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In che modo le proteine ​​di membrana trovano le loro posizioni target?

In che modo le proteine ​​di membrana trovano le loro posizioni target?



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La domanda potrebbe essere posta per qualsiasi tipo di proteina "legata", ma vorrei limitarla alle proteine ​​di membrana.

Supponendo che le proteine ​​di membrana (o le loro parti principali) non si costruiscano (o non lo siano) sul posto ma a una certa distanza dalla membrana, mi chiedo con quali meccanismi viaggino dal loro sito di generazione alla loro destinazione finale all'interno della membrana (interna o esterna).

Le proteine ​​che sono distribuite approssimativamente uniformemente (o casualmente) sulla membrana non pongono un grosso problema concettuale: avrebbero potuto fare il loro solo per diffusione, possibilmente da molti siti di generazione, distribuiti approssimativamente uniformemente (o casualmente) all'interno della cellula.

Ma che dire delle distribuzioni irregolari, in cui alcune proteine ​​sono più densamente e non casualmente impacchettate (significative e funzionali) in alcuni siti della membrana rispetto ad altri, ad es.

  • recettori a densità postsinaptica

  • N / A+ canali nei siti di inizio del potenziale d'azione come la collinetta dell'assone o il segmento iniziale dell'assone

  • N / A+ canali ai nodi di Ranvier?

Con quali meccanismi (forze, segnali o strutture) queste proteine ​​sono condotte ai loro bersagli?

Forse dipende, e ci sono diversi meccanismi. Questi mi sono venuti in mente (contemplando i primi principi):

  • distribuzione non uniforme dei siti di generazione all'interno della cellula (a causa di cosa?)

  • distribuzione non uniforme delle origini dei segnali di attrazione all'interno della membrana (a causa di cosa?)

  • alcune forze o segnali "auto-attraenti" (che portano all'accumulo per feedback positivo)

  • microtubuli

Quale meccanismo è - eventualmente - predominante?


Domande correlate:

  • Ciclo di vita delle proteine

  • Vie dei canali ionici ligando-dipendenti

  • Distribuzione delle sinapsi dei neuroni CA1

  • Distribuzione dei canali ionici che generano picchi dendritici sull'albero dendritico

  • Mappe visive della membrana neuronale

  • Distribuzione pompe sodio-potassio


Questa è una grande domanda. Una risposta esauriente andrebbe oltre lo scopo di una risposta su un forum come questo. Riassumerò il meglio che posso qui, ma se sei veramente interessato a questo dovresti guardare alcuni dei lavori di Randy Schekman e Tom Rapoport, che hanno fatto un sacco di lavoro pionieristico in questo campo e hanno documenti da più di due decenni fa sui loro siti web di laboratorio. Parlerò delle proteine ​​di membrana in generale, ma non sono sicuro di quale sia lo stato del campo in particolare per i canali Na+, quindi non posso commentare troppo su quel caso particolare. Molti dei dettagli dei processi che citerò sono ancora aree di ricerca attiva, quindi cercherò di attenermi principalmente a ciò che è stato ben caratterizzato (per quanto a mia conoscenza).

Per ribadire il problema, le proteine ​​sono generalmente sintetizzate nel lume del reticolo endoplasmatico, che è un ambiente acquoso simile al citosol in molti modi (ma non tutti). Tuttavia, le proteine ​​di membrana, che non sono stabili in ambienti acquosi, devono:

1) Trova una via dal lume del RE in una membrana.
2) Entrare dal pronto soccorso nella membrana corretta in modo che possano svolgere la loro funzione cellulare.

Inizieremo con il passaggio 1, ma la chiave per entrambi è un aspetto critico ma spesso sottovalutato della biologia delle proteine ​​chiamato peptide segnale. Il peptide segnale è semplicemente una sequenza N-terminale di amminoacidi che precede ciò che normalmente considereremmo l'inizio di una proteina matura. È relativamente corto, di solito ha una lunghezza di soli 30 amminoacidi. Viene scisso dalla proteina matura da una proteasi una volta che la proteina è piegata e nella membrana. Fino a quel momento, il peptide segnale funge da marcatore molecolare che indica dove dovrebbe essere diretta la proteina nascente e come dovrebbe essere gestita. Non sorprende che ci siano molti peptidi segnale diversi che svolgono molteplici funzioni e non vengono utilizzati solo per le proteine ​​di membrana.

Quindi diciamo che siamo nel lume del RE e abbiamo un mRNA che codifica per una proteina di membrana destinata alla membrana plasmatica. Il primo amminoacidi che emergerà dal ribosoma è la sequenza segnale, in questo caso una sequenza segnale specifica che indica che questa deve essere una proteina della membrana plasmatica. Una volta che la sequenza segnale emerge dal ribosoma, viene riconosciuta da un complesso ribonucleoproteico (cioè un complesso di RNA e proteine) chiamato particella di riconoscimento del segnale. Una volta che l'SRP si lega al peptide segnale, la traduzione viene interrotta e l'intero complesso si sposta sulla membrana ER, dove forma un complesso con un altro grande complesso proteico chiamato translocone. Non posso entrare nella complessità di questi complessi e delle loro funzioni solo in questa risposta, ma la semplice descrizione è che il translocone contiene un ATPasi che può inserire la proteina di membrana nella membrana ER mentre viene tradotta, con l'orientamento corretto. L'idrolisi dell'ATP fornisce energia per spostare la catena polipeptidica emergente nella membrana idrofobica, dove gli chaperon la aiutano a ripiegarsi. Questo processo è in parte guidato dal riconoscimento delle regioni transmembrana idrofobe delle proteine ​​da parte del translocone. Può anche spostare proteine ​​solubili e citosoliche attraverso la membrana attraverso un meccanismo simile.

Ora che la proteina è stata traslocata, una peptidasi scinderà la sequenza segnale dalla proteina. Da qui, i segnali di smistamento prenderanno il sopravvento. Generalmente, questi sono semplici motivi di sequenza nel primo dominio transmembrana che agiscono in modo simile a una sequenza segnale, ma non vengono scissi. Tuttavia, in alcuni casi, i segnali di smistamento possono essere anche tratti di peptide in tutta la proteina.

Questi motivi di sequenza saranno riconosciuti dal meccanismo di traffico cellulare. Senza entrare troppo nei dettagli, le proteine ​​verranno raccolte in vescicole e trasportate ad altri organelli. Di solito, la prima tappa per le proteine ​​è l'apparato del Golgi, che è tipicamente il luogo in cui avvengono molte modificazioni post-traduzionali, come la glicosilazione. Sono un biochimico e non un biologo cellulare, quindi non sono il più qualificato per entrare nei dettagli del traffico subcellulare. Basti dire che una volta che la proteina ha finito di essere processata nel golgi, verrà trasferita in altri organelli, come la membrana plasmatica, usando come prima il trasporto delle vescicole. Dalla mia comprensione, la proteina verrà smistati nelle vescicole appropriate in base ai suoi segnali di smistamento, così come ad altri marcatori (in alcuni casi, alcune modifiche post-traduzionali su determinate proteine ​​​​possono influenzare il suo traffico). Le vescicole riconoscono la corretta membrana di destinazione in parte dalla composizione lipidica di quella membrana. Ad esempio, i fosfoinositidi hanno un'ampia influenza sul traffico di membrana e molte membrane possono essere differenziate dalla loro firma fosfoinositidica.

