Informazione

7.19E: Regolazione della traduzione del fattore Sigma - Biologia

7.19E: Regolazione della traduzione del fattore Sigma - Biologia



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

I fattori sigma sono proteine ​​che regolano l'espressione genica che sono controllate a vari livelli, incluso a livello traslazionale.

obiettivi formativi

  • Spiegare la regolazione della traduzione del fattore sigma

Punti chiave

  • L'espressione del fattore Sigma è spesso associata a cambiamenti ambientali che causano cambiamenti nell'espressione genica.
  • Il controllo traduzionale dei fattori sigma è fondamentale nel suo ruolo nella regolazione della trascrizione.
  • La traduzione del fattore Sigma è controllata da piccoli RNA non codificanti che possono attivare o inibire la traduzione.

Parole chiave

  • lo stress ossidativo: Danni causati a cellule o tessuti da specie reattive dell'ossigeno.
  • fattore sigma: Un fattore sigma (fattore σ) è una proteina necessaria solo per l'inizio della sintesi dell'RNA.
  • proteina RpoS: RpoS è un regolatore centrale della risposta generale allo stress e opera sia in modo retroattivo che proattivo: non solo consente alla cellula di sopravvivere alle sfide ambientali, ma la prepara anche a stress successivi (protezione incrociata).

I fattori sigma sono gruppi di proteine ​​che regolano la trascrizione e quindi funzionano nel mantenimento della casa, nel metabolismo e nella regolazione dei processi di crescita nei batteri. L'espressione del fattore Sigma è spesso associata a cambiamenti ambientali che causano cambiamenti nell'espressione genica. La regolazione dell'espressione dei fattori sigma avviene a livello trascrizionale, traduzionale e post-traduzionale come dettato dall'ambiente cellulare e dalla presenza o assenza di numerosi cofattori.

I fattori Sigma includono numerosi tipi di fattori. I fattori sigma più comunemente studiati sono spesso indicati come proteine ​​RpoS poiché i geni rpoS codificano per proteine ​​sigma di varie dimensioni. In E. coli, l'RpoS è il regolatore dei geni della fase di crescita, in particolare nella fase stazionaria. L'RpoS è fondamentale nelle risposte generali allo stress e può funzionare nel promuovere la sopravvivenza durante gli stress ambientali, ma può anche preparare la cellula agli stress. In particolare, il controllo traslazionale del fattore sigma è un importante livello di controllo.

Il controllo traduzionale dei fattori sigma coinvolge la presenza e la funzione di piccoli RNA non codificanti. Usando le proteine ​​RpoS come focus, l'espressione e la trascrizione di RpoS è regolata a livello traslazionale. Piccoli RNA non codificanti sono in grado di rilevare i cambiamenti ambientali e gli stress con conseguente aumento dell'espressione della proteina RpoS. I piccoli RNA non codificanti sono in grado di aumentare in modo specifico la quantità di mRNA rpoS che subisce la traduzione.

L'aumento risultante della proteina RpoS si basa sull'ambiente cellulare e sui suoi bisogni. Esistono numerose classi di piccoli RNA non codificanti che funzionano nella regolazione RpoS, inclusi DsrA, RprA e OxyS. Questi piccoli RNA non codificanti sono in grado di rilevare i cambiamenti di temperatura (DsrA), lo stress sulla superficie cellulare (RprA) e lo stress ossidativo (OxyS). Questi RNA possono indurre l'attivazione della traduzione di rpoS. Tuttavia, ci sono piccoli RNA non codificanti, come LeuO, che sono in grado di inibire la traduzione di rpoS anche tramite meccanismi di repressione. La regolazione della traduzione rpoS è complessa e coinvolge la segnalazione incrociata e la messa in rete di numerose proteine ​​e dei piccoli RNA non codificanti regolatori.


7.19E: Regolazione della traduzione del fattore Sigma - Biologia

La fosforilazione di RssB avviene sull'interfaccia quindi indebolisce l'interazione σ S .

IraD interagisce con RssB con maggiore affinità indipendentemente dalla fosforilazione.

Viene proposto un nuovo meccanismo a due livelli per la proteolisi controllata di S. RssB è completamente attivato durante la crescita logaritmica, favorendo la degradazione di σS. La fosforilazione su D58 spegne parzialmente la degradazione poiché la fosforilazione riduce l'affinità RssB per S . Il legame della proteina anti-adattatrice IraD a RssB impedisce qualsiasi interazione RssB-σS e blocca completamente la degradazione di σS.


Profilazione proteomica e imparziale di modifica post-traduzionale delle placche amiloidi e del tessuto circostante in un modello murino transgenico della malattia di Alzheimer

Corrispondenza: [*] Corrispondenza con: Allan Stensballe, PhD, Department of Health Science and Technology, Aalborg University, Fredrik Bajersvej 7E, 9220 Aalborg, Denmark. Tel.: +45 6160 8786 Fax: +45 9815 4008 E-mail: [email protected] .

Nota: [1] Paternità senior condivisa.

Riassunto: Le placche amiloidi sono uno dei segni distintivi della malattia di Alzheimer (AD). Il costituente principale delle placche amiloidi sono i peptidi amiloide-β, ma co-localizza anche una complessa interazione di altre proteine ​​infiltranti. Abbiamo ipotizzato che l'analisi proteomica potrebbe rivelare differenze tra le placche amiloidi e il tessuto di controllo adiacente nel modello murino transgenico di AD (APPPS1-21) e in regioni simili da cuccioli non transgenici. La nostra strategia di microproteomica includeva l'isolamento di regioni di interesse mediante microdissezione di cattura laser e analisi mediante quantificazione relativa priva di etichette basata su cromatografia liquida di spettrometria di massa. Abbiamo costantemente identificato 183, 224 e 307 proteine ​​da placche amiloidi, controlli adiacenti e campioni non tg, rispettivamente. L'analisi del percorso ha rivelato 27 proteine ​​che sono state significativamente regolate quando si confrontano le placche amiloidi e le corrispondenti regioni di controllo adiacenti. Abbiamo inoltre chiarito che le proteine ​​​​co-localizzate sono state soggette a modifiche post-traduzionali e sono le prime a riportare 193 e 117 modifiche uniche associate alle placche amiloidi e agli estratti di controllo adiacenti, rispettivamente. Le tre modificazioni più comuni rilevate nelle proteine ​​delle placche amiloidi erano l'ossidazione, la deammidazione e la piroglutamilazione. Insieme, i nostri dati forniscono nuove informazioni sui processi biologici che si verificano all'interno e intorno alle placche amiloidi nel modello murino APPPS1-21 di AD.

Parole chiave: morbo di Alzheimer, placca amiloide, spettrometria di massa, microdissezione, piroglutammato

Journal: Journal of Alzheimer's Disease, vol. 73, n. 1, pp. 393-411, 2020


SOMMARIO DELL'INVENZIONE

Tra i vari aspetti della presente divulgazione vi è la fornitura di un'endonucleasi guidata da RNA isolata, in cui l'endonucleasi comprende almeno un segnale di localizzazione nucleare, almeno un dominio nucleasico e almeno un dominio che interagisce con un RNA guida per colpire il endonucleasi a una sequenza nucleotidica specifica per la scissione. In una forma di realizzazione, l'endonucleasi può essere derivata da una proteina Cas9. In un'altra forma di realizzazione, l'endonucleasi può essere modificata in modo da non avere almeno un dominio nucleasi funzionale. In altre forme di realizzazione, l'endonucleasi può comprendere inoltre un dominio di penetrazione cellulare, un dominio marcatore o entrambi. In un'ulteriore forma di realizzazione, l'endonucleasi può essere parte di un complesso proteina-RNA comprendente l'RNA guida. In alcuni casi, l'RNA guida può essere una singola molecola comprendente una regione 5' complementare a un sito bersaglio. Viene anche fornito un acido nucleico isolato codificante una qualsiasi delle endonucleasi guidate da RNA qui divulgate. In alcune forme di realizzazione, l'acido nucleico può essere codone ottimizzato per la traduzione in cellule di mammifero, come, per esempio, cellule umane. In altre forme di realizzazione, la sequenza di acido nucleico che codifica per l'endonucleasi RNA-guidata può essere operativamente collegata a una sequenza di controllo del promotore e, facoltativamente, può essere parte di un vettore. In altre forme di realizzazione, un vettore comprendente una sequenza codificante l'endonucleasi RNA-guidata, che può essere operativamente collegata a una sequenza di controllo del promotore, può anche comprendere una sequenza codificante un RNA guida, che può essere operativamente collegata a una sequenza di controllo del promotore.

Un altro aspetto della presente invenzione comprende un metodo per modificare una sequenza cromosomica in una cellula o embrione eucariotica. Il metodo comprende l'introduzione in una cellula o embrione eucariotica (i) almeno un'endonucleasi RNA-guidata comprendente almeno un segnale di localizzazione nucleare o acido nucleico che codifica almeno un'endonucleasi RNA-guidata come qui definita, (ii) almeno un RNA guida o DNA codificante almeno un RNA guida e, facoltativamente, (iii) almeno un polinucleotide donatore comprendente una sequenza donatrice. Il metodo comprende inoltre la coltura della cellula o dell'embrione in modo tale che ciascun RNA guida diriga un'endonucleasi RNA-guidata verso un sito mirato nella sequenza cromosomica dove l'endonucleasi RNA-guidata introduce una rottura a doppio filamento nel sito mirato e il doppio filamento la rottura viene riparata da un processo di riparazione del DNA tale che la sequenza cromosomica viene modificata. In una forma di realizzazione, l'endonucleasi RNA-guidata può essere derivata da una proteina Cas9. In un'altra forma di realizzazione, l'acido nucleico che codifica per l'endonucleasi RNA-guidata introdotta nella cellula o nell'embrione può essere mRNA. In un'ulteriore forma di realizzazione, in cui l'acido nucleico che codifica per l'endonucleasi guidata da RNA introdotta nella cellula o nell'embrione può essere DNA. In un'ulteriore forma di realizzazione, il DNA che codifica per l'endonucleasi RNA-guidata può essere parte di un vettore che comprende inoltre una sequenza codificante per l'RNA guida. In alcune forme di realizzazione, la cellula eucariotica può essere una cellula umana, una cellula di mammifero non umana, una cellula staminale, una cellula di vertebrato non di mammifero, una cellula di invertebrato, una cellula vegetale o un organismo eucariotico a cellula singola. In certe altre forme di realizzazione, l'embrione è un embrione animale unicellulare non umano.

Un ulteriore aspetto della divulgazione fornisce una proteina di fusione comprendente una proteina simile a CRISPR/Cas o un suo frammento e un dominio effettore. In generale, la proteina di fusione comprende almeno un segnale di localizzazione nucleare. Il dominio effettore della proteina di fusione può essere un dominio di scissione, un dominio di modificazione epigenetica, un dominio di attivazione trascrizionale o un dominio repressore trascrizionale. In una forma di realizzazione, la proteina simile a CRISPR/Cas della proteina di fusione può essere derivata da una proteina Cas9. In un'iterazione, la proteina Cas9 può essere modificata per non avere almeno un dominio nucleasi funzionale. In un'iterazione alternativa, la proteina Cas9 può essere modificata per non avere tutta l'attività nucleasica. In una forma di realizzazione, il dominio effettore può essere un dominio di scissione, come, per esempio, un dominio endonucleasico FokI o un dominio endonucleasi FokI modificato. In un'altra forma di realizzazione, una proteina di fusione può formare un dimero con un'altra proteina di fusione. Il dimero può essere un omodimero o un eterodimero. In un'altra forma di realizzazione, la proteina di fusione può formare un eterodimero con una nucleasi a dito di zinco, in cui il dominio di scissione sia della proteina di fusione che delle nucleasi a dito di zinco è un dominio endonucleasico FokI o un dominio endonucleasi FokI modificato. In ancora un'altra forma di realizzazione, la proteina di fusione comprende una proteina simile a CRISPR/Cas derivata da una proteina Cas9 modificata per non avere tutta l'attività nucleasica, e il dominio effettore è un dominio endonucleasico FokI o un dominio endonucleasi FokI modificato. In ancora un'altra forma di realizzazione, la proteina di fusione comprende una proteina simile a CRISPR/Cas derivata da una proteina Cas9 modificata per non avere tutta l'attività nucleasica, e il dominio effettore può essere un dominio di modificazione epigenetica, un dominio di attivazione trascrizionale o un dominio repressore trascrizionale. In ulteriori forme di realizzazione, una qualsiasi delle proteine ​​di fusione qui divulgate può comprendere almeno un dominio aggiuntivo scelto da un segnale di localizzazione nucleare, un dominio di penetrazione cellulare e un dominio marcatore. Sono anche forniti acidi nucleici isolati che codificano una qualsiasi delle proteine ​​di fusione qui fornite.

