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Come si forma la plasmina dal plasminogeno?


Nella recensione di Ganong sulla fisiologia medica viene menzionato che il plasminogeno viene convertito in plasmina attiva quando l'attivatore del plaminogeno di tipo tissutale idrolizza il legame tra Arg560 e Valina 561. Qualcuno può mostrare il meccanismo molecolare? Cosa succede alle due diverse parti della catena idrolizzata.


L'attivatore tissutale del plasminogeno è una serina proteasi costituita da circa 530 aminoacidi e circa il 13% di carboidrati.

Questo enzima è composto da cinque domini che svolgono funzioni diverse. Il dominio finger e i due domini kringle sono coinvolti nel legame del t-PA alla fibrina, mentre il dominio del fattore di crescita epidermico è responsabile dell'attivazione del recettore EGF. Kringle 1 aiuta anche nel trasporto di questa molecola attraverso le cellule endoteliali del fegato. Kringle 2 aiuta anche a legarsi con il plasminogeno inattivo. Il dominio della serina proteasi scinde il plasminogeno in Arg561-Val562 e lo attiva in plasmina.

(Fonte immagine: https://www.researchgate.net/figure/Structure-and-functions-of-tissue-type-Plasminogen-Activator-tPA-A-Structure-of_fig1_284797342)

Il plasminogeno è il precursore per la sintesi della proteasi plasmina. Il plasminogeno viene convertito in plasmina scindendo Arg561 e Val562. La plasmina attivata si forma creando un legame disolfuro tra queste due catene polipeptidiche.

La catena pesante è al N-terminale e la catena leggera è al C-terminale. L'attivazione avviene rimuovendo il peptide segnale e il peptide di attivazione mediante scissione autolitica. Questo peptide di attivazione viene rilasciato dall'N-terminale per convertire la Glu-plasmina in Lys-Plasmin. Il sito attivo che svolge un ruolo nel legame con la fibrina è situato sulla catena leggera.

(Fonte immagine: https://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzyme-explorer/analytical-enzymes/plasmin.html)

Quindi, questa proteolisi produce solo una sequenza peptidica funzionante, poiché il legame peptidico si è scisso e quindi gli amminoacidi sono nuovamente uniti dal legame disolfuro. E questo legame peptidico tra arginina e valina è a 561/562 invece di 560/561 secondo varie fonti.


Fibrinolisi: un sistema primordiale legato alla risposta immunitaria

Il sistema fibrinolitico fornisce un mezzo essenziale per rimuovere depositi di fibrina e coaguli di sangue. L'effettiva proteasi responsabile di ciò è la plasmina, formata dal suo precursore, il plasminogeno. La fibrina è annunciata come il substrato più rinomato, ma da molti anni è noto che la plasmina scinde molti altri substrati e attiva anche altri sistemi proteolitici. Recenti studi clinici hanno dimostrato che la promozione della plasmina può portare a un fenotipo immunosoppresso, in parte attraverso la sua capacità di modulare l'espressione delle citochine. Quasi tutte le cellule immunitarie ospitano almeno uno su una dozzina di recettori del plasminogeno che consente la formazione di plasmina sulla superficie cellulare che a sua volta modula il comportamento delle cellule immunitarie. Allo stesso modo, una moltitudine di agenti patogeni può anche esprimere i propri attivatori del plasminogeno o contenere proteine ​​di superficie che forniscono siti di legame che ospitano il plasminogeno. La plasmina formata in queste circostanze consente anche a questi agenti patogeni di modulare i meccanismi di difesa immunitaria dell'ospite. Studi filogenetici hanno rivelato che il sistema di attivazione del plasminogeno precede la comparsa della fibrina, indicando che la plasmina non si è evoluta come proteasi fibrinolitica ma forse ha le sue radici come proteasi immunomodificante. Mentre la sua capacità di rimuovere la fibrina è diventata evidente nei vertebrati inferiori, queste funzioni di modificazione immunitaria primitive e poco apprezzate rimangono ancora e ora stanno diventando più riconosciute.

Parole chiave: fibrinolisi risposta immunitaria infiammazione attivazione del plasminogeno.


Meccanismo di generazione di plasmina da S100A10

Il plasminogeno (Pg) viene scisso per formare plasmina dall'azione di specifici attivatori del plasminogeno come l'attivatore tissutale del plasminogeno (tPA). Sebbene l'interazione di tPA e Pg con la superficie del coagulo di fibrina sia stata ben caratterizzata, la loro interazione con i recettori Pg della superficie cellulare è poco conosciuta. S100A10 è un recettore Pg sulla superficie cellulare che svolge un ruolo chiave nella generazione di plasmina cellulare. Nel presente rapporto, abbiamo utilizzato varianti di tPA commutate/cancellate, varianti troncate del plasminogeno e proteine ​​mutanti site-directed S100A10 per definire le regioni responsabili della generazione di plasmina S100A10-dipendente. In contrasto con il ruolo stabilito del dominio finger di tPA nella generazione di plasmina stimolata dalla fibrina, mostriamo che il dominio kringle-2 di tPA svolge un ruolo chiave nella generazione di plasmina S100A10-dipendente. Il dominio kringle-1 del plasminogeno, indispensabile per il legame con la fibrina, è anche critico per la generazione di plasmina dipendente da S100A10. S100A10 mantiene l'attività dopo la sostituzione o la delezione della lisina carbossi-terminale suggerendo che i residui interni di lisina contribuiscono alla sua attività di generazione di plasmina. Questi studi definiscono un nuovo paradigma per l'attivazione del plasminogeno da parte del recettore del plasminogeno, S100A10.

Parole chiave: S100A10 annessina A2 plasmina plasminogeno regolazione del plasminogeno attivatore tissutale del plasminogeno.


10 elementi essenziali sulla plasmina

La coagulazione del sangue, o anche conosciuta come coagulazione, è un processo che previene l'eccessiva perdita di sangue quando un vaso sanguigno è ferito. La capacità del corpo di controllare il flusso di sangue dopo una lesione vascolare è fondamentale per la sopravvivenza.

I coaguli di sangue possono verificarsi in circostanze e luoghi diversi. Se il coagulo di sangue prende forma in risposta a una lesione oa un taglio, è normalmente un meccanismo benefico del corpo che arresta il sanguinamento potenzialmente pericoloso e l'eccessiva perdita di sangue.

Il processo di coagulazione del sangue fino alla successiva dissoluzione del coagulo, dopo la riparazione del tessuto danneggiato, è definito emostasi.

L'emostasi comprende quattro eventi principali che si verificano in un ordine in seguito alla perdita dell'integrità vascolare:

1. La fase iniziale del processo è costrizione vascolare. Ciò limita il flusso di sangue nell'area della lesione.

2. Successivamente, le piastrine vengono attivate dalla trombina e si aggregano nel sito della lesione, formando un tappo piastrinico temporaneo e libero. Il fibrinogeno proteico è principalmente responsabile della stimolazione dell'aggregazione piastrinica. Le piastrine si aggregano legandosi al collagene che viene esposto in seguito alla rottura del rivestimento endoteliale dei vasi.

Dopo l'attivazione, le piastrine rilasciano il nucleotide, l'ADP e l'eicosanoide, TXA2 (entrambi attivano piastrine aggiuntive), serotonina, fosfolipidi, lipoproteine ​​e altre proteine ​​importanti nella cascata della coagulazione.

Oltre alla secrezione indotta, le piastrine attivate cambiano forma per adattarsi alla formazione del tappo.

3. Per assicurare la stabilità del tappo piastrinico inizialmente allentato, si forma una rete di fibrina (chiamata anche coagulo) che intrappola il tappo. Se la spina contiene solo piastrine si chiama trombo bianco se sono presenti globuli rossi si parla di a trombo rosso.

4. Infine, il coagulo deve essere sciolto affinché il normale flusso sanguigno riprenda dopo la riparazione dei tessuti. La dissoluzione del coagulo avviene attraverso l'azione di plasmina.


Astratto

Obbiettivo-

Il sistema plasmina/plasminogeno è coinvolto nell'aterosclerosi. Tuttavia, i meccanismi con cui stimola la malattia non sono completamente definiti. Un evento chiave nell'aterogenesi è la deposizione di lipoproteine ​​a bassa densità (LDL) sulle pareti arteriose dove viene modificata, aggregata e trattenuta. I macrofagi vengono reclutati per eliminare le lipoproteine ​​e diventano cellule schiumose. L'obiettivo di questo studio era di valutare il ruolo della plasmina nell'assorbimento da parte dei macrofagi delle LDL aggregate e nella formazione di cellule schiumose.

