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Possiamo produrre globuli rossi sintetici privi di antigeni?

Possiamo produrre globuli rossi sintetici privi di antigeni?



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Ho avuto un'idea che mi è venuta durante la lezione di biologia e l'ho immediatamente chiesto alla mia insegnante, ma non ha saputo rispondere alla domanda, quindi la farò qui.

Quali sono i fattori limitanti nella produzione di globuli rossi sintetici privi di antigeni? Voglio dire, abbiamo mappato il genoma umano, ma sono ingenuo a pensare che abbiamo una tecnologia genetica in grado di farlo?

Se i globuli rossi sono troppo complessi da produrre, è possibile produrre particelle molto più piccole di sola emoglobina all'interno di piccole sfere della membrana cellulare e utilizzarle come sostituto temporaneo dei globuli rossi?

(Ero a una conferenza di ricerca medica qualche tempo fa e un professore stava spiegando che ci sono molte altre proteine ​​legate a un globulo rosso che non sono del sistema ABO o RH. Normalmente questo non è un problema per i riceventi che solo occasionalmente hanno ricevuto trasfusioni, ma per le persone che hanno bisogno di un apporto di sangue a lungo termine, i loro corpi si sensibilizzano alle proteine ​​estranee e alla fine iniziano ad attaccare i globuli rossi estranei).


In realtà ci sono tali particelle. Si stima che circa il 20% dell'emoglobina (HGB in seguito) sia nelle vescicole HGB (HbV in seguito) formate dai globuli rossi. Quindi certo, è possibile utilizzare piccole particelle invece di globuli rossi, ma queste vescicole hanno antigeni maggiori e minori sulla loro superficie. Secondo alcuni articoli causano anche altre complicazioni da trasfusioni di sangue e vengono distrutte dal sistema immunitario entro 3-7 giorni. Quindi non risolvono il problema.

Neanche le vescicole di HGB senza antigeni maggiori e minori non sono una soluzione perfetta (credo), perché il sistema immunitario tende ad attaccare queste cose. Ad esempio per le infezioni virali i livelli di MHC1 sono bassi (nelle cellule con nucleo) per evitare la risposta delle cellule T e le cellule NK non lo gradiscono, quindi distruggono tali cellule. Sono quasi sicuro che succederebbe qualcosa di simile anche con questo tipo di vescicole. Almeno afaik. il sistema immunitario controlla non solo la presenza di questi antigeni, ma anche la loro composizione. Quindi, se un GR è sotto stress, cambia la composizione dell'antigene sulla sua superficie e i leucociti lo distruggono se necessario. Secondo alcuni esperimenti, il PEG può coprire gli antigeni dell'HbV e aumentare la compatibilità immunitaria, quindi avere meno antigeni di superficie sembra essere una scelta migliore che averne di più.

Le vescicole HGB hanno un altro problema. L'HGB si inattiva in essi senza riduzione (formazione di metHb). Solo Fe2+ HGB può trasportare ossigeno. Questo può essere risolto con il blu di metilene secondo questo studio.

Non possiamo nemmeno usare l'HGB libero, perché diminuirebbe i livelli di NO e porterebbe alla disfunzione endoteliale. Penso che le particelle piccole avrebbero lo stesso effetto a causa dell'aumento della superficie.

  • Meccanismi di assorbimento più lento dell'ossido nitrico da parte dei globuli rossi e di altre vescicole contenenti emoglobina

  • Microparticelle nei globuli rossi immagazzinati come potenziali mediatori di complicanze trasfusionali

  • Rimozione del trasportatore di ossigeno a base di emoglobina di tipo cellulare (vescicole di emoglobina) dal sangue mediante centrifugazione e ultrafiltrazione

Secondo altri studi, l'eme RHSA (albumina sierica legata all'eme sintetico) è un'altra opzione. Sembra essere sicuro se sostituisci solo il 20% del volume del sangue (di ratti). Penso che una trasfusione completa non sia sicura, perché ridurrebbe i livelli di NO come abbiamo già discusso. Non ho trovato un esperimento che completi la trasfusione.

Quindi c'è una ricerca in corso sull'argomento. Ci sono progressi, ma credo che nessuna delle soluzioni attuali sia perfetta.


I sostituti del sangue artificiale sono oggetto di ricerca e sviluppo come alternative per sostituire i globuli rossi per la capacità di trasporto dell'ossigeno. Il sangue umano normale ha una durata di soli 42 giorni che ne limita l'utilizzo su periodi più estesi. Ciò richiede lo sviluppo di sostituti del sangue che possono essere conservati per una durata maggiore. Inoltre, i sostituti del sangue hanno una compatibilità universale e quindi la loro applicazione non è limitata dalla tipizzazione e dal cross-matching. I sostituti del sangue sono estremamente necessari in caso di perdite ematiche acute e croniche dovute a lesioni e incidenti in cui una carenza di ossigeno alle cellule pregiudica la sopravvivenza del paziente infliggendo danni permanenti ai tessuti.

Il mercato dei sostituti del sangue è classificato in due segmenti, vale a dire. Portatori di ossigeno a base di perfluorocarburi (PFBOC) e portatori di ossigeno a base di emoglobina (HBOC). I PFBOC sono basati su componenti inerti che sostituiscono l'idrogeno con il fluoro. Gli HBOC sono costituiti da prodotti derivati ​​dall'emoglobina provenienti da sangue umano, sangue bovino, microrganismi e animali transgenici.


Il sostituto del sangue artificiale è un sostituto sviluppato artificialmente per i globuli rossi che viene utilizzato per trasportare ossigeno e sostanze nutritive alle cellule del corpo e trasportare anidride carbonica, ammoniaca e altri prodotti di scarto lontano dalle cellule.

Sono stati identificati sei potenziali mercati di applicazione basati sulla possibilità di sostituire il sangue del donatore in trattamenti medici critici:

Lesioni, Malattie cardiovascolari, Neoplasie maligne, Malattie neonatali, Trapianti d'organo, Condizione materna


Antigene sintetico

Michael Sela, Israel Pecht, in Advances in Protein Chemistry, 1996

III. Criteri molecolari per l'antigenicità

La disponibilità di antigeni sintetici ha permesso un approccio sistematico per chiarire il ruolo di vari aspetti molecolari nell'antigenicità e nell'immunogenicità (Sela, 1969 Novotny et al., 1987). Landsteiner ha mostrato per primo che piccole molecole (ad es. 2,4-dinitrofenolo), quando iniettate negli animali, non provocano la formazione di anticorpi. Tuttavia, le proteine ​​dinitrofenile, in cui il dinitrofenile è attaccato a un vettore macromolecolare, provocano la formazione di anticorpi che reagiscono specificamente con il gruppo dinitrofenile. Tali piccole molecole sono state chiamate apteni. Pertanto, una nuova specificità antigenica può essere innestata su un antigene. D'altra parte, un limitato arricchimento della gelatina con tirosina ne ha aumentato l'immunogenicità senza modificarne significativamente la specificità. Pertanto, è possibile modificare sia l'immunogenicità che la specificità antigenica mediante modificazione chimica. Un aumento dell'immunogenicità per mezzo di adiuvanti appropriati si è sviluppato in modo significativo a causa della disponibilità di adiuvanti sintetici che possono anche essere attaccati covalentemente all'antigene.

I polipeptidi sintetici (polimeri di amminoacidi), lineari e ramificati, sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca immunologica, poiché le loro strutture sono sia semplici che ben note. Ciò consente la costruzione di centinaia di antigeni allo scopo di chiarire le basi molecolari dell'antigenicità, e successivamente le basi molecolari di molteplici fenomeni immunologici.

La conoscenza della chimica dei copolimeri ha permesso di giungere a conclusioni sul ruolo di varie caratteristiche strutturali nella loro funzione antigenica. È stato determinato che l'area immunogenica importante della molecola deve essere facilmente accessibile e non nascosta all'interno della molecola. Mediante modificazione chimica, i materiali antigenici possono essere convertiti in non antigeni [ad esempio, mediante attacco di polietilenglicole o mediante poli(dl-alanilazione)], mentre i materiali non antigenici possono diventare immunogenici. Esempi recenti di diminuzione dell'immunogenicità sono descritti da Fuertges e Abuchowski (1990) e da Sasaki et al. (1993). Un esempio interessante di aumento dell'immunogenicità riguarda l'inserimento di un peptide dall'interleuchina-1 in proteine ​​ricombinanti scarsamente immunogeniche ( Beckers et al., 1993). La presenza di cariche elettriche su una macromolecola non è un requisito minimo per essere immunogenica. La forma complessiva della molecola non sembra essere un fattore cruciale nell'immunogenicità, mentre la dimensione sembra essere importante: pochissime molecole inferiori a 2 kDa sono immunogeniche e l'immunogenicità aumenta costantemente con la dimensione molecolare. La presenza di amminoacidi aromatici aumenta la possibilità che una piccola molecola diventi immunogena da sola. In generale, nella nostra attuale comprensione, una molecola così piccola sarà immunogenica se può fungere sia da epitopo di cellule B che da epitopo di cellule T allo stesso tempo.

Polimeri di d-amminoacidi opportunamente costruiti possono essere immunogenici in modo simile ai polimeri di l-amminoacidi naturali. Per rilevare questa antigenicità, tuttavia, è necessario immunizzare gli animali con dosi molto basse, poiché nell'intervallo di dosi richiesto per dimostrare l'immunogenicità dei polimeri l-amminoacidi, i polimeri d possono indurre tolleranza immunologica, chiamata anche paralisi. Questo è probabilmente perché vengono metabolizzati molto lentamente, se non del tutto. Attraverso studi di immunogeni strutturalmente correlati, è stato possibile stabilire che antigeni, come i polisaccaridi pneumococcici, Escherichia coli lipopolisaccaridi e polimeri di d-amminoacidi, che possiedono determinanti antigenici ripetuti e sono metabolizzati lentamente, sono T-indipendenti, cioè non necessitano della cooperazione di cellule T helper e cellule B, la cui progenie produce anticorpi, per una risposta immunitaria efficiente. Al contrario, la maggior parte degli antigeni, inclusi i copolimeri l-amminoacidi, sono T-dipendenti. La risposta immunitaria puramente cellulare è limitata alla popolazione di linfociti T, di cui sono ormai note molte sottopopolazioni, e probabilmente implica la cooperazione di linfociti T helper e linfociti T effettori.

Gli antigeni che portano a una risposta immunitaria essenzialmente di qualsiasi specificità desiderata possono essere preparati sinteticamente, compresa la produzione di anticorpi contro peptidi, oligosaccaridi, oligonucleotidi, tRNA e lipidi, nonché contro apteni come penicillina, prostaglandina, dinitrofenolo, piridossale e ferrocene . Allo stesso modo, sono stati ottenuti anticorpi contro molti peptidi biologicamente attivi come l'angiotensina, la bradichinina e la vasopressina. Inoltre, sono stati prodotti immunogeni totalmente sintetici, inclusi segmenti peptidici di proteine ​​del rivestimento virale, ad esempio batteriofago MS2, virus dell'epatite e tossine batteriche (difterite, colera), che hanno portato alla produzione di anticorpi in grado di neutralizzare il virus o indurre protezione contro la difterite e il colera negli animali da esperimento, aprendo così la porta concettuale alla produzione di vaccini sintetici (per una rassegna, vedi Milich, 1989).

Per fare solo uno dei tanti esempi in cui gli antigeni sintetici erano di importanza cruciale nel rilevare o chiarire un fenomeno immunologico definito, dovrebbe essere menzionato il controllo genetico della risposta immunitaria. La capacità di rispondere bene o male a un determinato stimolo antigenico è sotto stretto controllo genetico. Questa osservazione è stata resa possibile in gran parte a causa di antigeni sintetici (chimicamente semplici) e ceppi consanguinei di animali (geneticamente semplici). Utilizzando polipeptidi sintetici ramificati definiti, che differiscono solo in modo limitato nei loro determinanti antigenici, è stato possibile dimostrare in modo conclusivo che il controllo genetico della risposta immunitaria è determinante-specifico (McDevitt e Sela, 1965, 1967). McDevitt dimostrò in seguito che la risposta immunitaria a questi antigeni sintetici era legata al locus maggiore di istocompatibilità della specie (McDevitt e Chinitz, 1969). Il Ir i geni ed i loro prodotti (Ia) sono stati estremamente importanti per consentirci di comprendere i fenomeni di immunità e resistenza alle malattie.


Scienza del sangue e dei sostituti sintetici

Figura 4. Diagramma che mostra le percentuali di composizione del sangue. Creato utilizzando Piktochart.

Il sangue è una miscela di globuli rossi, globuli bianchi, piastrine e plasma. Il sangue che scorre attraverso i nostri corpi appare di colore rosso, ma la maggior parte di esso è in realtà plasma al 54% che appare di colore leggermente giallastro (Dean, 2005). Questo plasma è costituito principalmente da acqua, zuccheri, grassi e varie proteine ​​che agiscono in tutto il nostro corpo (Dean, 2005). Il componente successivo del sangue è costituito da globuli bianchi e piastrine. I globuli bianchi sono il fondamento della nostra immunità acquisita e ci proteggono da infezioni batteriche o virali estranee. Le piastrine sono molecole che funzionano nella coagulazione del sangue. Infine, i globuli rossi (eritrociti) sono il tipo più comune di cellule presenti nel sangue e lavorano per trasportare l'ossigeno in tutto il nostro corpo (Dean, 2005). I globuli rossi maturi hanno il loro nucleo espulso facendoli assumere una forma curva al centro. Questa forma consente loro di immagazzinare più proteine ​​dell'emoglobina che in realtà lega l'ossigeno in modo che possa essere trasportato in tutto il corpo (Dean, 2005). Il sangue svolge molti compiti che svolge molto bene e questo è ciò che rende difficile creare un sostituto del sangue adatto.

Figura 5. Tabella che mostra i diversi gruppi sanguigni negli esseri umani, insieme ai loro antigeni e anticorpi specifici.


I vantaggi del sangue sintetico sono che il sangue sarebbe intrinsecamente di tipo O negativo e potrebbe essere somministrato a tutti. Potrebbero anche essere progettati per essere sterilizzati, il che lo rende estremamente sicuro da usare senza la preoccupazione di trasmettere malattie e una durata di tre anni senza refrigerazione (sangue artificiale). Ciò consentirebbe l'accumulo di sangue e una minore necessità di donatori di sangue e la possibilità di avere sangue più che sufficiente in caso di emergenza. L'attuale modo in cui vengono prodotti i sostituti del sangue è l'utilizzo di trasportatori di ossigeno a base di emoglobina (HBOC) o PFC.

Le emulsioni PFC (perfluorocarbonio) sono economiche, biologicamente inerti e possono dissolvere 50 volte più ossigeno del plasma sanguigno, ma ancora molto meno dell'emoglobina (Sarker, 2008). La praticità di questi composti deriva dal fatto che non richiedono alcuna entità biologica nella loro produzione (Sarkar, 2008). Per questo motivo, i PFC sono estremamente facili da realizzare senza consumare materiali biologici e mantenendo bassi i costi di produzione. Un altro fattore positivo da considerare è come possono ridurre il rischio di trasmissione di malattie attraverso le trasfusioni di sangue (Sarkar, 2008). I PFC sono noti per essere abbastanza efficaci nel loro trattamento, ma molti sono ancora in fase di sperimentazione clinica prima di poter essere immessi sul mercato. Non si mescolano bene con il sangue, quindi devono essere prima emulsionati, quindi possono essere miscelati (Spahn, 1999). Alcuni esempi di prodotti sostitutivi del sangue PFC includono Fluosol-DA-20, Oxygent, Perftoran, Oxycyte e PHER-O2 (Pacific, 2016).