Ad ogni modo, questa è una panoramica molto ampia della risposta alla tua domanda. Mi dispiace non poter commentare troppo la complessità del traffico cellulare, non ho le competenze per esaminare quella letteratura abbastanza velocemente per rispondere alla tua domanda in un lasso di tempo ragionevole. Spero che questo sia utile per indirizzarti nella giusta direzione, e buona fortuna!


Il trasporto attivo è una risposta? Con speciali peptidi di segnalazione e interazione all'interno della proteina, le proteine ​​possono essere mirate a diverse sottolocazioni. Se sei interessato a come i canali Na+ si accumulano nell'AIS, leggi ad esempio Gasser et al. 2012, questo è un articolo molto carino che mostra che il motivo di legame dell'anchirina è sufficiente per raggruppare i canali Na+ all'AIS.


Astratto

L'identificazione di nuovi bersagli farmacologici è una delle principali sfide della proteomica. I metodi computazionali sviluppati nell'ultimo decennio hanno migliorato il processo di progettazione dei farmaci sia in termini di tempo che di qualità. Il compito principale è la progettazione di composti selettivi, che legano i bersagli in modo più specifico, a seconda della modalità d'azione desiderata del particolare farmaco. Ciò rende necessario creare composti che esprimano le loro funzioni su una singola proteina per escludere cross-reattività indesiderate o per utilizzare l'effetto vantaggioso di farmaci meno selettivi che colpiscano numerose proteine ​​e quindi espongano le loro funzioni su intere classi proteiche. Gli aspetti principali nell'assegnazione delle interazioni tra ligandi e bersagli putativi riguardano la composizione amminoacidica del sito di legame, la conservazione evolutiva e la somiglianza nella sequenza e nella struttura dei bersagli noti. Somiglianze o differenze all'interno di famiglie di proteine ​​classificate possono essere la chiave della loro funzione e fornire i primi suggerimenti per la progettazione di farmaci funzionali. Pertanto, la classificazione basata sul sito di legame supera in numero le classificazioni basate sulla sequenza poiché siti di legame simili possono essere trovati anche in proteine ​​più distanti. Le proteine ​​di membrana sono "bersagli difficili", a causa delle loro speciali caratteristiche fisico-chimiche e della generale mancanza di informazioni strutturali. Qui, descriviamo i recenti progressi nei metodi di modellazione dedicati alle proteine ​​di membrana.

Diversi descrittori di somiglianza tra composti e somiglianza tra siti di legame sono in fase di sviluppo e chiariscono aspetti importanti come la dinamica o l'entropia. L'importanza della progettazione computazionale dei farmaci è indiscutibile. Tuttavia, il processo di progettazione è complicato dalla crescente complessità, il che sottolinea l'importanza di una conoscenza accurata delle classi target interessate e in particolare dei loro siti di legame. Un obiettivo principale, considerando argomenti nominati, è prevedere presunti effetti collaterali e funzioni erranti (effetti fuori bersaglio) di nuovi farmaci, il che richiede una visione olistica (biologia dei sistemi) sulle relazioni farmaco-bersaglio-percorso. Di seguito, diamo un breve riassunto della recente discussione sulle interazioni farmaco-bersaglio con enfasi sulle proteine ​​di membrana.


Contenuti

Le proteine ​​di membrana svolgono una varietà di funzioni vitali per la sopravvivenza degli organismi: [2]

    le proteine ​​trasmettono segnali tra l'ambiente interno ed esterno della cellula. spostare molecole e ioni attraverso la membrana. Possono essere classificati in base al database di classificazione dei trasportatori.
  • Gli enzimi di membrana possono avere molte attività, come ossidoriduttasi, transferasi o idrolasi. [3] consentono alle cellule di identificarsi e interagire. Ad esempio, proteine ​​coinvolte nella risposta immunitaria

La localizzazione delle proteine ​​nelle membrane può essere prevista in modo affidabile utilizzando analisi di idrofobicità delle sequenze proteiche, ovvero la localizzazione di sequenze di amminoacidi idrofobiche.

Proteine ​​integrali di membrana Modifica

Le proteine ​​integrali di membrana sono permanentemente attaccate alla membrana. Tali proteine ​​possono essere separate dalle membrane biologiche solo utilizzando detergenti, solventi non polari o talvolta agenti denaturanti. Un esempio di questo tipo di proteina che non è stato ancora caratterizzato funzionalmente è SMIM23. Possono essere classificati in base alla loro relazione con il doppio strato:

    sono proteine ​​transmembrana che attraversano la membrana più di una volta. Queste proteine ​​possono avere una diversa topologia transmembrana. [4][5] Queste proteine ​​hanno una delle due architetture strutturali:
      proteine, che sono presenti in tutti i tipi di membrane biologiche proteine, che si trovano solo nelle membrane esterne dei batteri Gram-negativi e nelle membrane esterne dei mitocondri e dei cloroplasti. [6]

    Proteine ​​della membrana periferica Modifica

    Le proteine ​​della membrana periferica sono temporaneamente attaccate al doppio strato lipidico o alle proteine ​​integrali mediante una combinazione di interazioni idrofobe, elettrostatiche e non covalenti. Le proteine ​​periferiche si dissociano dopo il trattamento con un reagente polare, come una soluzione con un pH elevato o alte concentrazioni di sale.

    Le proteine ​​integrali e periferiche possono essere modificate post-traduzionalmente, con l'aggiunta di catene di acidi grassi, diacilglicerolo [8] o prenile, o GPI (glicosilfosfatidilinositolo), che possono essere ancorate nel doppio strato lipidico.

    Tossine polipeptidiche Modifica

    Le tossine polipeptidiche e molti peptidi antibatterici, come le colicine o le emolisine, e alcune proteine ​​coinvolte nell'apoptosi, sono talvolta considerate una categoria separata. Queste proteine ​​sono idrosolubili ma possono aggregarsi e associarsi irreversibilmente al doppio strato lipidico e diventare reversibilmente o irreversibilmente associate alla membrana.