Ancora un altro aspetto della divulgazione comprende un metodo per modificare una sequenza cromosomica o regolare l'espressione di una sequenza cromosomica in una cellula o embrione. Il metodo comprende l'introduzione nella cellula o nell'embrione (a) di almeno una proteina di fusione o acido nucleico che codifica almeno una proteina di fusione, in cui la proteina di fusione comprende una proteina simile a CRISPR/Cas o un suo frammento e un dominio effettore, e ( b) almeno un RNA guida o DNA che codifica almeno un RNA guida, in cui l'RNA guida guida la proteina CRISPR/Cas-like della proteina di fusione in un sito mirato nella sequenza cromosomica e il dominio effettore della proteina di fusione modifica il sequenza cromosomica o regola l'espressione della sequenza cromosomica. In una forma di realizzazione, la proteina simile a CRISPR/Cas della proteina di fusione può essere derivata da una proteina Cas9. In un'altra forma di realizzazione, la proteina simile a CRISPR/Cas della proteina di fusione può essere modificata per non avere almeno un dominio nucleasi funzionale. In ancora un'altra forma di realizzazione, la proteina simile a CRISPR/Cas della proteina di fusione può essere modificata per non avere tutta l'attività nucleasica. In una forma di realizzazione in cui la proteina di fusione comprende una proteina Cas9 modificata per non avere tutta l'attività nucleasica e un dominio di scissione FokI o un dominio di scissione FokI modificato, il metodo può comprendere l'introduzione nella cellula o nell'embrione di una proteina di fusione o di un acido nucleico che codifica per una proteina di fusione e due RNA guida o DNA che codificano due RNA guida e in cui viene introdotta una rottura a doppio filamento nella sequenza cromosomica. In un'altra forma di realizzazione in cui la proteina di fusione comprende una proteina Cas9 modificata per mancare di tutta l'attività nucleasica e un dominio di scissione FokI o un dominio di scissione FokI modificato, il metodo può comprendere l'introduzione nella cellula o nell'embrione di due proteine ​​di fusione o acido nucleico che codifica per due proteine ​​di fusione e due RNA guida o DNA che codificano due RNA guida e in cui vengono introdotte due rotture a doppio filamento nella sequenza cromosomica. In ancora un'altra forma di realizzazione in cui la proteina di fusione comprende una proteina Cas9 modificata per mancare di tutta l'attività nucleasica e un dominio di scissione FokI o un dominio di scissione FokI modificato, il metodo può comprendere l'introduzione nella cellula o nell'embrione di una proteina di fusione o di un acido nucleico che codifica uno proteina di fusione, un RNA guida o acido nucleico che codifica per un RNA guida e una nucleasi a dita di zinco o acido nucleico che codifica per una nucleasi a dita di zinco, in cui la nucleasi a dita di zinco comprende un dominio di scissione FokI o un dominio di scissione FokI modificato e in cui un doppio -la rottura del filamento viene introdotta nella sequenza cromosomica. In alcune forme di realizzazione in cui la proteina di fusione comprende un dominio di scissione, il metodo può inoltre comprendere l'introduzione nella cellula o nell'embrione di almeno un polinucleotide donatore. Nelle forme di realizzazione in cui la proteina di fusione comprende un dominio effettore scelto da un dominio di modificazione epigenetica, un dominio di attivazione trascrizionale o un dominio repressore trascrizionale, la proteina di fusione può comprendere una proteina Cas9 modificata per mancare di tutta l'attività nucleasica, e il metodo può comprendere l'introduzione nella cellula o nell'embrione una proteina di fusione o acido nucleico che codifica una proteina di fusione, e un RNA guida o acido nucleico che codifica un RNA guida, e in cui la struttura o l'espressione della sequenza cromosomica mirata è modificata. In alcune forme di realizzazione, la cellula eucariotica può essere una cellula umana, una cellula di mammifero non umana, una cellula staminale, una cellula di vertebrato non di mammifero, una cellula di invertebrato, una cellula vegetale o un organismo eucariotico a cellula singola. In certe altre forme di realizzazione, l'embrione è un embrione animale unicellulare non umano.

Altri aspetti e iterazioni dell'informativa sono descritti di seguito.


Discussione

I risultati primari di questo studio sono che 1) i cuori femminili sono più suscettibili dei cuori maschili ai cambiamenti nella trascrizione genica indotti dalla metanfetamina 2) la metanfetamina non induce cambiamenti di lunga durata nella trascrizione genica miocardica che persistono dopo 1 mese di successiva astinenza da il farmaco e 3) la metanfetamina induce cambiamenti sesso-dipendenti nella trascrizione dei geni che regolano l'orologio circadiano nel cuore.

Questo lavoro è stato suggerito dalla nostra precedente scoperta che il trattamento con metanfetamina per 10�ys fa sì che le femmine di ratto (ma non i loro fratelli maschi) sviluppino ipersensibilità miocardica al danno ischemico [14]. È importante sottolineare che questo effetto indotto dalla metanfetamina persisteva nei cuori femminili dopo 1 mese di successiva astinenza dal farmaco, suggerendo che potrebbe derivare da cambiamenti a lungo termine nell'espressione genica cardiaca che non si invertono rapidamente quando si interrompe l'esposizione alla metanfetamina. Abbiamo anticipato che l'identificazione dei cambiamenti indotti dalla metanfetamina nell'espressione genica del miocardio che sono entrambi dipendenti dal sesso (si verificano solo nelle femmine) e che persistono dopo un periodo di successiva astinenza dal farmaco può fornire una base meccanicistica per le nostre osservazioni sull'impatto della metanfetamina sul cuore ischemico. Contrariamente a questa ipotesi, i nostri risultati indicano che la metanfetamina non induce cambiamenti nella trascrizione del gene miocardico che persistono a lungo termine dopo la sospensione del farmaco.

Le interazioni tra i geni del periodo, BmalI, Npas2, Dbp, Clock, criptocromi e altri geni che regolano la funzione circadiana sono ben caratterizzate e sono state oggetto di recenti revisioni [27, 28]. La capacità della metanfetamina di alterare l'espressione dei geni che regolano il ritmo circadiano nell'ippocampo, nello striato e in altre regioni del cervello è ben consolidata [29�]. Tuttavia, questo è il primo studio di cui siamo a conoscenza per dimostrare che la metanfetamina altera la trascrizione miocardica dei geni correlati all'orologio (Per2, Per3, Dbp, Orologio, Bmal I, Cry2, Npas2) nel cuore e che ciò avviene in modo dipendente dal sesso. L'orologio circadiano svolge un ruolo importante nella regolazione dei cambiamenti diurni nel metabolismo cardiaco, nella frequenza cardiaca e nella pressione sanguigna [28, 34], e ci sono prove sia da modelli animali [35, 36] che da studi sull'uomo [37�] [40 , 41] che l'interruzione dell'orologio circadiano influisce negativamente sullo sviluppo di malattie cardiovascolari [27, 42, 43] e sulla suscettibilità all'infarto del miocardio [36, 44]. Pertanto, l'osservazione che 10�ys di trattamento con metanfetamina altera la trascrizione dei geni dell'orologio circadiano e fa sì che i cuori femminili diventino ipersensibili al danno ischemico [14] è coerente con il lavoro di altri ricercatori. Tuttavia, i nostri risultati non forniscono una spiegazione per l'osservazione che questi animali rimangono ipersensibili all'ischemia dopo un periodo di 1 mese di successiva astinenza quando la trascrizione di questi geni non è più alterata dalla metanfetamina. I nostri dati non escludono la possibilità che la metanfetamina induca cambiamenti epigenetici che fungono da "memoria" dell'esposizione alla metanfetamina e successivamente influenzino i cambiamenti trascrizionali indotti da un insulto ischemico. È necessario ulteriore lavoro per determinare se la metanfetamina induce cambiamenti epigenetici che alterano le risposte trascrizionali innescate dall'ischemia o da altre forme di stress cardiaco.

I cuori femminili erano significativamente più sensibili dei cuori maschili ai cambiamenti nell'espressione genica indotti dalla metanfetamina, sia in termini di numero di geni influenzati che di entità dei cambiamenti indotti dalla metanfetamina. Ciò potrebbe derivare dal fatto che il tasso di eliminazione della metanfetamina è inferiore nei ratti femmine rispetto ai ratti maschi, con conseguente maggiore esposizione delle femmine (in termini di area sotto la curva di concentrazione –) rispetto ai maschi a parità di dose del farmaco [45]. È stato riportato che la metanfetamina interrompe l'asse ipotalamo-ipofisi-ovaio nelle femmine [46]. Quindi, questa differenza di sesso potrebbe in alternativa essere secondaria a cambiamenti nella funzione dell'asse ipotalamo-ipofisi-ovaio, interruzione degli effetti cardioprotettivi degli estrogeni o a differenze di sesso nella risposta del cervello alla metanfetamina piuttosto che a un effetto diretto della metanfetamina sulla il cuore. Va notato che non tutti gli effetti cardiaci indotti dalla metanfetamina si verificano esclusivamente nei cuori femminili. Alcuni ricercatori hanno riferito che i maschi sono più suscettibili delle femmine alla cardiomiopatia indotta da metanfetamina [47, 48]. È necessario ulteriore lavoro per comprendere il meccanismo mediante il quale la metanfetamina induce effetti sesso-dipendenti nel miocardio.

La scoperta che il cuore femminile è più sensibile del cuore maschile ai cambiamenti nell'espressione genica indotti dalla metanfetamina è coerente con le differenze di sesso cardiaco precedentemente riportate. Il dimorfismo sessuale nei modelli di roditori di salute e malattia cardiovascolare è stato recentemente oggetto di un'ampia revisione [49]. Differenze sessuali al basale nell'attività dei canali ionici [50], nel metabolismo mitocondriale cardiaco [51], nell'espressione cardiaca delle proteine ​​di manipolazione del calcio [52�] e nelle differenze di sesso nella concentrazione di noradrenalina nel tessuto miocardico [55, 56] sono state riportato in roditori sani. Inoltre, il beneficio cardioprotettivo degli estrogeni è ben consolidato [57]. I cuori maschili sono più sensibili dei cuori femminili al danno ischemico miocardico [15, 58�]. È stato anche riportato che i roditori maschi hanno un rimodellamento cardiaco più disadattivo, un recupero più scarso della funzione ventricolare e tassi di sopravvivenza inferiori rispetto alle femmine a seguito di un infarto miocardico [61, 62]. Sono state riportate anche differenze di sesso nella risposta cardiaca al sovraccarico di pressione, al sovraccarico di volume e all'ipertrofia indotta da isoproterenolo [49]. Pertanto, le differenze sesso-dipendenti sia nella fisiologia cardiaca che nella fisiopatologia sono ben stabilite. La nostra scoperta che il trascrittoma cardiaco femminile è più sensibile del trascrittoma maschile agli effetti della metanfetamina amplia la nostra conoscenza delle differenze tra i sessi cardiaci.

Il sequenziamento dell'RNA ha identificato cambiamenti indotti dalla metanfetamina nel numero di trascritti cardiaci per diversi geni correlati al ritmo circadiano nel cuore femminile (Fig. ​ (Fig.3 3 ). La maggior parte di questi risultati sono stati replicati da qPCR (Fig. ​ (Fig.3 3 ). I dati qPCR per Per3 e Clock hanno dimostrato una tendenza nella stessa direzione dei dati di sequenziamento dell'RNA, ma l'effetto indotto dalla metanfetamina non ha raggiunto la significatività statistica per Per3 e Clock quando misurato mediante qPCR. Il sequenziamento dell'RNA ha identificato un aumento indotto dalla metanfetamina nel numero di trascrizioni di Dbp nei cuori femminili (Fig. ​ (Fig.3e) 3 e) ma nessun cambiamento nei cuori maschili. Al contrario, qPCR ha riscontrato un aumento significativo delle trascrizioni Dbp in entrambi i sessi (Fig. ​ (Fig.3f). 3 f). Non è chiaro il motivo per cui esiste una disparità tra questi due metodi di misurazione delle trascrizioni Dbp nei cuori maschili.

I geni che codificano Per2, BMALI e DBP sono regolati da meccanismi di feedback negativo in cui l'espressione della proteina sopprime la trascrizione del gene [63]. L'espressione è anche regolata da meccanismi dipendenti dall'ubiquitina che regolano i tassi di degradazione delle proteine ​​[64�]. Questi meccanismi determinano uno schema di espressione ciclico su un periodo di 24 ore. Sulla base del fatto che l'espressione di queste proteine ​​è strettamente controllata da meccanismi sia trascrizionali che proteolitici, non sorprende che i dati degli esperimenti di western blotting (Fig. ​ (Fig.4) 4) non rispecchiassero esattamente i cambiamenti osservati a il livello di trascrizione (Fig. ​ (Fig.3). 3 ). La valutazione dei geni dell'orologio circadiano (sia a livello di trascrizione che di proteine) in un solo punto temporale è una limitazione di questo studio.

La stragrande maggioranza dei cambiamenti nelle trascrizioni per i cuori sia maschili che femminili è stata osservata immediatamente dopo 10�ys di trattamento con metanfetamina (Fig. ​ (Fig.1a). 1 a). Tuttavia, sono stati identificati cambiamenti nelle trascrizioni di 6 geni aggiuntivi (3 nei cuori maschili e 3 nei cuori femminili) dopo un periodo di 30 giorni di successiva astinenza dalla metanfetamina. La maggior parte (5 su 6) di questi cambiamenti era di magnitudo inferiore a 2 volte (Fig. ​ (Fig.1b 1 b Tabella ​ Table4). 4 ). È interessante notare che tutti e 3 i cambiamenti osservati nei cuori maschili dopo 30  giorni di astinenza hanno coinvolto geni che regolano il ritmo circadiano e che nessun gene correlato al circadiano è stato alterato nei cuori femminili dopo 30  giorni di astinenza (Tabella ​ (Tabella 4) .4). Precedenti studi hanno documentato periodi prolungati di sonno disturbato negli esseri umani che in precedenza facevano uso di metanfetamine [68, 69]. Pertanto, ipotizziamo che le differenze di sesso nell'espressione di questi geni circadiani potrebbero riflettere alterazioni dipendenti dal sesso nei modelli di sonno associate all'interruzione della metanfetamina. È necessario ulteriore lavoro per comprendere il meccanismo e l'impatto fisiologico di questi cambiamenti.