Approccio e risultati—

Il trattamento con plasminogeni dei macrofagi che catabolizzare le LDL aggregate ha accelerato significativamente la formazione di cellule schiumose. L'interazione dei macrofagi con le LDL aggregate ha aumentato l'espressione superficiale del recettore dell'attivatore del plasminogeno di tipo urochinasi e dell'attività dell'attivatore del plasminogeno, con conseguente aumento della capacità di generare plasmina sulla superficie cellulare. L'alto livello locale di plasmina scinde le LDL aggregate associate alle cellule, consentendo a una parte dell'aggregato di essere sequestrata in un compartimento acido quasi sigillato, ma extracellulare. Il basso pH nel compartimento indotto dalla plasmina consente agli enzimi lisosomiali, erogati tramite l'esocitosi del lisosoma, una maggiore attività, con conseguente idrolisi più efficiente dell'estere del colesterolo e somministrazione di un grande carico di colesterolo ai macrofagi, favorendo così la formazione di cellule schiumose.

Conclusioni-

Questi risultati evidenziano un ruolo critico della plasmina nel catabolismo delle LDL aggregate da parte dei macrofagi e forniscono un nuovo contesto per considerare il ruolo aterogenico della plasmina.

Introduzione

Molteplici linee di evidenza suggeriscono che il sistema plasmina/plasminogeno è coinvolto nell'inizio e nella progressione dell'aterosclerosi. 1-9 La plasmina è una serina proteasi fibrinolitica in grado di degradare direttamente i componenti della matrice extracellulare e di attivare le metalloproteinasi della matrice. 10-12 Aumenti locali dell'attività fibrinolitica associati ai vasi aterosclerotici umani sono stati originariamente segnalati >40 anni fa 13 e da allora sono stati confermati. 1–4,10 La plasmina viene generata tramite la scissione del plasminogeno da un attivatore del plasminogeno di tipo urochinasi (uPA) o da PA tissutale. I monociti/macrofagi sono una fonte importante di uPA nelle lesioni aterosclerotiche 10 dove è sintetizzato in una forma immatura, nota come pro-uPA. 14 Pro-uPA si attiva quando si lega al recettore uPA del recettore della superficie cellulare (uPAR), accelerando così la conversione del plasminogeno in plasmina. 15 Nonostante un'ampia ricerca, il ruolo del sistema plasmina/plasminogeno nella formazione e nella progressione della lesione aterosclerotica rimane caratterizzato in modo incompleto.

Studi su modelli sia umani che murini indicano un ruolo aterogenico per la plasmina. 1 In numerosi ampi studi clinici, è stato dimostrato che elevate concentrazioni plasmatiche sia della plasmina che del suo precursore plasminogeno sono fattori di rischio sia per l'aterosclerosi che per l'infarto del miocardio. 2-4 Inoltre, l'espressione di uPA 10,16,17 e uPAR 18,19 è sovraregolata nelle lesioni aterosclerotiche e correla con la gravità della malattia. 16,18 Le analisi di immunolocalizzazione hanno dimostrato che la colorazione dell'uPAR è localizzata nei macrofagi nella neointima delle lesioni aterosclerotiche, ma si trova poco uPAR sui macrofagi nelle arterie non aterosclerotiche. 19 Inoltre, la sovraespressione di uPA mirata ai macrofagi è aterogenica sia nei topi ApoE -/- che LDLR -/-, 6-8, mentre il knockout uPA specifico dei macrofagi è ateroprotettivo nei topi ApoE -/-. 9 Questi dati supportano fortemente l'ipotesi che un'elevata espressione di uPA da parte dei macrofagi della parete arteriosa acceleri l'aterosclerosi. Nonostante il fatto che sia gli studi sugli animali che quelli sull'uomo abbiano indicato un ruolo chiave dei macrofagi nei meccanismi aterogenici del sistema plasmina/plasminogeno, la maggior parte della ricerca si è concentrata sulla modificazione mediata dalla plasmina della matrice extracellulare. 20,21 Pertanto, non è ancora emerso un quadro coerente del ruolo del sistema plasmina/plasminogeno nell'aterogenesi, in particolare rispetto alla biologia dei macrofagi.

Il nostro laboratorio è interessato alla conversione dei macrofagi in cellule schiumose attraverso la loro interazione con le lipoproteine ​​aggregate a bassa densità (agLDL). Sebbene la maggior parte degli studi esamini la formazione di cellule schiumose attraverso l'incubazione di macrofagi con LDL monomeriche modificate (p. es., LDL ossidate), ciò non riflette accuratamente l'ambiente in vivo perché la stragrande maggioranza delle LDL nelle placche aterosclerotiche è aggregata e avidamente legata al subendoteliale matrice. 22-24 Ad esempio, >90% delle lipoproteine ​​​​lesionali nelle strisce di grasso aortico umano non sono state rilasciate mediante estrazione o elettroforesi, 24 e l'interazione monociti/macrofagi con agLDL nelle lesioni aterosclerotiche è stata visualizzata con la microscopia elettronica. 25 Pertanto, i meccanismi di formazione delle cellule schiumose basati sull'ingestione di LDL aggregato, piuttosto che monomerico, possono essere più rilevanti dal punto di vista fisiologico.

Precedenti studi nel nostro laboratorio e altri hanno chiarito un nuovo percorso per la formazione di cellule schiumose dei macrofagi attraverso il catabolismo di agLDL. 26-28 Abbiamo dimostrato che quando i macrofagi entrano in contatto con gli aggregati LDL, si forma un compartimento extracellulare, acido, idrolitico (una sinapsi lisosomiale). I lisosomi vengono consegnati alla sinapsi lisosomiale tramite esocitosi mirata, che si traduce nell'idrolisi degli esteri del colesterolo LDL (CE) e nel trasferimento del colesterolo libero (FC) al macrofago con successiva formazione di cellule schiumose. 27 Il laboratorio Kruth ha esaminato gli effetti della plasmina sui macrofagi che interagiscono con agLDL. 29 Hanno scoperto che il trattamento con plasmina può disaggregare e rilasciare molto, ma non tutto, l'agLDL contenuto nella sinapsi lisosomiale (chiamata anche compartimento connesso alla superficie), generando strutture lipoproteiche simili a quelle osservate a livello extracellulare nelle lesioni aterosclerotiche. È probabile che il rilascio di agLDL mediato dalla plasmina sia causato dalla degradazione dell'apolipoproteina B. 30

In questo studio, esaminiamo gli effetti della plasmina sull'interazione tra macrofagi e lipoproteine ​​aggregate. Piuttosto che esaminare l'aggregato rilasciato dal trattamento con plasmina, ci concentriamo sulla porzione dell'aggregato che non viene rilasciata dalla sinapsi lisosomiale e rimane associata alla cellula. Sorprendentemente, abbiamo scoperto che il trattamento con plasminogeno dei macrofagi che interagiscono con agLDL ha causato un aumento significativo della formazione di cellule schiumose. L'incubazione dei macrofagi con agLDL ha aumentato l'espressione superficiale dell'attività di uPAR e PA, che produrrebbe un alto livello di plasmina vicino alla superficie cellulare. Per comprendere il meccanismo con cui la plasmina promuove la formazione di cellule schiumose, abbiamo visualizzato gli effetti del trattamento con plasmina sulle interazioni agLDL dei macrofagi utilizzando diverse tecniche di microscopia e biochimica. Questi esperimenti indicano che la plasmina scinde l'agLDL associato alle cellule, determinando cambiamenti nella morfologia della sinapsi lisosomiale e consentendo il sequestro di una porzione dell'aggregato in un compartimento acido quasi sigillato, ma extracellulare, actina-dipendente. I cambiamenti morfologici nel compartimento indotti dalla plasmina facilitano la generazione di un ambiente più acido, che a sua volta consente una maggiore attività degli enzimi lisosomiali. Ciò si traduce in un'idrolisi CE più efficiente e nella consegna di un grande carico di colesterolo al macrofago. Questi risultati indicano che le concentrazioni fisiologiche di plasminogeno sono sufficienti per l'elaborazione dell'agLDL mediata dalla plasmina e forniscono un meccanismo per la capacità della plasmina di accelerare la formazione di cellule schiumose e l'aterosclerosi. Una comprensione dettagliata dei meccanismi di formazione delle cellule schiumose è indispensabile per il successo del targeting terapeutico dell'aterosclerosi.

Materiali e metodi

Materiali e metodi sono disponibili nel Supplemento solo online.