    Le proteine ​​di membrana, come le proteine ​​globulari solubili, le proteine ​​fibrose e le proteine ​​disordinate, sono comuni. [9] Si stima che il 20-30% di tutti i geni nella maggior parte dei genomi codifica per proteine ​​di membrana. [10] [11] Ad esempio, circa 1000 dei

    4200 proteine ​​di E. coli si pensa siano proteine ​​di membrana, 600 delle quali sono state verificate sperimentalmente come residenti di membrana. [12] Negli esseri umani, il pensiero attuale suggerisce che il 30% del genoma codifica per le proteine ​​di membrana. [13]

    Le proteine ​​di membrana sono gli obiettivi di oltre il 50% di tutti i farmaci moderni. [1] Tra le malattie umane in cui sono implicate le proteine ​​di membrana ci sono le malattie cardiache, il morbo di Alzheimer e la fibrosi cistica. [13]

    Sebbene le proteine ​​di membrana svolgano un ruolo importante in tutti gli organismi, la loro purificazione ha storicamente, e continua ad essere, un'enorme sfida per gli scienziati delle proteine. Nel 2008, erano disponibili 150 strutture uniche di proteine ​​di membrana, [14] e nel 2019 solo 50 proteine ​​di membrana umane avevano chiarito le loro strutture. [13] Al contrario, circa il 25% di tutte le proteine ​​sono proteine ​​di membrana. [15] Le loro superfici idrofobe rendono difficile la caratterizzazione strutturale e soprattutto funzionale. [13] [16] I detergenti possono essere utilizzati per rendere solubili in acqua le proteine ​​di membrana, ma questi possono anche alterare la struttura e la funzione delle proteine. [13] Rendere idrosolubili le proteine ​​di membrana può essere ottenuto anche attraverso l'ingegnerizzazione della sequenza proteica, sostituendo gli amminoacidi idrofobici selezionati con quelli idrofili, avendo grande cura di mantenere la struttura secondaria durante la revisione della carica complessiva. [13]

    La cromatografia di affinità è una delle migliori soluzioni per la purificazione delle proteine ​​di membrana. L'attività delle proteine ​​di membrana diminuisce molto velocemente rispetto ad altre proteine. Quindi la cromatografia di affinità fornisce una purificazione rapida e specifica delle proteine ​​di membrana. Il tag poliistidina è un tag comunemente usato per la purificazione delle proteine ​​di membrana, [17] e anche il tag alternativo rho1D4 è stato utilizzato con successo. [18] [19]


    Targeting proteico

    Il targeting proteico si riferisce ai metodi utilizzati dalle cellule per portare le proteine ​​nella posizione corretta dopo la sintesi. Le proteine ​​svolgono un ruolo importante nella maggior parte dei processi cellulari, ma devono essere localizzate correttamente per svolgere le loro funzioni. Sapere come le proteine ​​di nuova sintesi prendono di mira le cellule è essenziale per comprendere la funzione delle proteine.

    Le proteine ​​sono sintetizzate sia nel citosol o sul reticolo endoplasmatico . Quando sintetizzato nel citosol su libero ribosomi , la maggior parte delle proteine ​​si diffondono liberamente finché non si legano a un particolare substrato o assemblare in un complesso più grande. La diffusione delle proteine ​​nel citosol è generalmente rapida, quindi una proteina non legata è in grado di diffondersi attraverso la cellula in pochi secondi.

    Un modo in cui le proteine ​​citosoliche vengono prese di mira all'interno delle cellule è formando grandi complessi macromolecolari. Molte proteine ​​possono esistere sia come monomeri , che si diffondono liberamente attraverso il citoplasma , o come polimeri , che formano strutture su larga scala che si distribuiscono dinamicamente in posizioni distinte nella cellula. Le proteine ​​del citoscheletro actina e tubulina, ad esempio, hanno un paio di complementare siti autoleganti sulle loro superfici che consentono loro di polimerizzare in lunghi filamenti elicoidali che si estendono attraverso la cellula. Questi filamenti formano il citoscheletro della cellula, che si riorganizza continuamente mentre la cellula cambia forma, si divide e risponde al suo ambiente.

    I cambiamenti conformazionali in una proteina spesso portano a cambiamenti nella proteina's affinità verso un particolare substrato. Questo processo può svolgere un ruolo cruciale nella regolazione della localizzazione intracellulare di una proteina. Un esempio di questo tipo di regolazione è la proteina fosforilazione o aggiunta di un gruppo fosfato. Questo può cambiare drasticamente l'affinità di una proteina per un substrato e può quindi portare a rapidi cambiamenti nella posizione della proteina. Questo tipo di regolazione della localizzazione delle proteine ​​è fondamentale per consentire alle cellule di coordinare le proprie attività in diverse condizioni di crescita e durante la divisione cellulare.

    Alcune proteine ​​citoplasmatiche sono mirate a un particolare sito nella cellula perché contengono uno specifico amminoacido sequenza che li induce a legarsi ai recettori situati in quel sito. Un esempio di tale sequenza di mira è il cosiddetto segnale di localizzazione nucleare (NLS), che consiste in due brevi tratti di di base amminoacidi divisi da una regione distanziatrice di amminoacidi 10�. Questa sequenza di amminoacidi consente a una proteina che lo possiede di legarsi ai recettori di localizzazione nucleare presenti nel nucleo . Una volta che una proteina contenente un segnale NLS si lega a un recettore nucleare, non è più in grado di diffondersi liberamente e diventa "localizzata" nel nucleo.

    Molte proteine ​​sono incorporate all'interno o associate alle membrane. In cellule eucariotiche , le membrane formano i confini di una varietà di compartimenti distinti, compreso il nucleo, mitocondri , reticolo endoplasmatico (ER) e complesso di Golgi. Alcune proteine ​​sono sintetizzate nel citosol e quindi modificate con a lipidi Ȫncora," e associazione con le membrane è semplicemente una questione di incorporamento nello strato lipidico esterno della membrana. Le molecole di segnalazione, come la proteina Ras che si lega al GTP, si localizzano in questo modo sulle membrane.

    Tutte le altre proteine ​​che mirano alle membrane intracellulari richiedono segnali di smistamento che dirigono il loro trasporto dal citosol. Ad esempio, le proteine ​​mirate ai mitocondri contengono una specifica sequenza peptidica di 20� amminoacidi che ne media l'importazione. Questa sequenza si trova all'estremità amminica della proteina e dopo l'importazione viene rapidamente rimossa da una proteasi.

    Le proteine ​​localizzate all'interno di quelle membrane coinvolte nell'endocitosi e nell'esocitosi vengono prima mirate all'ER e quindi utilizzano le vie di trasporto della membrana per raggiungere altri compartimenti. Il targeting delle proteine ​​al pronto soccorso inizia prima del polipeptide catena è completamente sintetizzata. Ciò è in contrasto con l'importazione di proteine ​​nei mitocondri, nei cloroplasti e nei perossisomi, che avviene dopo che la sintesi è stata completata. Un peptide segnale ER, localizzato al terminale amminico di queste proteine, dirige il ribosoma ad attaccarsi alla membrana ER prima che la proteina sia stata completamente tradotta. Il peptide segnale ER è guidato alla membrana ER da una particella di riconoscimento del segnale (SRP), che si lega al peptide segnale, e un recettore SRP nelle membrane ER.