7.19E: Regolazione della traduzione del fattore Sigma - Biologia

Negli ultimi decenni, Helicoverpa armigera il nucleopoliedrovirus (HearNPV) è stato ampiamente utilizzato per il controllo biologico del verme del cotone, che è uno degli insetti parassiti più distruttivi in ​​agricoltura in tutto il mondo. Tuttavia, il meccanismo molecolare alla base dell'interazione tra HearNPV e gli insetti ospiti rimane poco compreso. In questo studio, il sequenziamento dell'RNA ad alto rendimento è stato integrato con l'analisi proteomica quantitativa senza etichetta per esaminare la dinamica dell'espressione genica nel corpo grasso di H. armigera larve in risposta alla sfida con HearNPV. L'analisi trascrittomica basata sul sequenziamento dell'RNA ha indicato che l'espressione genica dell'ospite era sostanzialmente alterata, producendo 3.850 geni espressi in modo differenziale (DEG), mentre nel corpo grasso non sono stati osservati effetti di spegnimento trascrizionale globale. Tra i DEG, 60 geni correlati all'immunità sono stati down-regolati dopo l'infezione da baculovirus, una scoperta coerente con i risultati della RT-PCR quantitativa in tempo reale. L'ontologia genica e la classificazione funzionale hanno dimostrato che la maggior parte dei geni sottoregolati era arricchita in coorti di geni coinvolti nelle vie metaboliche dell'energia, dei carboidrati e degli amminoacidi. L'analisi proteomica ha identificato proteine ​​differenzialmente espresse nel corpo grasso, tra cui 76 erano up-regolate, mentre 373 erano significativamente down-regolate dopo l'infezione. Le proteine ​​​​down-regolate sono coinvolte in percorsi metabolici come il metabolismo energetico, il metabolismo dei carboidrati (CM) e il metabolismo degli amminoacidi, in accordo con i dati della sequenza di RNA. Inoltre, l'analisi di correlazione ha suggerito una forte associazione tra il livello di mRNA e l'abbondanza di proteine ​​nel H. armigera corpo grasso. Ancora più importante, la rete di interazione genica prevista ha indicato che un ampio sottoinsieme di reti metaboliche era regolato in modo significativamente negativo dall'infezione virale, inclusi enzimi correlati alla CM come aldolasi, enolasi, malato deidrogenasi e isomerasi trioso-fosfato. Presi insieme, i dati trascrittomici combinati con i dati proteomici hanno chiarito che il baculovirus ha stabilito un'infezione sistemica delle larve dell'ospite e ha manipolato l'ospite principalmente sopprimendo la risposta immunitaria dell'ospite e sottoregolando il metabolismo per consentire l'autoreplicazione e la proliferazione virale. Pertanto, questo studio ha fornito importanti informazioni sul meccanismo dell'interazione ospite-baculovirus.

Contributi dell'autore: Z.Z. e Z.H. ha progettato la ricerca L.X., C.Y., M.W., Z.L., B.S., Z.H. e Z.Z. eseguito l'esperimento L.X. e C.Y. analizzato i dati L.X., Z.H. e Z.Z. ha scritto il giornale.

Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca strategica prioritaria del CAS Grant XDB11030600, dal National Key Plan for Scientific Research and Development of China Grant 2016YFD0500300, dalla National Natural Science Foundation of China Grants 31472008 e 31672291 e dall'Open Research Fund Program dello State Key Laboratory of Integrated Gestione di insetti nocivi e roditori cinese IPM 1515.


RISULTATI

Caratterizzazione di rposTy19, Un naturale rpos allele mutante di S. tifi.

Durante una ricerca di rpos mutanti in isolati clinici di Salmonella (36 dati non mostrati), la nostra attenzione è stata attirata da S. Ceppo Typhi Ty19, un ceppo isolato dal sangue umano. S. Typhi Ty19 ha prodotto una bassa quantità di σ S (Fig. ​ (Fig.1, 1, corsia 2), rispetto agli isolati wild-type di S. Typhi (Fig. ​ (Fig.1, 1, corsia 1) (36). Sorprendentemente, Ty19 era resistente al perossido di idrogeno (H2oh2) in fase stazionaria (Fig. ​ (Fig.2A, 2A, colonne 1 e 3), un fenotipo dipendente da σ S (Fig. ​ (Fig.2A, 2A, colonne 1 e 5). La sequenza delle regioni promotrici e leader del rpos gene in Ty19 (rposTy19) era di tipo selvaggio, ma l'open reading frame conteneva una mutazione G/T in posizione 845, che ha provocato una sostituzione dell'amminoacido glicina-valina al residuo 282 (G282V) nel σ S Ty19 proteina.

Rilevamento di σ S e σ S Ty19 in S. Typhi (STY) e S. Typhimurium (STM). Le colture LB notturne a 37ଌ sono state analizzate mediante Western blotting con anticorpi anti-σ S. Una porzione 5-μg di proteine ​​totali è stata caricata in ogni slot. Corsie: 1, 5959 2, Ty19 3, Ty19K 4, 2922K 5, 2922Kcrl 6, 2922Krpos 7, 2922KrposTy19 8, 2922KrposTy19crl.

In vivo caratterizzazione del rposTy19 allele mutante. (da A a C) Resistenza al perossido di idrogeno di Salmonella ceppi che trasportano wild-type o rposTy19 alleli mutanti. (UN) S. ceppi di Typhi. Colonne: 1, 5959 2, 5959crl 3, Ty19 4, Ty19crl 5, Ty19K. (B) S. Ceppi Typhi 5959 (WT), Ty19, Ty19crle Ty19K. (C) S. Ceppi di Typhimurium 2922K (WT), 2922KΔcrl, 2922KrposTy19, 2922KrposTy19Δcrle 2922Krpos. Le cellule sono state fatte crescere in fase stazionaria in mezzo LB a 37ଌ, lavate, risospese in PBS ad un OD600 di 1 (A) e 0,1 (B e C), e H2oh2 È stato aggiunto 15 mM. I risultati di esperimenti rappresentativi sono mostrati nei pannelli B e C. Risultati simili sono stati ottenuti in esperimenti ripetuti. (D) Espressione di a katE-lacZ fusione genica in S. Typhimurium che trasporta il tipo selvatico rpos e mutante rposTy19 alleli. Colonne: 1, 2922KkatE-lacZ 2, 2922Krpos katE-lacZ 3, 2922Kcrl katE-lacZ 4, 2922KrposTy19 katE-lacZ 5, 2922KrposTy19crl katE-lacZ. L'attività della β-galattosidasi è stata misurata in colture LB notturne a 37ଌ secondo il metodo di Miller (27).

La proteina chaperone-simile Crl aumenta le prestazioni di σ S , ma il suo impatto sull'H2oh2 livello di resistenza di S. Typhimurium in fase stazionaria è difficilmente rilevabile in condizioni di crescita standard (37, 40). Più interessante, a crl mutazione ha influenzato la capacità di S. Typhi Ty19 per resistere a H2oh2 (Fig. ​ (Fig.2A, 2A, colonne da 3 a 4), mentre, come previsto, nessun effetto significativo della crl la mutazione è stata rilevata sull'H2oh2 livello di resistenza al ceppo 5959 (Fig. ​ (Fig.2A, 2A , colonne da 1 a 2), un S. Ceppo di Typhi wild-type per rpos (36). A bassa densità cellulare, l'effetto del crl mutazione su H2oh2 il livello di resistenza di Ty19 era drastico e non molto diverso da quello del rpos cancellazione (Fig. ​ (Fig.2B). 2B ). Questi risultati hanno suggerito che l'attività di σ S in Ty19 era più dipendente dall'attivazione di Crl rispetto al ceppo 5959.

L'attività di σ S Ty19 è fortemente dipendente da Crl.

Per caratterizzare il rposTy19 allele in uno sfondo altrimenti isogenico, il rpos gene da S. Typhimurium ATCC 14028 è stato sostituito dal rposTy19 allele, ceppo cedevole 2922KrposTy19. Come precedentemente osservato in S. Typhi, σ S Ty19 è stato rilevato in quantità inferiori rispetto alla proteina σ S wild-type (Fig. ​ (Fig.1, 1, corsie 4 e 7). È interessante notare che i livelli di H2oh2 la resistenza era più dipendente da Crl nel rposTy19 mutante rispetto al ceppo wild-type (Fig. ​ (Fig.2C). 2C). Coerentemente con questo risultato, il livello di espressione di a lacZ fusione genica in katE, un gene σ S -dipendente che codifica per una catalasi richiesta per H2oh2 resistenza di Salmonella in fase stazionaria (37), risente della crl mutazione nella rposTy19 mutante ma non nel ceppo wild-type (Fig. ​ (Fig.2D, 2D, colonne da 4 a 5 e colonne da 1 a 3). σ S Ty19 i livelli di produzione non sono stati abbassati in assenza di Crl (Fig. ​ (Fig.1, 1, corsie da 7 a 8). Questi risultati hanno suggerito che l'attività di σ S Ty19 era fortemente dipendente dall'attivazione di Crl. A bassa densità cellulare, il rposTy19 mutante era leggermente meno resistente a H2oh2 rispetto al ceppo wild-type (Fig. ​ (Fig.2C) 2C ) ed ha espresso il katE-lacZ fusione a livelli leggermente inferiori (Fig. ​ (Fig.2D 2D ).

In accordo con il in vivo dati, in vitro esperimenti di trascrizione utilizzando tre diversi promotori σ S-dipendenti—katE, katN, e vaiolo—ha dimostrato che l'attività del σ S Ty19 la proteina era inferiore, e molto più dipendente dall'attivazione di Crl, rispetto a quella della proteina S wild-type (Fig. ​ (Fig.3A). 3A). In questi saggi, l'aggiunta di Crl ha salvato σ S Ty19 attività ad un livello simile a quello ottenuto utilizzando la proteina σ S wild-type in assenza di Crl (Fig. ​ (Fig.3A). 3A). In conclusione, la sostituzione G282V in σ S Ty19 entrambi hanno diminuito l'attività di σ S e aumentato la sua dipendenza dall'attivazione di Crl.

In vitro caratterizzazione del rposTy19 allele mutante. (A) Trascrizioni di runoff a turno singolo di katE (corsie da 1 a 4), katN (corsie da 5 a 8), e vaiolo (corsie da 9 a 12) promotori. RNA polimerasi ricostituite con His6-σ S Ty19 (corsie 1 e 2, 5 e 6 e 9 e 10) o His6-σ S WT (corsie 3 e 4, 7 e 8 e 11 e 12) in assenza (corsie 1, 3, 5, 7, 9 e 11) o presenza di Crl (corsie 2, 4, 6, 8, 10 e 12) sono stati incubati con modelli plasmidici per 12 min a 30ଌ prima dell'aggiunta di una miscela di eparina e XTP come descritto in Materiali e metodi. I 32 trascritti marcati con P sono stati analizzati su un gel di sequenziamento 7% e le intensità di banda sono state quantificate come indicato sotto ciascuna corsia. (B) Esperimenti SPR in tempo reale che mostrano l'effetto di Crl (5 μM) sul legame di His6-σ S Ty19 (sinistra 625 nM) o His6-σ S WT (a destra 625 nM) al nucleo RNAP immobilizzato. I sensorgrammi mostrati in blu e ciano corrispondono al legame di σ S in assenza di Crl, e quelli in rosso e magenta corrispondono a quello in presenza di Crl. Nessun suo E-binding6-σ S Ty19 rilevabile in assenza di Crl.

σ S Ty19 dipende da Crl per il legame al core RNAP.

In vitro saggi di trascrizione hanno mostrato che l'attività di σ S Ty19 è compromessa e che questo difetto viene salvato da Crl (Fig. ​ (Fig.3A). 3A). Poiché Crl favorisce il legame di σ S all'enzima core E RNAP, una possibilità per spiegare questa scoperta è che Crl compensa una bassa propensione al legame E di σ S Ty19.

Studiare l'interazione tra σ S Ty19 ed E, abbiamo usato un saggio di risonanza plasmonica di superficie (SPR) che avevamo precedentemente impostato (12). Un anticorpo monoclonale specifico per il terminale C della subunità RNAP α (α-CTD che non svolge alcun ruolo nell'associazione di σ con E) è stato immobilizzato in modo covalente alla superficie destrano di un chip sensore e utilizzato per catturare E in modo non covalente.

Abbiamo osservato che, in assenza di Crl, nessun legame di σ S Ty19 (fino a 2,5 μM) a E potrebbe essere rilevato (Fig. ​ (Fig.3B). 3B). Al contrario, in presenza di Crl, la capacità di σ S Ty19 legarsi a E è stato ripristinato a un livello simile a quello osservato con la proteina σ S wild-type in assenza di Crl (Fig. ​ (Fig.3B), 3B), in accordo con il in vitro dati di trascrizione (Fig. ​ (Fig.3A). 3A). Complessivamente, questi risultati hanno mostrato che σ S Ty19 è alterato per il legame E e che questo difetto è alleviato da Crl.

G282 si trova in un anello flessibile nella regione 4 di σ S .

Gli allineamenti di sequenza di σ 70 membri della famiglia, a cui appartiene σ S, hanno rivelato che sono costituiti da quattro regioni conservate (regioni da 1 a 4, Fig. ​ Fig.4B) 4B ) (26, 29, 33). Tra questi, la regione 2 (sottoregioni da 2.1 a 2.4) e la regione 4 (sottoregioni 4.1 e 4.2) contengono domini di legame al DNA che mediano il riconoscimento degli elementi conservati � e � di σ 70 promotori dipendenti, rispettivamente. La divisione lineare di σ 70 fattori in regioni funzionalmente distinte è stata ampiamente confermata da dati strutturali, che hanno rivelato che i fattori sigma primari hanno quattro domini collegati in modo flessibile—σ1.1, σ2, σ3e σ4𠅌ontenenti regioni 1.1, 1.2-2.4, 3.0-3.1 e 4.1-4.2, rispettivamente (6, 7, 26, 29, 33) (Fig. ​ (Fig.4). 4 ). Il σ1.1 regione non è strutturata in tutte le strutture cristalline disponibili. Inoltre, il linker tra σ3 e σ4 corrisponde alla regione 3.2 (Fig. ​ (Fig.4). 4 ). Le regioni 2 e 4 non sono solo coinvolte nel legame al DNA, ma contengono anche determinanti critici per il legame delle subunità β′ e β dell'RNAP, rispettivamente (1, 29) (Fig. ​ (Fig.5A) .5A). La sostituzione G282V si trova nella regione 4 di σ S Ty19 (Fig. ​ (Fig.4B 4B ).

Crl si lega al dominio σ S 2. (A) Modello della struttura σ S. I domini strutturali σ2 (residui da 53 a 163), σ3 (residui da 164 a 216), linker (residui da 217 a 244) e σ4 (residui da 245 a 314) sono rappresentati rispettivamente in verde chiaro, giallo, arancione e blu. Il G282 è rappresentato in rosso. (B) Analisi BACTH delle interazioni Crl con σ S , σ S Ty19e proteine ​​σ S troncate.Nella parte superiore del pannello è mostrata una rappresentazione schematica delle quattro regioni della proteina σ S che mostrano una sequenza di amminoacidi altamente conservata con i membri della famiglia σ 70 (7, 26). Le efficienze della complementazione funzionale tra le proteine ​​ibride indicate sono state quantificate misurando le attività della β-galattosidasi in E. coli Cellule BTH101 che ospitano i plasmidi corrispondenti come descritto in Materiali e metodi. L'attività della β-galattosidasi è stata misurata secondo il metodo di Miller (27).