Risultati

L'incubazione dei macrofagi con plasminogeno accelera la formazione di cellule schiumose

Per esaminare gli effetti della plasmina sull'assorbimento da parte dei macrofagi di agLDL, i macrofagi derivati ​​dal midollo osseo che interagiscono con AlexaFluor-546 (Alexa546)-agLDL sono stati incubati per 4 ore in assenza (Figura 1A) o in presenza di una concentrazione fisiologica di plasminogeno senza (Figura 1A). 1B) o con (Figura 1C) α2-trattamento antiplasmina. Dopo l'incubazione con agLDL, le cellule sono state fissate ed etichettate con LipidTOX Green per rilevare le goccioline lipidiche. LipidTOX Green colora anche la porzione CE dell'agLDL, quindi gli aggregati appaiono giallo/arancione. In assenza di plasminogeno, la maggior parte degli agLDL è rimasta extracellulare dopo 4 ore di incubazione e si è potuta osservare solo una piccola percentuale di cellule contenenti goccioline LipidTOX-positive (Figura 1A). Tuttavia, i macrofagi derivati ​​dal midollo osseo incubati con agLDL in presenza di plasminogeno hanno portato alla formazione di numerose cellule contenenti goccioline di lipidi neutri (Figura 1B, frecce), indicative della formazione di cellule schiumose. La percentuale di cellule LipidTOX-positive è stata quantificata per ciascuna condizione. Il trattamento con una concentrazione fisiologica di plasminogeno ha causato un aumento di 3 volte del numero di macrofagi derivati ​​dal midollo osseo contenenti goccioline lipidiche (Figura 1D). Quando sono stati esaminati gli effetti del plasminogeno sulla formazione di cellule schiumose nei macrofagi derivati ​​da monociti umani (huMDM), è stato osservato un aumento di 2 volte del numero di cellule contenenti goccioline lipidiche (Figura I nel supplemento dati solo online).

Figura 1. L'incubazione dei macrofagi con lipoproteine ​​a bassa densità aggregate (agLDL) in presenza di una concentrazione fisiologica di plasminogeno determina un aumento della formazione di cellule schiumose. I macrofagi derivati ​​dal midollo osseo (BMM) sono stati incubati per 4 ore con Alexa546-agLDL (rosso) in assenza (UN) o presenza di 2 μmol/L di plasminogeno (B e C), fissato ed etichettato con LipidTOX Green (verde). L'incubazione cellulare con agLDL in presenza di una concentrazione fisiologica di plasminogeno determina la formazione di goccioline lipidiche LipidTOX-positive (B, frecce). Applicazione di α2-antiplasmina ha impedito la formazione di goccioline lipidiche LipidTOX-positive (C). D, La quantificazione della percentuale di cellule LipidTOX-positive dimostra un aumento di 3 volte nella formazione di cellule schiumose attribuibile alla plasmina. ***P≤0,001 ANOVA a 2 vie. Dati raccolti da 3 esperimenti indipendenti. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM).

Il trattamento con plasmina può portare all'induzione di citochine proinfiammatorie che possono causare la morte cellulare. 31 Per indagare se l'aumento della formazione di cellule schiumose osservato con l'aggiunta di plasminogeno fosse parzialmente il risultato della fagocitosi dei macrofagi delle cellule morte, abbiamo eseguito un controllo in cui le cellule sono state incubate con plasminogeno in assenza di agLDL. Non c'era differenza nella quantità di macrofagi derivati ​​dal midollo osseo LipidTOX-positivi nelle cellule trattate con plasminogeno e nelle cellule non trattate (dati non mostrati).

Cellule incubate con agLDL e trattate sia con plasminogeno che con inibitore della plasmina α2- l'antiplasmina non ha mostrato la formazione di goccioline lipidiche indotta dal plasminogeno (Figura 1C e 1D), indicando un ruolo specifico della plasmina nell'accumulo di lipidi intracellulari e nella formazione di cellule schiumose. L'aggiunta di α2-antiplasmina ha ridotto la formazione di cellule schiumose a livelli inferiori a quelli osservati per il solo agLDL (Figura 1D). È stato riportato che la quantità di plasminogeno contenuto nel siero è sufficiente per agire sul processamento dell'agLDL dei macrofagi. 29 Gli esperimenti mostrati nella Figura 1 sono stati eseguiti in un mezzo contenente siero, quindi è possibile che sia il plasminogeno aggiunto esternamente che il plasminogeno derivato dal siero contribuiscono all'aumento osservato nella formazione di cellule schiumose. Coerentemente con questo, quando lo stesso esperimento è stato eseguito in terreno privo di siero, non c'era differenza statisticamente significativa nella formazione di cellule schiumose tra cellule trattate con solo agLDL e cellule trattate con plasminogeno e α2-antiplasmina in aggiunta all'agLDL (dati non mostrati).

L'incubazione dei macrofagi con agLDL determina un aumento dell'espressione di uPAR in superficie e dell'attività PA

Per comprendere il meccanismo con cui il plasminogeno promuove la formazione di cellule schiumose, abbiamo prima studiato il livello di attività locale della plasmina sulla membrana plasmatica dei macrofagi. È noto che l'espressione di uPAR può essere indotta dal caricamento dei macrofagi di acidi grassi. 32,33 Pertanto, ci siamo chiesti se l'incubazione dei macrofagi con agLDL avrebbe causato un aumento dell'espressione di uPAR sulla superficie. Per testare ciò, abbiamo eseguito l'etichettatura della superficie dell'immunofluorescenza di uPAR in cellule J774 non permeabilizzate incubate con agLDL. Nelle cellule a riposo, è stata osservata una piccola quantità di colorazione uPAR sulla superficie cellulare (Figura 2A). Durante il trattamento con agLDL per 4 ore, la quantità di colorazione uPAR superficiale è stata significativamente aumentata (Figura 2B). La quantificazione dei livelli superficiali di uPAR in diversi momenti ha rivelato un forte aumento dei livelli superficiali di uPAR a 2 ore che ha raggiunto un plateau a 4 ore (Figura 2C). Questi risultati si adattano all'osservazione di un aumento della colorazione di uPAR nella colocalizzazione con i macrofagi nelle lesioni aterosclerotiche umane. 18,19

Figura 2. L'espressione del recettore dell'attivatore del plasminogeno di tipo urochinasi (uPAR) e l'attività dell'attivatore del plasminogeno (PA) aumentano durante l'incubazione dei macrofagi con lipoproteine ​​a bassa densità aggregate (agLDL). Le cellule J774 sono state incubate con agLDL per 0 (UN) o 4 ore (B), fissato senza permeabilizzazione e marcato con un anticorpo contro uPAR. C, Quantificazione della colorazione uPAR superficiale di cellule J774 incubate con agLDL per periodi di tempo indicati. I valori tracciati sono l'intensità di colorazione uPAR della superficie integrata per cellula. I dati mostrati provengono da un esperimento rappresentativo di 3 esperimenti indipendenti. Le barre di errore rappresentano il SEM. D, le cellule J774 sono state incubate in assenza o presenza di agLDL per i periodi di tempo indicati, seguite da un'incubazione di 30 minuti con 2 μmol/L di plasminogeno e la concentrazione di plasmina generata è stata misurata utilizzando un substrato cromogenico specifico per la plasmina. I cambiamenti nell'attività PA risultanti dall'incubazione con agLDL sono stati quantificati dividendo la concentrazione di plasmina generata dalle cellule incubate con agLDL per la concentrazione di plasmina misurata per le cellule incubate nei soli terreni per lo stesso periodo di tempo. Dati raccolti da 3 esperimenti indipendenti. Le barre di errore rappresentano il SEM.

Successivamente, abbiamo misurato l'attività PA associata alla superficie cellulare in funzione del tempo di incubazione di agLDL. I macrofagi J774 sono stati incubati con agLDL per varie volte seguito dall'aggiunta di plasminogeno per 30 minuti e la concentrazione di plasmina generata è stata misurata utilizzando un substrato cromogenico specifico per la plasmina. L'aumento dell'attività PA risultante dall'incubazione di agLDL è stato determinato dal rapporto tra la quantità di plasmina generata dai macrofagi incubati con agLDL divisa per la concentrazione di plasmina generata dai macrofagi incubati nei soli terreni (Figura 2D). L'attività PA di superficie è aumentata di 2,5 volte dopo un'incubazione di 4 ore con agLDL, indicando che i macrofagi sono in grado di generare alti livelli locali di plasmina sulla membrana plasmatica in risposta al contatto con agLDL.