    Dall'ER le proteine ​​utilizzano una varietà di meccanismi per raggiungere diverse destinazioni finali nella cellula. Proteine ​​destinate al membrana nucleare semplicemente diffondi lì e attacca, poiché l'involucro nucleare è in diretta continuità con il pronto soccorso. Per raggiungere il complesso di Golgi, la membrana plasmatica, gli endosomi e i lisosomi, tuttavia, le proteine ​​devono entrare nel via secretoria e utilizzare percorsi di traffico di membrana. Per le proteine ​​di membrana, si pensa che l'ingresso nella via secretoria richieda la loro concentrazione e lo smistamento nei siti di uscita dell'ER. Al contrario, le proteine ​​che sono solubili nel lume del RE (spazio interno) escono tramite un processo di flusso di massa. Dopo aver lasciato il pronto soccorso, la maggior parte delle proteine ​​solubili viene infine secreta dalla cellula. Molte proteine ​​di membrana sono dirette a specifiche organelli all'interno delle vie secretorie ed endocitiche perché contengono segnali di smistamento specifici nelle loro code citoplasmatiche, che funzionano in modo molto simile ai codici postali. In alternativa, l'ordinamento può essere dovuto alle proprietà del dominio transmembrana di una proteina, una regione della proteina che conferisce la sua affinità per diversi ambienti lipidici caratteristici di diversi organelli.


    Contenuti

    Nel 1970, Günter Blobel condusse esperimenti sulla traslocazione delle proteine ​​attraverso le membrane. Blobel, allora assistente professore alla Rockefeller University, si è basato sul lavoro del suo collega George Palade. [5] Palade aveva precedentemente dimostrato che le proteine ​​non secrete venivano tradotte dai ribosomi liberi nel citosol, mentre le proteine ​​secrete (e le proteine ​​bersaglio, in generale) erano tradotte dai ribosomi legati al reticolo endoplasmatico. [5] Le spiegazioni candidate all'epoca postulavano una differenza di elaborazione tra i ribosomi liberi e quelli legati all'ER, ma Blobel ipotizzò che il targeting proteico si basasse su caratteristiche inerenti alle proteine, piuttosto che su una differenza nei ribosomi. A sostegno della sua ipotesi, Blobel ha scoperto che molte proteine ​​hanno una breve sequenza di amminoacidi a un'estremità che funziona come un codice postale che specifica una destinazione intracellulare o extracellulare. [2] Ha descritto queste brevi sequenze (generalmente da 13 a 36 residui di amminoacidi) [1] come peptidi segnale o sequenze segnale ed è stato insignito del premio Nobel per la fisiologia 1999 per le sue scoperte. [6]

    I peptidi di segnale fungono da segnali di targeting, consentendo ai macchinari di trasporto cellulare di dirigere le proteine ​​verso specifiche posizioni intracellulari o extracellulari. Sebbene non sia stata identificata alcuna sequenza consenso per i peptidi segnale, molti possiedono comunque una caratteristica struttura tripartita: [1]

    1. Una regione idrofila carica positivamente vicino all'N-terminale.
    2. Un intervallo di 10-15 amminoacidi idrofobici vicino al centro del peptide segnale.
    3. Una regione leggermente polare vicino al C-terminale, che tipicamente favorisce gli amminoacidi con catene laterali più piccole in posizioni che si avvicinano al sito di scissione.

    Dopo che una proteina ha raggiunto la sua destinazione, il peptide segnale viene generalmente scisso da una peptidasi segnale. [1] Di conseguenza, la maggior parte delle proteine ​​mature non contiene peptidi segnale. Mentre la maggior parte dei peptidi segnale si trova all'N-terminale, nei perossisomi la sequenza di targeting si trova sull'estensione C-terminale. [7] A differenza dei peptidi segnale, i cerotti segnale sono composti da residui di amminoacidi che sono discontinui nella sequenza primaria ma diventano funzionali quando il ripiegamento li riunisce sulla superficie della proteina. [8] Diversamente dalla maggior parte delle sequenze di segnale, le patch di segnale non vengono scisse al termine dell'ordinamento. [9] Oltre alle sequenze di segnalazione intrinseche, le modificazioni proteiche come le glicosilazioni possono anche indurre il targeting a specifiche regioni intracellulari o extracellulari.

    Poiché la traduzione dell'mRNA in proteina da parte di un ribosoma avviene all'interno del citosol, le proteine ​​destinate alla secrezione o uno specifico organello devono essere traslocate. [10] Questo processo può verificarsi durante la traduzione, noto come traslocazione co-traduzionale, o dopo il completamento della traduzione, noto come traslocazione post-traduzionale. [11]

    Traslocazione co-traduzionale Modifica

    La maggior parte delle proteine ​​secretorie e legate alla membrana sono traslocate in modo co-traduzionale. Anche le proteine ​​che risiedono nel reticolo endoplasmatico (ER), nel golgi o negli endosomi utilizzano la via di traslocazione co-traduzionale. Questo processo inizia mentre la proteina viene sintetizzata sul ribosoma, quando una particella di riconoscimento del segnale (SRP) riconosce un peptide segnale N-terminale della proteina nascente. [12] Il legame dell'SRP interrompe temporaneamente la sintesi mentre il complesso ribosoma-proteina viene trasferito a un recettore SRP sull'ER negli eucarioti e alla membrana plasmatica nei procarioti. [13] Lì, la proteina nascente viene inserita nel translocon, un canale di conduzione proteico legato alla membrana composto dal complesso di traslocazione Sec61 negli eucarioti e dal complesso omologo SecYEG nei procarioti. [14] Nelle proteine ​​secretorie e nelle proteine ​​transmembrana di tipo I, la sequenza segnale viene immediatamente scissa dal polipeptide nascente una volta che è stata traslocata nella membrana dell'ER (eucarioti) o nella membrana plasmatica (procarioti) dalla peptidasi segnale. La sequenza segnale delle proteine ​​di membrana di tipo II e di alcune proteine ​​di membrana politopiche non vengono scisse e quindi sono indicate come sequenze di ancoraggio del segnale. All'interno dell'ER, la proteina viene prima coperta da una proteina chaperone per proteggerla dall'alta concentrazione di altre proteine ​​nell'ER, dandogli il tempo di ripiegarsi correttamente. Una volta piegata, la proteina viene modificata secondo necessità (ad esempio, mediante glicosilazione), quindi trasportata al Golgi per ulteriori elaborazioni e raggiunge i suoi organelli bersaglio o viene trattenuta nell'ER da vari meccanismi di ritenzione dell'ER.

    La catena di amminoacidi delle proteine ​​transmembrana, che spesso sono recettori transmembrana, passa attraverso una membrana una o più volte. Queste proteine ​​vengono inserite nella membrana per traslocazione, fino a quando il processo non viene interrotto da una sequenza di stop-transfer, chiamata anche ancora di membrana o sequenza di ancoraggio del segnale. [15] Queste complesse proteine ​​di membrana sono attualmente caratterizzate utilizzando lo stesso modello di targeting sviluppato per le proteine ​​secretorie. Tuttavia, molte proteine ​​complesse multi-transmembrana contengono aspetti strutturali che non si adattano a questo modello. Sette recettori accoppiati a proteine ​​G transmembrana (che rappresentano circa il 5% dei geni nell'uomo) per lo più non hanno una sequenza segnale ammino-terminale. Contrariamente alle proteine ​​secretorie, il primo dominio transmembrana agisce come la prima sequenza segnale, che le indirizza alla membrana ER. Ciò si traduce anche nella traslocazione del terminale amminico della proteina nel lume della membrana dell'ER. Questa traslocazione, che è stata dimostrata con l'opsina con esperimenti in vitro, [16] [17] rompe il consueto schema di traslocazione "co-traduzionale" che è sempre stato valido per le proteine ​​di mammifero mirate all'ER. Resta da chiarire gran parte della meccanica della topologia transmembrana e del ripiegamento.

