alla sabbiatura, e l'incisione chimica si sono dimostrate efficaci tecniche di irruvidimento superficiale che promuovono la stabilità a lungo termine degli impianti in titanio. [25] L'aumento della stabilità è un risultato diretto dell'aumento osservato della matrice extracellulare e dell'adesione del collagene, che si traduce in un aumento dell'adesione e della mineralizzazione degli osteoblasti rispetto alle superfici non ruvide. [26] Tuttavia, l'adsorbimento non è sempre desiderabile. I macchinari possono essere influenzati negativamente dall'adsorbimento, in particolare con l'adsorbimento di proteine ​​nell'industria alimentare.

    I polimeri sono di grande importanza quando si considera l'adsorbimento di proteine ​​nell'arena biomedica. I polimeri sono composti da uno o più tipi di "meri" legati insieme ripetutamente, tipicamente da legami covalenti direzionali. Man mano che la catena cresce per aggiunta di mer, le proprietà chimiche e fisiche del materiale sono dettate dalla struttura molecolare del monomero.Selezionando attentamente il tipo o i tipi di meri in un polimero e il suo processo di fabbricazione, le proprietà chimiche e fisiche di un polimero possono essere altamente personalizzate per assorbire proteine ​​e cellule specifiche per una particolare applicazione.

    Effetti di conformazione Modifica

    L'adsorbimento delle proteine ​​spesso provoca cambiamenti conformazionali significativi, che si riferiscono ai cambiamenti nelle strutture secondarie, terziarie e quartarie delle proteine. Oltre alle velocità e alle quantità di adsorbimento, l'orientamento e la conformazione sono di importanza critica. Questi cambiamenti conformazionali possono influenzare l'interazione della proteina con ligandi, substrati e antigeni che dipendono dall'orientamento del sito di legame di interesse. Questi cambiamenti conformazionali, come risultato dell'adsorbimento di proteine, possono anche denaturare la proteina e modificarne le proprietà native.

    Adsorbimento su scaffold polimerici Modifica

    L'ingegneria dei tessuti è un campo relativamente nuovo che utilizza un'impalcatura come piattaforma su cui proliferano le cellule desiderate. Non è chiaro cosa definisca uno scaffold ideale per uno specifico tipo di tessuto. Le considerazioni sono complesse e l'adsorbimento proteico non fa che aumentare la complessità. Sebbene l'architettura, la meccanica strutturale e le proprietà della superficie svolgano un ruolo chiave, anche la comprensione della degradazione e della velocità di assorbimento delle proteine ​​è fondamentale. Oltre agli elementi essenziali della meccanica e della geometria, un costrutto di scaffold adatto avrà proprietà di superficie ottimizzate per l'attacco e la migrazione dei tipi cellulari di particolare interesse.

    In generale, è stato scoperto che gli scaffold che assomigliano molto agli ambienti naturali del tessuto in fase di ingegneria sono i più efficaci. Di conseguenza, sono state fatte molte ricerche per studiare i polimeri naturali che possono essere adattati, attraverso la metodologia di lavorazione, a criteri di progettazione specifici. Il chitosano è attualmente uno dei polimeri più utilizzati in quanto è molto simile al glicosaminoglicano (GAG) naturale ed è degradabile dagli enzimi umani. [28]

    Chitosano Modifica

    Il chitosano è un polisaccaride lineare contenente residui derivati ​​dalla chitina ed è ampiamente studiato come biomateriale grazie alla sua elevata compatibilità con numerose proteine ​​del corpo. Il chitosano è cationico e quindi reagisce elettrostaticamente con numerosi proteoglicani, GAG anionici e altre molecole che possiedono una carica negativa. Poiché molte citochine e fattori di crescita sono legati al GAG, gli scaffold con i complessi chitosano-GAG sono in grado di trattenere queste proteine ​​secrete dalle cellule aderite. Un'altra qualità del chitosano che gli conferisce un buon potenziale di biomateriale è la sua elevata densità di carica nelle soluzioni. Ciò consente al chitosano di formare complessi ionici con molti polimeri anionici idrosolubili, ampliando la gamma di proteine ​​che sono in grado di legarsi ad esso e ampliandone così i possibili utilizzi. [29]

    Polimero struttura dell'impalcatura Tessuto bersaglio Tipo di cella dell'applicazione Rif
    chitosano Blocchi porosi 3D Osso ROS simile agli osteoblasti [30]
    Chitosano-poliestere Reti in fibra 3D Osso MSC umana [31]
    Chitosano-alginato Gel iniettabile Osso MG63 . simile all'osteoblasto [32]
    Chitosano-gelatina Cilindri porosi 3D Cartilagine Condrociti [33]
    Chitosano-GP Gel iniettabile Cartilagine Condrociti [34]
    Chitosano-collagene Membrane porose Pelle Co-coltura di fibroblasti e cheratinociti [35]
    Tabella 1: Strutture, tessuti bersaglio e tipi di cellule di applicazione di scaffold a base di chitosano

    L'adsorbimento delle proteine ​​è fondamentale per molte applicazioni industriali e biomediche. Una previsione accurata dell'assorbimento delle proteine ​​consentirà di compiere progressi in questi settori.

    Database di adsorbimento biomolecolare Modifica

    Il database dell'adsorbimento biomolecolare (BAD) è un database online liberamente disponibile con dati sperimentali sull'assorbimento delle proteine ​​raccolti dalla letteratura. Il database può essere utilizzato per la selezione dei materiali per la fabbricazione di dispositivi microfluidici e per la selezione delle condizioni operative ottimali dei dispositivi lab-on-a-chip. La quantità di proteine ​​adsorbite sulla superficie può essere prevista utilizzando la previsione basata sulle reti neurali disponibile presso BAD. Questa previsione è stata convalidata per essere inferiore al 5% di errore per i dati complessivi disponibili nel BAD. Possono essere stimati anche altri parametri, come lo spessore degli strati proteici e la tensione superficiale delle superfici ricoperte di proteine. [ citazione necessaria ]


    Guarda il video: Le proteine (Agosto 2022).