La plasmina provoca cambiamenti morfologici nella sinapsi lisosomiale che si traducono in un restringimento del compartimento

Per visualizzare le conseguenze di questi alti livelli locali di plasmina, abbiamo eseguito l'imaging time-lapse delle cellule che interagiscono con Alexa488-agLDL prima e durante il trattamento con plasmina (Figura 3A e 3B). Le cellule sono state incubate con Alexa488-agLDL per 1 ora per consentire la formazione di sinapsi lisosomiale seguita dall'aggiunta di 1 U/mL di plasmina al campione sul palco del microscopio. Coerentemente con gli studi precedenti, l'imaging time-lapse 29 mostra la scissione e la rimozione di gran parte dell'agLDL extracellulare durante il trattamento con plasmina, mentre una parte dell'aggregato rimane associata alle cellule (Figura 3B, vedere anche il film I nel supplemento dati solo online). Per caratterizzare ulteriormente la frazione dell'aggregato che rimane associata alla cellula dopo il trattamento con plasmina, le cellule sono state incubate con agLDL marcato con oro colloidale e riprese mediante microscopia elettronica a trasmissione. La microscopia elettronica ha confermato la presenza di agLDL associato alla superficie che risiede in compartimenti in corrispondenza o in prossimità della superficie cellulare in assenza di trattamento con plasmina (Figura 3C, cerchiata). Abbiamo dimostrato in precedenza che questi sono compartimenti collegati alla superficie, acidificati, contenenti idrolasi, che abbiamo chiamato sinapsi lisosomiali. 27 Dopo la rimozione di gran parte dell'aggregato extracellulare da parte della plasmina, l'agLDL rimanente si trovava in un compartimento vicino alla superficie cellulare che sembrava essere intracellulare nelle sezioni sottili EM (asterischi nella Figura 3D).

Figura 3. La plasmina provoca cambiamenti morfologici nella sinapsi lisosomiale che si traducono in un restringimento del compartimento. UN e B, Fotogrammi fissi da un filmato time-lapse di cellule prima e dopo il trattamento con plasmina. Le cellule J774 sono state incubate con lipoproteine ​​a bassa densità aggregate Alexa488 (agLDL green) per 60 min (UN), è stata aggiunta 1 U/mL di plasmina sul tavolino del microscopio e l'acquisizione dei dati è stata continuata. B, Cellule 30 min dopo il trattamento con plasmina. Le cellule J774 sono state incubate con agLDL marcato con oro colloidale per 45 minuti, non trattate (C) o trattati con 1 U/mL di plasmina durante gli ultimi 15 min di incubazione (D). Senza trattamento con plasmina l'oro-agLDL risiede nelle sinapsi lisosomiali (C, cerchiato). Il trattamento con plasmina porta alla formazione di compartimenti intracitoplasmatici contenenti agLDL condensato (D, asterischi). Le cellule J774 sono state incubate con streptavidina-Alexa488-agLDL (verde) per 60 minuti e non trattate (E) o trattati con 1 U/mL di plasmina durante gli ultimi 15 min di incubazione (F e G). Le cellule sono state pulsate per 2 minuti con Alexa546-biotina (rosso) alla fine dell'incubazione (E), dopo (F), o prima (G) trattamento con plasmina. In assenza di trattamento con plasmina, l'agLDL nella sinapsi lisosomiale è disponibile per la marcatura della biotina (E, giallo). Tuttavia, l'agLDL nei compartimenti indotti da plasmina non è disponibile per il legame con la biotina dopo il trattamento con plasmina (assenza di giallo in F). AgLDL nei compartimenti indotti da plasmina era esposto in superficie e disponibile per il legame della biotina prima del trattamento con plasmina (G, giallo). Le cellule J774 sono state incubate con Alexa546-agLDL (rosso) per 45 min (h e io) o per 30 min seguito da un rilascio di 15 min con 1 U/mL di plasmina (J e K) ed etichettato su ghiaccio con la subunità B della tossina del colera Alexa488 (CtB verde) prima della fissazione. In assenza di trattamento con plasmina, l'agLDL che risiede nella sinapsi lisosomiale è disponibile per la marcatura di CtB (h e io, giallo, frecce). Compartimenti indotti dalla plasmina (J e K, frecce) non sono disponibili per CtB come indicato dall'assenza di etichettatura verde intorno agLDL. K e K', Immagine confocale ad alto ingrandimento di una cellula trattata con plasmina. AgLDL in compartimenti CtB-negativi indotti da plasmina (K, frecce) conserva la connessione con agLDL extracellulare (K', freccia). La linea rossa in K indica la posizione del z ricostruzione mostrata in K'. Allo stesso modo, la linea blu in K' designa la posizione del X aereo mostrato in K. Le cellule J774 e gli huMDM (inserto) sono stati incubati con isotiocianato di fluoresceina (FITC)-agLDL (l e m, verde) per 45 min, trattata con 1 U/mL di plasmina per 15 min e spenta con tampone di acido 2-(N-morfolino)etansolfonico (MES pH 5,5). FITC-agLDL (l) prima della tempra, (m) dopo la tempra, e (n) corrispondente contrasto di interferenza differenziale (DIC). AgLDL nel compartimento indotto da plasmina viene spento da tampone a basso pH impermeabile alle cellule (m). oh attraverso Q, Le cellule di controllo, in cui il citoplasma è stato caricato con 2'7'-bis-(2-carbossietil)-5-(e-6)-carbossifluoresceina (BCECF), non hanno mostrato una diminuzione della fluorescenza durante il trattamento con MES pH 5,5 (P), confermando che il trattamento non ha influito sul pH dei compartimenti intracellulari. BCECF (oh) prima della tempra, (P) dopo la tempra, e (Q) corrispondente DIC.

Per determinare se i compartimenti indotti dalla plasmina sono intracellulari o extracellulari, abbiamo testato l'accessibilità dell'agLDL coniugato con streptavidina alla biotina prima e dopo il trattamento con plasmina (Figura 3E-3G). I macrofagi J774 incubati con streptavidina-Alexa488-agLDL sono stati esposti a un impulso di 2 minuti di Alexa546-biotina per etichettare strutture accessibili alla biotina extracellulare e quindi fissati. Coerentemente con studi precedenti, in assenza di trattamento con plasmina, la colorazione con biotina-Alexa546 ha mostrato chiaramente che l'aggregato era in gran parte extracellulare dopo l'incubazione di 1 ora (Figura 3E). 34 Tuttavia, un impulso di biotina Alexa546 eseguito dopo il trattamento con plasmina risulta in assenza di legame con la biotina (Figura 3F), indicando che l'aggregato in questi compartimenti non è stato etichettato durante una breve incubazione con Alexa546-biotina. Un impulso di biotina Alexa546 seguito da un trattamento con plasmina determina la formazione di compartimenti positivi alla biotina (Figura 3G), confermando che l'aggregato in questi compartimenti è stato esposto in superficie prima del trattamento. Questi dati potrebbero indicare che l'agLDL si trova in un compartimento completamente sigillato, come un fagosoma, ma abbiamo anche considerato la possibilità che il compartimento connesso alla superficie fosse diventato quasi sigillato ma fosse ancora aperto allo spazio extracellulare.

Abbiamo precedentemente utilizzato l'etichettatura della membrana plasmatica con la subunità fluorescente della tossina del colera B (CtB) per caratterizzare l'organizzazione topologica della sinapsi lisosomiale. 27,28 In questo esperimento, le cellule non sono permeabilizzate, quindi il CtB macromolecolare può marcare solo i glicolipidi sulla membrana plasmatica. Abbiamo utilizzato questa tecnica per confrontare la disponibilità di compartimenti contenenti agLDL con CtB con e senza trattamento con plasmina (Figura 3H-3K). A differenza dei compartimenti CtB-positivi nelle cellule non trattate (Figura 3H e 3I, frecce), i compartimenti indotti da plasmina contenenti agLDL generalmente mancano dell'etichettatura CtB (Figura 3J e 3K, frecce). Anche i compartimenti indotti dalla plasmina negli huMDM mancano dell'etichettatura CtB (dati non mostrati). La capacità dei compartimenti indotti dalla plasmina di escludere CtB e Alexa546-biotina suggerisce cambiamenti significativi nella loro permeabilità allo spazio extracellulare rispetto ai compartimenti nelle cellule non trattate. Alla luce di questi risultati, sembrava che il trattamento con plasmina inducesse i compartimenti a sigillarsi completamente ea diventare intracellulari. Pertanto, siamo rimasti sorpresi dal fatto che nella ricostruzione confocale tridimensionale ad alto ingrandimento, l'agLDL nei compartimenti CtB-negativi indotti da plasmina (Figura 3K, frecce) appare continuo con porzioni extracellulari dell'aggregato (Figura 3K′, freccia). Il fatto che l'agLDL nei compartimenti CtB-negativi indotti dalla plasmina sia ancora connesso ai resti extracellulari dell'aggregato mostra che i compartimenti indotti dalla plasmina preservano la connessione allo spazio extracellulare.