Questo passaggio emulsionante necessario è dove gli HBOC hanno il vantaggio. Sono fatti con emoglobina isolata o emoglobina sintetica, il che li rende più naturali. Tuttavia, l'emoglobina deve essere modificata per rimanere stabile all'interno del flusso sanguigno e viene reticolata mediante PEG. Quando si utilizzano gli HBOC, non vi è alcun rischio che il gruppo sanguigno di una persona non sia corretto come durante una trasfusione di sangue. Poiché questi HBOC sono solo proteine ​​dell'emoglobina, non sono legati a un globulo rosso che esprime i gruppi sanguigni A, B o O (Sarkar, 2008). Entrambe le soluzioni durano solo circa 20-30 ore nel corpo prima di essere filtrate dove il sangue intero dura fino a 34 giorni (Sarker, S.). Questo lo rende adatto per la somministrazione di farmaci e trattamenti. Alcuni esempi di prodotti sostitutivi del sangue HBOC includono Hemopure, PolyHeme, MP40X (Hemospan), Hemotech e Engineered Hemoglobin (Pacific, 2016).

Attualmente sono in corso ricerche per modificare le cellule T per riconoscere il linfoma e sradicare le cellule. Le cellule T sono modificate per esprimere i recettori chimerici dell'antigene (CAR) che riconoscono le cellule tumorali. Il sangue va a ogni cellula del corpo e questo li rende ideali per il trasporto e la consegna dei farmaci. Le cellule possono colpire cellule specifiche e quindi essere rimosse naturalmente dal corpo. Questo ha molte applicazioni e viene esaminato dai militari per l'uso da parte dei soldati sul campo. Apre la possibilità di una migliore assistenza medica durante la distribuzione, nonché la possibilità di miglioramenti.


2 Top-down vs. Bottom-up: un confronto

Ci sono diversi vantaggi associati all'ingegneria delle cellule artificiali da zero piuttosto che alla riprogettazione delle cellule viventi. In primo luogo, la limitazione del carico cellulare - il tiro alla fune associato alla distribuzione di energia e risorse tra le funzioni cellulari naturali e artificiali - non è una caratteristica delle cellule sintetiche. 27 Non devono dedicare risorse a processi ausiliari associati all'esecuzione di compiti che le cellule si sono evolute per svolgere e, in effetti, per rimanere in vita. I processi ingegnerizzati possono quindi essere potenzialmente più efficienti se le cellule sono completamente sintetiche. In secondo luogo, il fatto che le cellule sintetiche non siano viventi significa che è possibile ingegnerizzarle per produrre composti altrimenti tossici. 28 Inoltre, poiché i problemi di biocompatibilità non sono più critici con le cellule non viventi, è possibile incorporare elementi costitutivi completamente non biologici, consentendo di superare le capacità biologiche. Queste aggiunte non biologiche potrebbero includere componenti elettronici, nanoparticelle funzionali e nuove macchine molecolari (ad esempio origami di DNA o elementi nanoelettrici). In terzo luogo, l'uso di cellule sintetiche riduce gli ostacoli alla biosicurezza, alla regolamentazione e alla percezione pubblica. 29 Non si replicano, non sono vivi, non sono autonomi e non sono funzionali per lunghi periodi senza un intervento umano attivo, almeno per il prossimo futuro. A questo proposito, hanno più in comune con le nanotecnologie tradizionali ei microrobot che con gli organismi viventi. Per questi motivi, non sono considerati OGM né dai regolatori né dalla psiche pubblica. Infine, e forse la cosa più importante, le cellule sintetiche hanno una complessità molecolare notevolmente ridotta rispetto alle loro controparti biologiche, il che le rende più programmabili e prevedibili. 30 Sono spesso composti da decine di specie molecolari distinte, rispetto alle decine di migliaia di specie presenti nelle cellule viventi. In uno scenario in cui ogni biomolecola interagisce con molte altre, questo produce una rete di interazione con complessità esponenzialmente crescente per ogni nuovo componente aggiunto. Inoltre, le cellule viventi possono modificare la loro biochimica interna per resistere ai cambiamenti loro imposti, spesso in modo imprevedibile. Questi fattori rendono difficile prevedere in modo efficace come risponderanno le cellule viventi una volta riprogettate per avere nuove funzioni. Inoltre, si conosce (e si può controllare con precisione) l'intera composizione molecolare delle cellule sintetiche, poiché sono costruite da zero, il che non è il caso delle cellule viventi.

Tuttavia, nonostante la loro promessa, le capacità delle cellule artificiali sono intrinsecamente limitate rispetto a quelle biologiche viventi. Le cellule biologiche hanno vie metaboliche, biosintetiche e regolatorie dinamiche. La loro complessità molecolare significa che sono in grado di convertire l'energia e di spingersi fuori dall'equilibrio.Possono autoripararsi, interagire tra loro per produrre comportamenti collettivi, autoreplicarsi ed essere coltivati ​​su larga scala. Lo sfruttamento di queste caratteristiche ha sostenuto molti progressi biotecnologici e si prevede che sarà uno dei principali motori della "quarta rivoluzione industriale". 31 È chiaro che le cellule biologiche hanno una sofisticatezza comportamentale che le cellule artificiali attualmente non possono eguagliare. Inoltre, quando si tratta di produrre quantità di prodotti industrialmente rilevanti in modo economicamente accettabile, è improbabile che le prestazioni delle cellule "viventi" saranno superate da quelle sintetiche.

È importante notare che il confine tra cellule biologiche e sintetiche non è sempre netto, con la distinzione tra organismo e macchina che è un argomento centrale nella discussione teorica in biologia sintetica. 32 Il confine tra i due viene avvicinato da più direzioni, comprese le cellule artificiali con caratteristiche sempre più realistiche, le cellule minime basate sulla genomica sintetica e le macchine batteriche/eucariotiche geneticamente programmate prodotte dalla bioingegneria. 33


Sistema di gruppi sanguigni ABO

I nostri redattori esamineranno ciò che hai inviato e determineranno se rivedere l'articolo.

Sistema di gruppi sanguigni ABO, la classificazione del sangue umano in base alle proprietà ereditarie dei globuli rossi (eritrociti) determinate dalla presenza o assenza degli antigeni A e B, che sono trasportati sulla superficie dei globuli rossi. Le persone possono quindi avere sangue di tipo A, di tipo B, di tipo O o di tipo AB. I gruppi sanguigni A, B e O furono identificati per la prima volta dall'immunologo austriaco Karl Landsteiner nel 1901. Vedere gruppo sanguigno.

Il sangue contenente globuli rossi con antigene di tipo A sulla loro superficie ha nel suo siero (fluido) anticorpi contro i globuli rossi di tipo B. Se, durante la trasfusione, viene iniettato sangue di tipo B in persone con sangue di tipo A, i globuli rossi nel sangue iniettato verranno distrutti dagli anticorpi nel sangue del ricevente. Allo stesso modo, i globuli rossi di tipo A saranno distrutti dagli anticorpi anti-A nel sangue di tipo B. Il sangue di tipo O può essere iniettato in persone con sangue di tipo A, B o O a meno che non vi sia incompatibilità rispetto ad altri sistemi di gruppi sanguigni presenti. Le persone con sangue di tipo AB possono ricevere sangue di tipo A, B o O.

I gruppi ABO e Rh in trasfusione
sistema tipo di destinatario tipo di globuli rossi del donatore tipo di plasma donatore
*No se il siero del paziente contiene anti-A1 (anticorpo contro globuli rossi comuni di tipo A nei pazienti del sottogruppo A).
**No se il paziente è una donna di età inferiore a 45 anni (possibile gravidanza), a meno che non sia presente un'emorragia pericolosa per la vita e la trasfusione di sangue Rh-positivo non sia salvavita.
***No se il siero del paziente contiene anti-D (anticorpo contro globuli rossi positivi), tranne in circostanze mediche insolite.
ABO UN A* o O A o AB
ABO B B o O B o AB
ABO oh O solo O, A, B o AB
ABO AB AB*, A*, B o O AB
RH positivo positivo o negativo positivo o negativo
RH negativo negativo o positivo**, *** negativo o positivo**

Il gruppo sanguigno O è il gruppo sanguigno più comune in tutto il mondo, in particolare tra i popoli del Sud e Centro America. Il tipo B è prevalente in Asia, specialmente nell'India settentrionale. Il tipo A è anche comune in tutto il mondo, la frequenza più alta è tra i popoli aborigeni australiani, gli indiani Blackfoot del Montana e i Sami della Scandinavia settentrionale.

Gli antigeni ABO sono sviluppati molto prima della nascita e rimangono per tutta la vita. I bambini acquisiscono gli anticorpi ABO passivamente dalla madre prima della nascita, ma entro i tre mesi di età i bambini stanno facendo i propri si ritiene che lo stimolo per tale formazione di anticorpi provenga dal contatto con sostanze antigeniche simili all'ABO in natura. L'incompatibilità ABO, in cui gli antigeni di una madre e del suo feto sono abbastanza diversi da causare una reazione immunitaria, si verifica in un piccolo numero di gravidanze. Raramente, l'incompatibilità ABO può dar luogo a eritroblastosi fetale (malattia emolitica del neonato), un tipo di anemia in cui i globuli rossi del feto vengono distrutti dal sistema immunitario materno. Questa situazione si verifica più spesso quando una madre è di tipo O e il suo feto è di tipo A o di tipo B.

Gli editori dell'Enciclopedia Britannica Questo articolo è stato recentemente rivisto e aggiornato da Barbara A. Schreiber.


La prima persona che ha scoperto di avere il fenotipo di Bombay aveva un gruppo sanguigno che reagiva ad altri gruppi sanguigni in un modo mai visto prima. Il siero conteneva anticorpi che attaccavano tutti i globuli rossi dei normali fenotipi ABO. I globuli rossi sembravano mancare di tutti gli antigeni del gruppo sanguigno ABO e avere un antigene aggiuntivo precedentemente sconosciuto.

Gli individui con il raro fenotipo Bombay (hh) non esprimono l'antigene H (chiamato anche sostanza H), l'antigene presente nel gruppo sanguigno O. Di conseguenza, non possono produrre l'antigene A (chiamato anche sostanza A) o l'antigene B ( sostanza B) sui loro globuli rossi, qualunque alleli possano avere dei geni dei gruppi sanguigni A e B, perché l'antigene A e l'antigene B sono costituiti dall'antigene H. Per questo motivo le persone che hanno il fenotipo Bombay possono donare globuli rossi a qualsiasi membro del sistema del gruppo sanguigno ABO (a meno che qualche altro gene del fattore sanguigno, come Rh, non sia incompatibile), ma non possono ricevere sangue da alcun membro del sangue ABO sistema di gruppo (che contiene sempre uno o più antigeni A, B o H), ma solo da altre persone che hanno il fenotipo Bombay.

Ricevere sangue che contiene un antigene che non è mai stato nel sangue del paziente provoca una reazione immunitaria dovuta al sistema immunitario di un ipotetico ricevitore che produce immunoglobuline non solo contro l'antigene A e B, ma anche contro l'antigene H. Le immunoglobuline più comuni sintetizzate sono IgM e IgG. Questo sembra avere un ruolo molto importante nella bassa frequenza della malattia emolitica del neonato tra i figli non-Bombay di madri Bombay.

È molto importante, al fine di evitare complicazioni durante una trasfusione di sangue, rilevare individui con fenotipo Bombay, perché i normali test per il sistema dei gruppi sanguigni ABO li mostrerebbero come gruppo O. Poiché le immunoglobuline anti-H possono attivare la cascata del complemento, porterà alla lisi dei globuli rossi mentre sono ancora in circolazione, provocando una reazione trasfusionale emolitica acuta. Questo, ovviamente, non può essere evitato a meno che il tecnico di laboratorio coinvolto non sia a conoscenza dell'esistenza del gruppo sanguigno di Bombay e non abbia i mezzi per testarlo.

Questo fenotipo molto raro è generalmente presente in circa lo 0,0004% (circa il 4 per milione) della popolazione umana, sebbene in alcuni luoghi come Mumbai (ex Bombay) i locali possano avere occorrenze fino allo 0,01% (1 su 10.000) degli abitanti . Dato che questa condizione è molto rara, qualsiasi persona con questo gruppo sanguigno che ha bisogno di una trasfusione di sangue urgente probabilmente non sarà in grado di ottenerla, poiché nessuna banca del sangue ne avrebbe in stock. Coloro che prevedono la necessità di una trasfusione di sangue possono depositare il sangue per il proprio uso, ma ovviamente questa opzione non è disponibile in caso di lesioni accidentali. Ad esempio, nel 2017 solo una persona colombiana era nota per avere questo fenotipo e il sangue doveva essere importato dal Brasile per una trasfusione. [2]

La biosintesi degli antigeni H, A e B coinvolge una serie di enzimi (glicosil transferasi) che trasferiscono i monosaccaridi. Gli antigeni risultanti sono catene di oligosaccaridi, che sono attaccate a lipidi e proteine ​​che sono ancorate nella membrana dei globuli rossi. La funzione dell'antigene H, oltre ad essere un substrato intermedio nella sintesi degli antigeni del gruppo sanguigno ABO, non è nota, sebbene possa essere coinvolto nell'adesione cellulare. Le persone che mancano dell'antigene H non soffrono di effetti deleteri, ed essere carenti di H è un problema solo se hanno bisogno di una trasfusione di sangue, perché avrebbero bisogno di sangue senza l'antigene H presente sui globuli rossi.

La specificità dell'antigene H è determinata dalla sequenza degli oligosaccaridi. Più specificamente, il requisito minimo per l'antigenicità dell'H è il disaccaride terminale fucosio-galattosio, dove il fucosio ha un legame alfa(1-2). Questo antigene è prodotto da una specifica fucosil transferasi (Galactoside 2-alfa-L-fucosiltransferasi 2) che catalizza il passaggio finale nella sintesi della molecola. A seconda del gruppo sanguigno ABO di una persona, l'antigene H viene convertito nell'antigene A, nell'antigene B o in entrambi. Se una persona ha sangue di gruppo O, l'antigene H rimane invariato. Pertanto, l'antigene H è più presente nel gruppo sanguigno O e meno nel gruppo sanguigno AB.

Due regioni del genoma codificano per due enzimi con specificità di substrato molto simili: il locus H (FUT1) che codifica per la Fucosyl transferasi e il locus Se (FUT2) che codifica invece indirettamente una forma solubile dell'antigene H, che si trova nelle secrezioni corporee . Entrambi i geni sono sul cromosoma 19 a q.13.3. — FUT1 e FUT2 sono strettamente collegati, essendo distanti solo 35 kb. Poiché sono altamente omologhi, è probabile che siano stati il ​​risultato di una duplicazione genica di un antenato gene comune.