    Traslocazione post-traduzionale Modifica

    Anche se la maggior parte delle proteine ​​secretorie sono traslocate in modo co-traduzionale, alcune sono tradotte nel citosol e successivamente trasportate alla membrana ER/plasma da un sistema post-traduzionale. Nei procarioti questo processo richiede alcuni cofattori come SecA e SecB ed è facilitato da Sec62 e Sec63, due proteine ​​legate alla membrana. [18] Il complesso Sec63, che è incorporato nella membrana ER, provoca l'idrolisi dell'ATP, consentendo alle proteine ​​chaperone di legarsi a una catena peptidica esposta e far scorrere il polipeptide nel lume ER. Una volta nel lume la catena polipeptidica può essere ripiegata correttamente. Questo processo si verifica solo nelle proteine ​​non ripiegate situate nel citosol. [19]

    Inoltre, le proteine ​​mirate ad altre destinazioni cellulari, come mitocondri, cloroplasti o perossisomi, utilizzano percorsi post-traduzionali specializzati. Le proteine ​​mirate al nucleo sono anche traslocate post-traduzionali attraverso l'aggiunta di un segnale di localizzazione nucleare (NLS) che promuove il passaggio attraverso l'involucro nucleare attraverso i pori nucleari. [20]

    Mitocondri Modifica

    La maggior parte delle proteine ​​mitocondriali sono sintetizzate come precursori citosolici contenenti segnali peptidici di captazione. Gli chaperon citosolici forniscono preproteine ​​ai recettori collegati al canale nella membrana mitocondriale. La preproteina con presequenza mirata ai mitocondri è legata ai recettori e al poro di importazione generale (GIP), noto collettivamente come traslocasi della membrana esterna (TOM), alla membrana esterna. Viene quindi traslocato attraverso TOM come tornanti. La preproteina viene trasportata attraverso lo spazio intermembrana da piccoli TIM (che agiscono anche come chaperon molecolari) al TIM23 o TIM22 (translocasi della membrana interna) a livello della membrana interna. All'interno della matrice la sequenza di targeting viene scissa da mtHsp70.

    Sono noti tre recettori della membrana mitocondriale esterna:

    1. TOM70: si lega ai peptidi di targeting interni e funge da punto di attracco per gli chaperon citosolici.
    2. TOM20: Associa le presequenze.
    3. TOM22: lega sia le presequenze che i peptidi di targeting interni.

    Il canale TOM (TOM40) è un canale ad alta conduttanza specifico per cationi con un peso molecolare di 410 kDa e un diametro dei pori di 21Å.

    La presequenza translocase23 (TIM23) è localizzata sulla membrana mitocondriale interna e agisce come una proteina formatrice di pori che lega le proteine ​​precursori con il suo N-terminale. TIM23 agisce come traslocatore per le preproteine ​​per la matrice mitocondriale, la membrana mitocondriale interna e per lo spazio intermembrana. TIM50 è legato a TIM23 sul lato mitocondriale interno e si trova a legare presequenze. TIM44 è legato sul lato della matrice e si lega a mtHsp70.
    La presequenza translocase22 (TIM22) lega le preproteine ​​legate esclusivamente alla membrana mitocondriale interna.

    Le sequenze mirate alla matrice mitocondriale sono ricche di amminoacidi carichi positivamente e di quelli idrossilati.

    Le proteine ​​sono indirizzate ai compartimenti subcondriali da molteplici segnali e diverse vie.

    Il targeting per la membrana esterna, lo spazio intermembrana e la membrana interna spesso richiede un'altra sequenza di segnale oltre alla sequenza di targeting della matrice.

    Cloroplasti Modifica

    La preproteina per i cloroplasti può contenere una sequenza di importazione stromale o una sequenza di targeting stromale e tilacoide. La maggior parte delle preproteine ​​viene traslocata attraverso i complessi Toc e Tic situati all'interno dell'involucro del cloroplasto. Nello stroma la sequenza di importazione stromale viene scissa e ripiegata, così come lo smistamento intra-cloroplasto ai tilacoidi continua. Le proteine ​​mirate all'involucro dei cloroplasti di solito mancano di una sequenza di smistamento scindibile.

    Sia i cloroplasti che i mitocondri Modifica

    Molte proteine ​​sono necessarie sia nei mitocondri che nei cloroplasti. [21] In generale il peptide dual-targeting è di carattere intermedio ai due specifici. I peptidi bersaglio di queste proteine ​​hanno un alto contenuto di aminoacidi basici e idrofobici, un basso contenuto di aminoacidi con carica negativa. Hanno un contenuto inferiore di alanina e un contenuto maggiore di leucina e fenilalanina. Le proteine ​​a doppio bersaglio hanno un peptide mirato più idrofobo rispetto a quelli mitocondriali e cloroplastici. Tuttavia, è noioso prevedere se un peptide ha un duplice obiettivo o meno in base alle sue caratteristiche fisico-chimiche.

    Perossisomi Modifica

    Tutte le proteine ​​perossisomiali sono codificate da geni nucleari. [22] Ad oggi sono noti due tipi di segnali di targeting perossisoma (PTS): [23]

    1. Segnale di targeting per perossisoma 1 (PTS1): un tripeptide C-terminale con una sequenza consenso (S/A/C)-(K/R/H)-(L/A). Il PTS1 più comune è la serina-lisina-leucina (SKL). La maggior parte delle proteine ​​della matrice perossisomiale possiede un segnale di tipo PTS1.
    2. Segnale di targeting per perossisoma 2 (PTS2): un nonapeptide situato vicino all'N-terminale con una sequenza consenso (R/K)-(L/V/I)-XXXXX-(H/Q)-(L/A/F) (dove X può essere qualsiasi amminoacido ).

    Ci sono anche proteine ​​che non possiedono nessuno di questi segnali. Il loro trasporto può essere basato su un cosiddetto meccanismo "piggy-back": tali proteine ​​si associano alle proteine ​​della matrice che possiedono PTS1 e vengono traslocate nella matrice perossisomiale insieme ad esse. [24]

    Il trasporto delle proteine ​​è difettoso nelle seguenti malattie genetiche:

    Come discusso sopra (vedi traslocazione proteica), la maggior parte delle proteine ​​​​procariotiche legate alla membrana e secretorie sono mirate alla membrana plasmatica da una via di co-traduzione che utilizza SRP batterica o da una via di post-traduzione che richiede SecA e SecB. Sulla membrana plasmatica, queste due vie forniscono proteine ​​al traslocone SecYEG per la traslocazione. I batteri possono avere una singola membrana plasmatica (batteri Gram-positivi) o una membrana interna più una membrana esterna separata dal periplasma (batteri Gram-negativi). Oltre alla membrana plasmatica, la maggior parte dei procarioti mancano di organelli legati alla membrana come si trovano negli eucarioti, ma possono assemblare proteine ​​su vari tipi di inclusioni come vescicole di gas e granuli di accumulo.