Per studiare ulteriormente la connettività superficiale dei compartimenti indotti dalla plasmina, abbiamo utilizzato un metodo basato sull'estinzione dipendente dal pH dei fluorofori extracellulari. Questo approccio è stato utilizzato in precedenza per esaminare i compartimenti che escludono grandi molecole ma preservano la connessione alla superficie cellulare. 35,36 Ad esempio, le cellule endoteliali formano un compartimento sottogiunzionale durante la diapedesi dei monociti che non è accessibile al destrano marcato con fluorescenza ma è sensibile alle variazioni del pH extracellulare. 36 Per esaminare la connettività superficiale dei compartimenti indotti dalla plasmina tramite la modulazione del pH extracellulare, i macrofagi J774 e gli huMDM sono stati incubati con agLDL marcato con isotiocianato di fluoresceina, un fluoroforo sensibile al pH, per 45 minuti, trattati con plasmina 1U/mL per 15 minuti e esaminati in assenza (Figura 3L) o presenza (Figura 3M) di un tampone a basso pH impermeabile alle cellule. 37 La fluorescenza dell'isotiocianato-agLDL di fluoresceina nei compartimenti indotti dalla plasmina viene efficacemente estinta dall'acido 2-(N-morfolino)etansolfonico (pH 5,5 Figura 3L–3N). Le cellule di controllo, in cui il citoplasma è stato caricato con 2′7′-bis-(2-carbossietil)-5-(e-6)-carbossifluoresceina, un sensore di pH fluorescente, non hanno mostrato una diminuzione della fluorescenza durante il trattamento con 2- Acido (N-morfolino)etansolfonico pH 5,5 (Figura 3O-3Q), confermando che il trattamento non ha influenzato il pH dei compartimenti intracellulari. I dati degli huMDM mostrano anche che la fluoresceina dell'isotiocianato-agLDL della fluoresceina nei compartimenti indotti dalla plasmina è efficacemente estinta dall'acido 2-(N-morfolino) etansolfonico (pH 5,5), indicando che nei macrofagi umani la sinapsi lisosomiale rimane collegata alla superficie dopo il trattamento con plasmina (Figura 3L–3N, riquadro). Taken together these data show that plasmin-induced compartments preserve connection to the cell surface, but this connection is more nearly sealed than in compartments in nontreated cells.

Formation of Plasmin-Induced Compartments Is an F-Actin–Dependent Process

The lysosomal synapse is formed via F-actin–driven membrane protrusions surrounding the aggregate, and enhanced actin polymerization is detected during the first hour of the cell-aggregate interaction. 28 To test the role of actin polymerization in the formation and tightening of plasmin-induced compartments, we performed plasmin treatment on J774 macrophages and huMDMs in the presence of the F-actin disrupting drug latrunculin A (Figure 4). In the absence of latrunculin A treatment, agLDL was observed primarily in plasmin-induced compartments (Figure 4A). Consistent with the known function of the lysosomal synapse, the cholesterol-binding dye filipin indicates that these compartments contain high levels of FC (Figure 4B). However, plasmin treatment in the presence of latrunculin A removed almost all of the cell engaged agLDL and inhibited the formation of plasmin-induced compartments and the generation of FC (Figure 4D–4F). These data confirm the critical role of actin polymerization in the formation of plasmin-induced compartments.

Figura 4. Actin polymerization is required for the formation of plasmin-induced compartments. J774 cells and human monocyte–derived macrophages (huMDMs inset) were incubated with Alexa546-agLDL (red) for 30 min and then treated with 1 U/mL plasmin during the last 15 min of aggregate incubation in the absence (UN attraverso C) or presence of 5 μmol/L latrunculin A (LatA D attraverso F). Cells were fixed and labeled with filipin (green B e E). The formation of plasmin-induced compartments is blocked in the presence of LatA.

Plasmin-Induced Compartment Tightening Results in Increased Compartment Acidification

We have previously reported that the lysosomal synapse functions as an extracellular hydrolytic organelle because of targeted exocytosis of lysosomes and compartment acidification by vacuolar (H + )-ATPase on the plasma membrane. 27 The presence of lysosomal acid lipase and a low pH lead to extracellular hydrolysis of CEs. 27,28 However, pH values observed in the lysosomal synapse are typically higher than in lysosomes and fluctuate because of diffusion of H + ions into the extracellular space. 27 To test how tightening of plasmin-induced compartments affects compartment acidification, we labeled LDL with CypHer 5E Mono N-hydroxysuccinimide ester and Alexa488. The fluorescence of CypHer 5E Mono N-hydroxysuccinimide ester increases as the pH decreases from 7 to 5, 38 whereas Alexa488 is pH-independent in this range. Macrophages were incubated with dual-labeled agLDL, and the pH of the aggregate-containing compartment was determined from the ratio of CypHer 5E Mono N-hydroxysuccinimide ester to Alexa488 fluorescence as compared with values obtained in pH calibration buffers. When J774 and huMDMs interacted with the dual-labeled agLDL, regions of low pH could be seen at the contact sites (Figure 5A–5D). Measurements of the lowest pH achieved per compartment revealed that plasmin-induced compartments are significantly more acidic than their counterparts in nontreated cells (Figure 5E). The optimal activity for lysosomal acid lipase is at pH 5.5, 39 which is the average value of the lowest pH recorded in plasmin-induced compartments. The pH in plasmin-induced compartments allows enhanced lysosomal acid lipase activity and thereby more efficient CE hydrolysis than in untreated compartments.

Figura 5. Plasmin treatment results in a decrease in compartment pH. J774 cells (UN e B) and human monocyte–derived macrophages (huMDMs C e D) were incubated with CypHer/Alexa488-labeled agLDL for 1 h, left untreated (UN e C) or treated with plasmin for the last 15 min of incubation (B e D), rinsed with media, and imaged. E, Quantification of lowest pH achieved in the lysosomal synapse and plasmin-induced compartments from 60 untreated and 60 plasmin-treated J774 cells from 3 independent experiments and 20 untreated and 20 plasmin-treated huMDMs from 1 experiment. ***P≤0.001 **P≤0.005 Student T test. Error bars represent the SEM.

CE Hydrolysis in Plasmin-Induced Compartments Is More Efficient, Leading to the Cellular Delivery of Large Amounts of FC

The lower pH of plasmin-induced compartments suggests increased activity of lysosomal enzymes, in particular lysosomal acid lipase. To measure changes in agLDL-derived CE hydrolysis resulting from plasmin treatment, we fixed nontreated and plasmin-treated J774 macrophages and huMDMs and labeled them with the cholesterol-binding dye filipin (Figure 6A–6H). In nontreated cells, agLDL had the typical thread-like morphology, and the filipin signal was increased at sites of contact between aggregates and cells because of CE hydrolysis in the lysosomal synapse (Figure 6A–6D, arrows). 27,28 Plasmin treatment caused a change in agLDL morphology resulting in the formation of condensed, cell-associated structures significantly enriched in FC, as reflected by bright filipin labeling (Figure 6E–6H, arrowheads).

Figura 6. The concentration of aggregated low-density lipoprotein (agLDL)–derived free cholesterol (FC) in macrophages increases after plasmin treatment. J774 cells (UN, B, E, e F) and human monocyte–derived macrophages (huMDMs C, D, G, e h) were incubated with Alexa546-agLDL for 45 min and left untreated (UN attraverso D) or treated with 1 U/mL plasmin for the last 15 min of incubation (E attraverso h). Cells were then fixed and labeled with filipin (B, D, F, e h). In the absence of plasmin treatment, a major fraction of the agLDL stays in contact with the cell surface (UN attraverso D, arrows). Plasmin treatment results in formation of cell-associated compartments containing condensed agLDL and a significant amount of FC (E attraverso h, arrowheads). io, J774 cells were incubated with 14 C-cholesteryl oleate-labeled agLDL for 90 min, left untreated, or treated with plasmin during the last 15 min of incubation. After rinsing out extracellular agLDL, cellular lipids were extracted and separated by thin layer chromatography. The amount of agLDL-derived FC and cholesteryl ester was measured by radioautography. ***P≤0.001 Student T test. Data compiled from 2 independent experiments. Error bars represent the SEM.