Il locus H contiene quattro esoni che si estendono su più di 8 kb di DNA genomico. Entrambi i fenotipi Bombay e para-Bombay sono il risultato di mutazioni puntiformi nel gene FUT1. È necessario che sia presente almeno una copia funzionante di FUT1 (H/H o H/h) affinché l'antigene H venga prodotto sui globuli rossi. Se entrambe le copie di FUT1 sono inattive (h/h), risulta il fenotipo Bombay. Il fenotipo classico di Bombay è causato da una mutazione Tyr316Ter nella regione codificante di FUT1. La mutazione introduce un codone di stop, che porta a un enzima troncato a cui mancano 50 aminoacidi all'estremità C-terminale, rendendo l'enzima inattivo. Nei caucasici, il fenotipo di Bombay può essere causato da una serie di mutazioni. Allo stesso modo, è stato riportato un numero di mutazioni alla base del fenotipo para-Bombay. Il locus Se contiene il gene FUT2, che è espresso nelle ghiandole secretorie. Gli individui che sono "secretori" (Se/Se o Se/se) contengono almeno una copia di un enzima funzionante. Producono una forma solubile di antigene H che si trova nella saliva e in altri fluidi corporei. I "non secretori" (se/se) non producono antigene H solubile. L'enzima codificato da FUT2 è anche coinvolto nella sintesi degli antigeni del gruppo sanguigno di Lewis.

Il fenotipo Bombay si verifica in individui che hanno ereditato due alleli recessivi del gene H (cioè: il loro genotipo è hh). Questi individui non producono il carboidrato H che è il precursore degli antigeni A e B, il che significa che gli individui possono possedere alleli per uno o entrambi gli alleli A e B senza essere in grado di esprimerli. Poiché entrambi i genitori devono portare questo allele recessivo per trasmettere questo gruppo sanguigno ai loro figli, la condizione si verifica principalmente in piccole comunità chiuse dove c'è una buona probabilità che entrambi i genitori di un bambino siano di tipo Bombay o eterozigoti per il h allele e quindi recante la caratteristica di Bombay come recessiva. Altri esempi possono includere famiglie nobili, che sono consanguinee a causa dell'usanza piuttosto che della varietà genetica locale.

In teoria, la produzione materna di anti-H durante la gravidanza potrebbe causare una malattia emolitica in un feto che non ha ereditato il fenotipo Bombay della madre. In pratica, non sono stati descritti casi di HDN causati in questo modo. Ciò può essere possibile per la rarità del fenotipo Bombay ma anche per le IgM prodotte dal sistema immunitario della madre. Poiché le IgM non vengono trasportate attraverso i microscopici vasi sanguigni placentari (come lo sono le IgG), non possono raggiungere il flusso sanguigno del feto per provocare la reazione emolitica acuta prevista.


Laboratorio di biologia di base


Spiegazione rapida del test del gruppo sanguigno ABO/Rh: Per capire come funziona questo tipo di test del gruppo sanguigno, dovrai (a) capire cosa sono gli anticorpi e come funzionano e (b) cos'è l'agglutinazione. La foto sopra mostra una diapositiva con 4 gocce di sangue SEPARATE (della stessa persona). OGNUNA di queste quattro gocce di sangue è stata miscelata con un liquido contenente UN tipo di anticorpi (che sono diversi per ogni goccia di sangue).

(a) Che cos'è un? anticorpo e COME funziona nella tipizzazione ABO/Rh?

Gli anticorpi sono proteine ​​a forma di Y che sono, come probabilmente saprai, attori importanti nel sistema immunitario. Nel sistema immunitario, gli anticorpi "segnalano" molecole dall'aspetto estraneo (chiamate "antigeni"). Questa segnalazione aiuta a segnalare ("reclutare") alcune altre cellule immunitarie per distruggere la cosa dall'aspetto estraneo, perché quella cosa dall'aspetto estraneo potrebbe essere tossica o essere attaccata a qualcosa di tossico/nocivo.

Gli anticorpi hanno una proprietà fisica speciale: possono essere prodotti in "lotti" estremamente specifici per essere in grado di "segnalare" solo UN tipo di antigene (qualche piccola molecola), come quelli sulla superficie dei globuli rossi nell'uomo. Nella tipizzazione del sangue, possiamo sfruttare questa proprietà di "specificità" fisica che hanno gli anticorpi. Gli antigeni comuni trovati sui globuli rossi nell'uomo sono antigeni "A", antigeni "B" e antigeni del fattore Rh. Possiamo REALIZZARE anticorpi contro CIASCUNO di questi antigeni, rispettivamente, e usarli per la tipizzazione del sangue. (Vedi Link 1 di seguito per video e ulteriori dettagli).


(b) Che cos'è agglutinazione?


Qual è la configurazione di base per la tipizzazione del sangue?

La configurazione di base PER OGNI GOCCIA DI SANGUE è questa: goccia di sangue da UNA persona + UNA goccia di liquido contenente un tipo di anticorpo che si attacca solo a un certo antigene noto. Ad esempio, consideriamo la prima goccia di liquido nella foto, partendo da sinistra (ovvero la goccia etichettata "anti-A"). Cosa c'è, nello specifico, in quella prima goccia di liquido? Questa goccia di liquido etichettata "anti-A" contiene due elementi: goccia di sangue (quindi globuli rossi) + anticorpi che sono *specificamente* CONTRO l'antigene umano "A" (piccole molecole che possono essere trovate in molti punti del superficie cellulare dei globuli rossi di persone che hanno sangue di tipo A o di tipo AB).

La storia dell'agglutinazione qui è che l'anticorpo anti-A si "attaccherà" SOLO agli antigeni "A" umani che questo anticorpo "vede"/in cui incontra quando il sangue di tipo A o di tipo AB viene mescolato con una soluzione liquida piena di anti-A anticorpi. Questo "attaccare" l'anticorpo anti-A all'antigene "A" sulla superficie dei globuli rossi è un altro modo per dire che si sta verificando una reazione di agglutinazione diretta. Nel caso della tipizzazione del sangue, viene utilizzata una classe comune di anticorpi chiamata IgM perché questa classe di anticorpi ha una forma che gli consente di "attaccarsi" a molti globuli rossi contemporaneamente, determinando così una reazione di aggregazione/agglutinazione MOLTO veloce se è presente l'antigene corretto ("A" in questo caso) che corrisponde all'anticorpo (nel caso, anticorpo anti-A). Pertanto, se non sono presenti antigeni "A" sui globuli rossi in presenza di anticorpi anti-A, non si verificherà alcuna reazione di agglutinazione.


In breve, se la configurazione del gruppo sanguigno è quella che è normalmente: goccia di sangue + UN tipo di anticorpo verso un certo antigene noto (es. antigene "A", antigene "B" o fattore/antigene "Rh") , poi NESSUNA reazione di agglutinazione (cioè NESSUN agglomerato) osservato significa che la persona NON hanno QUEL antigene (cioè l'antigene contro cui l'anticorpo è specificamente "contro", cioè "capace di attaccarsi") sulla superficie dei loro globuli rossi. Tuttavia, se l'aggregazione è osservata, quindi la persona FA hanno quell'antigene presente sulla superficie dei loro globuli rossi.

Per le tue schede flash/guida allo studio:

S aggregazione = il campione di sangue HA l'antigene.
NESSUN agglomerato = il campione di sangue NON ha l'antigene

Cosa devo fare per determinare il gruppo sanguigno dalle 4 gocce di sangue ciascuna mescolata con un anticorpo diverso?

Quindi, determinare l'aggregazione (agglutinazione) o meno è abbastanza facile: o S o NO. Non vi è alcuna via di mezzo nel caso della tipizzazione del sangue mediante anticorpi.

SE il campione di sangue SI ACCUMULA in presenza di anticorpo "anti-A", sai che la persona ha l'antigene "A". Ma questo è tutto, non sai ancora se sono di tipo A o di tipo AB se non hai guardato il risultato della reazione anticorpale "anti-B" con il loro sangue. D'altra parte, SE il campione di sangue della persona NON SI ACCUMULA in presenza di anticorpi "anti-A", allora DI SICURO puoi dire che la persona NON ha sangue di tipo A, NÉ ha sangue AB - tuttavia, non conosci ancora il loro gruppo sanguigno definitivo perché potrebbero essere di tipo B o di tipo O. Hai ancora bisogno di guardare la reazione del loro sangue in presenza dell'anticorpo "anti-B". Come puoi vedere, non puoi gruppo sanguigno usando un solo tipo di anticorpo, devi usare tutti e tre i tipi di anticorpi usati nella tipizzazione del sangue: anticorpo "anti-A", anticorpo "anti-B" e "anti-Rh" anticorpo.

SE il campione di sangue si aggrega in presenza di anticorpi "anti-B", allora sai che la persona ha l'antigene "B". Se NON hai già ottenuto il risultato del test per gli anticorpi "anti-A", potrai solo dire che il sangue della persona è di tipo B o di tipo AB. Se HAI già fatto il test per gli anticorpi "anti-A" e il sangue della persona AVEVA GRUMATO in presenza di anticorpi "anti-A", allora puoi determinare il loro gruppo sanguigno ABO (ma non il fattore Rh - ancora, cioè non puoi dire se sono "positivi" o "negativi" per Rh a questo punto). Ad esempio, se il sangue della persona si è agglomerato in presenza di un anticorpo "anti-A" E si è ammassato in presenza di un anticorpo "anti-B" (di nuovo, queste sono reazioni separate - non si mescolano mai due diversi tipi di anticorpi insieme per qualsiasi fase della tipizzazione del sangue), allora il sangue è di tipo AB. Tuttavia, se c'era aggregazione in presenza di anticorpo "anti-A" ma NESSUN agglomerato in presenza di anticorpo "anti-B", allora il sangue è di tipo A. Il contrario dell'ultimo esempio segue logicamente: se il sangue ha NON si ammucchia in presenza di anticorpo "anti-A", ma HA CLUMP in presenza di anticorpo "anti-B", quindi il sangue della persona è di tipo B.

Cosa succede se NON c'è agglomerazione in presenza di anticorpo "anti-A" E NESSUN agglomerato in presenza di anticorpo "anti-B"? Bene, allora quel gruppo sanguigno è di tipo O, perché il sangue di tipo O significa che i globuli rossi NON hanno antigeni, quindi non c'è fisicamente NIENTE a cui l'anticorpo "anti-A" si attacchi, proprio come non c'è NIENTE per l'anticorpo "anti-A". Anticorpo B" a cui attenersi.


Conosco il mio tipo ABO (A, B, AB o O), ma il mio gruppo sanguigno A/B/AB/O è "positivo" o "negativo"? Si tratta di determinare il fattore Rh.

SE il campione di sangue SI ACCUMULA in presenza di anticorpo "anti-Rh", allora il sangue è Rh POSITIVO (Rh +).

SE il campione di sangue NON SI ACCUMULA in presenza di anticorpi "anti-Rh", allora il sangue è Rh NEGATIVO (Rh -).

Quando si "segnala" il proprio gruppo sanguigno ABO/Rh COMPLETO, scrivere il gruppo sanguigno ABO (A, B, AB o O) e poi un apice di "+" o "-" per indicare la presenza (+) di Rh fattore o l'assenza (-) del fattore Rh.


Perché il fattore Rh è importante per scopi medici?

Il fattore Rh è importante a causa delle trasfusioni di sangue, di alcuni trapianti di organi e delle gravidanze nelle donne Rh.

Il fattore Rh è un altro tipo di antigene che determina il gruppo sanguigno (gruppo sanguigno complessivo) ed è importante perché proprio come la corrispondenza del gruppo sanguigno ABO per le trasfusioni di sangue, il fattore Rh può causare problemi potenzialmente fatali per il ricevente di sangue se c'è una mancata corrispondenza . Cioè, è una discrepanza potenzialmente problematica trasfondere una persona con sangue di tipo A (ad esempio) Rh+ (positivo) a una persona con sangue Rh- (negativo) di tipo A. Il problema nasce dal fatto che la persona con Rh - sangue può avere un sistema immunitario che ha già prodotto anticorpi naturali, permanenti, circolanti al fattore Rh (dove Rh "positivo" indica la "presenza" del fattore Rh o "antigene" "sulla superficie dei globuli rossi nel sangue di quella persona). Nel caso di questo mismatch trasfusionale del fattore Rh, gli anticorpi "anti-Rh" del ricevente attaccherebbero i globuli rossi del donatore a causa della presenza del fattore/antigene Rh sulla superficie dei globuli rossi del donatore, che si vedono (da la prospettiva del sistema immunitario del ricevente) come "estraneo", e quindi deve essere contrassegnato per la distruzione da parte degli anticorpi "anti-Rh". Ciò porta a una reazione trasfusionale in cui gli anticorpi Rh del ricevente si attaccano ai globuli rossi appena donati di cui il ricevente ha disperatamente bisogno, con conseguente agglutinazione ed eventuale distruzione da parte di altre cellule immunitarie (causando così "soffocamento" a livello cellulare attraverso il progressivo perdita di globuli rossi che trasportano ossigeno) - se il ricevente non muore PRIMA per il blocco dei vasi sanguigni in tutto il corpo a causa della reazione di agglutinazione causata dall'incompatibilità Rh nella trasfusione di sangue. D'altra parte, è perfettamente sicuro trasfondere SOLO i globuli rossi di un donatore con sangue di tipo A Rh - in un ricevente con sangue di tipo A Rh+. Questo è sicuro perché il sistema immunitario del ricevente "non si preoccupa" se i globuli rossi del donatore MANCANO del fattore Rh (antigene). Trasfondere sangue da un donatore con Rh+ di tipo A a un ricevente con Rh+ di tipo A è sicuro, ovviamente, PERCHÉ il ricevente, in virtù di AVERE il fattore Rh (antigene) presente sui PROPRI globuli rossi, NON ha anticorpi contro il fattore Rh --quindi, non c'è possibilità di una reazione trasfusionale basata sul fattore Rh.

Oltre alle trasfusioni di sangue, ai trapianti di organi, ecc., l'altra implicazione medica dell'eritroblastosi fetale del fattore Rh, o "malattia emolitica del neonato".

1. Una spiegazione carina e concisa del gruppo sanguigno ABO/Rh (

video di 15 minuti):
Spiegazioni del gruppo sanguigno ABO/Rh più facili da elaborare quando viene utilizzata un'analogia appropriata. Ecco un link a un ottimo video, che, anche se un po' sdolcinato, è molto appropriato per coloro che vogliono imparare per la prima volta i fondamenti sulla tipizzazione ABO/Rh.


Anticorpi del gruppo sanguigno

I globuli rossi di un individuo contengono antigeni sulle superfici cellulari che corrispondono al loro gruppo sanguigno. Gli anticorpi nel siero che identificano tale antigene si localizzano sulle superfici dei globuli rossi di un altro gruppo sanguigno. Attualmente, 35 sistemi di gruppi sanguigni che rappresentano oltre 300 antigeni sono elencati dalla International Society of Blood Transfusion (ISBT).