Posizione della sostituzione G282V che influenza l'interazione di σ S Ty19 con l'enzima core RNAP. (A) Struttura della modellata σ S posizionata nel T. termofilo nucleo enzimatico. Il αΙ, αIILe subunità , β, β′ e ω sono rappresentate rispettivamente in giallo pallido, beige, marrone, rosa e marrone chiaro. La regione corrispondente al lembo β è colorata in arancione e la regione corrispondente al dito di zinco β′ in ciano. (B) Vista ravvicinata dell'interazione tra l'enzima principale e σ4. Viene mostrata una valina nella posizione 282 di σ S .

Nell'oloenzima Eσ 70, la subunità σ si estende attraverso la faccia a monte dell'enzima, stabilendo ampi contatti con le subunità β e β′ dell'RNAP e con i suoi elementi di riconoscimento del DNA posizionati per contattare il promotore (29). Un dominio lembo flessibile della subunità β dell'RNAP (β-flap), interagisce con la regione 4 di σ 70 , coinvolgendo principalmente residui appartenenti all'ansa flessibile tra l'elica H2 e l'elica H3 di σ4, posizionando la regione 4.2 per interagire con l'elemento promotore �, il dominio 㬜-terminale e gli attivatori (11) (Fig. ​ (Fig.5). 5). Questa interazione dipende da un cerotto idrofobo su una faccia del breve tratto di elica situato sulla punta del dominio del lembo, chiamato β-elica del lembo (15). Il contatto tra il cerotto idrofobo β-lembo-punta elica e la regione idrofoba σ è essenziale per l'interazione stabile dell'elica β-punta lembo con l'ansa H2-H3. Il σ4 dominio (regione 4.1-4.2) è a forma di C, con una tasca concava ricoperta di residui idrofobici della regione 4.1. Nell'oloenzima, l'elica a punta lembo β si inserisce in questa tasca concava (Fig. ​ (Fig.5 5).

Nella struttura del modello σ S , basato sulla struttura di T. termofilo σ 70 (47), il residuo G282 si trova nella parte superiore dell'anello flessibile H2-H3 (residui L280-E289, Fig. ​ Fig.4A). 4A). Quando è agganciato a E, questo anello si trova in una fessura formata dal lembo β da un lato e dal dito di zinco β dall'altro lato (Fig. ​ (Fig.5). 5 ). È interessante notare che sia le sequenze β-flap che β′ della regione del dito di zinco sono altamente conservate tra Thermus thermophilus e Salmonella enterica. Al contrario, i residui corrispondenti a G282 in σ 70 sono un aspartato o una metionina, le cui catene laterali si adattano facilmente alla fessura E come osservato nella T. termofilo Eσ 70 oloenzima (47). La sostituzione G282V potrebbe interrompere direttamente l'interazione tra σ S ed E attraverso due diversi meccanismi. Innanzitutto, G282V potrebbe modificare la conformazione dell'anello H2-H3 aumentandone la rigidità e riducendo così la sua capacità di interagire con il lembo β. In secondo luogo, l'interazione dell'ansa con il lembo β potrebbe essere destabilizzata stericamente a causa della presenza della catena laterale di valina.

Crl si lega al dominio 2 di σ S .

Il dominio σ S coinvolto nel legame Crl era rimasto finora sconosciuto. Per comprendere meglio l'effetto della sostituzione G282V sull'interazione tra Crl e σ S , è stato utilizzato il sistema batterico a due ibridi (sistema BACTH [19]). In questo sistema, è stato dimostrato che le proteine ​​ibride T25-σ S e Crl-T18 interagiscono, producendo livelli di attività della β-galattosidasi superiori a quelli rilevati nei controlli negativi (Fig. ​ (Fig.4B) 4B ) (28). In precedenza abbiamo dimostrato che i primi 71 residui di σ S non erano necessari per il legame Crl poiché T25-σ S 72-330 e le chimere Crl-T18 hanno interagito in modo efficiente (28 e Fig. ​ Fig.4B). 4B). Il livello di attività β-galattosidasi rilevato con T25-σ S 72-330 era in realtà maggiore rispetto a T25-σ S , il che potrebbe essere dovuto alla maggiore espressione di T25-σ S 72-330 rispetto a T25-σ S , come rilevato mediante immunoblotting con un anticorpo policlonale σ S (28 dati non mostrati) (Fig. ​ (Fig.4B). 4B). Per il T25-σ S Ty19 chimera, anche i livelli di attività β-galattosidasi erano superiori a quelli della chimera T25-σ S (Fig. ​ (Fig.4B), 4B ), ma in questo caso la quantità di T25-&# x003c3 S Ty19 rilevato dall'anticorpo σ S era inferiore a quello di T25-σ S (dati non mostrati).

Per determinare se il dominio C-terminale di σ S interagisce con Crl, sono state valutate varianti troncate della chimera T25-σ S nel BACTH. Il T25-σ S 90-330, T25-σ S 169-330e T25-σ S 238-330 le chimere non hanno prodotto una significativa attività β-galattosidasi (Fig. ​ (Fig.4B), 4B), sebbene le quantità proteiche fossero simili a quelle del T25-σ S 72-330 chimera, come valutato mediante immunorilevamento con l'anticorpo σ S (dati non mostrati). Al contrario, le cinque chimere T25-σ S 1-254, T25-σ S 72-254, T25-σ S 1-167, T25-σ S 56-167e T25-σ S 72-167 hanno prodotto livelli di attività β-galattosidasi nel BACTH superiori a quelli rilevati con la chimera T25-σ S, dimostrando che erano in grado di interagire con la proteina Crl-T18 (Fig. ​ (Fig. 4B).4B). Queste chimere erano appena o non rilevabili dall'anticorpo policlonale σ S (dati non mostrati), suggerendo che le loro quantità erano basse o che queste chimere non reagivano in modo efficiente con l'anticorpo σ S. Complessivamente, questi risultati hanno dimostrato che gli amminoacidi da 72 a 167 in σ S sono sufficienti per l'interazione con Crl. È interessante notare che la sostituzione G282V in T25-σ S 90-330 e T25-σ S 238-330 non ha permesso loro di interagire con Crl-T18 (Fig. ​ (Fig.4B). 4B). Quindi, questa sostituzione probabilmente favorisce l'interazione di T25-σ S Ty19 con Crl-T18 indirettamente, attraverso cambiamenti conformazionali di T25-σ S Ty19.

RposTy19 conferisce idoneità agonistica a Salmonella, condizionato al crl stato della popolazione batterica.

Una probabile ipotesi per spiegare l'aspetto del rposTy19 allele in isolati naturali di S. Typhi è che questo allele mutante conferisce un'idoneità competitiva. Abbiamo precedentemente impostato un test di sopravvivenza con popolazioni miste di Salmonella in cui il Δcrl mutazione ha aumentato l'idoneità competitiva di Salmonella in fase stazionaria (40). Abbiamo usato questo test per valutare l'idoneità competitiva dei ceppi che trasportano il rposTy19 allele.

Due ceppi di Salmonella sono stati miscelati in numeri uguali di cellule nel mezzo liquido LB e il numero di ciascuno è stato monitorato per diversi giorni (Fig. ​ (Fig.6B). 6B). Il rposTy19 il mutante ha mostrato un vantaggio competitivo durante la fase stazionaria rispetto al ceppo di tipo selvatico ATCC 14028 (Fig. 6Bc). Due giorni dopo l'inoculazione del terreno, rposTy19 le cellule mutanti rappresentavano più di 80% della popolazione totale. Tuttavia, il guadagno di fitness offerto dal rposTy19 l'allele è stato perso in una popolazione portatrice di una delezione del crl gene. Infatti, in Δcrl contesto, ceppi che trasportano rposTy19 l'allele è stato superato dai ceppi portatori di un wild-type rpos allele (Fig. 6Bd). In modo simile, il Δrpos mutante è stato superato dal ceppo wild-type (40) (Fig. ​ (Fig.6B, 6B, pannello b), suggerendo che il guadagno di fitness offerto dal rposTy19 mutazione è condizionata dalla presenza di crl. Viceversa, il Δcrl mutante ha anche mostrato un vantaggio competitivo rispetto al ceppo wild-type (Fig. 6Be), ma questo guadagno di fitness è stato perso nelle popolazioni portatrici del rposTy19 allele (Fig. 6Bf e h ). Negli esperimenti di controllo, il ceppo selvatico ATCC 14028 ha mostrato una fitness simile a quella del ceppo selvatico 2922K (Fig. 6Ba), e le cartucce di resistenza Km o Cm, ospitate da alcuni ceppi, non hanno avuto effetto (Fig. 6Ba eg) (40). Infine, non abbiamo osservato differenze significative quando abbiamo confrontato la capacità dei ceppi wild-type e mutanti di sopravvivere in monocolture nelle stesse condizioni (Fig. ​ (Fig.6A 6A).

Sopravvivenza e idoneità agonistica di Salmonella deformazioni durante la fase stazionaria. (A) Sopravvivenza in colture in fase stazionaria in mezzo LB a 37ଌ. Cellule da colture LB notturne di S. Typhimurium (a) e S. I ceppi di Typhi (b) sono stati lavati, risospesi in PBS ad un OD600 di 1,0, diluito in terreno LB fresco e incubato a 37ଌ con agitazione. Aliquote di batteri sono state rimosse a intervalli di tempo e il numero di cellule vitali è stato determinato su piastre LB. La sopravvivenza del cento per cento corrisponde al numero di cellule nelle colture coltivate durante la notte (giorno 1). Vengono mostrati i risultati di esperimenti rappresentativi. Risultati simili sono stati ottenuti in esperimenti ripetuti. (B) Saggi di concorrenza tra S. Typhimurium (da a a g) e S. ceppi di Typhi (h). Le colture LB durante la notte sono state lavate e risospese in PBS ad un OD600 di 1.0. In ciascuno degli otto esperimenti, i due ceppi indicati sono stati miscelati in numero uguale di cellule in terreno LB fresco per dare un totale di circa 3.000 cellule ml 𢄡 (tempo zero), e le miscele sono state incubate a 37ଌ con agitazione. Aliquote di batteri sono state rimosse a intervalli di tempo e sono stati determinati i numeri di cellule vitali di ciascun ceppo. Il numero di cellule di ciascun ceppo è riportato come percentuale del numero totale di cellule vitali nella coltura.


7.19E: Regolazione della traduzione del fattore Sigma - Biologia

Un singolo gene umano può potenzialmente produrre una gamma diversificata di isoforme di mRNA alternative, ampliando così sia il repertorio dei prodotti genici che, di conseguenza, il numero di proteine ​​alternative prodotte. Gli mRNA con diverse combinazioni di esoni sono trascritti dalla maggior parte (fino al 90%) dei geni umani e possono generare varianti che differiscono nelle regioni regolatorie non tradotte o codificare proteine ​​con diverse localizzazioni e funzioni subcellulari 1 – 5 . Modelli di splicing alterati sono stati suggeriti come un nuovo segno distintivo delle cellule tumorali 6 – 8 e nel cancro alla prostata stanno emergendo prove che l'espressione di specifiche isoforme di mRNA derivate da geni rilevanti per il cancro può contribuire alla progressione della malattia 9 – 11 .

Gli ormoni androgeni steroidei e il recettore degli androgeni (AR) svolgono un ruolo chiave nello sviluppo e nella progressione del cancro alla prostata, con lo splicing alternativo che consente alle cellule tumorali di produrre AR costitutivamente attivi 11 – 13 . L'AR appartiene alla superfamiglia dei recettori nucleari dei fattori di trascrizione ed è essenziale per la sopravvivenza, la proliferazione e l'invasione delle cellule del cancro alla prostata 14 – 16 . Classicamente, il legame degli androgeni promuove la dimerizzazione dell'AR e la sua traslocazione nel nucleo, dove agisce come attivatore trascrizionale o repressore trascrizionale per dettare modelli di espressione genica specifici della prostata 17 – 23 . L'obiettivo principale delle terapie per il cancro alla prostata è stato quello di ridurre i livelli di androgeni attraverso la terapia di deprivazione degli androgeni (ADT), sia con inibitori della sintesi degli androgeni (ad esempio, abiraterone) sia con antagonisti che impediscono il legame degli androgeni all'AR (come la bicalutamide o l'enzalutamide) 24. Sebbene l'ADT sia di solito inizialmente efficace, la maggior parte dei pazienti alla fine sviluppa una malattia letale resistente alla castrazione per la quale ci sono opzioni di trattamento limitate 11, 12.

Anche gli androgeni e altri ormoni steroidei sono stati associati allo splicing alternativo. Una recente analisi basata sul sequenziamento dell'RNA della risposta degli androgeni delle cellule di cancro alla prostata coltivate in vitro e all'interno di pazienti dopo ADT ha identificato un insieme di 700 geni la cui trascrizione è regolata dall'AR nelle cellule di cancro alla prostata 25 . Tuttavia, oltre a regolare i livelli trascrizionali, i recettori degli ormoni steroidei possono controllare il contenuto dell'esone dell'mRNA 10 , 26 – 29 . Nel cancro alla prostata gli androgeni possono modulare l'espressione delle isoforme dell'mRNA tramite l'elaborazione del pre-mRNA e la selezione del promotore 9, 10, 18, 30. L'AR può reclutare le proteine ​​leganti l'RNA Sam68 e p68 come cofattori per influenzare lo splicing alternativo di geni specifici, e studi che utilizzano minigeni guidati da promotori responsivi agli steroidi indicano che l'AR può influenzare sia l'attività trascrizionale che lo splicing alternativo di un sottoinsieme di geni bersaglio 11 , 31 , 32 . Anche altri ormoni steroidei coordinano le decisioni di trascrizione e di splicing 29 . È noto che il recettore dell'ormone tiroideo (TR) svolge un ruolo nel coordinare la regolazione della trascrizione e dello splicing alternativo 27 e il recettore degli estrogeni (ER) può sia regolare la selezione di promotori alternativi che indurre lo splicing alternativo di specifici set di geni che possono influenzare il cancro al seno comportamento delle cellule 28 , 33 – 35 .