To measure changes in agLDL-derived CE hydrolysis on plasmin treatment, J774 macrophages were incubated with agLDL reconstituted with 14 C-labeled cholesteryl oleate, left untreated, or treated with plasmin, and the hydrolysis of CE was measured as described previously. 27 We found that the fraction of cell-associated CE that was hydrolyzed to FC after plasmin treatment was 3× higher than in nontreated cells (Figure 6I). These data show that plasmin treatment of macrophages interacting with agLDL results in the delivery of large amounts of FC to the cell, which facilitates the increase in foam cell formation resulting from plasminogen treatment.

Discussione

A key pathogenic event in the development of atherosclerosis is the retention of lipoprotein particles in the subintima. 40 These lipoprotein particles undergo oxidative modification, association with extracellular matrix proteoglycans, and aggregation. 23 Macrophages attempt to clear the lipoproteins and subsequently become foam cells. The physical features of the lipoproteins require distinctive mechanisms for their uptake. In particular, unlike monomeric LDL, the uptake of agLDL does not involve receptor-mediated endocytosis, but rather the aggregate is sequestered in deep invaginations at the cell surface, termed the lysosomal synapse. 26–28 Our studies elucidate the mechanism of a novel pathway by which the plasmin/plasminogen system may act on macrophage-engaged agLDL contributing to accelerated foam cell formation and thereby atherogenesis. The results nicely reconcile the data of the Kruth group, showing that plasminogen releases agLDL from macrophages, 29 with the reported atherogenicity of the plasmin/plasminogen system.

We have shown that plasmin can dramatically alter the early processing of cell-associated agLDL, its uptake by macrophages, and foam cell formation. Figure 7 shows a schematic of the proposed mechanism of plasmin action. Monomeric LDL in the blood stream is deposited in the subintimal space, where it becomes oxidatively modified, retained, and aggregated. When macrophages come into contact with agLDL, they form an extracellular acidic hydrolytic compartment, a lysosomal synapse (Figure 7A and 7B). Interaction of macrophages with agLDL causes upregulation of uPAR and increased PA activity, resulting in the generation of local levels of plasmin sufficient to cleave the aggregate (Figure 7C). Upregulation of macrophage uPAR is also observed in human atherosclerotic lesions, 18,19 possibly because of macrophage interaction with agLDL. The aggregate located in acidic portions of the compartment probably is not cleaved further by plasmin because of the enzyme’s low activity at acidic pH. 39 Cleavage of macrophage-engaged agLDL results in tightening of the plasmin-induced compartment in an actin-dependent manner. Compartment tightening allows more efficient generation of an acidic environment and enhanced activity of lysosomal enzymes that are exocytosed to the lysosomal synapse (Figure 7D). This results in accelerated agLDL catabolism, leading to the delivery of large amounts of FC to the macrophage, thereby promoting foam cell formation. For clarity, we note that the lysosomal synapse forms independently of plasmin and is then modified by plasmin.

Figura 7. Proposed model explaining the mechanism of plasmin-induced foam cell formation. UN, Monomeric low-density lipoprotein (LDL red) in the blood stream is deposited in the subintimal space, where it becomes oxidatively modified, retained, and aggregated. When subintimal macrophages (purple) interact with aggregated LDL (agLDL red), an extracellular, acidic, hydrolytic compartment, a lysosomal synapse, is created. B, The lysosomal synapse is formed by F-actin (green)–driven plasma membrane protrusions. The low pH of the compartment is maintained by V-ATPase in the macrophage plasma membrane. Free cholesterol (FC) may be transferred to the macrophage plasma membrane after hydrolysis of LDL cholesteryl esters (CEs) by lysosomal acid lipase that has been delivered to the compartment via lysosome exocytosis. C, Macrophage interaction with agLDL results in upregulation of surface urokinase-type plasminogen activator receptor (uPAR) expression and increased plasminogen activator (PA) activity resulting in the generation of local levels of plasmin sufficient to cleave the aggregate. The aggregate located in acidic portions of the compartment is not cleaved by plasmin because of its low activity at acidic pH. D, Proteolysis of macrophage-engaged agLDL results in tightening of the plasmin-induced compartment in an actin-dependent process. Compartment tightening allows efficient generation of an acidic environment and enhanced activity of lysosomal enzymes which are exocytosed to the lysosomal synapse. This results in accelerated agLDL catabolism leading to the delivery of large amounts of FC to the macrophage and thereby promoting foam cell formation.

One aspect of the plasmin-induced changes in the physical organization of the lysosomal synapse that we find intriguing is the fact that the compartments do not fully seal. A proposed rationale for the need for extracellular hydrolysis in a lysosomal synapse was that macrophages could not internalize large species or moieties tightly linked to the extracellular matrix, even by phagocytosis. However, after plasmin treatment, there is no apparent reason that the compartments do not fully seal. Further, in the absence of plasmin we have repeatedly observed formation of the lysosomal synapse even with agLDL particles that are small enough to be internalized via phagocytosis. There is some precedence for macrophage surface-connected compartments containing lipoproteins that do not immediately seal. Macrophages sequester large β-very LDL proteins in peripheral tubular compartments that remain surface connected for several minutes. 35 One possible reason the compartments do not fully close is that moieties generated during the catabolism of agLDL inhibit compartment sealing. Phagosome sealing occurs through contractile activities regulated by Rho-family GTPases. 41 In particular, Rac and Cdc42 are transiently activated during phagocytosis. 42 Rac and/or Cdc42 are also involved in macrophage agLDL interactions inducing local actin polymerization to form the lysosomal synapse. 28 We have previously reported that loading of macrophages with FC causes increased Rac activity. 43 Interestingly, it was shown that constant activation of Rac causes a delay in phagosome closure. 44 Thus, it is possible that agLDL-derived FC and potentially other moieties generated during the catabolism of agLDL affect Rho-family GTPase activities in a way that interferes with their activation–inactivation cycle, thus preventing compartment sealing. The detailed signaling mechanisms responsible for lysosomal synapse formation and function are currently under investigation.

The fact that the plasmin-induced compartments retain connection to the extracellular space is relevant to both atherogenesis and macrophage biology. Pharmacological approaches to inhibit lipid accumulation by macrophage foam cells have been pursued intensely as they are thought to be of value in preventing coronary artery disease. 45 However, successes have been limited, possibly because of an incomplete understanding of the mechanisms of foam cell formation in vivo. The cellular mechanisms for agLDL catabolism are likely to be significantly different for extracellular hydrolysis by lysosomal enzymes as opposed to degradation within a phagolysosome. After pinching off, phagosomes undergo a maturation process that alters their membrane composition. 46 As a consequence, different sets of soluble N-ethylmaleimide–sensitive factor attachment protein receptors and other proteins are used for lysosome fusion with phagosomes and lysosome fusion with the plasma membrane. 47–49 To develop efficacious therapeutic approaches, the exact mechanism by which macrophages become foam cells must be understood.

Further, the extracellular catabolism of agLDL may play a role in the development of the atherosclerotic core itself. We have shown in our previous work that lysosomal synapses are dynamic. 27 They can be tightly sealed at times, but they also transiently open up, a process that would not happen with a fully sealed phagolysosome. This opening can release catabolic products, such as unesterified cholesterol, into the extracellular space. Significant increases in the ratio of free to total cholesterol have been observed during progression of plaques from fatty streaks to fibrolipid lesions. 50,51 Extracellular FC is present in excess in advanced plaques, particularly those prone to rupture and, therefore, may represent an underlying sign of lesion instability. However, the source of this unesterified cholesterol is currently unknown. It is plausible that the extracellular hydrolysis of CEs contained in agLDL may contribute to the increased extracellular FC contained in the atherosclerotic core of fibrolipid lesions. The release of FC into the extracellular space may also play a role in the formation of extracellular cholesterol crystals, implicated as a mechanical factor that contributes directly to plaque vulnerability. 52 Several additional enzymes are likely released into the extracellular space during the process of macrophage agLDL catabolism, including lysosomal hydrolases, which have been implicated in some studies to increase fusion of lipoproteins 53 and hydrolyze the extracellular matrix. 54

In conclusion, the data presented herein indicate that in addition to remodeling the extracellular matrix, plasmin may be involved in lipoprotein modification and foam cell formation during genesis and progression of atherosclerotic lesions. Plasmin-induced macrophage cholesterol accumulation is a novel pathway by which the plasmin/plasminogen system may contribute to atherogenesis. These findings provide new insight into the atherogenicity of plasmin and implicate a specific mechanism by which plasmin can accelerate atherosclerosis. Elucidation of this pathway may enable the development of novel, targeted therapies for the prevention of atherosclerosis. This newly identified pathway for the plasmin/plasminogen system to regulate foam cell formation provides a new context in which to understand the mechanism by which plasmin plays a role in proatherogenic processes.