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Cos'è il gruppo sanguigno?
La presenza o l'assenza di determinate proteine, antigeni situati sulla superficie dei globuli rossi e anticorpi nel plasma sanguigno, portano ai diversi tipi di gruppi sanguigni. Finora, ci sono più di 300 gruppi sanguigni umani, ma solo circa 20 sono geneticamente determinati. Tra questi 20 gruppi sanguigni, una minoranza sono le reazioni trasfusionali clinicamente significative, in cui i sistemi ABO e Rh sono i più comuni.

Il sistema ABO
Il sistema ABO è il sistema del gruppo sanguigno più importante nella trasfusione di sangue umano, poiché qualsiasi persona di età superiore ai 6 mesi possiede anticorpi anti-A e/o anti-B clinicamente significativi nel proprio siero. Il gruppo sanguigno A contiene anticorpi contro il gruppo sanguigno B nel siero e viceversa, mentre il gruppo sanguigno O non contiene antigeni A/B ma entrambi i loro anticorpi nel siero. Questa scoperta è un enorme progresso nella pratica trasfusionale clinica per prevenire il pericolo fatale di trasfusioni di sangue ABO-incompatibili.

Il sistema Rh
Il sistema Rh (Rh che significa Rhesus) è il secondo sistema di gruppi sanguigni più significativo nella trasfusione di sangue umano comprendente antigeni di D (o Rho), C, E, c ed e, tra i quali l'antigene D è il più significativo . Quelli che possiedono l'antigene D sulla superficie dei globuli rossi sono Rh-positivi, mentre altri che mancano dell'antigene D sono Rh-negativi, indipendentemente dagli altri antigeni Rh presenti. La presenza o l'assenza dell'antigene Rh(D) è indicata dal segno + o ? segno, in modo che per esempio la A? gruppo è ABO di tipo A e non ha l'antigene Rh (D).

Altri sistemi di gruppi sanguigni clinicamente importanti

Oltre agli antigeni ABO e agli antigeni Rh, molti altri antigeni sono espressi sulla membrana superficiale dei globuli rossi. Ad esempio, un individuo può essere AB, D positivo, e allo stesso tempo M e N positivo (sistema MNS), K positivo (sistema Kell), Lea o Leb negativo (sistema Lewis), e così via, essendo positivo o negativo per ciascun antigene del sistema dei gruppi sanguigni.

Che cos'è l'anticorpo del gruppo sanguigno?

Gli anticorpi del gruppo sanguigno nel siero sono gli anticorpi clinicamente significativi, che possono identificare in modo specifico gli antigeni localizzati sulle superfici dei globuli rossi di un altro gruppo sanguigno, tipicamente a scopo di trasfusione. Come tutti sappiamo, se si mescolano gruppi sanguigni incompatibili, si verificheranno agglomerati di sangue o agglutinazione. Vale a dire, le reazioni trasfusionali o la malattia emolitica del feto e del neonato (HDFN) sono solitamente il risultato di alloanticorpi prodotti dall'esposizione a un diverso gruppo sanguigno mediante trasfusione o gravidanza.

L'attività anti-A e anti-B risiede in modo preminente nella classe IgM, mentre solo pochi rimangono con le IgG che rivestono i globuli rossi senza alcun effetto sulla loro vitalità ma con conseguente MEFN attraversando la placenta. Specialmente, quelli con gruppo sanguigno O hanno regolarmente più IgG anti-A e anti-B di tutti gli altri.

Come monomero con 2 siti Fab e una porzione Fc che trasporta il recettore dei macrofagi, IgG, richiede un'elevata concentrazione per attivare il complemento, ma solo per gli immunocomplessi C3, che è in grado di amplificare l'emolisi extravascolare. La maggior parte delle IgG può legarsi con l'antigene correlato sui globuli rossi intorno alla normale temperatura corporea di 37 ° C, che sono definiti come anticorpi caldi e anticorpi clinicamente più significativi. D'altra parte, l'IgM, come un pentamero con 10 siti Fab e senza il recettore dei macrofagi, è l'anticorpo freddo che si lega all'Ag a temperatura ambiente oa temperature più basse. Le IgM di solito non causano problemi clinici, ma possono essere rilevate dai test di laboratorio poiché i polimeri consentono l'attivazione del complemento a C9 e l'emolisi intravascolare se riattivati ​​a 37°C.


Immunologia e patogenesi degli stadi ematici asessuati di P. falciparum

Un esame dei meccanismi di invasione merozoite dell'eritrocita rivela strategie di evasione immunitaria impiegate dal parassita e potenziali bersagli per i vaccini. L'invasione degli eritrociti segue una sequenza di eventi ben definita e rapida sulla superficie dei globuli rossi (RBC). Innanzitutto, il merozoite interagisce con la superficie dei globuli rossi e riorienta la regione apicale verso la membrana (Aikawa et al.,1978 Dvorak et al.,1975). Il contenuto degli organelli apicali (rottrie e micronemi) viene espulso e si forma una giunzione mobile tra il merozoite e la membrana dei globuli rossi. Infine, il parassita entra in un vacuolo formato dall'invaginazione della membrana dei globuli rossi e delle membrane secrete dal parassita. Questo processo è completato in pochi minuti. All'estremità invasiva (apicale) del parassita sono presenti tre organelli (rottrie, micronemi e granuli densi). I recettori che mediano l'invasione dei globuli rossi da parte dei merozoiti e l'invasione del fegato da parte degli sporozoiti si trovano nei micronemi, sulla superficie cellulare e nelle rottrie, e l'accumulo di prove suggerisce che queste molecole sono i principali bersagli della neutralizzazione delle risposte immunitarie (Miller et al., 2002 ).

La posizione di questi recettori all'interno degli organelli fornisce una certa protezione al parassita dalla neutralizzazione mediata da anticorpi, poiché l'esposizione all'anticorpo si verifica solo tra il rilascio da un GR e l'invasione di un altro. Ciò fornisce una breve finestra di opportunità per gli anticorpi di legare e neutralizzare i merozoiti. Una volta all'interno dei globuli rossi, alcune molecole del parassita si dirigono verso la superficie dei globuli rossi, mentre altre rimangono nei vacuoli membranosi all'interno della cellula (Miller et al., 2002). Poiché i globuli rossi mancano di antigeni del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I e II, i parassiti dello stadio ematico sono anche protetti dalle risposte delle cellule T effettrici, che dipendono dalle vie di presentazione dell'antigene di classe I e II. Solo dopo la rottura dei globuli rossi allo stadio dell'anello gli antigeni interni al parassita sono direttamente esposti agli anticorpi.

Si pensa che l'immunità contro gli antigeni dello stadio ematico coinvolga sia gli anticorpi che i linfociti T sebbene, nell'uomo, esistano prove migliori per l'immunità mediata da anticorpi (Good et al., 1998). Gli studi epidemiologici nelle regioni endemiche della malaria supportano l'idea che le risposte anticorpali ai parassiti dello stadio ematico contribuiscono all'immunità acquisita naturalmente. I sieri di esseri umani che vivono in regioni iperendemiche contengono anticorpi che prevengono l'invasione dei globuli rossi mirando agli antigeni sui merozoiti (Bull e Marsh, 2002). La prova diretta di una funzione protettiva degli anticorpi deriva dal trasferimento passivo di immunoglobuline purificate da individui "naturalmente immuni" a bambini parzialmente immuni, che è risultato produrre una rapida eliminazione dei parassiti nei bambini riceventi anche quando gli anticorpi non bloccano la crescita in vitro (McGregor, 1964). Questi sieri contenevano indubbiamente alti livelli di anticorpi contro l'antigene di superficie dei globuli rossi variante, PfEMP1, che non ucciderebbe in vitro, ma impedirebbe il sequestro di parassiti maturi in vivo, con conseguente loro distruzione splenica. Questi risultati sono coerenti con gli effetti osservati degli anticorpi anti-PfEMP1 indotti in Aotus scimmie sfidate con P. falciparum (Baruch et al.,1996). Negli esseri umani, i sieri di individui immuni hanno titoli elevati di anticorpi contro la proteina 1 della membrana eritrocitaria (PfEMP1) oltre ad altri antigeni merozoiti interni e di superficie, quindi i ricercatori hanno ipotizzato che PfEMP1 sia un bersaglio per l'immunità mediata da anticorpi (Miller et al., 2002). Diversi domini di questo antigene espresso sulla superficie degli eritrociti mediano la citoaderenza dei globuli rossi parassitizzati attraverso interazioni con recettori specifici, ad esempio CD36 (sulla superficie delle cellule endoteliali) e condroitin solfato A (sui sinciziotrofoblasti placentari) (Miller et al., 2002). PfEMP1 è codificato dal grande e diversificato varia famiglia di geni, che svolge un ruolo chiave nella variazione antigenica clonale. La pressione immunitaria porta rapidamente alla comparsa di parassiti che esprimono geni varianti differenti. Tuttavia, studi recenti indicano che alcuni domini funzionali della molecola possono indurre un grado di immunità cross-variante (Baruch et al.,1997).

Oltre all'effetto diretto dell'anticorpo umano sui parassiti, in vitro l'incubazione di eritrociti infetti con IgG da donatori umani immuni e monociti da un donatore ingenuo uccide il parassita all'interno dei globuli rossi. Questa inibizione cellulare anticorpo-dipendente (ADCI) associata all'uccisione del parassita è mediata da fattori solubili trasferibili nei surnatanti dei macrofagi (Bouharoun-Tayoun et al., 1995). Sono stati implicati anticorpi citofili contro antigeni merozoiti in vitro in saggi con macrofagi umani e invivo nei topi SCID (Badell et al.,2000). L'ADCI può fornire una strategia alternativa o complementare per l'eliminazione del parassita mediata da anticorpi dopo la vaccinazione.

Indipendentemente dall'anticorpo, le linee e i cloni di cellule T possono trasferire adottivamente la protezione, suggerendo che le cellule T CD4 possono controllare i parassiti dello stadio ematico (Amante e Good, 1997 Brake et al., 1988). Gli studi su modelli animali hanno anche implicato meccanismi mediati dalle cellule T (o indipendenti dagli anticorpi) nell'immunità contro i parassiti della malaria allo stadio ematico (per una rassegna, vedere Wipasa et al., 2002). Questi studi hanno dimostrato che cloni (Brake et al., 1988) e popolazioni policlonali di cellule T (Amante e Good, 1997) possono trasferire adottivamente protezione, apparentemente in assenza di anticorpi, suggerendo che le cellule T CD4 possono controllare i parassiti dello stadio ematico. Continuano le speculazioni sui meccanismi alla base del controllo dei parassiti mediato dalle cellule T CD4. Le citochine e altri meccanismi effettori diretti come l'ossido nitrico e le cellule T sono stati implicati nell'eliminazione dei parassiti da numerosi studi (Hirunpetcharat et al., 1999 Seixas et al., 2002). Tuttavia, le conclusioni degli studi sui roditori dovrebbero essere estese con cautela alla malaria umana, perché ci sono chiare differenze nell'importanza relativa degli anticorpi e della funzione effettrice delle cellule T per l'eliminazione dei parassiti tra diverse specie di roditori e ospiti. Sebbene la maggior parte delle prove del coinvolgimento delle cellule T provenga da studi murini, dati recenti sull'uomo che mostrano che l'infezione ripetuta di basso grado induce l'immunità sterile in assenza di anticorpi rilevabili suggerisce che la protezione mediata dalle cellule T opera anche negli esseri umani (Pombo et al. al.,2002).

Recenti indagini hanno fornito nuove informazioni sul ruolo delle cellule T e dell'immunità innata nella clearance dei parassiti dello stadio ematico (Perlmann e Troye-Blomberg, 2002). Le prove provengono da esperimenti che dimostrano che l'infezione con alcune specie di parassiti nei roditori può portare a anergia e apoptosi delle cellule T CD4 parassita-specifiche (ma non cellule di altre specificità) (Xu et al., 2002). Questa potrebbe essere un'ulteriore strategia del parassita per inibire l'immunità dell'ospite. Sono stati descritti anche altri meccanismi di compromissione immunitaria da parte del parassita della malaria, come l'inibizione della maturazione delle cellule dendritiche e l'attivazione da parte del parassita (Urban et al.,2001).


II. Pazienti in trasfusione con anemia emolitica autoimmune: come dovrebbe trattare un medico con le unità "L east incompatibili"?

Direttore medico, StemCyte, 400 Rolyn Place, Arcadia, CA 91007

La trasfusione di pazienti con anemia emolitica autoimmune (AIHA) presenta una serie unica di problemi. Quando è presente un autoanticorpo ampiamente reattivo, come è generalmente vero, tutte le unità di globuli rossi (RBC) saranno incompatibili. Tuttavia, con le dovute precauzioni, la sopravvivenza dei globuli rossi trasfusi è generalmente buona quanto la sopravvivenza dei globuli rossi del paziente e la trasfusione generalmente causa un beneficio temporaneo. Infatti, la trasfusione non dovrebbe mai essere negata a un paziente con un bisogno giustificato, anche se potrebbe essere impossibile trovare sangue compatibile. 1– , 3 In altre parole, la decisione di trasfondere dovrebbe dipendere da una valutazione dello stato clinico del paziente e non dai risultati del test di compatibilità (crossmatch test).

Comunicazione con il servizio trasfusionale

La notifica al servizio trasfusionale circa la potenziale necessità di trasfusione dovrebbe avvenire non appena viene presa in considerazione la trasfusione. 4, 5 Il medico deve considerare il tempo necessario al servizio trasfusionale per eseguire i test sierologici, spesso complessi, necessari per garantire l'ottenimento del prodotto ottimale di globuli rossi per la trasfusione. Nella grande maggioranza dei casi, può essere necessario un tempo adeguato per completare gli studi di identificazione degli anticorpi e i test di compatibilità appropriati.

I principi dei test di compatibilità in AIHA

I medici devono avere familiarità con i seguenti principi dei test di compatibilità nei pazienti con AIHA in modo che possano comunicare efficacemente con il personale del servizio trasfusionale.

Nel funzionamento quotidiano del servizio trasfusionale di un ospedale, vengono eseguiti test di compatibilità per determinare se le unità di GR possono essere trasfuse senza il rischio di una reazione trasfusionale emolitica. Il sangue compatibile non reagisce con gli anticorpi dei globuli rossi nel siero del paziente. Gli anticorpi più importanti sono anti-A e anti-B, poiché questi causano l'emolisi più grave. L'emolisi causata da anti-A e anti-B è facilmente evitata fornendo sangue di tipo ABO identico o compatibile. Determinare il corretto tipo di ABO del paziente non è un grosso problema nei pazienti con AIHA.