Nel lavoro precedente abbiamo utilizzato l'analisi di microarray a livello di esone per identificare 7 cambiamenti dipendenti dagli androgeni nell'espressione dell'isoforma dell'mRNA 10 . Tuttavia, non è chiaro fino a che punto le isoforme di mRNA regolate dagli androgeni siano espresse nel cancro alla prostata clinico. Per risolvere questo problema, qui abbiamo utilizzato i dati di sequenziamento dell'RNA per profilare globalmente l'espressione di isoforme alternative nelle cellule di cancro alla prostata esposte agli androgeni e correlato i risultati con i dati trascrittomici dal tessuto clinico. I nostri risultati aumentano di 10 volte il numero di isoforme di mRNA regolate dall'AR e implicano che l'elaborazione del pre-mRNA è un meccanismo importante attraverso il quale gli androgeni regolano l'espressione genica nel cancro alla prostata.

La coltura cellulare era come descritto in precedenza 25, 36. Tutte le cellule sono state coltivate a 37ଌ in 5% CO 2. Le cellule LNCaP (CRL-1740, ATCC) sono state mantenute in RPMI-1640 con L-Glutammina (PAA Laboratories, R15-802) integrata con 10% di siero fetale bovino (FBS) (PAA Laboratories, A15-101). Per il trattamento con androgeni delle cellule, il terreno è stato integrato con FBS striato di carbone di destrano al 10% (PAA Laboratories, A15-119) per produrre un terreno privo di steroidi. Dopo la coltura per 72 ore, è stato aggiunto l'analogo sintetico dell'androgeno 10 nM metiltrienolone (R1881) (Perkin-Elmer, NLP005005MG) (Androgeno +) o assente (Steroid deplete) per i tempi indicati.

L'analisi dell'espressione del trascritto RNA-seq dei dati precedentemente generati 25 è stata eseguita secondo il protocollo Tuxedo 37 . Tutte le letture sono state prima mappate al trascrittoma/genoma umano (build hg19) con TopHat 38 /Bowtie 39, seguito dall'assemblaggio della trascrizione per campione con gemelli 40. I dati mappati sono stati elaborati con Cuffmerge, Cuffdiff e Cuffcompare, seguiti dall'estrazione di geni/isoforme espressi in modo significativamente differenziato, sono stati valutati i cambiamenti di espressione tra cellule cresciute con androgeni e cellule cresciute senza androgeni. I file di riferimento per il genoma umano (UCSC build hg19) sono stati scaricati dalle pagine dei gemelli: (è stato utilizzato il pacchetto UCSC-hg19 di giugno 2012). Le versioni software utilizzate per l'analisi sono state: TopHat v1.4.1, SAM tools Version: 0.1.18 (r982:295), bowtie versione 0.12.8 (64 bit) e gemelli v1.3.0 (collegati alla versione Boost 104000). Il protocollo Tuxedo 37 è stato eseguito come segue: Per i passaggi 1𠄵, nessun parametro (ad eccezione dei percorsi dei file di input/output) è stato modificato. Nel passaggio 15, sono stati utilizzati interruttori aggiuntivi -s, -R e -C durante l'esecuzione di cuffcompare. I passaggi 16� (estrazione di risultati significativi) sono stati eseguiti sulla riga di comando.

Estrazione dell'RNA, RT–PCR e PCR in tempo reale

Le cellule sono state raccolte e l'RNA totale estratto utilizzando TRIzol (Invitrogen, 15596-026) secondo le istruzioni del produttore. L'RNA è stato trattato con DNasi 1 (Ambion, AM2222) e il cDNA è stato generato mediante trascrizione inversa di 500 ng di RNA totale utilizzando il kit di sintesi di cDNA Superscript VILO (Invitrogen, 11754-050). Gli eventi alternativi sono stati analizzati mediante PCR con trascrittasi inversa o PCR in tempo reale. I profili di esone sono stati monitorati e quantificati utilizzando il sistema di elettroforesi capillare Qiaxcel (Qiagen) e l'inclusione percentuale è stata calcolata come descritto in precedenza 10 . La PCR in tempo reale è stata eseguita in triplicato su cDNA utilizzando SYBR® Green PCR Master Mix (Invitrogen, 4309155) e il sistema QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific). I campioni sono stati normalizzati utilizzando la media di tre geni di riferimento, GAPDH, β -tubulina e actina. I valori Ct per ciascun campione sono stati calcolati utilizzando il software SDS 2.4 (Applied Biosystems) e l'espressione relativa dell'mRNA è stata calcolata utilizzando il metodo 2-Δ㥌t. Tutte le sequenze di primer sono elencate nella tabella supplementare 1 . I valori Ct grezzi sono forniti nel set di dati 1 41 .

Nello studio sono stati utilizzati i seguenti anticorpi commerciali: monoclonale di coniglio anti-RLN2 (Abcam, ab183505 diluizione 1:1000), anticorpo policlonale di coniglio anti-TACC2 (11407-1-AP, diluizione Proteintech 1:500), policlonale di coniglio anti-NDUFV3 anticorpo (13430-1-AP, Proteintech diluizione 1:500), policlonale di coniglio anti-actina (A2668, diluizione Sigma 1:2000), monoclonale di topo anti-α-Tubulina (Sigma, diluizione T5168 1:2000), normale IgG di coniglio (711-035-152, Jackson labs diluizione 1:2000) e IgG di topo normale (715-036-150, Jackson labs diluizione 1:2000).

L'analisi dell'ontologia genica (GO) dei dati RNA-Seq è stata eseguita come descritto in precedenza 42 . L'arricchimento dei termini GO (con annotazioni b500) è stato calcolato utilizzando il pacchetto goseq R (versione 1.18.0). I geni sono stati considerati significativi a una soglia del valore p di 0,05 dopo aggiustamento utilizzando il tasso di falsa scoperta di Benjamini-Hochberg.

Analisi bioinformatica dei dati del trascrittoma dei pazienti

Dati clinici ed elaborati RNA-Seq disponibili dalla coorte di adenocarcinoma prostatico (PRAD) The Cancer Genome Atlas (TCGA), comprendente 497 campioni di tumore di altrettanti pazienti con diversi stadi/gradi di Gleason e 52 campioni corrispondenti prelevati da tessuto prostatico normale (sono stati scaricati da il Broad Institute TCGA Genome Analysis Center (Firehose 16/01/28 run https://doi.org/10.7908/C11G0KM9 43). I dati del trascrittoma della coorte TCGA PRAD sono stati analizzati per l'espressione di isoforme alternative, con modelli di trascrizione che si basano su TCGA GAF2 .1, corrispondente all'annotazione del genoma dell'Università della California, Santa Cruz (UCSC) del giugno 2011 (assemblea hg19). Questa annotazione comprendeva 42 delle 73 coppie di isoforme di mRNA alternative regolate da androgeni identificate. Queste sono state studiate utilizzando due tipi di analisi: 1) espressione differenziale del trascritto tra tumore e tessuto prostatico normale e 2) correlazione tra espressione isoforme in campioni di tumore e punteggio di Gleason o stadio del tumore.

L'analisi differenziale dell'isoforma e dell'espressione genica è stata eseguita sui conteggi di lettura stimati utilizzando il pacchetto software limma R (versione 3.7) seguendo il flusso di lavoro dell'analisi RNA-Seq44. Questo flusso di lavoro è stato utilizzato anche per l'analisi del rapporto di isoforma differenziale, basandosi sul rapporto trasformato in logit (vedi sotto). Come soglia per la significatività dell'espressione differenziale è stato utilizzato un valore p aggiustato per FDR di 0,05 per le statistiche t moderate. L'espressione delle singole isoforme è stata stimata in TPM (trascrizioni per milione di letture mappate). Il rapporto di espressione, d'ora in poi chiamato PSI (percent spliced-in), di ciascuna coppia di isoforme regolata dagli androgeni annotata in ciascun campione TCGA è stato calcolato come il rapporto tra l'espressione dell'isoforma 1 e l'espressione totale delle isoforme 1 e 2 combinate, ovvero il somma delle loro espressioni. Per ogni coppia di isoforme, ΔPSI è la differenza del PSI mediano tra il tumore e i gruppi di campioni normali.

I test di correlazione per ranghi di Spearman a due code sono stati utilizzati per studiare l'associazione tra l'espressione dell'isoforma e sia il punteggio di Gleason che lo stadio del tumore (questi sono stati usati qui come variabili numeriche). Come soglia di significatività è stato utilizzato un valore p aggiustato per FDR di 0,05. Le differenze di espressione delle isoforme tra campioni tumorali e campioni normali sono state considerate equivalenti a quelle rilevate nelle cellule LNCaP sotto stimolazione con androgeni quando c'era un cambiamento coerente statisticamente significativo nei livelli dell'isoforma indotta o repressa prevista (1 o 2), concomitante con nessun cambiamento contraddittorio in il PSI. Isoform “switch” sono stati considerati equivalenti quando c'era un minimo (ΔPSI > 2,5%) e un cambiamento coerente statisticamente significativo nel PSI. Sono stati utilizzati criteri equivalenti per valutare l'equivalenza tra la dipendenza da androgeni e le associazioni con il punteggio di Gleason e lo stadio del tumore.

Le analisi statistiche sono state condotte utilizzando il software GraphPad Prism (versione 5.04/d). La quantificazione mediante PCR delle isoforme dell'mRNA è stata valutata utilizzando il test t di student non appaiato.

I dati sono presentati come media di tre campioni indipendenti ± errore standard della media (SEM). La significatività statistica è indicata come * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 e **** p ≤ 0,0001.

Risultati L'identificazione globale della produzione di isoforme di mRNA androgeno-dipendente nelle cellule del cancro alla prostata prevede un ruolo importante per l'utilizzo di promotori alternativi

Abbiamo analizzato i dati RNAseq precedentemente pubblicati dalle cellule LNCaP 25 per profilare a livello globale la frequenza con cui gli androgeni guidano la produzione di isoforme di mRNA alternative nelle cellule del cancro alla prostata. Questa analisi ha identificato un gruppo di 73 isoforme di mRNA alternative regolate da androgeni, che potrebbero essere convalidate mediante visualizzazione su UCSC Genome Browser 45 (Tabella 1). 64 isoforme di mRNA regolate da AR erano nuove per questo studio. La convalida sperimentale in una serie di campioni di RNA indipendente utilizzando RT-PCR ha confermato 17/17 di questi eventi alternativi a livello di mRNA (Figura 1 supplementare). Il 73% dei geni (53/73) con isoforme alternative dell'mRNA regolate dagli androgeni identificate ha anche cambiato i loro livelli di espressione complessivi in ​​risposta agli androgeni (Tabella 2). Alcuni degli eventi alternativi regolati dagli androgeni si trovano nei geni e sono già implicati nel cancro alla prostata o in altri tipi di cancro (riassunti nella Tabella 3). Tuttavia, l'analisi di Gene Ontology di questi 73 geni non ha identificato alcun processo biologico significativamente arricchito.

Le 73 isoforme di mRNA identificate sono state generate tramite l'utilizzo regolato dagli androgeni di 56 promotori alternativi, 4 estremità 3′ alternative e 13 eventi di splicing alternativi (Figura 1A). Dei 56 promotori alternativi regolati dagli androgeni identificati, 23 promotori alternativi sono stati indotti dagli androgeni (incluso LIG4, Figura 1B), 26 promotori sono stati repressi dagli androgeni e per 7 geni c'è stato un passaggio nell'uso da un promotore all'altro (Tabella 1). Gli eventi di splicing alternativi che erano sotto il controllo degli androgeni includevano 12 esoni alternativi e una ritenzione di introni regolata dagli androgeni (Tabella 1). 10 di questi sono nuovi per questo studio, inclusa l'esclusione di un esone alternativo in ZNF678 (Figura 1C). Degli esoni alternativi, sei geni contenevano interruttori in esoni codificanti proteine ​​precedentemente non annotati in risposta all'esposizione agli androgeni. Abbiamo anche identificato quattro interruttori dell'isoforma di estremità 3' dell'mRNA alternativo regolati da androgeni, incluso un interruttore nell'estremità 3’ della trascrizione dell'mRNA per il gene MAT2A (Figura 1D).

Figura 1. L'identificazione globale della produzione di isoforme di mRNA androgeno-dipendente nelle cellule del cancro alla prostata prevede un ruolo importante per l'utilizzo di promotori alternativi.

(A) L'analisi dei dati RNAseq da cellule LNCaP cresciute con (A+) o senza androgeni (R1881) (steroide esaurito, SD) per 24 ore ha identificato 73 isoforme di mRNA alternative regolate dagli androgeni. I 73 eventi alternativi sono stati generati tramite l'utilizzo regolato dagli androgeni di 56 promotori alternativi, 4 estremità 3' alternative e 13 eventi di splicing alternativi. (B) Gli androgeni guidano un interruttore del promotore nel gene LIG4, che produce un'isoforma di mRNA con un 5’UTR alternativo. La visualizzazione delle letture RNA-seq delle nostre cellule LNCaP per il gene LIG4 sul browser del genoma UCSC ha identificato un passaggio dal promotore 1 al promotore alternativo 2 nelle cellule cresciute in presenza di androgeni. Si prevede che il promotore 2 produca un diverso 5’UTR senza influenzare la sequenza proteica (pannello di sinistra). La PCR quantitativa che utilizza primer specifici per ciascun promotore indica che in risposta agli androgeni c'è repressione del promotore 1 e induzione del promotore 2 (pannello di destra). (C) Gli androgeni guidano lo splicing alternativo del gene ZNF678. La visualizzazione delle letture RNA-seq delle nostre cellule LNCaP per il gene ZNF678 sul browser del genoma UCSC ha identificato un passaggio all'inclusione di un esone della cassetta in presenza di androgeni. Si prevede che l'inclusione dell'esone cassetta alternativo nel gene ZNF678 induca un passaggio a un'isoforma di mRNA non codificante alternativa (pannello di sinistra). La PCR quantitativa che utilizza primer negli esoni fiancheggianti ha confermato una maggiore inclusione dell'esone alternativo nelle cellule LNCaP esposte agli androgeni (pannello di destra). (D) Gli androgeni promuovono la selezione di un'estremità 3’ alternativa per il gene MAT2A. La visualizzazione delle letture RNA-seq delle nostre cellule LNCaP per il gene MAT2A sul browser del genoma UCSC indica un passaggio all'utilizzo ridotto di un'estremità 3’ alternativa in presenza di androgeni (pannello di sinistra). La PCR quantitativa utilizzando primer specifici per ciascuna isoforma ha confermato la down-regulation di un'estremità 3’ alternativa (p<0.01). Si prevede che le estremità alternative 3’ per il gene MAT2A producano proteine ​​con diverse sequenze di amminoacidi e influenzino un dominio Pfam noto (pannello di destra).

