Informazione

Quali prodotti di scarto secernono le cellule in coltura e con quale velocità?

Quali prodotti di scarto secernono le cellule in coltura e con quale velocità?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Sto progettando chip microfluidici per colture cellulari di mammiferi. Un aspetto che mi interessa modellare è la velocità con cui devo rinnovare i media per garantire che:

  1. Le cellule ricevono abbastanza nutrienti
  2. I prodotti di scarto citotossici vengono rimossi prima che raggiungano concentrazioni che sarebbero dannose per le cellule.

Il numero 1 è abbastanza facile. I numeri per la velocità di assorbimento del glucosio, ad esempio, sono disponibili per molti tipi di cellule. Il numero 2 si sta rivelando più impegnativo. Non riesco a trovare articoli che descrivano in dettaglio i metaboliti secreti, compreso il loro tasso di secrezione e la relazione tra la loro concentrazione nei media e gli effetti tossici (o altri) sulle cellule.

Ci sono risorse là fuori sulla valutazione quantitativa dei rifiuti metabolici secreti?


Differenza tra egestione ed escrezione

Il processo di scarico del cibo non digerito dal corpo dell'animale è chiamato egestione.

Diversi gruppi di animali assorbono il cibo non utilizzato in modo diverso. Negli organismi unicellulari, il cibo non digerito viene trasportato alla membrana cellulare e rilasciato all'esterno del corpo. Alcuni animali multicellulari non hanno un sistema digestivo specializzato. Ad esempio, nell'idra, il cibo viene digerito nel sacco dello stomaco e il cibo non digerito viene egerito attraverso la bocca.

Negli animali superiori c'è un sistema digestivo ben sviluppato e specializzato. Dopo la digestione e l'assorbimento nell'intestino tenue, il cibo non ancora digerito e non assorbito va nell'intestino crasso. Nell'intestino crasso vengono assorbiti l'acqua rimanente, gli elettroliti e alcune vitamine. L'intestino crasso non ha una funzione digestiva. Molti batteri vivono qui. Sintetizzano alcune vitamine scomponendo alcune sostanze non digerite.

Parte del cibo rimane ancora non digerito e non assorbito. Deve essere rimosso dal corpo. I resti di cibo non trasformato si accumulano nel colon. Vengono espulsi periodicamente dal corpo attraverso il colon e l'ano (o la cloaca). Le onde peristaltiche spingono il contenuto nell'ano. Le particelle di cibo inutilizzato scaricate sono semisolide o spesse, per il fatto che la maggior parte dell'acqua viene utilizzata nel corpo dell'animale.


Gli organi escretori primari del corpo umano sono i reni, gli ureteri e la vescica urinaria, coinvolti nella creazione e nell'espulsione dell'urina. Attraverso questi organi viene espulsa gran parte delle scorie azotate del corpo, in particolare l'urea. Anche altri organi come il fegato, l'intestino crasso e la pelle sono necessari per l'escrezione di specifici rifiuti metabolici.

Reni

I reni sono organi accoppiati a forma di fagiolo situati nell'addome, su entrambi i lati della colonna vertebrale, sotto il diaframma. Tsono costituiti da un gran numero di subunità strutturali e funzionali chiamate nefroni. Questi nefroni svolgono il compito principale di filtrare il sangue e rimuovere i prodotti di scarto. Ogni nefrone si snoda tra la corteccia esterna del rene e il midollo interno, con diverse attività che si verificano in ogni sito.

L'immagine sopra mostra parti di due nefroni, con le loro posizioni relative all'interno del rene. Ogni nefrone inizia con una struttura globulare chiamata capsula di Bowman situata nella corteccia renale. Questa struttura riceve il sangue dalla circolazione renale attraverso un'arteriola afferente che si divide ulteriormente per formare un ciuffo di capillari chiamato glomerulo. Il rene è riccamente vascolarizzato con letti capillari che circondano ciascun nefrone (capillari intertubulari) e vasi sanguigni che corrono tra i lobi del rene (arterie e vene interlobulari).

Funzione renale

Un processo di ultrafiltrazione crea il filtrato glomerulare dal sangue, che è notevolmente simile nella composizione al plasma sanguigno. Acqua, piccole molecole e proteine ​​di dimensioni inferiori a 30 kilodalton possono passare liberamente nel lume della capsula di Bowman. L'anatomia di ciascun nefrone è discussa di seguito.

Capsula di Bowman al PCT

La capsula di Bowman si evolve e crea un collo, che poi si estende nella prima struttura tubolare allungata chiamata tubulo contorto prossimale o PCT. Il PCT è il sito per la secrezione di alcuni acidi e per il riassorbimento di quasi i due terzi del filtrato glomerulare. Rimuove anche tutto il glucosio e gli amminoacidi. La presenza di glucosio o altri soluti organici nelle urine è un segno di danno renale, specialmente della corteccia. Alcuni rifiuti azotati vengono anche rimossi dal corpo sotto forma di ammoniaca secreta dalle cellule che formano il PCT. Molti farmaci sono anche disintossicati in questo sito.

PCT all'ansa di Henle

Il PCT conduce in una struttura a forma di U chiamata Anello di Henle, estendendosi nel midollo del rene. Questo ha due braccia funzionalmente e anatomicamente distinte: gli arti ascendenti e discendenti. Tra questi due rami dell'ansa di Henle, attraverso una serie di pompe elettrolitiche, viene mantenuta un'elevata concentrazione di urea nel midollo del rene.