Il problema tecnico più importante affrontato dal servizio trasfusionale nei confronti dei pazienti con AIHA riguarda altri alloanticorpi eritrocitari, in grado di provocare reazioni emolitiche trasfusionali. Questi alloanticorpi sono sviluppati a seguito di precedenti trasfusioni o gravidanze e possono essere diretti contro antigeni di un certo numero di sistemi di gruppi sanguigni, come Rh, Kell, Kidd e Duffy. I dati pubblicati indicano che gli alloanticorpi sono stati rilevati in 209 su 647 sieri (32%) di pazienti con AIHA, 6 indicando chiaramente la necessità di un metodo per rilevare questi anticorpi per prevenire reazioni trasfusionali emolitiche indotte da alloanticorpi. Infatti, gli alloanticorpi non rilevati possono essere la causa di un aumento dell'emolisi dopo la trasfusione, che può essere erroneamente attribuito ad un aumento della gravità dell'AIHA. 1

Questi alloanticorpi vengono normalmente rilevati e identificati testando il siero del paziente contro un pannello di globuli rossi di fenotipi noti. Ad esempio, l'anti-Jk a (un anticorpo nel sistema del gruppo sanguigno Kidd che può causare gravi reazioni emolitiche trasfusionali) è identificato dal fatto che il siero del paziente reagirà con Jk a+ RBC e non reagirà con Jk a RBC. Tuttavia, nell'anticorpo caldo AIHA, gli autoanticorpi nel siero del paziente generalmente reagiscono con tutti i globuli rossi testati, mascherando così la presenza dell'anti-Jk a .

Approcci alla selezione di unità donatrici di globuli rossi in pazienti con autoanticorpi caldi

Sono disponibili numerosi approcci per la selezione di unità di globuli rossi del donatore in pazienti con autoanticorpi caldi. 7 Questi includono test di routine del siero del paziente contro un pannello di globuli rossi che diluisce il siero del paziente prima di eseguire test di compatibilità eseguendo test di adsorbimento, che rimuoveranno gli autoanticorpi ma non gli alloanticorpi dal siero del paziente e forniranno unità di globuli rossi fenotipicamente abbinate.

Test del siero del paziente contro un pannello di globuli rossi

Se sono presenti un autoanticorpo debolmente reattivo e un alloanticorpo fortemente reattivo, le differenze nella forza della reazione delle varie cellule del pannello lo renderanno evidente.Tuttavia, non vi è alcuna garanzia che l'alloanticorpo di un paziente reagirà più fortemente dell'autoanticorpo, quindi sono necessari ulteriori test.

Tecnica di diluizione

Una diluizione del siero, come 1 su 5, può essere scelta arbitrariamente per i test di compatibilità nella speranza che questa diluisca l'autoanticorpo ma non l'alloanticorpo. 8 Sebbene la procedura rilevi alcuni alloanticorpi, Leger e Garratty 7 hanno riferito che solo il 19% degli alloanticorpi potenzialmente significativi dal punto di vista clinico era identificabile. Sembra preferibile selezionare una diluizione del siero del paziente che reagisce 1+ contro i globuli rossi del donatore e quindi testare tale diluizione contro un pannello di globuli rossi. Le tecniche di diluizione sono facili e rapide. Tuttavia, sono inaffidabili, quindi dovrebbero essere eseguite altre procedure più efficaci tranne che in situazioni molto urgenti.

Procedure di adsorbimento

Tecnica di autoadsorbimento a caldo.

La tecnica di adsorbimento ottimale per la rilevazione di alloanticorpi in presenza di un autoanticorpo ampiamente reattivo è la procedura di autoadsorbimento a caldo. In questa tecnica, parte dell'autoanticorpo viene eluito dai globuli rossi del paziente, quindi queste cellule vengono utilizzate per adsorbire l'autoanticorpo dal siero del paziente a 37°C. Il siero può quindi essere testato per gli alloanticorpi, poiché gli alloanticorpi non verranno adsorbiti sui globuli rossi del paziente.

Un problema affrontato dai servizi trasfusionali è che la grave anemia del paziente può precludere l'ottenimento di un volume sufficiente di globuli rossi per la procedura di autoadsorbimento. I medici dovrebbero fornire quanti più globuli rossi possibile perché la procedura di autoadsorbimento è il metodo più efficace per rilevare gli alloanticorpi nei pazienti con autoanticorpi caldi. Il test di autoadsorbimento a caldo non è utile nei pazienti che sono stati trasfusi di recente (entro circa gli ultimi 3 mesi) perché anche una piccola percentuale di cellule trasfuse può adsorbire l'alloanticorpo durante la procedura di adsorbimento in vitro, invalidando così i risultati. 9

Adsorbimento allogenico.

Quando i test di autoadsorbimento non sono fattibili, la procedura ottimale è la tecnica di adsorbimento allogenico, ovvero l'assorbimento di autoanticorpi dal siero del paziente utilizzando diversi campioni di globuli rossi allogenici di fenotipi diversi. Ad esempio, l'esecuzione di un adsorbimento utilizzando una cellula Jk a− di un siero contenente un autoanticorpo caldo e un alloanticorpo anti-Jk a rimuoverà l'autoanticorpo ma non l'anti-Jk a . Selezionando 2 o 3 campioni di globuli rossi di vari fenotipi per la procedura di assorbimento, è possibile rilevare gli alloanticorpi responsabili di quasi tutte le reazioni emolitiche trasfusionali clinicamente importanti. Tuttavia, la tecnica richiede molta manodopera ed è impopolare nei laboratori dei servizi trasfusionali.

Trasfusione di globuli rossi fenotipicamente abbinati

Quando viene eseguita la fenotipizzazione estesa dei globuli rossi del paziente, è possibile determinare quali alloanticorpi un paziente potrebbe sviluppare a seguito di precedenti trasfusioni o gravidanze. Ad esempio, se un paziente è Jk a+, è impossibile sviluppare un alloanticorpo anti-Jk a. La trasfusione di globuli rossi selezionati sulla base del fenotipo esteso del paziente può fornire una misura significativa di sicurezza, 10, 11 ma devono essere sottolineate alcune avvertenze e precauzioni.

Per fornire un'adeguata sicurezza, la tipizzazione deve essere eseguita per numerosi antigeni eritrocitari (ad es. D, C, E, c, e, K, Jk a, Jk b, Fy a, Fy b, S e s). Tuttavia, determinare il fenotipo esteso è tecnicamente difficile quando il paziente ha un test dell'antiglobulina diretto (Coombs) positivo e può essere impossibile in una percentuale significativa di pazienti con AIHA da anticorpi caldi anche se tentato dai tecnologi più esperti. Quei servizi trasfusionali che potrebbero preferire selezionare il sangue per la trasfusione sulla base della fenotipizzazione estesa piuttosto che dei test di adsorbimento devono tenere presente che i test di adsorbimento saranno necessari per quei pazienti per i quali non è possibile determinare un fenotipo esteso.

Fenotipizzazione parziale, ad esempio, per gli antigeni Rh, K e Jk a non fornirebbe protezione contro l'alloimmunizzazione da parte di antigeni di altri sistemi di gruppi sanguigni che possono causare reazioni trasfusionali emolitiche, 12–, 14 e quindi non precluderebbero la necessità di studi di adsorbimento pretrasfusione.

Non è stato determinato se l'implementazione di questo approccio sia conveniente e fattibile in molti ospedali e centri trasfusionali. Se l'intenzione è quella di enfatizzare la fornitura di unità fenotipiche, è necessario determinare che il fornitore di sangue possa fornire tali unità in modo affidabile e si deve riconoscere che saranno necessari studi di adsorbimento nei casi in cui i globuli rossi del paziente non possono essere fenotipizzati.

Test di compatibilità nell'anticorpo freddo AIHA

Il test di compatibilità nell'AIHA con anticorpi freddi richiede meno lavoro rispetto all'AIHA con anticorpi caldi. Nella sindrome da agglutinine fredde, gli autoanticorpi non reagiscono spesso fino a una temperatura di 37°C, mentre gli alloanticorpi eritrocitari clinicamente significativi reagiranno a questa temperatura. Di conseguenza, il test di compatibilità può essere eseguito rigorosamente a 37°C. Se il servizio trasfusionale non è in grado di eseguire i test rigorosamente a 37°C, devono essere eseguiti 1 o 2 autoadsorbimenti a freddo, che non rimuoveranno completamente un'agglutinina fredda ad alto titolo ma è probabile che eliminino le reazioni che si verificano a 37°C. Anche se la specificità delle agglutinine fredde è spesso anti-I, fornire globuli rossi negativi per l'antigene I non è pratico a causa della loro rarità e il loro uso potrebbe non essere vantaggioso.

Allo stesso modo, nell'emoglobinuria parossistica fredda (PCH), l'autoanticorpo non reagirà a 37°C. In questo disturbo, l'autoanticorpo è insolito in quanto molto spesso ha specificità per l'antigene P. Sebbene il test incrociato di routine possa sembrare compatibile con i globuli rossi P + poiché l'anticorpo reagisce solo al freddo (di solito < 15°C), ci sono alcuni suggerimenti che i globuli rossi p o pk (mancanti dell'antigene P) sopravviveranno meglio . 15, 16 Tuttavia, questi globuli rossi sono disponibili solo da file di donatori rari ed è probabile che i pazienti necessitino di trasfusioni prima che i globuli rossi siano disponibili. In generale, dovrebbe essere fornita la trasfusione di globuli rossi dei tipi P comuni poiché i pazienti con PCH hanno spesso un'emolisi grave e l'attesa della disponibilità di globuli rossi p o p k rischia di ritardare una trasfusione necessaria. Numerosi autori hanno riportato il successo di trasfusioni di pazienti con PCH e, quasi certamente, le trasfusioni erano di sangue P-positivo. 17

Uso di sangue caldo per pazienti con anticorpi freddi AIHA

Eminenti autorità offrono opinioni nettamente divergenti riguardo alla necessità di sangue caldo quando si trasfondono pazienti con anemie emolitiche da anticorpi freddi, e ci sono pochi dati che indicano l'efficacia di tale politica. 12, 16– , 20 In assenza di dati estesi, deve prevalere la logica. L'uso di un riscaldatore di sangue in linea sembrerebbe indicato se il paziente ha una grave emolisi indotta da anticorpi del raffreddore. È anche logico mantenere caldo il paziente, anche se l'efficacia di tale manovra non è stata dimostrata. Se il sangue deve essere riscaldato, deve essere fatto correttamente. Il riscaldamento incontrollato o incontrollato del sangue è estremamente pericoloso e non dovrebbe essere tentato. I globuli rossi riscaldati troppo vengono rapidamente distrutti in vivo e possono essere letali. Sono disponibili 18 riscaldatori di sangue in linea semplici, efficienti e sicuri da usare. 21

Unità “meno incompatibili”

"Unità meno incompatibile" non è un termine ufficiale in medicina trasfusionale e non è definito nella letteratura medica. In generale, sembra significare la selezione di un'unità di sangue che dà reazioni più deboli nel test di compatibilità rispetto ad altre unità incompatibili. Cioè, i test di crossmatch possono essere eseguiti utilizzando un numero di unità donatrici che sono ABO e Rh abbinate al paziente e può essere selezionata quella che reagisce meno fortemente. La logica per l'utilizzo di unità "meno incompatibili" sembra essere che le reazioni più forti potrebbero essere causate da un alloanticorpo. L'uso di questo termine sembra risalire ai giorni precedenti all'elaborazione di test sierologici efficaci e pratici per identificare gli alloanticorpi in presenza di autoanticorpi che reagiscono con tutti i globuli rossi.

La selezione delle unità meno incompatibili non deve essere considerata un'alternativa accettabile alle tecniche sopra descritte per la selezione delle unità donatrici per la trasfusione. Affidarsi a unità meno incompatibili invece di eseguire studi sierologici appropriati è una pratica pericolosa e dovrebbe essere abbandonata tranne che in contesti estremamente urgenti in cui non c'è tempo per eseguire test sierologici adeguati.

Alcuni servizi trasfusionali sembrano utilizzare unità "meno incompatibili" in un altro contesto. Selezionano le unità donatrici per la trasfusione dopo aver tenuto adeguatamente conto degli alloanticorpi eritrocitari o selezionando le unità sulla base della fenotipizzazione estesa. Tuttavia, qualsiasi unità selezionata sarà, ovviamente, incompatibile con gli autoanticorpi del paziente. I servizi trasfusionali possono scegliere di incrociare le unità selezionate con il siero del paziente, anche se tutti questi incroci saranno incompatibili. Sebbene la scelta dell'unità meno incompatibile tra quelle selezionate possa fornire un livello di comfort al personale del servizio trasfusionale e non possa causare danni, questa scelta non fornisce alcun beneficio noto al paziente. Ciò è vero poiché è prevedibile che si verifichi una certa variabilità nella reattività causata da un autoanticorpo quando un numero di unità viene incrociato con il siero del paziente, semplicemente a causa dei limiti di precisione delle reazioni sierologiche.

L'unità “meno incompatibile” dovrebbe essere collocata nella spazzatura della terminologia sierologica per i seguenti motivi: non è definita nella nomenclatura della medicina trasfusionale è senza dubbio utilizzata in modo diverso da vari servizi trasfusionali e il suo utilizzo non fornisce informazioni sull'entità dei test di compatibilità eseguita. Inoltre, l'utilizzo del termine implica che l'utilizzo di unità meno incompatibili è un'alternativa accettabile all'esecuzione di un'adeguata valutazione sierologica prima della trasfusione in pazienti con AIHA, quando in realtà non è un'alternativa accettabile.

Riepilogo dei punti principali relativi ai test di compatibilità

La comprensione dei concetti di cui sopra dovrebbe consentire una comunicazione efficace tra il servizio trasfusionale e il medico che ordina la trasfusione. È necessario tenere a mente i seguenti punti: (1) se il paziente ha un autoanticorpo ampiamente reattivo, come di solito accade nell'AIHA, tutte le unità saranno incompatibili (2) sono disponibili metodi per aggirare il potenziale di una reazione emolitica trasfusionale causata da un alloanticorpi, e questi studi sierologici dovrebbero essere eseguiti per fornire una sicurezza ottimale (3) non ci sono dati disponibili che indichino che la selezione di unità "meno incompatibili" sia utile. Il termine non è definito nella letteratura sulla medicina trasfusionale e dovrebbe essere scartato.

Altri aspetti importanti della trasfusione per i pazienti con AIHA

Emoglobinemia ed emoglobinuria post-trasfusione

L'emoglobinemia e l'emoglobinuria a seguito di trasfusione di un paziente con AIHA sono state generalmente attribuite a un aumento del tasso di emolisi, sebbene possano verificarsi più comunemente a causa dell'aumento della massa totale di eritrociti disponibili per la distruzione. Infatti, la cinetica della distruzione dei globuli rossi nei pazienti con AIHA descrive sempre una curva esponenziale di decadimento, indicando che il numero di cellule rimosse in un'unità di tempo è una percentuale del numero di cellule presenti all'inizio di questo intervallo di tempo. 18 Quindi, più celle sono presenti all'istante zero, più celle in numero assoluto verranno distrutte nell'arco di tempo unitario. Infatti, Chaplin indica che la causa più comune di emoglobinuria post-trasfusionale nell'AIHA potrebbe non essere l'emolisi indotta da alloanticorpi ma, invece, l'effetto quantitativo della trasfusione nell'aumentare la massa eritrocitaria soggetta a continua distruzione mediata da autoanticorpi. 22 L'emoglobinemia e l'emoglobinuria post-trasfusionali così marcate hanno il potenziale per un grado significativo di morbilità associata e possibile mortalità.