    Batteri Gram-negativi Modifica

    In gram-negative bacteria proteins may be incorporated into the plasma membrane, the outer membrane, the periplasm or secreted into the environment. Systems for secreting proteins across the bacterial outer membrane may be quite complex and play key roles in pathogenesis. These systems may be described as type I secretion, type II secretion, etc.

    Gram-positive bacteria Edit

    In most gram-positive bacteria, certain proteins are targeted for export across the plasma membrane and subsequent covalent attachment to the bacterial cell wall. A specialized enzyme, sortase, cleaves the target protein at a characteristic recognition site near the protein C-terminus, such as an LPXTG motif (where X can be any amino acid), then transfers the protein onto the cell wall. Several analogous systems are found that likewise feature a signature motif on the extracytoplasmic face, a C-terminal transmembrane domain, and cluster of basic residues on the cytosolic face at the protein's extreme C-terminus. The PEP-CTERM/exosortase system, found in many Gram-negative bacteria, seems to be related to extracellular polymeric substance production. The PGF-CTERM/archaeosortase A system in archaea is related to S-layer production. The GlyGly-CTERM/rhombosortase system, found in the Shewanella, Vibrio, and a few other genera, seems involved in the release of proteases, nucleases, and other enzymes.


    Study challenging interactions with membrane proteins to improve drug design

    Figuring out the role a membrane protein plays in a cellular process requires understanding how it interacts with its ligands. This knowledge also helps in designing drugs that target these processes. The characterization of the interactions with ligands during drug discovery and development with label-free assays and in solution allows researchers to unravel molecular mechanisms and improve drug design.

    Improve drug design to target membrane proteins

    The human PepT1 transporter plays an important role in drug uptake and transport — which makes it a promising pharmacological target. Using DtpA — a bacterial homolog — this team measured the binding of peptides and drugs to DtpA with label-free MST. The data helped them model and improve drug design for the human transporter. Additionally, they looked at how nanobodies stabilized the transporter for crystallization and structure determination with label-free nanoDSF.

    Identify key ligand binding sites in solution

    The NRT1.1 proton-coupled transporter is responsible for nitrogen assimilation and nitrate transport in plants. In nature, it switches between low and high affinity nitrate binding states in response to falling nitrate levels via a process of phosphorylation. To understand this mechanism, researchers used MST to determine how nitrate binding to GFP-fused NRT1.1 in detergent was affected by phosphorylation and point mutations. In combination with crystallography data, they revealed a key amino acid residue for nitrate binding and showed how phosphorylation of the transporter allows it to switch binding states.


    Membrane Protein Overview

    Membrane proteins represent about a third of the proteins in living organisms. Based on their structure, there are main three types of membrane proteins: the first one is integral membrane protein that is permanently anchored or part of the membrane, the second type is peripheral membrane protein that is only temporarily attached to the lipid bilayer or to other integral proteins, and the third one is lipid-anchored proteins (Fig. 1). Here we only describe the first two types of membrane protein.

    Fig. 1 Structural classification of membrane proteins

    According to their their relationship with the bilayer, integral membrane protein can be classified two primary types: integral polytopic proteins and Integral monotopic proteins. Integral polytopic proteins are also known as “transmembrane proteins” which can span across the membrane at least once (Fig. 2). These integral membrane proteins may have different transmembrane topology which refers to orientations (locations of N- and C-termini) of membrane-spanning segments with respect to the inner or outer sides of the biological membrane occupied by the protein. The first three types in the Fig. 2 are common forms in integral membrane proteins, such as, transmembrane α-helix protein, transmembrane α-helical protein and transmembrane β-sheet protein.

    Integral monotopic proteins are one type of integral membrane proteins that are attached to only one side of the membrane and do not span the whole way across. There are 4 types of interaction between Integral monotopic membrane protein and cell membranes: by an amphipathicα-helix paralle, by a hydrophobic loop, by a covalently bound membrane lipid and electrostatic or ionic interaction with membrane lipids (No. 4, 5, 6,7 of Fig. 2). Integral membrane proteins can be separated from the biological membranes only using detergents, nonpolar solvents, or sometimes denaturing agents. Peripheral proteins dissociate following treatment with a polar reagent, such as a solution with an elevated pH or high salt concentrations.

    Fig. 2 Seven types of Integral Membrane protein Structure

    The membrane is represented in yellow. 1. A single transmembrane α-helix (bitopic membrane protein). 2. A polytopic transmembrane α-helical protein. 3. A polytopic transmembrane β-sheet protein. 4. Interaction by an amphipathic α-helix parallel to the membrane plane (in-plane membrane helix). 5. Interaction by a hydrophobic loop. 6. Interaction by a covalently bound membrane lipid. 7. Ionic or electrostatic interactions with membrane lipids.

    Function of Membrane Proteins

    Membrane proteins play crucial roles in all organisms, where they serve as, such as membrane receptors, ion channels , GPCR (G protein–coupled receptors) and various kinds of proteine ​​di trasporto . Membrane receptors that embedded in the cell membranes, which can transmit signals between the cell’s internal and external environments. Membrane transport protein (or transporter) is a kind of membrane protein that involved in the movement of ions, small molecules, or macromolecules across a biological membrane. About membrane transport protein, there is a detailed classification called Transporter Classification Database (or TCDB) approved by International Union of Biochemistry and Molecular Biology. Ion channels are one of most important type of membrane transport proteins. The functions of ion channel include establishing a resting membrane potential, shaping action potentials and other electrical signals by gating the flow of ions across the cell membrane, controlling the flow of ions across secretory and epithelial cells, and regulating cell volume. Some enzymes are also membranes proteins, for example oxidoreductase, transferase or hydrolase. Cell adhesion molecules that located on the cell surface involved in binding with other cells or with the extracellular matrix (ECM), allow cells to identify each other and interact. For example, proteins including Ig ( immunoglobulin ) superfamily involved in immune response. The following figure 3 summarizes membrane protein functions for easy to understand.

    Fig. 3 Membrane proteins functions

    Owing to their central role in basically all physiological processes, membrane proteins constitute around 60% of approved drug targets, and, therefore, their experimentally determined three – dimensional structures are eagerly sought to assist in structure – based drug design. Despite significant and considerable recent improvements, the expression of functionally folded membrane proteins in sufficient amounts for functional and structural studies is still a challenging task. Compared with soluble cytoplasmic proteins, a variety of difficulties in expression of membrane proteins. 1. Membrane proteins are not just released into the cytosol but must rather be targeted and translocated to their final destinations in membranes. In particular in eukaryotic cells, there is need a more complicated biological process requires sophisticated recognition and sorting mechanisms. 2. Copy number and capacity of prokaryotic and eukaryotic expression systems are limited because of translocation machineries, and translocation can be selective only for distinct groups of membrane proteins. 3. For structural and functional studies or other purposes, it is have to extract membrane protein from cellular after expression, followed by transfer into artificial and defined hydrophobic environments like micelles or liposomes. In this procedure, it is highly critical as membranes have to be disintegrated by relatively harsh detergents which can result in conformational aberrations or in unfolding of membrane proteins. It is therefore not surprising that the structural information obtained from membrane proteins with some 150 unique structures and only

    7% entries in the Protein Data Bank is lacking far behind the data obtained from soluble proteins.