Ringraziamenti

We thank Leona Cohen-Gould for electron microscopy analysis and Haley Fraser for figure editing.


What is Tissue Plasminogen Activator

Tissue plasminogen activator is one of the three main classes of fibrinolytic drugs that activate plasminogen. It is used to treat cerebrovascular thrombotic stroke, acute myocardial infarction, and pulmonary embolism. Tissue plasminogen activator can also be found in the endothelial cells. It is a type of serine protease that catalyzes the conversion of plasminogen into plasmin. It is produced in vitro by recombinant DNA technology and is used in clinical medicine as a drug. The structure of tissue plasminogen activator is shown in Figura 1.

Figure 1: Tissue Plasminogen Activator


The cell biology of the plasminogen system

To whom correspondence and reprint requests should be addressed, at: Joseph J. Jacobs Center for Thrombosis and Vascular Biology, Cleveland Clinic Foundation/FF20, 9500 Euclid Ave., Cleveland, OH 44195, USA.Search for more papers by this author

Joseph J. Jacobs Center for Thrombosis and Vascular Biology, Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio, 44195 USA

Joseph J. Jacobs Center for Thrombosis and Vascular Biology, Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio, 44195 USA

Department of Vascular Biology, The Scripps Research Institute, La Jolla, California, 92037 USA

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Research output : Contribution to journal › Review Article › Research › peer-review

T1 - Structural studies of plasmin inhibition

N2 - Plasminogen (Plg) is the zymogen form of the serine protease plasmin (Plm), and it plays a crucial role in fibrinolysis as well as wound healing, immunity, tissue remodeling and inflammation. Binding to the targets via the lysine-binding sites allows for Plg activation by plasminogen activators (PAs) present on the same target. Cellular uptake of fibrin degradation products leads to apoptosis, which represents one of the pathways for cross-talk between fibrinolysis and tissue remodeling. Therapeutic manipulation of Plm activity plays a vital role in the treatments of a range of diseases, whereas Plm inhibitors are used in trauma and surgeries as antifibrinolytic agents. Plm inhibitors are also used in conditions such as angioedema, menorrhagia and melasma. Here, we review the rationale for the further development of new Plm inhibitors, with a particular focus on the structural studies of the active site inhibitors of Plm. We compare the binding mode of different classes of inhibitors and comment on how it relates to their efficacy, as well as possible future developments.

AB - Plasminogen (Plg) is the zymogen form of the serine protease plasmin (Plm), and it plays a crucial role in fibrinolysis as well as wound healing, immunity, tissue remodeling and inflammation. Binding to the targets via the lysine-binding sites allows for Plg activation by plasminogen activators (PAs) present on the same target. Cellular uptake of fibrin degradation products leads to apoptosis, which represents one of the pathways for cross-talk between fibrinolysis and tissue remodeling. Therapeutic manipulation of Plm activity plays a vital role in the treatments of a range of diseases, whereas Plm inhibitors are used in trauma and surgeries as antifibrinolytic agents. Plm inhibitors are also used in conditions such as angioedema, menorrhagia and melasma. Here, we review the rationale for the further development of new Plm inhibitors, with a particular focus on the structural studies of the active site inhibitors of Plm. We compare the binding mode of different classes of inhibitors and comment on how it relates to their efficacy, as well as possible future developments.


Plasminogen activation by t-PA on the surface of human melanoma cells in the presence of alpha 2-macroglobulin secretion.

Several human melanoma cell lines produced tissue-type plasminogen activator (t-PA), as detected by zymography and immunocapture assay of culture media and cell lysates. Urokinase (u-PA) was found at only less than or equal to 1% the level of t-PA. Acid eluates of the cell surface indicated that the melanoma cells had t-PA bound on their surface, but no u-PA, and also had a very low capacity to bind exogenous u-PA. After incubation of the melanoma cells with 10% plasminogen-depleted fetal calf serum and human plasminogen, bound plasmin activity could be eluted from the cell surface with tranexamic acid, an analogue of lysine. This indicated that plasminogen was activated on the cell surface. The cell-surface plasmin formation was inhibited by an anti-catalytic monoclonal antibody to human t-PA, and not by an anti-catalytic antibody to u-PA. The melanoma cells also synthesized and secreted alpha 2-macroglobulin (alpha 2M), as shown by alpha 2M-specific mRNA in Northern blotting and detection of alpha 2M protein in conditioned cell culture media. The media were found to inhibit u-PA but not t-PA. This inhibition was related to their alpha 2M content, and immunoabsorption of alpha 2M removed the inhibitory activity. These studies suggest that t-PA can bind to the surface of melanoma cells and generate surface-bound plasmin. Because t-PA and cell-bound plasmin are unaffected by alpha 2M, t-PA may, in the case of melanoma cells, serve an analogous function to u-PA in supporting tumor cell invasion.


Risultati e discussione

The μPlm/YO-2 structure reveals an unexpected binding mode (Figure 1), in which the TXA moiety inserts into the S1 pocket and forms extensive canonical interactions with S736 and D735 at the base of the pocket in addition to the oxyanion hole (S741 and G739). The remainder of the inhibitor occupies the S1′-S3′ pockets, and a total of 2 additional hydrogen bonds and 57 van der Waal interactions are made between inhibitor and protease. Of note, the inhibitor forms particularly extensive interactions at the S3′ subsite where the tyrosine moiety forms a hydrogen bond with K607, and the pyridine moiety forms an imperfect face-to-face π stacking with the benzyl side chain of F587. The hydrophobic aliphatic octylamide does not have extensive interactions with the acidic S2′ site instead, it points away from the protease. Binding of YO-2 does not have an impact on the geometry of the catalytic triad residues (H603, D646, and S741) because they remain in their catalytic conformations (Figure 1B supplemental Figure 1). To study the role of F587 and K607 in the interaction with the YO compounds, we determined the IC50 using F587A and K607A single and double mutants (Table 1). The results reveal that although the IC50 for K607A is marginally lower than the wild-type, that for the F587A variant is much higher (four- to fivefold) than the wild-type. L'IC50 for the double mutant (F587A/K607A) is similar to that of F587A. Taken together, these data suggest that F587 plays a substantive and important role in the inhibitor interaction.

To investigate whether the lysine analog TXA alone could bind to Plm, both saturation-transfer differences NMR (STD-NMR) and Car-Purcell-Meiboom-Gill NMR (CPMG-NMR) 17 were used. TXA showed positive STD signals at 2.60 and 2.58 ppm in the presence of μPlm but not in its absence (Figure 2A), which suggests that μPlm binds to TXA. The CPMG-NMR further validates this observation (Figure 2B) TXA signals were attenuated in the presence of μPlm (at 600 ms) compared with TXA alone. We also tested the binding of lysine to μPlm by CPMG (Figure 2C) in which positive CPMG signals were observed at 2.75 to 2.8 ppm from the methylene side chain in the presence of μPlm. We show the results on YO-2 and methionine as the positive and the negative controls, respectively, for the CPMG experiments (Figure 2D-E).

Inhibitor binding to Plm determined by NMR. (A) Saturation-transfer difference (STD) spectra reveal binding of TXA to μPlm. The top line (blue) shows the reference spectrum of TXA alone. The middle line (green) shows the STD signals of TXA in the presence of μPlm positive STD signal at 2.6 and 2.58 ppm of TXA with an intensity of 5% is indicative of TXA binding to μPlm. The bottom line (red) shows the STD spectrum in the absence of μPlm there are no signals, as expected. (B) Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) spectra confirm binding of TXA to μPlm. TXA signals are compared in the presence (green) and absence (red) of μPlm. TXA binding to μPlm is indicated by the reduction in peak intensity in the presence of μPlm. (C) CPMG spectra of lysine. The ligand signals in the presence of μPlm (green) at 2.8 to 2.75 ppm are attenuated, which indicates binding. (D) CPMG spectra of YO-2 as a positive control. The binding of the μPlm (green) leads to a reduction of signals and also a shift of the signal at 7.25, 6.94, and 6.75 ppm, which indicates strong binding of YO-2 to μPlm. (E) CPMG spectra of methionine as a negative control. In the presence of μPlm (green), the change of the intensity is insignificant, suggesting that methionine does not bind to μPlm.