Nei pazienti con anemia grave, c'è la tendenza a trasfondere grandi volumi di sangue per riportare rapidamente l'emoglobina e l'ematocrito a livelli quasi normali. Questo approccio può portare a conseguenze tragiche. Infatti, Gürgey et al 23 hanno sottolineato che 2 bambini con anticorpo caldo AIHA che sono stati trattati con trasfusioni di scambio sono morti di emolisi profonda poco dopo la procedura (sebbene Heidemann et al 24 abbiano riportato successo trasfusione di scambio in 1 paziente).

I pazienti sottoposti a grave emolisi intravascolare post-trasfusionale possono sviluppare coagulazione intravascolare disseminata (CID), probabilmente a causa di sostanze procoagulanti presenti nei lisati eritrocitari. 25, 26 Questi potenziali problemi hanno portato a forti avvertimenti contro l'eccessiva trasfusione di pazienti con AIHA. 1, 2, 18, 22, 27 Appare consigliabile la trasfusione di modesti volumi di globuli rossi appena sufficienti a mantenere un livello di ematocrito tollerabile. 18

Test di compatibilità in vivo

Il test di compatibilità in vivo è stato sostenuto da circa 28, 29 e, in generale, si basa sul test della sopravvivenza di un'aliquota di globuli rossi da un'unità che è stata selezionata per la trasfusione. Tuttavia, se è stato effettuato un attento studio sierologico utilizzando le tecniche e i principi già descritti per selezionare il miglior sangue possibile per la trasfusione, e un test in vivo dimostra tuttavia una sopravvivenza dei globuli rossi molto breve, non esiste un modo logico per selezionare un altro, unità più sicura.

Alcuni studi sono stati condotti utilizzando globuli rossi radiomarcati. Un'adeguata sopravvivenza (± 70% a 1 ora) dell'aliquota radiomarcata è stata considerata un'indicazione che non si sarebbe verificata una reazione trasfusionale emolitica acuta dopo la trasfusione dell'intera unità. 29 Tuttavia, la sopravvivenza di un'aliquota di globuli rossi in un breve periodo di tempo non fornisce necessariamente una buona indicazione circa la successiva sopravvivenza di un'intera unità di globuli rossi. 1, 29, 30 I test di compatibilità in vivo che utilizzano globuli rossi radiomarcati sono raramente, se non mai, eseguiti su servizi clinici.

Un approccio alternativo utilizzato da alcuni servizi trasfusionali è quello di infondere in un periodo di 20-30 minuti un'aliquota di 50 mL di globuli rossi dall'unità da trasfondere e osservare il paziente per i sintomi di una reazione emolitica trasfusionale e per lo sviluppo dell'emoglobinemia (ed emoglobinuria). La lisi intravascolare di appena 5 ml di globuli rossi aumenterà la concentrazione di emoglobina plasmatica di un adulto di circa 50 mg/100 ml, una quantità facilmente rilevabile mediante ispezione visiva. 22 Si ottiene un campione di sangue anticoagulato dopo l'infusione dell'aliquota e si centrifuga quindi il plasma viene confrontato visivamente con quello ottenuto prima dell'infusione. La mancanza di emoglobinemia (ed emoglobinuria) suggerisce che una reazione trasfusionale emolitica acuta non si verificherà con l'infusione dell'intera unità di sangue. La tecnica non è applicabile se il paziente ha già l'emoglobinemia.

Tuttavia, è improbabile che si verifichi una reazione trasfusionale emolitica acuta abbastanza grave da causare emoglobinemia immediata se non a causa dell'incompatibilità ABO. È improbabile che alloanticorpi diversi da quelli nel sistema dei gruppi sanguigni ABO causino una reazione così acuta. Scarse informazioni, se del caso, sono fornite sulla presenza di altri alloanticorpi che potrebbero causare una reazione trasfusionale emolitica ritardata. Anche se non si notano effetti avversi immediati, è improbabile che la sopravvivenza dell'intera unità sia migliore di quella dei globuli rossi del paziente. Oltre a rilevare l'incompatibilità ABO, l'unico vantaggio di questa tecnica è che il test richiede la valutazione dello stato del paziente durante la fase iniziale di una trasfusione. L'attenta osservazione del paziente è fondamentale, anche se ovviamente dovrebbe essere effettuata in ogni caso. In una modifica di questa procedura, la trasfusione viene eseguita lentamente fino a quando non è stato infuso l'equivalente di circa 50 ml di globuli rossi, quindi si ottiene un campione di sangue per l'ispezione visiva del plasma. La trasfusione non deve essere interrotta se il paziente rimane asintomatico. Non vi è alcun danno nell'eseguire un test di compatibilità in vivo, ma non dovrebbe essere considerato un sostituto per un adeguato test di compatibilità.

Uso di sostituti dei globuli rossi

Sono stati compiuti progressi nello sviluppo di sostituti dei globuli rossi e la disponibilità di O2-il trasporto di agenti terapeutici per uso clinico potrebbe influenzare la pratica della medicina trasfusionale. 31, 32 Mullon et al 32 hanno descritto l'uso di successo di un'emoglobina bovina polimerizzata in un paziente con AIHA pericolosa per la vita che era refrattaria al trattamento aggressivo. Tuttavia, nessun sostituto dei globuli rossi è attualmente approvato dalla FDA.

Uso di globuli rossi a ridotto contenuto di leucociti

È logico utilizzare globuli rossi a ridotto contenuto di leucociti per i pazienti con AIHA nel tentativo di ridurre la probabilità di una reazione trasfusionale febbrile non emolitica, che potrebbe essere difficile da distinguere da una reazione emolitica. Una reazione febbrile non emolitica porterebbe alla cessazione della trasfusione e, come risultato delle procedure tecniche aggiuntive coinvolte nei test di compatibilità in AIHA, potrebbe esserci un ritardo significativo nella scelta di un'unità alternativa. D'altra parte, se non sono prontamente disponibili globuli rossi a riduzione di leucociti appropriati, non si dovrebbe ritardare una trasfusione solo per ottenerli.

Uso di globuli rossi lavati

In precedenza, gli eritrociti lavati venivano utilizzati per ridurre l'incidenza di reazioni trasfusionali febbrili non emolitiche per la stessa ragione per cui sono stati utilizzati gli eritrociti leucocitari ridotti. È stato anche suggerito che i globuli rossi lavati potrebbero essere di beneficio nei pazienti con AIHA perché sono privi di componenti del complemento, che saranno in qualsiasi emoderivato contenente plasma. Tuttavia, i dati a sostegno di questa giustificazione per l'utilizzo dei globuli rossi lavati non sono conclusivi.

Comunicazione tra medici e servizio trasfusionale

Quando un paziente con AIHA necessita di trasfusioni, dovrebbero essere discusse una serie di questioni critiche. Il medico dovrebbe fornire al personale del servizio trasfusionale un'indicazione dell'urgenza della trasfusione e dovrebbe informarsi sulle procedure di test di compatibilità intraprese dal laboratorio al fine di valutare la sicurezza della trasfusione. Se il servizio trasfusionale ha tentato di evitare una reazione trasfusionale emolitica indotta da alloanticorpi selezionando i globuli rossi per la trasfusione sulla base dei test di adsorbimento o sulla base della corrispondenza del fenotipo di globuli rossi estesi del paziente, si può essere certi di un'adeguata sicurezza. Se devono essere utilizzate unità di globuli rossi fenotipicamente abbinati, il medico deve riconoscere che i globuli rossi devono corrispondere al fenotipo esteso del paziente, piuttosto che a un fenotipo parziale. Negli AIHA con anticorpi freddi, i test di compatibilità al caldo sono generalmente adeguati.

Se il servizio trasfusionale ha selezionato unità "meno incompatibili", ciò dovrebbe essere considerato inaccettabile a meno che non siano state eseguite ulteriori procedure di test di compatibilità adeguate. Anche in situazioni molto urgenti, c'è quasi sempre tempo per eseguire almeno procedure minime di test di compatibilità come l'utilizzo della tecnica di diluizione e forse la fenotipizzazione parziale dei globuli rossi, che fornirà una certa misura di sicurezza.

In ogni caso, non ci si può aspettare che anche unità di GR adeguatamente selezionate sopravvivano normalmente, ma è improbabile che causino una trasfusione emolitica acuta. Ci si può aspettare che sopravvivano tanto quanto i globuli rossi del paziente e quindi forniscono un beneficio temporaneo.

III. M odulazione in vitro della membrana a celle rosse per la produzione di celle U niversali/S tealth D onor

George Garratty, PhD, FRCPath *

American Red Cross Blood Services, regione della California meridionale, 1130 S. Vermont Avenue, Los Angeles, CA 90006

Conversione in vitro dei globuli rossi del gruppo A e B in globuli rossi del gruppo O

È noto dagli anni '30 che alcuni estratti batterici distruggono l'attività A, B o H. 1 Durante il 1947-1961, Morgan e Watkins (nel Regno Unito) 2, 3 e Iseki (in Giappone) 4 hanno mostrato che alcuni enzimi batterici, come quelli di Clostridium tertium, C. welchii, Bacillus cereus, e Trichomonas feto, distruggerebbe specificamente gli antigeni A, B o H. Quando i globuli rossi (RBC) hanno perso la reattività A e B, hanno dimostrato un aumento dell'attività H, e quando l'attività H è stata persa, i globuli rossi hanno dimostrato reattività con gli antisieri anti-pneumococco di tipo IV. Successivamente, è stato dimostrato che la degradazione degli antigeni A e B ha portato al rilascio di 2 zuccheri, N-acetilgalattosamina e galattosio, rispettivamente la degradazione dell'antigene H ha portato al rilascio di fucosio. 5, 6 Questi risultati sono stati parte della base per l'elaborazione di un percorso biochimico e genetico per la formazione di antigeni ABH e Lewis sui globuli rossi e nelle secrezioni. 5, 6 Gli antigeni ABH sono risultati essere il risultato delle interazioni di ABO, Hh, Lewis (Lele), e secretore (Sese) geni. I prodotti di A, B, H, e Lewis i geni sono glicosiltransferasi che trasferiscono gli zuccheri immunodominanti per A (N-acetilgalattosamina [GalNAc]), B (galattosio [Gal]), H (fucosio [Fuc]) e Lewis (fucosio [Fuc]).

Quindi, semplicemente, gli antigeni ABH sono composti da corte catene di zuccheri (Gal, GalNAc, Fuc e N-acetilglucosamina [GlcNAc]), che si presentano come glicoproteine ​​o glicolipidi. Originariamente sono state descritte due catene. Entrambe le catene contengono l'unità disaccaridica -GlcNAc gli zuccheri sono collegati 1→3 (catene di tipo I) o 1→4 (catene di tipo II). Le catene di tipo 1 si formano tipicamente nelle secrezioni (ma possono essere adsorbite sui globuli rossi) e le catene di tipo 2 si formano sui globuli rossi. Lo zucchero terminale è lo zucchero “immunodominante” nel processo di riconoscimento da parte di anticorpi specifici (es. GalNAc per reazioni anti-A, Gal per reazioni anti-B e Fuc per reazioni anti-H) (vedi figura 2 ).

La maggior parte degli individui eredita un gene H, che porta a una fucosil-transferasi, che aggiunge un fucosio alla catena corta precursore degli zuccheri. Questo produce l'antigene H. L'ereditarietà dei geni A o B porta a GalNAc e Gal transferasi che aggiungono GalNAc e Gal, rispettivamente, al determinante H, producendo rispettivamente antigeni A e B (Figura 2). 5, 6

Sebbene fosse noto dal 1950 circa che si potevano scindere gli zuccheri dai globuli rossi A e B per produrre l'antigene H (cioè i globuli rossi del gruppo O), non furono altri 30 anni che qualcuno tentò di applicarlo in modo pratico.

Conversione di sangue da donatore di gruppo B in gruppo O

Durante ulteriori studi biochimici degli antigeni ABH, diversi ricercatori hanno degradato l'antigene B utilizzando enzimi non batterici. Una galattosidasi di successo (B-zima) è stata prodotta dai chicchi di caffè verde. 7–, 9 Goldstein e Lenny, presso il New York Blood Center, sono stati i primi ad applicare con successo la conversione enzimatica del sangue del gruppo B al gruppo O (ECO RBC), utilizzando così il chicco di caffè B-zyme per uno scopo pratico. 10- , 15 Nel 1980 10 e 1982 11 il gruppo del New York Blood Center ha riportato i risultati del trattamento in vitro di piccole quantità di gibbone di gruppo B e quindi di globuli rossi umani e della trasfusione dei globuli rossi dopo averli etichettati con 51 Cr rispettivamente nei gibboni e negli esseri umani .

Gli ECO RBC sono risultati avere una normale fragilità osmotica, acetilcolinesterasi, colesterolo, adenosina trifosfato e la formazione di metaemoglobina 2,3-DPG era minima e la P50 il valore è rimasto invariato. L'unico cambiamento negli antigeni del gruppo sanguigno notato è stata una perdita di B e P1 (P1 l'attività dipende anche dagli antigeni del galattosio α-legati terminali e da un aumento dell'antigene H. I globuli rossi ECO sono sopravvissuti normalmente nei riceventi del gruppo A, B e O. A seguito di questi studi di successo, i volontari normali del gruppo A e del gruppo O hanno ricevuto inizialmente 2 ml di globuli rossi ECO del gruppo B, seguiti 2 settimane dopo con altri 2 ml. 12 Quindi, è stato somministrato un ultimo 1 mL di ECO RBC etichettati con 51 Cr (cioè 5 mL di ECO RBC in un periodo di 4 settimane). La sopravvivenza dei globuli rossi era normale. Non è stato osservato alcun aumento di anti-B nei riceventi del gruppo A o O, né i loro sieri hanno agglutinato o emolizzato i globuli rossi ECO, durante un periodo post-trasfusione di 7 settimane. 12

Nel 1991, Lenny et al 13 hanno riportato i risultati della trasfusione di intere unità di sangue di gruppo B che erano state convertite in gruppo O in vitro, trattandole con la galattosidasi del chicco di caffè verde. Tre volontari del gruppo A e 4 del gruppo O hanno ricevuto 160-196 ml di globuli rossi ECO. I globuli rossi ECO tipizzati come gruppo O utilizzando i test di compatibilità di routine anti-A e anti-B autorizzati dalla Food and Drug Administration (con licenza FDA) sono risultati negativi. I pazienti non hanno mostrato segni clinici di reazione. La sopravvivenza dei GR era normale in tutti i casi. Due riceventi del gruppo O hanno ricevuto una seconda trasfusione. Non si sono verificati aumenti di anti-B e la sopravvivenza dei GR era normale. Nel 1994, Lenny et al 14 hanno riportato i risultati della trasfusione di 2 unità di ECO RBC a ciascuno dei 4 volontari del gruppo O. Non sono stati notati segni clinici o di laboratorio di una reazione, ma c'è stato un aumento di anti-B. 51 ECO RBC marcati con Cr sono stati somministrati a 1 soggetto con un aumento della sopravvivenza di RBC anti-B era normale. L'anno successivo, Lenny et al.15 hanno riportato risultati di trasfusioni multiple e seconde trasfusioni di globuli rossi ECO a volontari del gruppo O. Tabella 3 mostra il protocollo Hanno anche studiato l'uso di una galattosidasi del chicco di caffè ricombinante. I pazienti non hanno mostrato segni clinici o di laboratorio di una reazione. Sono stati raggiunti i normali 51 Cr RBC sopravvivenza ei risultati attesi di emoglobina/ematocrito. A seguito di queste trasfusioni, non è stato osservato alcun aumento di anti-B. Il B-zima ricombinante sembrava essere efficace quanto il B-zima nativo. Non sono stati rilevati anticorpi per nessuno dei due zimi B dopo la trasfusione.