    Core factors that determine the yield, integrity, activity and stability of synthesized membrane proteins mainly are the availability of highly processive transcription and translation machineries, suitable folding environments, the lipid composition of cellular membranes, the presence of efficient targeting systems and appropriate pathways for posttranslational modifications (PTMs). Expression of membrane proteins in expression systems/cellular background as closely related to their origin as possible may be the most reasonable strategy. However, the efficiency and workload of the individual expression systems are quite different, and preparative amounts of membrane proteins are often only obtained with bacterial, yeast or cell-free systems (Fig. 4).

    Fig. 4 Process design of membrane protein expression systems.

    Overview of protocol development for the most popular membrane protein expression systems. Basic optimization parameters characteristic for the individual expression systems are illustrated, and the most critical parts are indicated. Some optimization parameters are not considered: vector or target design, e.g. fusion technologies or modifications of the expression cassettes. Grey bars illustrate the success in obtaining membrane protein structures after using the individual expression systems, while white bars correspond to those membrane protein structures obtained only after recombinant expression. (F. Junge et al.)

    Although choosing an appropriate expression system need to consider many factors which may increase the complexity and time-consuming of research project, Creative Biolabs can provide comprehensive membrane protein production service which can help you decide optimization parameter and systems for your targeted experiments.

    Membrane Protein Antibody

    Membrane proteins represent the vast majority of clinical drug targets and are a focus of pharmaceutical and biotechnological interests. Despite significant and considerable recent improvements, the expression of functionally folded membrane proteins in sufficient amounts for functional and structural studies is still a challenging task. However, there are still many strategies for preparing membrane proteins that have been developed by Specialists from Creative Biolabs. In termini di anti-membrane protein antibody discovery and production , Creative Biolabs is able to provide various methods from immune antibody library construction by phage display to native antibody discovery by antigen-specific B lymphocytes cytometry technology. If you are interested in discovering novel membrane protein antibodies, please feel free to contact us for more details.


    Astratto

    Cellular organelles in the exocytic and endocytic pathways have a distinctive spatial distribution and communicate through an elaborate system of vesiculo-tubular transport. Rab proteins and their effectors coordinate consecutive stages of transport, such as vesicle formation, vesicle and organelle motility, and tethering of vesicles to their target compartment. These molecules are highly compartmentalized in organelle membranes, making them excellent candidates for determining transport specificity and organelle identity.


    Mapping the folding process of a single membrane protein

    Proteins are huge molecules containing hundreds to thousands of atoms that adopt a unique three dimensional structure, placing chemical groups in just the right place to catalyze reactions or build cellular structures. How all those atoms manage to find the right location -- the so-called folding problem -- has fascinated molecular biologists since the first structures were seen in the 1950s. Moreover, folding has important medical implications because most genetic defects cause protein misfolding.

    About a third of all proteins float around in the cell membrane where they ensure the right chemicals get in the cell in the right amounts. Membrane proteins also provide key information links between the cell and its environment. Indeed, most drugs target membrane proteins. Nevertheless, the folding of membrane proteins has been particularly difficult to study and has rarely been studied in natural environments, leaving the folding process for a large fraction of the protein universe still largely cloaked in mystery.

    In un recente numero di Natura chimica biologia, published on October 19, 2015, a research team led by Tae-Young Yoon of the Department of Physics at the Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST) and James U. Bowie of the Department of Chemistry and Biochemistry at the University of California, Los Angeles (UCLA), report a new method for manipulating the folding of membrane proteins in a membrane environment using a tool called a magnetic tweezer.

    Researchers first attach long DNA handles to the ends of the protein. One handle is attached to a glass surface and the other to a magnetic bead. Using a magnet, they can essentially grab the protein and pull on it, inducing it to unfold. By playing with the bead attached to the protein, they can force the protein to unfold or allow it to refold, and watch all this happening by 3D-tracking of the magnetic bead. With this novel strategy, they were able to quantitatively map the folding energy landscape, the folding kinetic rate, and folding intermediates of a membrane protein in a membrane environment for the first time.

    "I have been dreaming about this experiment for a decade. To see it work so well is really gratifying," said Dr. Bowie.

    One of the major surprises in the study was that essentially all the atoms of the protein jump into the correct structure together. The researchers expected that the protein structure would come together in a more piecemeal fashion, with different parts of the structure forming separately, but that was not the case. It is possible that nature evolved such a smooth, highly cooperative folding process to prevent partially folded forms that could get into trouble in the crowded cell membrane. On the other hand, the cooperative folding seen here might not apply to other membrane proteins.

    "We need to look at more proteins. The technique developed here may allow us to do just that," said Dr. Yoon.

    The single molecule mechanical manipulation technique could enable detailed folding studies of many other membrane proteins. A major barrier to the study of membrane proteins previously is that the proteins tend to stick together and get tangled up, as computer cords lying at your feet tend to do. With the tweezer technique used in this work, the protein cords are held apart from other cords so they can't get knotted up. It is hoped that the new approach will open up an important part of the protein universe to scrutiny, including many proteins that become misfolded in disease states.

    The title of the research paper is "Mapping the energy landscape for second-stage folding of a single membrane protein."


    6 Important Types of Membrane Proteins (With Diagram)

    Some of the most important types of membrane proteins are as follows:

    1. Peripheral (Extrinsic) Proteins 2. Integral (Intrinsic) Proteins 3. Asymmetric Distribution of Membrane Proteins 4. Mobility of Membrane Proteins 5. Enzymatic Properties of Membrane Proteins 6. Isolation and Characterization of Membrane Proteins.

    1. Peripheral (Extrinsic) Proteins:

    Peripheral or extrinsic membrane proteins are gener­ally loosely attached to the membrane and are more readily removed than are the integral proteins. Peripheral proteins are rich in amino acids with hydrophilic side chains that permit interaction with the surrounding water and with the polar surface of the lipid bilayer. Peripheral proteins on the cell’s exterior membrane surface often contain chains of sugars (i.e., they are glycoproteins).

    2. Integral (Intrinsic) Proteins:

    Integral or intrinsic membrane proteins contain both hydrophilic and hydrophobic regions. The hydrophilic portions of the protein interact with the polar heads of the lipid molecules at each surface of the bimolecular leaflet.

    Portions of integral proteins that project be­yond the surface of the lipid bilayer are also rich in hy­drophilic amino acids. Amino acids in that part of the protein projecting from the outer membrane surface may be linked to chains of sugars. Parts of the protein that are buried in the hydrophobic portion of the lipid bilayer are rich in amino acids with hydrophobic side chains.

    These side chains are believed to form hydro­phobic bonds with the hydrocarbon tails of the mem­brane phospholipids. It is speculated that within the hydrophobic interior of the membrane, the secondary structure of integral proteins is alpha helix and/or beta sheet (Fig. 15-12).