Inhibitor binding to Plm determined by NMR. (A) Saturation-transfer difference (STD) spectra reveal binding of TXA to μPlm. The top line (blue) shows the reference spectrum of TXA alone. The middle line (green) shows the STD signals of TXA in the presence of μPlm positive STD signal at 2.6 and 2.58 ppm of TXA with an intensity of 5% is indicative of TXA binding to μPlm. The bottom line (red) shows the STD spectrum in the absence of μPlm there are no signals, as expected. (B) Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) spectra confirm binding of TXA to μPlm. TXA signals are compared in the presence (green) and absence (red) of μPlm. TXA binding to μPlm is indicated by the reduction in peak intensity in the presence of μPlm. (C) CPMG spectra of lysine. The ligand signals in the presence of μPlm (green) at 2.8 to 2.75 ppm are attenuated, which indicates binding. (D) CPMG spectra of YO-2 as a positive control. The binding of the μPlm (green) leads to a reduction of signals and also a shift of the signal at 7.25, 6.94, and 6.75 ppm, which indicates strong binding of YO-2 to μPlm. (E) CPMG spectra of methionine as a negative control. In the presence of μPlm (green), the change of the intensity is insignificant, suggesting that methionine does not bind to μPlm.

Next, we investigated the impact of TXA (at concentrations between 0 and 125 mM) on Plm and μPlm enzyme activity. Inhibition was observed for both enzymes at high concentrations (>10 mM Figure 3). Although the inhibitory activity is weak (IC50, 86.79 ± 2.30 mM for Plm IC50, 65.29 ± 1.70 mM for μPlm), these data suggest that TXA may function as an active site inhibitor in vivo when high doses (grams) are administered to patients. 7

Inhibition of Plm enzyme activity by TXA and lysine. High concentration of TXA inhibits Plm activity. The enzyme assay was performed on both μPlm and Plm using the chromogenic substrate S2251. (Top panel) Activities of μPlm and Plm are shown as normalized residual activity of the initial rate and are attenuated in the presence of increasing concentration of TXA (0-125 mM), suggesting that TXA is also a weak active site inhibitor. Similar response was observed when lysine was tested but not with alanine as expected. Interestingly, at 100 mM, methionine inhibits up to 20% of the Plm activity. (Bottom panel) Also shown are the IC50 of TXA and lysine (Lys) on Plm activity derived from the experiment that of methionine (Met) and alanine (Ala) is too low to be determined. See supplemental Data for details. N.D., not determined.

Inhibition of Plm enzyme activity by TXA and lysine. High concentration of TXA inhibits Plm activity. The enzyme assay was performed on both μPlm and Plm using the chromogenic substrate S2251. (Top panel) Activities of μPlm and Plm are shown as normalized residual activity of the initial rate and are attenuated in the presence of increasing concentration of TXA (0-125 mM), suggesting that TXA is also a weak active site inhibitor. Similar response was observed when lysine was tested but not with alanine as expected. Interestingly, at 100 mM, methionine inhibits up to 20% of the Plm activity. (Bottom panel) Also shown are the IC50 of TXA and lysine (Lys) on Plm activity derived from the experiment that of methionine (Met) and alanine (Ala) is too low to be determined. See supplemental Data for details. N.D., not determined.

We also found that, like TXA, lysine itself inhibits μPlm activity with an IC50 of 35.79 ± 3.56 mM. In contrast, methionine and alanine showed minimal reductions of Plm activity, even at 125 mM (<20% and 5%, respectively Figure 3).

We next investigated whether YO could trigger a conformational change in closed Plg as seen with TXA. Here we used small-angle X-ray scattering (SAXS) the scattering profile of closed Plg is distinctively different from the open form (supplemental Figure 2) as depicted by the derived radius of gyration (RG) and maximum dimension of Plg in solution (Dmax) (Figure 4). The SAXS data revealed that in the presence of YO inhibitors, full-length Plg remained in the closed form, suggesting that the YO inhibitors are unlikely to interact with the LBSs of Plg or Plm.

Impact of YO compounds on Plg conformation. (Top panel) SAXS experiment shows that YO inhibitors do not have an impact on the conformation of full-length Plg. In the presence of TXA (1 mM), Plg switches from the closed (Plg) to the open conformation (Plg + TXA), as reflected by the change in the scattering profile (shape of the curve supplemental Figure 2). The profile of Plg remains unaltered after incubating with YO inhibitors (Plg + YO-2 and Plg + PSI-112) as detailed in supplemental Data, suggesting that the YO inhibitors cannot trigger conformational change of Plg and therefore, they do not interact with the LBS of KR domains. The SAXS profiles shown are the average of >15 individual images. (Bottom panel) Shown are the radius of gyration (RG) and maximum dimension of Plg in solution (Dmax) derived from the experiment (see supplemental Data and supplemental Figure 2 for details). Entrambi RG e Dmax of closed and open Plg are significantly different (P < .0001).

Impact of YO compounds on Plg conformation. (Top panel) SAXS experiment shows that YO inhibitors do not have an impact on the conformation of full-length Plg. In the presence of TXA (1 mM), Plg switches from the closed (Plg) to the open conformation (Plg + TXA), as reflected by the change in the scattering profile (shape of the curve supplemental Figure 2). The profile of Plg remains unaltered after incubating with YO inhibitors (Plg + YO-2 and Plg + PSI-112) as detailed in supplemental Data, suggesting that the YO inhibitors cannot trigger conformational change of Plg and therefore, they do not interact with the LBS of KR domains. The SAXS profiles shown are the average of >15 individual images. (Bottom panel) Shown are the radius of gyration (RG) and maximum dimension of Plg in solution (Dmax) derived from the experiment (see supplemental Data and supplemental Figure 2 for details). Entrambi RG e Dmax of closed and open Plg are significantly different (P < .0001).

Finally, we determined the crystal structure of a second YO class inhibitor, PSI-112. The μPlm/PSI-112 binary complex structure further confirms the binding mode of the YO inhibitors (Figure 1E-F supplemental Figures 1 and 3). Here, the double aromatic ring quinoline moiety of PSI-112 rotates to the side and upward (by ∼54° and ∼35°, respectively supplemental Figure 1) compared with the pyridine moiety in YO-2. Consequently, the pyridine ring of the quinoline moiety forms a perfect face-to-edge π stack with the benzyl side chain of F587. The electron density map also reveals discrete disorder around the quinoline moiety and K607, suggesting a number of different possible binding modes between PSI-112 and K607.

Analysis of the interactions of PSI-112 with mutants of μPlm further confirmed our previous findings for YO-2 (Table 1). Our data revealed that K607A has an IC50 similar to that of the wild-type, whereas those of the mutants F587A and F587A/K607A are much higher, approximately fivefold that of the wild-type. Together, these data confirm that F587 plays a key role in the inhibitor interaction.

Our results (Table 1) further show that, in contrast to published findings, 13 the IC50 for PSI-112 (0.38 ± 0.020 μM) is 35% higher than that of YO-2 (0.25 ± 0.001 μM). However, given that PSI-112 has a lower affinity for uPA (IC50 >25 μM) than YO-2 (IC50 3.99 ± 0.2 μM supplemental Figure 3), it is still a more specific inhibitor than YO-2 for Plm.

By using the 2 structures, we next investigated the structural basis for the specificity of the inhibitors for Plm over uPA and plasma kallikrein. Superposition of the Plm/YO complex structures with uPA (Protein Data Bank identifier 4JNI) reveals that substitution of several residues in uPA may interfere with effective binding of the inhibitors. First, the key residue F587 is substituted by V41 in uPA we argue that this change may explain the reduced IC50. However, the equivalent position to K607 is Y60 in uPA. We reason that the Y60 may play the key role in coordinating the pyridine moiety of YO-2. Conversely, the quinoline moiety of PSI-112 would clash with Y60 (supplemental Figure 4B) and also the side chain of R35. Together, these data provide a rationale for the reduced activity of PSI-112 against uPA in contrast to the YO-2/uPA complex (Figure 1).

YO inhibitors are ineffective against plasma kallikrein in enzyme assays. Superposition analysis suggests that the lower activity of the YO inhibitors against kallikrein may also arise through the S3′ pockets. Specifically, F587 and K607 are substituted by L41 and G60, respectively. We reason that the aromatic moiety of the YO inhibitor would not be able to form π stacking interactions with either amino acid, thus resulting in poor binding of YO inhibitor to kallikrein (supplemental Figure 4C).

Taken together, these data reveal a number of features that could be exploited to improve both the activity and specificity of the YO inhibitors. Most notably, we suggest that substitutions of the hydrophobic aliphatic octylamide moiety with basic groups would better take advantage of the extensive acidic S2′ pocket. Furthermore, inhibitors with moieties that bind to the S2-S4 pocket may provide further chemical opportunities to refine specificity and activity. Such highly specific and efficacious small molecule inhibitors would be of great value in clinical applications in which specific inhibition of Plm activity is required.


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