Nel 2000, Kruskall et al 16 hanno riportato i risultati della trasfusione di 21 gruppi A o O pazienti (piuttosto che i volontari utilizzati negli studi precedenti) con ECO RBC 18 pazienti hanno ricevuto anche trasfusioni di controllo. Non sono state osservate reazioni avverse. Gli ECO RBC hanno fornito incrementi di emoglobina comparabili e tutti i pazienti tranne 2 hanno avuto una sopravvivenza di 51 Cr RBC comparabile. Uno di questi pazienti stava sanguinando al momento della trasfusione ECO e gli ECO RBC dell'altro paziente sono risultati sierologicamente incompatibili con il siero del paziente, anche se i test di screening anticorpali di routine erano negativi. Un paziente ha sviluppato un test dell'antiglobulina diretto debolmente positivo transitorio senza evidenza di anemia emolitica. Due settimane dopo la trasfusione, 5 dei 19 riceventi ECO RBC avevano un aumento dei titoli anti-B. Gli autori hanno scoperto che il 20% dei sieri del gruppo A e il 40% dei sieri del gruppo O da pazienti casuali agglutinavano (spesso solo microscopicamente) e molto spesso solo con il test antiglobulina del polietilenglicole (PEG), gli ECO RBC, ma non i GR non trattati. La rilevanza clinica di questo risultato è al momento sconosciuta.

Conversione del Gruppo A in Gruppo O

Si potrebbe supporre che un A-zima (una glicosidasi in grado di scindere lo zucchero immunodominante GalNAc) dia risultati simili a quelli ottenuti con il B-zima. Sfortunatamente, questo non si è dimostrato così semplice come lo è stato per la conversione da B a O. Gli enzimi A non sono facilmente disponibili come gli enzimi B, quindi molte fonti microbiche e animali sono state vagliate prima di identificare una fonte adatta. Il New York Blood Center ha scelto il fegato aviario (di pollo) come fonte per il loro A-zyme. Usando questo enzima, sono stati in grado di convertire A2 globuli rossi a O ma sono riusciti solo a ridurre parzialmente l'attività dell'A1 antigene. È stato suggerito che ciò fosse probabilmente dovuto a epitopi A ripetitivi attaccati alla catena di tipo 2 (catena A di tipo 3) in A1 antigeni questi sono presenti solo in tracce su A2 globuli rossi (Figura 3 ). 17–, 19 Gli investigatori del New York Blood Center hanno tentato di utilizzare una combinazione di eso- ed endoglicosidasi nel tentativo di rimuovere i determinanti A interni, oltre a quelli esterni, ma questo non ha risolto il problema. 13

Il progetto del New York Blood Center è stato rilevato da ZymeQuest (Beverly, MA), che sta attivamente cercando nuove fonti di enzimi A che potrebbero risolvere questo problema. Kruskall e AuBuchon 20 hanno sostenuto alcune forti argomentazioni, compresi i calcoli costi-benefici, per il valore di essere in grado di convertire tutte le unità di donatori del gruppo A e B nel gruppo O.

Mascheramento degli antigeni dei globuli rossi con PEG

Nel 1996 e nel 1997, 4 gruppi hanno riferito che se il PEG era legato in modo covalente ai globuli rossi, i globuli rossi non reagivano più o davano una reattività notevolmente ridotta, con una gamma di anticorpi contro gli antigeni dei gruppi sanguigni (ad esempio, ABO e Rh). 21– , 30

Tre dei gruppi (Taejon, Korea Albany Medical College, NY University of Southern California, Los Angeles, CA) inizialmente utilizzavano un PEG lineare da 5 kD chiuso a un'estremità da un gruppo metilico (mPEG) e legato ai globuli rossi usando diclorotriazina (DT ) (altrimenti noto come cloruro cianurico [CN]). L'altro gruppo (Università dell'Alabama, Birmingham) inizialmente utilizzava un mPEG lineare da 3,4 kD legato ai globuli rossi utilizzando l'estere idrosuccinimidilico dell'acido metossipolipropionico (SPA). Hanno usato concentrazioni molto più elevate di PEG, che vanno da 2,9 a 147 mM.

Utilizzando queste procedure, tutti e 4 i gruppi hanno pubblicato risultati promettenti. Il gruppo coreano (che non ha pubblicato in quest'area dai suoi rapporti originali 21, 23) ha riscontrato una ridotta agglutinazione di PEG-RBC con anti-A, anti-B e anti-D. 21, 23 Il gruppo dell'Università dell'Alabama ha riscontrato una riduzione > 99% del numero di molecole di anti-D monoclonale legate ai globuli rossi PEG. I titoli anti-A sono stati ridotti da 2048 a < 32 quando sono state utilizzate alte concentrazioni (87-147 mM) di PEG. 22, 24, 25 Non sono state osservate reazioni con gli anticorpi Duffy, Kidd e Kell a una concentrazione inferiore (15 mM) di PEG. Il gruppo dell'Albany Medical College ha riferito che i globuli rossi PEG hanno mostrato reazioni diminuite con anti-A e anti-B, anche quando è stato utilizzato PEG 5 mM, e reazioni diminuite con anti-c, -E, -e, -K, -S e - s (ad esempio, agglutinazione 3+ ridotta a 1+) sono stati ottenuti con concentrazioni di PEG a partire da 1,2 mM. 26–, 28 Il gruppo della University of Southern California ha riportato reazioni diminuite con anti-A e anti-B e nessuna reazione con antisieri Rh quando si utilizza un PEG da 5 kD. 29 Il gruppo della University of Southern California ha anche preparato PEG-diclorotriazina bifunzionale sintetizzata su misura [PEG-(DT)2] derivati ​​di 3,4 e 18,5 kD per esaminare la relazione tra mascheramento dell'antigene e peso molecolare del PEG. Utilizzando il derivato a peso molecolare più elevato a una concentrazione moderata (1,3 mM), è stato possibile ottenere l'inibizione completa dell'agglutinazione con l'anti-D e tutti gli antigeni dei gruppi sanguigni minori, come misurato da un test standard in provetta con spin immediato. Gli antigeni A e B erano più difficili da mascherare rispetto all'antigene D, ma il PEG-(DT) da 18,5 kD2 molecola si è dimostrata più efficace del più piccolo 5-kD mPEG-DT o 3.4-kD PEG-(DT)2 derivati. 31 Una combinazione di PEG-(DT) grande (18,5 kD) e piccolo (3,4 kD)2 derivati ​​hanno dato i migliori risultati per tutti gli antigeni dei gruppi sanguigni testati (A, B, D, C, c, E, e, I, Le b , P1, N, Jk a e Jk b ). Tuttavia, sebbene i globuli rossi rivestiti con PEG siano risultati negativi per agglutinazione diretta, il test dell'antiglobulina indiretta (IAT) più sensibile è rimasto positivo per molti antigeni, indicando che il mascheramento era ancora incompleto. Anche il grado di mascheramento è risultato essere donatore specifico per l'antigene D, forse riflettendo il numero variabile di antigeni D presenti sui globuli rossi di donatori con particolari fenotipi Rh. 31

Problemi con PEG-RBC come preparato nei rapporti iniziali

Sebbene il mascheramento degli antigeni dei globuli rossi riportato in questi studi iniziali sia apparso relativamente efficiente, non soddisferebbe i criteri utilizzati dai servizi trasfusionali ospedalieri per i test di compatibilità pretrasfusionale. Molti degli studi iniziali utilizzavano procedure non ottimali per indagare sul mascheramento. Ad esempio, uno studio ha utilizzato un aggregometro piastrinico per misurare le reazioni antigene-anticorpo del gruppo sanguigno,26 e la maggior parte degli studi ha utilizzato l'agglutinazione come punto finale (cioè nessuna reazione utilizzando un anti-D monoclonale agglutinante) piuttosto che il test dell'antiglobulina, o citometria a flusso, per garantire che non vi fosse assorbimento di anticorpi IgG non agglutinanti. Sebbene i dati iniziali sulla ridotta reattività con anticorpi come l'anti-A o l'anti-B sembravano impressionanti, non sarebbero stati accettabili per i test pretrasfusionali. Ad esempio, un cambiamento del titolo anti-A da 2048 a < 32 sembra un mascheramento efficiente, ma il siero del paziente reagirebbe ancora fortemente (ad esempio, 4+) con i globuli rossi del gruppo A quando incrociato.

Nel 1997, il nostro laboratorio ha avuto la possibilità di testare i globuli rossi PEG preparati con tutti i metodi inizialmente riportati utilizzando le tecniche standard delle banche del sangue e la citometria a flusso. Abbiamo scoperto che tutti i globuli rossi PEG del gruppo A hanno reagito fortemente con anti-A anti-A commerciale nel gruppo B e anche i sieri di donatori del gruppo O hanno reagito fortemente (agglutinazione, test dell'antiglobulina e talvolta emolisi). Come riportato, la maggior parte dei globuli rossi del PEG non era reattiva con un'ampia gamma di anticorpi agglutinanti verso gli antigeni dei gruppi sanguigni (ad es. potenti reagenti di tipizzazione autorizzati dalla FDA), ma abbiamo scoperto che erano spesso reattivi al test dell'antiglobulina (cioè, i globuli rossi erano sensibilizzato con anticorpi IgG come l'anti-D). Ciò è stato confermato dalla citometria a flusso. 30, 32

Altri problemi

Durante il test dei PEG-RBC utilizzando alcune delle formulazioni originali, abbiamo rilevato ulteriori problemi che interferirebbero con i test pretrasfusionali di routine e potrebbero riflettersi sulla sopravvivenza in vivo.

I PEG-RBC tendevano ad attaccarsi ai lati dei tubi di vetro o polistirene quando venivano lavati i globuli rossi. Questo è stato superato trattando i tubi con determinate sostanze chimiche.

Quando i PEG-RBC sono stati incubati (30-60 minuti) in vitro con plasma normale compatibile, l'assorbimento non specifico di proteine ​​(ad es., IgG e IgM) sui globuli rossi è stato rilevabile dal test dell'antiglobulina e dalla citometria a flusso. 33 Questa osservazione non era stata riportata dagli altri gruppi e sembrava importante, in quanto tali PEG-RBC rivestiti di proteine ​​hanno reagito fortemente (48-82% di reattività, aderenza + fagocitosi) in un test monostrato di monociti che ha dimostrato di predire il potenziale clinico significatività degli anticorpi contro gli antigeni dei gruppi sanguigni (> 3% indica la significatività). 33, 34

Nel 1997, abbiamo presentato dati che mostrano che alcuni sieri normali del cordone di PEG-RBC direttamente agglutinati erano non reattivi e che i sieri normali reattivi di adulti non reagivano più dopo il trattamento con 2-mercaptoetanolo. 33 Abbiamo suggerito che i nostri risultati hanno mostrato che alcuni sieri contengono anticorpi IgM contro il PEG o un neoantigene creato dal trattamento con PEG dei globuli rossi. Successivamente, abbiamo dimostrato che la reazione di agglutinazione poteva essere inibita aggiungendo PEG (ma non altri polimeri) ai sieri reattivi e che le sfere rivestite con PEG mostravano risultati simili ai globuli rossi PEG, escludendo un neoantigene di elementi della membrana PEG + RBC. 35 Questi risultati suggerivano che le reazioni di agglutinazione causate da alcuni sieri normali fossero dovute agli anticorpi PEG. Sebbene si dica spesso che il PEG non è immunogenico, i dati in letteratura supportano le nostre conclusioni. Richter e Åkerblom 36 hanno rilevato anticorpi PEG (prevalentemente IgM) rispettivamente nel 3,3% e nello 0,2% dei pazienti con varie allergie e dei donatori sani. Dopo iposensibilizzazione con estratto di ambrosia modificato con mPEG e veleno d'api, il 50% dei pazienti ha prodotto anticorpi PEG di titoli 35-512.

Effetto del PEG sui globuli rossi

Utilizzando le formulazioni riportate inizialmente (vedi sopra), il gruppo coreano ha trovato normali la morfologia dei globuli rossi e le curve di equilibrio dell'ossigeno. 23 L'elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS ha mostrato che il PEG era associato alle bande 3, 4.5 e PAS-1. 23 Il gruppo dell'Università dell'Alabama ha riferito che i PEG-RBC hanno mostrato un lieve danno microscopico e che i PEG-RBC di ratto marcati con fluorocromi sono sopravvissuti bene per 1-3 giorni, ma poi sono stati rapidamente distrutti. 24 Il gruppo di Albany ha riscontrato che i PEG-RBC sono morfologicamente normali e hanno una normale fragilità osmotica e affinità per l'ossigeno dell'emoglobina. 26–, 28 I PEG-RBC avevano una normale funzione proteica come evidenziato dalla normale SO4 l'omeostasi del flusso Na + e K + non è stata influenzata. Non è stata osservata alcuna lisi significativa dopo 24 ore di incubazione a 37ºC a concentrazioni di PEG di < 6 mM. I membri del gruppo Albany hanno anche mostrato che il PEG si legava alla banda 3. Hanno trovato un normale legame con l'ossigeno e deformabilità cellulare a concentrazioni di 0,6-2,4 mM. I PEG-RBC murini sono sopravvissuti bene in vivo solo quando sono state utilizzate basse concentrazioni (0,4 mM) di PEG. 37 Concentrazioni più elevate (ad es. 0,6 mM e 0,8 mM) hanno portato a una scarsa sopravvivenza dei GR. 37 Va notato che erano necessarie concentrazioni di PEG di 1-5 mM per ottenere un mascheramento dell'antigene anche ragionevole.