Gli eventi regolati dagli androgeni controllano la produzione di isoforme proteiche alternative, RNA non codificanti e UTR 5' alternativi

Si prevede che 48/73 (66%) degli eventi alternativi regolati dagli androgeni rilevati in risposta alla stimolazione degli androgeni cambino la sequenza amminoacidica della proteina risultante (Tabella 1). Alcuni di questi sono già noti per avere un ruolo ben caratterizzato nella progressione del cancro alla prostata, incluso un promotore alternativo nell'oncogene TPD52 che produce un'isoforma proteica chiamata PrLZ ( Figura 2A ) 46 – 49 . Altri non sono così ben caratterizzati. Usando il western blotting potremmo rilevare una nuova isoforma proteica più corta corrispondente alla selezione guidata dagli androgeni di un promotore alternativo nel gene TACC2 (Figura 2B) e l'esclusione di un esone a cassetta nel gene NDUFV3, che mostriamo produce anche una nuova isoforma proteica più corta (Figura 2C). Abbiamo anche rilevato un interruttore nell'estremità 3' della trascrizione dell'mRNA per il gene MAT2A, che si prevede produca un'isoforma proteica con un dominio C-terminale più corto (Figura 1D) e l'induzione di un'isoforma 3' alternativa di CNNM2, che si prevede che manchi un dominio CBS conservato (Tabella 1 e Figura 1 supplementare).

Figura 2. Gli interruttori delle isoforme dell'mRNA regolati dagli androgeni controllano le isoforme proteiche alternative e gli RNA non codificanti.

( A ) Gli androgeni inducono un promotore alternativo nell'oncogene TPD52 che produce un'isoforma chiamata PrLZ. La visualizzazione delle letture RNA-seq delle nostre cellule LNCaP per il gene TPD52 sul browser del genoma UCSC ha identificato un passaggio dal promotore 1 al promotore alternativo 2 nelle cellule cresciute in presenza di androgeni. È noto che il promotore 2 produce un'isoforma proteica alternativa di TPD52 nota come PrLZ (pannello di sinistra). La PCR quantitativa che utilizza primer specifici per ciascun promotore indica un'induzione dell'isoforma PrLZ in risposta agli androgeni (pannello centrale). PrLZ ha una sequenza amminoacidica N-terminale alternativa che si traduce in un'isoforma proteica alternativa e interrompe un dominio Pfam noto (pannello di destra). (B) Gli androgeni inducono un promotore alternativo nel gene TACC2 che produce una nuova isoforma proteica alternativa. La visualizzazione delle letture RNA-seq delle nostre cellule LNCaP per il gene TACC2 sul browser del genoma UCSC ha identificato un passaggio dal promotore 1 al promotore alternativo 2 nelle cellule cresciute in presenza di androgeni. Si prevede che il promotore 2 produca un'isoforma proteica alternativa più corta di TACC2 (isoforma 2) (pannello di sinistra). La PCR quantitativa che utilizza primer specifici per ciascun promotore indica un passaggio dall'isoforma 1 all'isoforma 2 in risposta agli androgeni (pannello centrale). Rilevazione della proteina TACC2 in LNCaP mediante western blotting (le cellule sono state coltivate con o senza androgeni per 24 o 48 ore). La tubulina è stata utilizzata come controllo del carico. L'esposizione agli androgeni per 48 ore induce l'espressione dell'isoforma proteica alternativa TACC2 (pannello di destra). ( C ) Gli androgeni guidano lo splicing alternativo del gene NDUFV3. La visualizzazione delle letture RNA-seq delle nostre cellule LNCaP per il gene NDUFV3 sul browser del genoma UCSC ha identificato un passaggio all'esclusione di un esone della cassetta in presenza di androgeni (pannello di sinistra). La PCR quantitativa che utilizza primer negli esoni fiancheggianti ha confermato una minore inclusione dell'esone alternativo nelle cellule LNCaP esposte agli androgeni (pannello centrale). Si prevede che l'esclusione dell'esone cassetta alternativo produca un'isoforma proteica alternativa. Rilevazione della proteina NDUFV3 nelle cellule LNCaP mediante western blotting (pannello di destra). (D) Gli androgeni sopprimono un promotore alternativo nel gene RLN2, che produce un'isoforma di mRNA non codificante più corta. La visualizzazione delle letture RNA-seq delle nostre cellule LNCaP per il gene RLN2 sul browser del genoma UCSC ha identificato un passaggio dal promotore 1 al promotore alternativo 2 nelle cellule cresciute in presenza di androgeni. Si prevede che il promotore 2 produca un'isoforma di mRNA non codificante non tradotta (pannello di sinistra). La PCR quantitativa che utilizza primer specifici per ciascun promotore ha indicato un cambiamento significativo nell'uso del promotore in risposta agli androgeni (pannello centrale). Rilevazione della proteina RLN2 in LNCaP mediante western blotting (le cellule sono state coltivate con o senza androgeni per 48 ore). L'actina è stata utilizzata come controllo del carico. Come visto in precedenza 55 , gli androgeni sopprimono i livelli di proteina RLN2.

11 dei rimanenti eventi alternativi regolati da androgeni identificati cambiano l'espressione di mRNA da codificanti a non codificanti o non tradotti (non si prevede che producano una proteina) (Tabella 1). Questi includevano interruttori promotori per i geni RLN1 e RLN2 che codificano per ormoni peptidici che possono essere importanti nel cancro alla prostata 5 , 50 – 55 . Gli androgeni guidano un interruttore del promotore sia in RLN1 che in RLN2 per produrre isoforme di mRNA non codificanti o non tradotte previste, riducendo l'espressione delle isoforme di mRNA RLN1 e RLN2 codificanti proteine. Per verificare se le cellule del cancro alla prostata disattivano l'espressione genica passando dall'utilizzo di promotori che generano mRNA codificanti e non codificanti, abbiamo analizzato i livelli di proteina RLN2. Coerentemente con la nostra ipotesi e uno studio precedente 55, la produzione di proteine ​​RLN2 è stata regolata negativamente dagli androgeni in parallelo al passaggio all'isoforma dell'mRNA non codificante (Figura 2D).

14 delle isoforme di mRNA androgeno-dipendenti identificate portano/risultano nella codifica di mRNA con regioni 5’ alterate non tradotte (5′ UTR) senza alcun impatto sulla sequenza codificante. Questi includono un interruttore del promotore nel gene LIG4 (Figura 1B).

Espressione differenziale di isoforme di mRNA androgeno-dipendenti nell'adenocarcinoma prostatico rispetto al tessuto normale

Per studiare i potenziali collegamenti tra le isoforme di mRNA androgeno-dipendenti e la tumorigenesi, abbiamo analizzato l'espressione di 41 coppie di isoforme di mRNA regolate dagli androgeni nell'adenocarcinoma prostatico clinico e nei tessuti normali della prostata. Questa analisi ha utilizzato i dati trascrittomici di 497 campioni di tumore e 52 campioni normali nella coorte PRAD TCGA104. Le restanti coppie di isoforme identificate nel nostro set di dati non sono state precedentemente annotate da UCSC, quindi non è stato possibile includerle nel nostro confronto. Una descrizione della coorte utilizzata è riassunta nella Tabella 4 .

Tabella 4. Descrizione della coorte TCGA PRAD.

Caratteristiche Casi totali
Coorte 497 pazienti
Tumore 497
Normale 52 (con tumore abbinato
campione disponibile)
Grado di Gleason
6 50
7 287
8 67
9 140
10 4
Stadio del tumore
T2a 14
T2b 10
T2c 192
T3a 173
T3b 140
T4 12
Grado di gleason (grado di gleason alternativo
raggruppamento)
1 (primario +
punteggio secondario ≤ 6)
50
2 (3 + 4) 171
3 (4 + 3) 123
4 (4 + 4) 93
5 (primario +
punteggio secondario ≥ 9)
111

Tutti i tumori erano naive agli ormoni (non soggetti a ADT) al momento della raccolta del campione

33 delle 42 coppie di isoforme di mRNA hanno mostrato differenze significative nell'espressione di almeno una delle isoforme, o nel rapporto di espressione delle isoforme tra tumore e tessuti normali (Tabella 5). 13 di queste alterazioni specifiche del tumore imitavano l'effetto della stimolazione degli androgeni nelle cellule LNCaP: i cambiamenti erano in forma di promotori alternativi per TACC2, TPD52, NUP93, PIK3R1, RDH13, ZFAND6, CDIP1, YIF1B, LIMK2 e FDFT1 un'alternativa 3 x00b4 termina in CNNM2 ed esoni alternativi in ​​NDUFV3 e SS18 (Figura 3, Tabella 5 e Figura 2 supplementare). Si prevede che due dei promotori alternativi ( ZFAND6 e CDIP1 ) introducano un cambiamento nel 5′UTR, mentre si prevede che tutti gli altri alterino l'isoforma proteica risultante. Un certo numero di isoforme di mRNA che rispondevano agli androgeni nelle cellule LNCaP hanno mostrato alterazioni specifiche del tumore opposte all'effetto della stimolazione degli androgeni. Questi erano LIG4, MAPRE2, OSBPL1A, SEPT5, NR4A1 e RCAN1 (tutti previsti per alterare l'isoforma proteica risultante eccetto LIG4). Per le restanti 14 coppie di isoforme di mRNA, i dati erano inconcludenti secondo le condizioni di consistenza elencate nella sezione dei metodi (Tabella 5).

Violin-boxplot dell'espressione nelle trascrizioni per milione di letture mappate (TPM) delle Isoforme 1 (pannello sinistro) e 2 (pannello centrale) e del loro rapporto di espressione in PSI (pannello destro) in campioni normali e tumorali. Per entrambe le isoforme (pannello sinistro e centrale) sono mostrati il ​​log2 fold-change medio (logFC) nell'espressione tra i campioni tumorali e quelli normali e il valore p aggiustato per FDR associato per la statistica t moderata dell'espressione differenziale. Sono mostrati la differenza media di PSI (deltaPSI) tra campioni tumorali e campioni normali e il valore p aggiustato per FDR associato per il test U di Mann-Whitney di splicing differenziale (pannello di destra).

Cambiamenti nell'espressione dell'isoforma dell'mRNA androgeno-dipendente durante la progressione del tumore

Successivamente abbiamo studiato se le isoforme di mRNA androgeno-dipendenti identificate sono espresse in modo differenziale durante la progressione del cancro alla prostata correlando i livelli di espressione di ciascuna isoforma con i punteggi di Gleason e i gradi del tumore alla prostata all'interno della coorte PRAD TCGA (Figura 4 e Figura 5, Tabella 6 e Tabella 7 e Figura 3 supplementare e Figura 4 supplementare). Per 6 delle isoforme di mRNA alternative sensibili agli androgeni (realizzate da promotori alternativi in ​​LIG4, OSBPL1A, CLK3, TSC22D3 e ZNF32 e utilizzando un esone alternativo in ZNF121), l'espressione è cambiata significativamente con il punteggio di Gleason e ha mostrato alterazioni specifiche coerenti con l'effetto di stimolazione degli androgeni. Al contrario, 9 isoforme alternative (che rispondevano agli androgeni nelle cellule LNCaP) hanno mostrato alterazioni specifiche del tumore opposte all'effetto della stimolazione degli androgeni (incluso un promotore alternativo in NUP93 e l'alternativa 3୎nd di MAT2A). 3 isoforme di mRNA regolate dagli androgeni ( OSBPL1A , CLK3 e TSC22D3 ) cambiano significativamente sia con il grado di Gleason che con lo stadio del tumore.

Figura 4. Espressione differenziale dell'isoforma di mRNA alternativa nella coorte TGCA PRAD attraverso diversi gradi di Gleason per OSBPL1A, CLK3, TSC22D e ZNF121.

Violin-boxplot dell'espressione nelle trascrizioni per milione di letture mappate (TPM) delle Isoforme 1 (pannello sinistro) e 2 (pannello centrale) e del loro rapporto di espressione (pannello destro) per grado Gleason. Sono mostrati i rispettivi coefficienti di correlazione di Spearman (Rho) con il grado e il valore p aggiustato per FDR associato.

Figura 5. Espressione differenziale dell'isoforma di mRNA alternativa nella coorte TGCA PRAD in diversi stadi del tumore per OSBPL1A, CLK3 e TSC22D3.

Violin-boxplot dell'espressione nelle trascrizioni per milione di letture mappate (TPM) delle Isoforme 1 (pannello sinistro) e 2 (pannello centrale) e del loro rapporto di espressione (pannello destro) per stadio del tumore. Sono mostrati i rispettivi coefficienti di correlazione di Spearman (Rho) con lo stadio e il valore p aggiustato per FDR associato.

La funzione principale del recettore degli androgeni (AR) è come fattore di trascrizione legante il DNA che regola l'espressione genica. Qui vi mostriamo che l'AR può accoppiare la trascrizione genica indotta dall'ormone all'espressione alternativa dell'isoforma di mRNA nel cancro alla prostata. In risposta agli androgeni, l'AR può indurre l'uso di promotori alternativi, indurre l'espressione di isoforme di mRNA splicing alternativo, regolare l'espressione di trascritti di mRNA non codificanti e promuovere la trascrizione di isoforme di mRNA che codificano diverse isoforme proteiche. È importante sottolineare che troviamo anche che alcune di queste isoforme di mRNA alternative sono regolate in modo differenziale nel cancro alla prostata rispetto al tessuto normale e cambiano anche significativamente l'espressione durante la progressione del tumore. I nostri dati suggeriscono che la maggior parte delle isoforme di mRNA alternative regolate dagli androgeni sono generate attraverso la selezione di promotori alternativi piuttosto che attraverso meccanismi di splicing dell'esone alternativo interno. Ciò suggerisce che l'espressione di isoforme alternative di geni specifici può essere una conseguenza del reclutamento di RNA polimerasi a diversi promotori in risposta alla stimolazione degli androgeni. L'utilizzo di promotori alternativi è stato osservato per molti geni e si ritiene che svolga un ruolo significativo nel controllo dell'espressione genica 4, 105, 106. L'uso di promotori alternativi può anche generare isoforme di mRNA con attività funzionali distinte dallo stesso gene, a volte con funzioni opposte 11 .