    In the alpha helix conforma­tion, amino and carboxyl groups along a stretch of the polypeptide’s backbone form hydrogen bonds with one another in the beta sheet, hydrogen bonds are formed between amino and carboxyl groups in stretches of polypeptide that lie parallel to one another.

    In the absence of such hydrogen bonding, these amino and carboxyl groups would have polar proper­ties, their hydrophilic nature being incompatible with the membrane’s hydrophobic interior. Alpha amino and carboxyl groups that are not “neutralized” by hy­drogen bonding would be expected only in those parts of the integral protein that extend into the aqueous milieu on either side of the membrane.

    Integral Proteins That Span the Membrane:

    M. Bretscher first demonstrated the existence of inte­gral proteins that span the entire membrane. In a se­ries of elegant experiments, Bretscher showed that radioactive ligands specific for membrane proteins of the erythrocyte were bound in smaller quantities to intact cells than to disrupted cells. Disruption of the cells was shown to expose portions of the membrane proteins previously facing the cell interior, thereby al­lowing additional radioactive ligand to associate with the protein.

    T. L. Steck developed a technique for converting fragments of disrupted erythrocyte membranes into small vesicles that were either “right-side-out” (i.e., the external face of the membrane also formed the ex­ternal face of the vesicle) or “inside-out” (Fig. 15-13).

    When proteolytic enzymes were added to separate suspensions of each type of vesicle, certain of their membrane proteins were found to be equally suscepti­ble to digestion and could therefore be enzymatically attacked from either membrane surface. These pro­teins clearly spanned the membrane. Other proteins were susceptible to enzymatic digestion only when present in right-side-out or inside-out vesicles, indicat­ing their differential distribution in the membrane’s outer and inner surfaces.

    Integral proteins that span the entire membrane contain two outer regions that are hydrophilic (i.e., one at each surface of the membrane) the central re­gion is hydrophobic (Fig. 15-12). Carbohydrate asso­ciated with the hydrophilic region facing the cell’s sur­roundings is believed to play a role in maintaining the orientation of the protein within the membrane. The hydrophilic sugars, together with the hydrophilic side chains of amino acids in the out: region of the pro­tein, effectively prevent reorientation of the protein in the direction of the hydrocarbon core of the lipid bi­layer.

    3. Asymmetric Distribution of Membrane Proteins:

    The outer and inner regions of the plasma membrane do not contain either the same types or equal amounts of the various peripheral and integral proteins. For ex­ample, the outer half of the erythrocyte membrane contains far less protein than does the inner, half.

    In addition, various membrane proteins may be present in significantly different quantities the membranes of some cells contain a hundred times as many molecules of one protein species as another. Moreover, regard­less of absolute quantity, all copies of a given mem­brane protein species have exactly the same orienta­tion in the membrane.

    The differential distribution of proteins in the various regions of the plasma mem­brane within a single cell was described earlier in con­nection with liver parenchymal cells and intestinal epithelium. This irregular distribution of membrane proteins is known as membrane asymmetry. Not only are the proteins of plasma membranes asymmetri­cally distributed but so too are the proteins of the mem­branes of the endoplasmic reticulum and vesicular or­ganelles (e.g., mitochondria).

    4. Mobility of Membrane Proteins:

    When cells are grown in culture, there is an occasional fusion of one cell with another to form a larger cell. The frequency of cell fusion can be greatly increased by adding Sendai virus to the cell culture. In the pres­ence of this virus, even different strains of cells can be induced to fuse, producing hybrid cells or heterokaryons. D. Frye and M. Edidin utilized this phenom­enon to demonstrate that membrane proteins may not maintain fixed positions in the membrane but may move about laterally through the bilayer.

    Frye and Edidin induced the fusion of human and mouse cells to form heterokaryons and, using fluorescent antibody labels, followed the distribution of human and mouse membrane proteins in the heterokaryon during the time interval that followed fusion.

    At the onset of fu­sion, human and mouse membrane proteins were re­spectively restricted to their “halves” of the hybrid cell, but in less than an hour both protein types be­came uniformly distributed through the membrane (Fig. 15-14). The distribution of the membrane pro­teins was not dependent on the availability of ATP and was not prevented by metabolic inhibitors, indicating that lateral movement of proteins in the membrane oc­curred by diffusion.

    Although some membrane proteins are capable of lateral diffusion, many are not. G. Nicolson and others have obtained evidence suggesting that many integral proteins are restrained within the membrane by a pro­tein network lying just under the membrane’s inner surface (Fig. 15-9). In many cells, this network is as­sociated with a system of cytoplasmic filaments and microtubules that radiate through the cytosol forming a cytoskeleton.

    5. Enzymatic Properties of Membrane Proteins:

    Membrane proteins have been shown to possess enzy­matic activity. Table 15-1 lists some of the enzymes that are now recognized as constituents of the plasma membrane of various cells. To this list of proteins must be added receptor proteins (such as the insulin- binding sites of the liver plasma membrane) and struc­tural or non-enzymatic proteins.

    Ectoenzymes and Endoenzymes:

    Enzymes disposed in the plasma membrane may be characterized accord­ing to the membrane face containing the enzymatic activity. Accordingly, ectoenzymes are those enzymes whose catalytic activity is associated with the exterior surface of the plasma membrane the activity of plasma membrane endoenzymes is associated with the interior of the cell. Many (perhaps all) plasma membrane ectoenzymes are glycoproteins.

    6. Isolation and Characterization of Membrane Proteins:

    Because of the relative ease with which they may be purified, the plasma membranes of erythrocytes pro­vided much of the early information on the chemistry of proteins (and lipids) present in membranes. Now, however, plasma membranes can be obtained from many cell types in a reasonably uncontaminated state using various forms of density gradient centrifugation.

    Nonetheless, the individual protein constituents of the membrane are not so easily extricated for indi­vidual study because of their high degree of insolubil­ity. Varying degrees of success in extracting proteins from the plasma membrane have been achieved using organic detergents (especially sodium dodecyl sulfate, SDS) and concentrated solutions of urea, n-butanol, and ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA).

    These chemicals have a disaggregating effect on membranes and cause the release of many of the membrane pro­teins by dissociating the bonds that link the proteins together or to other membrane constituents. Often, the removal of these agents from a preparation of sol- ubilized membrane proteins is quickly followed by the reassociation or reaggregation of the proteins to form an intractable matrix.

    Once solubilized, the membrane proteins can be sep­arated into discrete classes using electrophoresis, chromatography, or other procedures. This generally demands that the dissociating agents be present in the separating medium (e.g., the electrophoresis gel, the column eluent, etc.) other­wise, application of the membrane extract to the me­dium is followed by membrane protein reaggregation into insoluble complexes that will not separate into distinct fractions.

    For example, the separation of liver plasma membrane proteins is achieved only if the electrophoresis gel contains SDS. The solubility problem has been one of the greatest barriers to progress in isolating and fully characterizing the proteins of membranes.

    Some of the plasma membrane enzymes listed in Table 15-1 have not actually been isolated from the membrane, as removal and isolation of the enzyme is not a prerequisite for establishing its presence. In­stead, the enzyme activity can be measured directly in the (un-solubilized) membrane preparation.