Il gruppo della University of Southern California ha mostrato che l'aumento della concentrazione del mPEG lineare 5-kD era associato all'aumento dell'echinocitosi dei PEG-RBC. 38 Hanno anche scoperto che anche basse concentrazioni di PEG (ad es. 1 mM) portano a una marcata riduzione della viscosità del sangue a basso taglio. 29

PEG-RBC di seconda generazione

A causa dei problemi incontrati con i PEG-RBC originali in relazione ai test pretrasfusionali e alla possibile scarsa sopravvivenza in vivo, sono state tentate varie modifiche. I gruppi dell'Università dell'Alabama e dell'Università della California meridionale hanno risolto molti dei problemi utilizzando reticolazione e/o PEG ramificato. Il gruppo dell'Università dell'Alabama ha utilizzato un derivato PEG-SPA bifunzionale incubato con albumina. Questo coniugato PEG-albumina reticolato è stato chiamato XPEG. 39 globuli rossi rivestiti con XPEG non hanno reagito con un'ampia gamma di antisieri anti-A e anti-B sono stati rilevati solo debolmente dal test dell'antiglobulina.Gli XPEG-RBC non sembravano assorbire proteine ​​in modo aspecifico. Gli XPEG-RBC murini hanno mostrato una sopravvivenza migliore rispetto ai PEG-RBC originali, ma avevano ancora un'emivita ridotta del 50% dei GR non trattati. Il gruppo dell'Università dell'Alabama ha successivamente riferito di aver utilizzato un PEG-(SPA) a 4 rami4 derivato combinato con l'albumina. Si diceva che questo prodotto avesse un efficace mascheramento dell'antigene e non reagisse con l'anti-PEG nei sieri dei donatori. 40

Il gruppo della University of Southern California ha anche prodotto PEG-RBC utilizzando un PEG ramificato con un approccio diverso (Figura 4 ). 31, 38 Questi globuli rossi non erano reattivi con tutti gli antisieri testati, inclusi anti-A e anti-B, mediante agglutinazione, test dell'antiglobulina e citometria a flusso. Sfortunatamente, la lisi dei PEG-RBC di gruppo A è stata ancora osservata con alcuni sieri di gruppo O contenenti emolisine anti-A (G. Garratty e R. Leger, dati non pubblicati, 2000). Il gruppo dell'Albany Medical Center ha anche pubblicato un elegante studio sull'attivazione classica del complemento correlata agli anticorpi ABO e alle interazioni PEG-RBC. 41 È stata osservata un'echinocitosi minima dei PEG-RBC di seconda generazione della University of Southern California. 31, 38 Alcuni sieri normali (circa il 20%) di donatori ABO-incompatibili agglutinavano ancora questi PEG-RBC (presumibilmente a causa degli anticorpi PEG). 31, 33– , 35, 38

Recentemente, il gruppo Alabany Medical Center ha riferito di aver migliorato i suoi PEG-RBC utilizzando un PEG a peso molecolare più elevato (20 kD) e benzitriazobil carbonato (BTC) invece di CN. 42 Si dice che sia stato ottenuto un buon mascheramento dell'antigene. È stato difficile giudicare l'efficienza del mascheramento degli antigeni A e B, poiché il gruppo ha utilizzato solo un aggregometro piastrinico per misurare le reazioni ABO. I ricercatori non hanno commentato l'assorbimento di proteine ​​non specifiche (cioè test diretti dell'antiglobulina utilizzando siero ABO-compatibile normale) o reazioni con sieri di donatori che potrebbero rappresentare interazioni anti-PEG. Tuttavia, è stato affermato che i BTC PEG-RBC murini sopravvivono normalmente nei topi. 42

Alloimmunizzazione

Nel 1977, Abuchowski et al hanno mostrato che quando il mPEG era legato in modo covalente (usando CN) all'albumina sierica bovina o alla catalasi epatica bovina, perdeva la sua immunogenicità quando iniettato nei conigli. 43 mPEG di 1 e 5 kD erano efficaci nel rendere l'albumina e l'enzima non immunogenici. 43 Inoltre, l'albumina trattata con PEG non ha reagito in vitro (mediante immunodiffusione) con l'albumina antibovina di coniglio. 43 I conigli non hanno prodotto anticorpi contro il complesso PEG o PEG. 43 È stato suggerito che, poiché è noto che il PEG attrae le molecole d'acqua, ogni molecola proteica viene rivestita con un guscio idrofilo flessibile di PEG e molecole d'acqua questo "guscio" maschera efficacemente i siti antigenici sulla proteina. 43 Questo approccio è stato comunemente utilizzato per modificare proteine ​​(ad es. proteine ​​ricombinanti), enzimi, farmaci e superfici artificiali. Diversi di questi prodotti sono in uso clinico o vengono utilizzati in studi clinici (ad esempio, PEG-adenosina deaminasi per il trattamento della sindrome da immunodeficienza combinata grave, citochine coniugate con PEG ed emoglobina modificata con PEG). Il PEG sembra non essere tossico ed è approvato per la somministrazione all'uomo.

Ci sono pochissimi dati per confermare che la quantità di mascheramento dell'antigene RBC ottenuta finora è sufficiente per prevenire l'alloimmunizzazione. Gli unici dati rilevanti provengono dal gruppo Albany, che ha iniettato globuli rossi di pecora mPEG nei topi. C'è stata una "risposta immunitaria smussata": è stato prodotto circa il 90% in meno di anticorpi, rispetto alla risposta immunitaria nei topi che hanno ricevuto globuli rossi di pecora non trattati. 44

Conclusioni

La trasfusione di unità ABO-incompatibili è la principale causa di decessi indotti da trasfusione negli Stati Uniti e nel Regno Unito. 45, 46 Tuttavia, sono stati investiti molti più sforzi e molti più milioni di dollari e sterline per prevenire l'infezione trasmessa dalle trasfusioni. Un sistema sanguigno in cui la maggior parte delle unità è di gruppo O potrebbe teoricamente essere ottenuto con entrambi i metodi sopra. Purtroppo, ci sono ancora molti problemi da risolvere in entrambe le aree. La produzione di ECO-RBC è a buon punto in quanto gli studi clinici sui B-ECO-RBC hanno già avuto successo. Se i nuovi enzimi A hanno successo, la procedura per la produzione di centri trasfusionali dovrebbe essere semplificata.

I PEG-RBC hanno ulteriori vantaggi in quanto è teoricamente possibile mascherare l'ABO e tutti gli altri antigeni del gruppo sanguigno di potenziale significato clinico. Una volta perfezionati, i globuli rossi PEG potrebbero essere utilizzati per qualsiasi paziente, indipendentemente dal fatto che i globuli rossi non trattati fossero incompatibili con ABO o altri alloanticorpi e autoanticorpi. Anche se gli antigeni ABO non possono essere completamente mascherati (p. es., sono suscettibili alla lisi da parte delle emolisine anti-A/B), il sangue sarebbe prontamente disponibile per i pazienti solitamente difficili da trasfondere, ad esempio pazienti con anemia emolitica autoimmune, anemia falciforme e anticorpi contro antigeni ad alta frequenza. I problemi di laboratorio discussi sopra devono essere risolti e devono ancora essere eseguiti studi sull'uomo (ad es.

Se i nuovi enzimi A non sono abbastanza efficienti da convertire completamente A1 a O, e se il mascheramento completo degli antigeni A e B richiede più PEG o manipolazioni chimiche di quanto sia necessario per mantenere l'integrità dei globuli rossi, allora forse potrebbe essere utilizzata una combinazione di entrambi gli approcci, che richiedono meno enzima e meno PEG. In un editoriale in Trasfusione, Lublin 47 ha suggerito un tale approccio con una vignetta raffigurante la possibile catena di montaggio del centro del sangue del 2005: un'unità di sangue si trova su una catena di montaggio, dove subisce l'inattivazione dei patogeni, la riduzione dei leucociti, il trattamento con enzimi per scindere gli zuccheri A e B dalla globuli rossi e trattamento con PEG per mascherare tutti gli altri antigeni.

Loci antigenici dei gruppi sanguigni e proteine ​​funzionali degli eritrociti umani.

Locus cromosomico . Nome del luogo . Gruppo sanguigno (abbreviazione) . Funzione .
1p13 CD58 Nessuno noto Molecola di adesione che lega CD2
1p36.11 RH Reso (Rh) Sconosciuto
1p22.1-p36.2 ns Scianna (Sc) Sconosciuto
1p32-p35 RD Radino (Rd) Sconosciuto
1q22-23 DARC Duffy (Fy) Recettore per le chemochine
1q32 CR1 Knops-McCoy Recettore del complemento 1 (proteina regolatrice del complemento)
1q32 DAF Cromer (Cr) Fattore di accelerazione del decadimento (proteina regolatrice del complemento)
2q14-21 GYPC Gerbich (Ge) Interazione membrana-citoscheletro
3q13.1-13.2 CD47 Nessuno noto Segnalazione associata all'integrina, recettore di adesione
4q28-31 GYPA MN Chaperone della proteina del canale anionico (banda 3)
4q28-31 GYPB ss Sconosciuto
6p21.3 C4A, C4B Chido, Rodgers C4 componente del complemento
6p21.3 HLA Bg HLA classe I
6p21.1-p11 RHAG Glicoproteina Rh-associata Trasporto di ammonio
7p14 AQP1 Colton (Co) Proteina del canale dell'acqua
7q22,1-22,3 DOLORE Cartwright (Yt) Acetilcolinesterasi
7q33 KEL Kell (K,k,Kp,Js) metalloproteinasi
9q34.1-q34.2 ABO ABO ABO glicosil transferasi
11p13 CD59 Nessuno noto Inibisce la formazione del complesso di attacco alla membrana del complemento (C5-9)
11p13 CD44 indiano (in), AnWj Recettore di adesione
11p15.5 MER2 MER2 Sconosciuto
12p13.2-12p12.1 DOK Dombrock ?ADP-ribosiltransferasi
15q22.3-23 SEMA7A JMH recettore di adesione putativo
16p12.3 UMOD ?Sd a Proteina di Tamm-Horsfall (uromodulina)
17q12-q21 EPB3 Diego (Di), Wright (Wr) Proteina del canale anionico (banda 3, AE1)
18q11-q12 UT1 Kidd (Jk) Trasportatore di urea
19p13.3 FUT3 Lewis (Le) alfa(1,3) fucosiltransferasi
19p32.2-pter ok ok e Neurotelina, putativa molecola di adesione
19p11-p13 LW LW Recettore di adesione
19q13.3 FUT2 Segretario (Se) alfa(1,2) fucosiltransferasi
19q13.3 FUT1 Hh alfa(1,2) fucosiltransferasi
19q13.2-13.3 LU luterano (Lu) Recettore di adesione
22q11.2-q7er P 1 P1Glicosiltransferasi
Xp21.1 XK Kx Trasportatore di neurotrasmettitori putativo
Xp22.32 XG Xg precedentemente chiamato PBDX possibile recettore di adesione
Xp22.33, Yp11.3 MIC2 Nessuno noto Mucina, molecola di adesione putativa
Locus cromosomico . Nome del luogo . Gruppo sanguigno (abbreviazione) . Funzione .
1p13 CD58 Nessuno noto Molecola di adesione che lega CD2
1p36.11 RH Reso (Rh) Sconosciuto
1p22.1-p36.2 ns Scianna (Sc) Sconosciuto
1p32-p35 RD Radino (Rd) Sconosciuto
1q22-23 DARC Duffy (Fy) Recettore per le chemochine
1q32 CR1 Knops-McCoy Recettore del complemento 1 (proteina regolatrice del complemento)
1q32 DAF Cromer (Cr) Fattore di accelerazione del decadimento (proteina regolatrice del complemento)
2q14-21 GYPC Gerbich (Ge) Interazione membrana-citoscheletro
3q13.1-13.2 CD47 Nessuno noto Segnalazione associata all'integrina, recettore di adesione
4q28-31 GYPA MN Chaperone della proteina del canale anionico (banda 3)
4q28-31 GYPB ss Sconosciuto
6p21.3 C4A, C4B Chido, Rodgers C4 componente del complemento
6p21.3 HLA Bg HLA classe I
6p21.1-p11 RHAG Glicoproteina Rh-associata Trasporto di ammonio
7p14 AQP1 Colton (Co) Proteina del canale dell'acqua
7q22,1-22,3 DOLORE Cartwright (Yt) Acetilcolinesterasi
7q33 KEL Kell (K,k,Kp,Js) metalloproteinasi
9q34.1-q34.2 ABO ABO ABO glicosil transferasi
11p13 CD59 Nessuno noto Inibisce la formazione del complesso di attacco alla membrana del complemento (C5-9)
11p13 CD44 indiano (in), AnWj Recettore di adesione
11p15.5 MER2 MER2 Sconosciuto
12p13.2-12p12.1 DOK Dombrock ?ADP-ribosiltransferasi
15q22.3-23 SEMA7A JMH recettore di adesione putativo
16p12.3 UMOD ?Sd a Proteina di Tamm-Horsfall (uromodulina)
17q12-q21 EPB3 Diego (Di), Wright (Wr) Proteina del canale anionico (banda 3, AE1)
18q11-q12 UT1 Kidd (Jk) Trasportatore di urea
19p13.3 FUT3 Lewis (Le) alfa(1,3) fucosiltransferasi
19p32.2-pter ok ok e Neurotelina, putativa molecola di adesione
19p11-p13 LW LW Recettore di adesione
19q13.3 FUT2 Segretario (Se) alfa(1,2) fucosiltransferasi
19q13.3 FUT1 Hh alfa(1,2) fucosiltransferasi
19q13.2-13.3 LU luterano (Lu) Recettore di adesione
22q11.2-q7er P 1 P1Glicosiltransferasi
Xp21.1 XK Kx Trasportatore di neurotrasmettitori putativo
Xp22.32 XG Xg precedentemente chiamato PBDX possibile recettore di adesione
Xp22.33, Yp11.3 MIC2 Nessuno noto Mucina, molecola di adesione putativa

Molecole di adesione espresse dagli eritrociti circolanti.

Molecola di adesione e nome/i alternativo/i . Funzione legante/adesivo .
CD36 (solo reticolociti), glicoproteina piastrinica IV, Nak a (piastrine) Trombospondina (piastrine)
VLA-4 (solo reticolociti), α4?1 integrina (CD49d/CD29) Trombospondina, VCAM-1, possibilmente fibronectina
CD44, indiano (In a /In b ), correlato a In(Lu) p80 Ialuronano, forse anche fibronectina
CD47, proteina associata all'integrina (IAP) Trombospondine
CD58, antigene 3 associato ai linfociti (LFA-3) CD2
CD99, prodotto del gene MIC2 Il linfocita CD99 è necessario per la formazione di rosette di cellule T
CD108, JMH, Semaforina K1 (SEMA7A) Possibile ruolo nell'adesione dei linfociti attivati
CD147, Neurotelina, Ok a Collagene di tipo IV, fibronectina. laminina in altri tessuti
CD242, ICAM-4, LW Integrine leucocitarie (α4?1, α4?3, αv?1)
CD239, luterano, B-CAM/LU Laminina, forse anche integrine
Molecola di adesione e nome/i alternativo/i . Funzione legante/adesivo .
CD36 (solo reticolociti), glicoproteina piastrinica IV, Nak a (piastrine) Trombospondina (piastrine)
VLA-4 (solo reticolociti), α4?1 integrina (CD49d/CD29) Trombospondina, VCAM-1, possibilmente fibronectina
CD44, indiano (In a /In b ), correlato a In(Lu) p80 Ialuronano, forse anche fibronectina
CD47, proteina associata all'integrina (IAP) Trombospondine
CD58, antigene 3 associato ai linfociti (LFA-3) CD2
CD99, prodotto del gene MIC2 Il linfocita CD99 è necessario per la formazione di rosette di cellule T
CD108, JMH, Semaforina K1 (SEMA7A) Possibile ruolo nell'adesione dei linfociti attivati
CD147, Neurotelina, Ok a Collagene di tipo IV, fibronectina. laminina in altri tessuti
CD242, ICAM-4, LW Integrine leucocitarie (α4?1, α4?3, αv?1)
CD239, luterano, B-CAM/LU Laminina, forse anche integrine

Programma delle trasfusioni di globuli rossi (RBC) di conversione enzimatica (ECO).


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