L'esposizione agli androgeni guida ulteriormente un numero minore di eventi di splicing alternativi, suggerendo che l'AR potrebbe contribuire a modelli alterati di splicing nelle cellule del cancro alla prostata. Si ritiene che la progressione del tumore sia associata a un cambiamento coordinato nei modelli di splicing che è regolato da diversi fattori tra cui le molecole di segnalazione 7 . Abbiamo anche identificato 4 interruttori di isoforma di estremità mRNA 3′ alternativi regolati AR.Questa è la prima volta che è stato dimostrato che la regolazione dell'elaborazione finale dell'mRNA 3′ è controllata dagli androgeni. La selezione di estremità 3′ alternative può produrre isoforme di mRNA che differiscono nella lunghezza delle loro UTR 3′ (che possono portare all'inclusione o all'esclusione di elementi regolatori e influenzare l'espressione genica), o nella loro regione codificante C-terminale (che può contribuire alla diversità del proteoma) 107 – 114 . L'elaborazione difettosa dell'mRNA 3′ di numerosi geni è stata collegata a un fenotipo oncogenico 115 – 119 e i profili finali dell'mRNA 3′ dei campioni di più tipi di cancro differiscono significativamente da quelli dei campioni di tessuto sano 115 , 119 – 121.

Sulla base dei risultati presentati in questo studio, proponiamo che l'AR attivato abbia la capacità di coordinare sia l'attività trascrizionale che le decisioni sull'isoforma dell'mRNA attraverso il reclutamento di co-regolatori a promotori specifici. L'azione genomica dell'AR è influenzata da un gran numero di fattori di trascrizione che collaborano 122 – 124 . In particolare, è stato dimostrato che Sam68 e p68 modulano lo splicing alternativo AR dipendente di geni specifici e sono significativamente sovraespressi nel cancro alla prostata 31,32. In futuro sarà importante definire il ruolo di specifici co-regolatori AR nella selezione delle isoforme AR mediata.

Si prevede che alcune delle isoforme dell'mRNA androgeno-dipendenti identificate qui producano isoforme proteiche che possono essere clinicamente importanti o che spengano la produzione di proteine ​​tramite la generazione di isoforme dell'mRNA non codificante. Sebbene il significato funzionale delle isoforme alternative dell'mRNA identificate in questo studio sia ancora in gran parte inesplorato, così come il loro ruolo nella risposta cellulare agli androgeni, i risultati presentati sottolineano l'importanza dell'analisi della regolazione e della funzione genica a livello dell'isoforma dell'mRNA.

I dati a cui fa riferimento questo articolo sono protetti da copyright con la seguente dichiarazione di copyright: Copyright: � 2018 Munkley J et al.

I dati associati all'articolo sono disponibili secondo i termini della rinuncia ai dati Creative Commons Zero "Nessun diritto riservato" (CC0 1.0 Dedica di pubblico dominio).

I dati RNASeq dalle cellule LNCaP sono stati pubblicati in precedenza https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2016.04.018 25

Le tracce personalizzate RNAseq sono disponibili nel file supplementare 1 . Per visualizzare questi file, caricali sul sito Web UCSC utilizzando la scheda ‘My data’ e 𠆌ustom track’. Quindi ‘Incolla URL o dati’. I dati sono allineati a febbraio 2009 (GRCh37/hg19).

I dati RNA-Seq della coorte di adenocarcinoma prostatico sono stati scaricati dal Broad Institute TCGA Genome Analysis Center: Firehose 16/01/28 run https://doi.org/10.7908/C11G0KM9 43

Set di dati 1: valori Ct grezzi PCR in tempo reale 10.5256/f1000research.15604.d212873 41

Set di dati 2: immagini western blot grezze non modificate 10.5256/f1000research.15604.d212874 125


(III) Acidi nucleici che codificano per endonucleasi guidate da RNA o proteine ​​di fusione

Un altro aspetto della presente divulgazione fornisce acidi nucleici che codificano una qualsiasi delle endonucleasi guidate da RNA o proteine ​​di fusione descritte sopra nelle sezioni (I) e (II), rispettivamente. L'acido nucleico può essere RNA o DNA. In una forma di realizzazione, l'acido nucleico che codifica per l'endonucleasi o la proteina di fusione RNA-guidata è mRNA. L'mRNA può essere 5' tappato e/o 3' poliadenilato. In un'altra forma di realizzazione, l'acido nucleico che codifica per l'endonucleasi o la proteina di fusione RNA-guidata è DNA. Il DNA può essere presente in un vettore (vedi sotto).

L'acido nucleico che codifica per l'endonucleasi o la proteina di fusione RNA-guidata può essere ottimizzato come codone per una traduzione efficiente in proteina nella cellula eucariotica o nell'animale di interesse. Ad esempio, i codoni possono essere ottimizzati per l'espressione in esseri umani, topi, ratti, criceti, mucche, maiali, gatti, cani, pesci, anfibi, piante, lieviti, insetti e così via. I programmi per l'ottimizzazione dei codoni sono disponibili come freeware. Sono disponibili anche programmi commerciali di ottimizzazione dei codoni.

In alcune forme di realizzazione, il DNA che codifica per l'endonucleasi o la proteina di fusione RNA-guidata può essere collegato operativamente ad almeno una sequenza di controllo del promotore. In alcune iterazioni, la sequenza codificante del DNA può essere operativamente collegata a una sequenza di controllo del promotore per l'espressione nella cellula eucariotica o nell'animale di interesse. La sequenza di controllo del promotore può essere costitutiva, regolata o tessuto-specifica. Sequenze di controllo del promotore costitutivo adatte includono, ma non sono limitate a, promotore immediato precoce del citomegalovirus (CMV), promotore del virus delle scimmie (SV40), promotore ritardato maggiore dell'adenovirus, promotore del virus del sarcoma di Rous (RSV), promotore del virus del tumore mammario del topo (MMTV), promotore della fosfoglicerato chinasi (PGK), promotore del fattore di allungamento (ED1)-alfa, promotori dell'ubiquitina, promotori dell'actina, promotori della tubulina, promotori delle immunoglobuline, loro frammenti o combinazioni di uno qualsiasi dei precedenti. Esempi di sequenze di controllo del promotore regolate adatte includono senza limiti quelle regolate da shock termico, metalli, steroidi, antibiotici o alcol. Esempi non limitativi di promotori tessuto-specifici includono promotore B29, promotore CD14, promotore CD43, promotore CD45, promotore CD68, promotore desmina, promotore elastasi-1, promotore endoglin, promotore fibronectina, promotore Flt-1, promotore GFAP, promotore GPIIb, Promotore ICAM-2, promotore INF-β, promotore Mb, promotore Nphsl, promotore OG-2, promotore SP-B, promotore SYN1 e promotore WASP. La sequenza del promotore può essere di tipo selvatico o può essere modificata per un'espressione più efficiente o efficace. In una forma di realizzazione esemplificativa, il DNA codificante può essere collegato operativamente a un promotore di CMV per l'espressione costitutiva in cellule di mammifero.

In alcune forme di realizzazione, la sequenza codificante l'endonucleasi o la proteina di fusione RNA-guidata può essere operativamente collegata a una sequenza promotrice che è riconosciuta da una RNA polimerasi fagica per la sintesi di mRNA in vitro. In tali forme di realizzazione, l'RNA trascritto in vitro può essere purificato per l'uso nei metodi dettagliati di seguito nelle sezioni (IV) e (V). Ad esempio, la sequenza del promotore può essere una sequenza del promotore T7, T3 o SP6 o una variazione di una sequenza del promotore T7, T3 o SP6. In una forma di realizzazione esemplificativa, il DNA che codifica per la proteina di fusione è operativamente legato a un promotore T7 per la sintesi dell'mRNA in vitro utilizzando l'RNA polimerasi T7.

In forme di realizzazione alternative, la sequenza codificante l'endonucleasi o la proteina di fusione RNA-guidata può essere operativamente collegata a una sequenza promotrice per l'espressione in vitro dell'endonucleasi o della proteina di fusione RNA-guidata in cellule batteriche o eucariotiche. In tali forme di realizzazione, la proteina espressa può essere purificata per l'uso nei metodi dettagliati di seguito nelle sezioni (IV) e (V). Promotori batterici adatti includono, senza limiti, promotori T7, promotori lac operone, promotori trp, loro variazioni e loro combinazioni. Un promotore batterico esemplare è tac che è un ibrido di promotori trp e lac. Esempi non limitativi di promotori eucariotici adatti sono elencati sopra.

In ulteriori aspetti, il DNA che codifica per l'endonucleasi o la proteina di fusione RNA-guidata può anche essere collegato a un segnale di poliadenilazione (ad es. segnale polyA SV40, segnale polyA dell'ormone della crescita bovino (BGH), ecc.) e/o almeno una terminazione trascrizionale sequenza. Inoltre, la sequenza che codifica per l'endonucleasi o la proteina di fusione RNA-guidata può anche essere collegata alla sequenza che codifica almeno un segnale di localizzazione nucleare, almeno un dominio di penetrazione cellulare e/o almeno un dominio marcatore, che sono dettagliati sopra nella sezione (IO).

In varie forme di realizzazione, il DNA che codifica per l'endonucleasi o la proteina di fusione RNA-guidata può essere presente in un vettore. Vettori adatti includono vettori plasmidici, fagemidi, cosmidi, mini-cromosomi artificiali, trasposoni e vettori virali (ad esempio vettori lentivirali, vettori virali adeno-associati, ecc.). In una forma di realizzazione, il DNA che codifica per l'endonucleasi o la proteina di fusione RNA-guidata è presente in un vettore plasmidico. Esempi non limitativi di vettori plasmidici adatti includono pUC, pBR322, pET, pBluescript e loro varianti. Il vettore può comprendere ulteriori sequenze di controllo dell'espressione (ad es. sequenze di potenziamento, sequenze di Kozak, sequenze di poliadenilazione, sequenze di terminazione trascrizionale, ecc.), sequenze di marcatori selezionabili (ad es. geni di resistenza agli antibiotici), origini di replicazione e simili. Ulteriori informazioni possono essere trovate in "Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003 o "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY , 3a edizione, 2001.

In alcune forme di realizzazione, il vettore di espressione che comprende la sequenza codificante l'endonucleasi o la proteina di fusione RNA-guidata può comprendere inoltre la sequenza codificante un RNA guida. La sequenza codificante l'RNA guida generalmente è operativamente collegata ad almeno una sequenza di controllo trascrizionale per l'espressione dell'RNA guida nella cellula o embrione di interesse. Ad esempio, il DNA che codifica per l'RNA guida può essere collegato operativamente a una sequenza promotrice che è riconosciuta dalla RNA polimerasi III (Pol III). Esempi di promotori di Pol III adatti includono, ma non sono limitati a, promotori di RNA U6, U3, H1 e 7SL di mammifero.


Metodi

Animali sperimentali

Tutti gli esperimenti hanno utilizzato topi femmina C57BL/6J, di età compresa tra 6 e 12 settimane, del Jackson Laboratory. Il comitato per la cura e l'uso degli animali del Jackson Laboratory (ACUC) ha approvato tutti gli esperimenti.

MA9 Produzione del surnatante retrovirale

Il surnatante retrovirale è stato generato come descritto 20 . In breve, la trasfezione transitoria di piastre da 10 cm di cellule HEK293T con 10 μg di pMSCV-IRES-MLL-AF9-GFP 20 e 10 μg di vettore di imballaggio ecotropico è stata eseguita utilizzando un kit di trasfezione di fosfato di calcio (Invitrogen). Dopo 24 ore, i terreni sono stati sostituiti con terreni di crescita freschi. Il surnatante retrovirale è stato raccolto 24 ore dopo, filtrato attraverso un filtro per siringa in polivinilidendifluoruro da 0,45 μm e utilizzato direttamente per la trasduzione delle cellule primarie.

Isolamento delle cellule primarie e infezione retrovirale

Sospensioni unicellulari di midollo osseo sono state preparate filtrando femori, tibie e creste iliache frantumati e raggruppati da ciascun topo. Le cellule mononucleate del midollo osseo sono state isolate mediante centrifugazione a densità di Ficoll-Paque (GE Healthcare) e la deplezione del lignaggio è stata eseguita utilizzando il Biotin Mouse Lineage Panel (BD Biosciences), compresi gli anticorpi contro CD3ɛ, CD11b, B220, Gr-1 e Ter-119, con streptavidina M-280 dynabeads (Invitrogen). Le cellule del midollo osseo impoverito del lignaggio sono state colorate con una combinazione di cloni di anticorpi coniugati con fluorocromo da eBioscience o BD Biosciences: c-Kit (clone 2B8), Sca-1 (clone E13-161.7), CD150 (clone mShad150), CD34 (clone RAM34), FcγR (clone 2.462), mix di marcatori di lignaggio maturo (Lin) (B220, CD11b, CD4, CD8, Ter-119, Gr-1) e la colorazione di vitalità ioduro di propidio (PI). Le cellule colorate sono state ordinate utilizzando un FACSAria con software Diva (BD) in base ai seguenti profili di marker di superficie: LT-HSC (Lin - Sca-1 + c-Kit + CD150 + CD34 -/lo ), ST-HSC (Lin - Sca -1 + c-Kit + CD150 + CD34 + ), MPP (Lin − Sca-1 + c-Kit + CD150 − CD34 + ), CMP (Lin − Sca-1 − c-Kit + CD150 − CD34 + FcγR lo ) e GMP (Lin − Sca-1 − c-Kit + CD150 − CD34 + FcγR + ). La purezza delle cellule ordinate è risultata essere ≥95%. Per la trasduzione, le cellule sono state sospese in un surnatante retrovirale fresco integrato con siero fetale di vitello al 10% (Sigma), 100 ng ml -1 fattore di cellule staminali murine (mSCF), 10 ng ml -1 mIL-3, 10 ng ml -1 mIL- 6 (Peprotech) e 4 μg ml -1 polibrene, filato a 2.500 rpm per 1 h a 32 °C, quindi trasferito in incubatore a 37 °C e 5% CO2. Le cellule sono state raccolte dopo 24 ore e risospese in un surnatante retrovirale fresco per una seconda spininfezione, come sopra. 24 ore dopo la seconda spinfezione, le cellule GFP+ sono state smistate da FACSAria e piastrate in in vitro coltura o direttamente trapiantato in vivo.

In vitro coltura di cellule MA9-trasformate

Le cellule GFP+ sono state piastrate nel metodo GF M3434 (Stem Cell Technologies). Dopo 7 giorni di coltura, le colonie sono state contate e raggruppate, quindi 10 4 cellule sono state ripiastrate nello stesso terreno. Per il terzo ciclo di coltura, sono state piastrate 5 × 10 3 cellule. Alla fine del terzo round, singole colonie sono state prelevate dalla metilcellulosa e trasferite in una coltura liquida contenente Iscove's Modified Dulbecco's Media (IMDM) (Invitrogen) con siero fetale di vitello al 10% (Sigma), 50 ng ml -1 mSCF, 10 ng ml - 1 ml-3 e 10 ng ml -1 ml-6 (Peprotech). Le colture sono state mantenute a una densità ≤1 × 10 6 cellule per ml a 37 ° C e 5% CO2.

In vivo trapianto

I topi riceventi sono stati irradiati subletalmente (600 rad, 137 Cs) e iniettati per via endovenosa con 10 3 , 10 4 o 10 5 cellule da linee cellulari di leucemia primaria, o 500 cellule primarie trasdotte con GFP.

Analisi di topi leucemici

I topi riceventi trapiantati sono stati monitorati ogni 4 settimane mediante prelievo di sangue periferico e emocromo differenziale utilizzando un analizzatore ematologico automatico KX21-N (Sysmex). I topi che mostravano un elevato numero di globuli bianchi e un peggioramento dello stato di salute sono stati sacrificati e sono stati prelevati sangue periferico, milza e midollo osseo. Sospensioni unicellulari di sangue periferico, milza e midollo osseo sono state analizzate mediante citometria a flusso per l'espressione di GFP (BD FACS Calibur) e il midollo osseo è stato colorato con anticorpi coniugati con fluorocromo contro c-Kit (clone 2B8), Sca-1 (clone E13-161.7), CD150 (clone mShad150), CD34 (clone RAM34), FcγR (clone 2.462) e mix di marcatori di lignaggio maturo (Lin) (B220, CD11b, CD4, CD8, Ter-119 e Gr-1) per valutare frequenza di LSC (L-GMP GFP + Lin − Sca-1 − c-Kit + CD150 − CD34 + FcγR + ) utilizzando un LSRII (BD). I dati della citometria a flusso sono stati analizzati utilizzando il software FlowJo (TreeStar).

Costruzione e analisi della libreria RNA-seq

50.000 cellule di leucemia di massa (GFP +) dalla milza dei topi riceventi sono state smistate direttamente in 350 μl di tampone RLT (Qiagen) e congelate. Inoltre, il topo primario ST-HSC (3.000-10.000), MPP (10.000-100.000), CMP (8.000-50.000) e GMP (10.000-50.000) sono stati isolati come descritto sopra, ordinati direttamente in 350 μl di tampone RLT e flash -congelato. Sono stati campionati da tre a sei repliche biologiche indipendenti di cellule leucemiche bulk e cellule normali. L'RNA totale è stato isolato secondo i protocolli del produttore (Qiagen) incluso il trattamento con DNasi e la qualità è stata valutata utilizzando un kit Agilent 2100 Bioanalyzer e RNA 6000 Nano. I campioni di RNA sono stati elaborati utilizzando il kit NuGen Ovation RNA-Seq V2. Il DNA complementare amplificato è stato tagliato a circa ∼ 300 bp utilizzando un ultrasuoni focalizzato Covaris E220. La preparazione della libreria RNA-seq ha utilizzato il kit di preparazione del campione TruSeq DNA v2 (Illumina). Il DNA tagliato è stato riparato all'estremità per generare frammenti con estremità smussate. La purificazione con perline magnetiche è stata utilizzata per arricchire il DNA riparato all'estremità che era >100 bp. I frammenti purificati erano muniti di coda ad "A" e legati ad adattatori a Y Illumina contenenti una sporgenza a "T" e indici unici per il multiplexing. I frammenti legati sono stati purificati su sfere magnetiche seguite da amplificazione PCR per fornire sequenze compatibili con le celle di flusso Illumina alle estremità. I prodotti della PCR sono stati purificati utilizzando sfere magnetiche seguite dall'analisi della distribuzione dimensionale QC utilizzando il bioanalizzatore Agilent 2100 e il test del chip DNA 1000. La dimensione media della libreria era di 350 bp con dimensioni degli inserti ∼ 230 bp. La PCR quantitativa utilizzando il kit Library Quantitation (Kapa Biosystems) è stata utilizzata per stimare le concentrazioni della libreria. Le librerie sono state sequenziate sulla piattaforma Illumina HiSeq 2000 a una profondità di sequenziamento di >35 milioni di letture per campione. Le abbondanze del trascritto sono state stimate per ciascun campione RNA-seq utilizzando RSEM 44 . Il grafico PCA per visualizzare la somiglianza nei profili del trascrittoma è stato calcolato dopo aver normalizzato i dati di conteggio della media tagliata di trasformazione log dei valori M (TMM)45. I dendrogrammi RNA-seq non radicati sono stati generati dai coefficienti di correlazione di Pearson derivati ​​dai conteggi di lettura normalizzati (trasformati in log2) e visualizzati con APE as.phylo(). Le lunghezze dei bordi risultanti sono state normalizzate per la leggibilità. I conteggi di lettura stimati per ciascun gene da RSEM sono stati forniti come input al pacchetto R edgeR per l'analisi dell'espressione differenziale 46 . I geni differenzialmente espressi sono stati raggruppati utilizzando l'algoritmo di partizione k-medioide disponibile nel cluster del pacchetto R 47 . Il valore di k è stato scelto in base al numero di confronti che hanno portato a raggruppare geni espressi in modo differenziale con un tasso di falsa scoperta<5%. I profili di espressione genica raggruppati sono stati visualizzati utilizzando la funzione heatmap.2 nei gplot del pacchetto R. Nelle popolazioni con più di 2 repliche, abbiamo scelto di visualizzare la coppia con la maggiore correlazione. Varianti a singolo nucleotide e piccole inserzioni e delezioni sono state identificate utilizzando FreeBayes, un rilevatore di varianti genetiche bayesiana 22 . Le varianti rilevate utilizzando questo metodo sono state filtrate in base alla profondità di lettura e alla qualità della mappatura per ridurre il tasso di falsi positivi 23 . Gli SNP germinali identificati nei topi C57BL/6 utilizzando la risorsa SNP 24 del Sanger Institute e gli SNP identificati in uno qualsiasi dei nostri dati RNA-seq delle cellule normali corrispondenti sono stati rimossi. Per testare il significato clinico della nostra firma di espressione genica derivata da ST-HSC rispetto a quella derivata da progenitori nei dati dei pazienti con LMA umana, abbiamo utilizzato le firme di espressione genica TCGA di 200 adulti de novo Pazienti con LMA 21 . Il significato prognostico di ciascun gene è stato calcolato classificando i campioni di TCGA in due gruppi in base al profilo di espressione del gene. Un campione con un livello di espressione superiore a una soglia (mediana + 0,5 × pazza) è stato considerato alto e l'espressione al di sotto della soglia (mediana-0,5 × pazza) è stata considerata bassa. Il modello di rischio proporzionale di Cox è stato utilizzato per testare l'associazione tra il livello di espressione del gene e l'esito clinico.

PCR in tempo reale

La PCR semi-quantitativa in tempo reale è stata eseguita utilizzando RT2 SYBR Green mix (Qiagen) su un ABI Biosystems 7500 e i valori di Ct sono stati normalizzati ai livelli di GAPDH. I primer utilizzati sono stati: Gapdh: 5′-CGTCCCGTAGACAAAATGGT-3′ e 5′-CTCCTGAAAGATGGTGATGG-3′, MA9: 5′-TGTGAAGCAGAAATGTGTGG-3′ e 5′-TGCCTTGTCACATTCACCAT-3′.

Costruzione e analisi della libreria ATAC-seq

Campioni di milza leucemica crioconservata e/o midollo osseo sono stati scongelati e FACSAria (BD) ha selezionato 50 K cellule di leucemia bulk (GFP+) o LSC (L-GMP GFP+ Lin- Sca-1-c-Kit+ CD34+ FcγR+). I campioni sono stati posti a 37 °C e 5% CO2 in IMDM più siero fetale di vitello al 10% per 30 minuti, quindi raccolte, lavate con 1 × PBS e le librerie ATAC-seq sono state preparate come descritto in precedenza 27 . La PCR quantitativa utilizzando il kit Library Quantitation (Kapa Biosystems) è stata utilizzata per stimare le concentrazioni della libreria. Le librerie sono state sequenziate sulla piattaforma Illumina HiSeq 2000 generando letture accoppiate 2 × 150 bp a una profondità di sequenziamento di 30-50 milioni di letture per campione. Le letture sono state allineate all'assieme del mouse mm9 utilizzando bowtie2.Solo le letture mappate in modo univoco al genoma sono state utilizzate nelle analisi successive. Le letture duplicate sono state eliminate per evitare potenziali artefatti di amplificazione della PCR e per eliminare i duplicati del DNA mitocondriale. Il filtraggio post-allineamento ha prodotto ∼ 20-30 milioni di letture singleton allineate in modo univoco per libreria. I campioni con <10 milioni di letture allineate in modo univoco sono stati considerati rumorosi e sono stati esclusi dall'analisi. I picchi ATAC-seq in ciascun campione sono stati identificati utilizzando MACS2 48 con le seguenti impostazioni: MACS2-2.1.0.20140616/bin/macs2 callpeak -t &lfile tag input> -f BED -n <file picco output> -g 'mm' --nomodel -- shift -100 --extsize 200 -B -largo. L'annotazione dei picchi è stata eseguita tramite HOMER v4.6 annotatePeaks.pl per l'assieme mm9. Le librerie ATAC-seq pubblicate in precedenza dalle popolazioni LSK, CMP e GMP sono state scaricate da GEO (GEO: GSE59992) 25 ed elaborate come descritto sopra. La presentazione della mappa di calore della correlazione del tipo di cellula è stata calcolata tramite la matrice di correlazione di Pearson dei punteggi di picco di HOMER, in seguito alla fusione di replicati intersecati tra bedtools e visualizzata con heatmap di gplots.2(). I dati ATAC-seq sono stati visualizzati sul browser del genoma UCSC 49 (http://genome.ucsc.edu/) con l'assemblaggio del mouse mm9, insieme ai file del letto dall'analisi ChIP-seq di H3K4me1 e H3K27ac nel midollo osseo di topo C57BL/6 ( ENCODE) 28 e H3K27ac in una linea cellulare AML murina MA9/Nras G12D (RN2) (GEO GSM1262348) 29 . Il sottoinsieme di dati RNA-seq sul punteggio di picco ATAC-seq del promotore ha utilizzato log2(FPKM+1) ed è stato generato dalla funzione edcf().

Analisi dei potenziatori della LMA umana e della metilazione del DNA

Il sollevamento dei picchi di cromatina aperti specifici della cellula di origine dal topo (mm9) al genoma umano (hg19) è stato eseguito utilizzando lo strumento liftOver UCSC. Questi loci sono stati valutati per il potenziale dell'enhancer rispetto al database dell'enhancer FANTOM5 34,35 e ai dati ChIP-seq H3K27ac della linea cellulare MA9 umana MOLM14 (GEO GSM1587893) 36 utilizzando Bedtools. Per valutare il significato prognostico dello stato di metilazione del DNA che circonda questi loci, sono state esaminate regioni di ±10 kb dal centro di ciascun picco aperto di cromatina. Tutte le sonde CpG sull'array Infinium 450 K Human Methylation BeadChip che rientravano in queste regioni sono state testate individualmente per il significato prognostico nei dati TCGA AML umani 21 . Lo stato di metilazione di ciascun campione, per ciascuna sonda, è stato classificato come elevato (?>0.8), parziale (0.2<?<0.8) o basso (?<0.2). Il modello di rischio proporzionale di Cox è stato utilizzato per testare l'associazione tra lo stato di metilazione e l'esito clinico.

Analisi statistiche

Per la sopravvivenza globale, è stato eseguito il test log-rank (Mantel-Cox) sulle curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier. È stato scelto un minimo di cinque topi per tipo di campione e dose cellulare per rilevare un rapporto di rischio di >3 con una potenza dell'80% con un tasso di errore del 5%. Sulla base di criteri prestabiliti, gli animali sono stati esclusi dall'analisi se non hanno dimostrato > 1% di cellule GFP+ rilevabili nel sangue periferico entro 1 mese dal trapianto. I topi riceventi sono stati randomizzati per quale linea cellulare o tipo di cellula AML primaria sono stati trapiantati. L'analisi dei topi non è stata accecata durante l'esperimento. L'analisi della diluizione limite è stata eseguita con il software ELDA 50 . L'analisi statistica dei dati di non sopravvivenza è stata eseguita mediante un'analisi della varianza non parametrica unidirezionale (test di Kruskal-Wallis) seguita dal test dei confronti multipli di Dunn o dall'analisi della varianza a due vie seguita dal test dei confronti multipli di Tukey. Per questi esperimenti, è stato scelto un minimo di 3 campioni per condizione per rilevare differenze statistiche con potenza >80% con un tasso di errore del 5%. La varianza era simile tra i gruppi che sono stati confrontati statisticamente. Il calcolo del coefficiente di correlazione di Pearson è stato utilizzato per calcolare la somiglianza complessiva tra i trascrittomi RNA-seq o le firme globali aperte della cromatina ATAC-seq. di Pearson ? Sono stati utilizzati 2 test per determinare il significato dell'arricchimento dei dati prognostici da TCGA umano pubblicato de novo dati AML.

Disponibilità dei dati

I dati RNA-seq e ATAC-seq possono essere trovati in GEO con il numero di accesso GSE74691. Tutto l'altro codice pertinente è disponibile presso gli autori su richiesta.