Il PCT inizialmente conduce nel ciclo discendente, che è liberamente permeabile all'acqua e per lo più impermeabile agli ioni, in particolare all'urea. L'elevata osmolarità della regione midollare del rene fa uscire l'acqua dall'ansa discendente, consentendo all'urina di concentrarsi.

Segue la sottile ansa ascendente, che ha la proprietà opposta di essere permeabile agli ioni e impermeabile all'acqua. I soluti come gli ioni sodio vengono riassorbiti attivamente, riducendo la concentrazione di urina. Tuttavia, a questo punto, il volume di fluido filtrato al glomerulo è stato ridotto a una frazione della sua quantità.

Loop di Henle al DCT

L'arto ascendente conduce quindi nel tubulo contorto distale o DCT, noto anche come secondo tubulo contorto. Il DCT è il sito per l'attività della maggior parte degli ormoni che regolano la funzione renale. Questo include l'ormone antidiuretico (ADH) e l'angiotensina II (AT II). Questa regione regola l'equilibrio di ioni e pH. Dal DCT, l'urina passa attraverso i dotti collettori che alla fine portano fuori dal rene attraverso gli ureteri.

Questa immagine è una rappresentazione composita del nefrone, con dettagli sulle sostanze riassorbite in ciascun sito, l'osmolarità del filtrato in diverse parti del nefrone e l'impatto di diversi ormoni o farmaci.

Vescica urinaria

La vescica urinaria è una struttura simile a una sacca con pareti muscolari che trattiene l'urina fino a quando non viene espulsa dal corpo durante la minzione. La vescica riceve l'urina attraverso due ureteri – uno da ciascun rene – che entrano attraverso aperture chiamate orifizi ureterici. Questi orifizi si trovano in corrispondenza del fondo convesso dell'organo. L'urina esce dalla vescica attraverso l'uretra.

Le pareti della vescica sono costituite da muscolatura liscia e il rivestimento epiteliale interno di questo organo è costituito da un notevole tessuto chiamato epitelio di transizione. Le cellule di questo tessuto stratificato cambiano forma a seconda che la vescica sia vuota o piena, permettendole di rimanere elastica, contenere fino a mezzo litro di urina.

Negli uomini, la vescica si trova sul pavimento pelvico davanti al retto. Nelle donne, si trova vicino all'utero, portando a una serie di cambiamenti nei modelli di minzione durante il corso della gravidanza. Durante il corso della gestazione, si verificano importanti cambiamenti nel volume del sangue e aumenti della velocità di filtrazione glomerulare. Mentre la vescica stessa aumenta di dimensioni, quasi raddoppiando entro la fine del terzo trimestre, l'utero allargato con il peso del feto, del liquido amniotico, della placenta e di altri tessuti può creare incontinenza da stress.

Fegato

Il fegato è il principale organo disintossicante del corpo, soprattutto per le scorie azotate. Le cellule del fegato ospitano processi biochimici che creano ammoniaca dagli amminoacidi. Poiché l'ammoniaca è estremamente tossica, viene rapidamente convertita in urea prima di essere trasportata nel sangue verso il rene.

La maggior parte degli animali fa la scelta tra ammoniaca, urea e acido urico come modalità preferita per l'escrezione dei rifiuti azotati, in base alla disponibilità di acqua. Sebbene l'ammoniaca sia tossica, può essere rapidamente diluita e rimossa dal corpo con abbondante acqua, e quindi rimane la sostanza chimica utilizzata dagli animali acquatici. Gli animali terrestri con regolare accesso all'acqua tendono a utilizzare l'urea, che ha una tossicità inferiore. Gli uccelli e altri animali che hanno un apporto minimo di acqua consumano energia per convertire l'urea in acido urico, che ha bisogno di una quantità minima di acqua per essere conservata in sicurezza fino all'escrezione.

Intestino crasso

Il fegato è necessario anche per la rimozione dell'emoglobina decomposta, di alcuni farmaci, di vitamine in eccesso, steroli e altre sostanze lipofile. Questi vengono secreti insieme alla bile e infine rimossi dal corpo attraverso le feci. L'intestino crasso, quindi, svolge un ruolo nell'escrezione, soprattutto per le particelle idrofobiche.

La pelle è un organo escretore secondario poiché le ghiandole sudoripare nel derma possono eliminare i sali e un po' d'acqua in eccesso. La pelle ha anche ghiandole sebacee che possono secernere lipidi cerosi.

Polmoni o branchie

Un prodotto importante che deve essere escreto da tutti gli animali è l'anidride carbonica. L'anidride carbonica viene creata nelle cellule, poiché subiscono la respirazione aerobica. Questo prodotto di scarto viene rimosso dalle cellule e trasferito nel flusso sanguigno. Quando il sangue raggiunge le branchie o i polmoni, viene scambiato con ossigeno e rilasciato nell'atmosfera. I pesci usano anche le loro branchie per espellere una serie di altri prodotti di scarto.


Come respiriamo

La respirazione è un processo fisiologico complesso che viene eseguito dalle strutture del sistema respiratorio. Ci sono una serie di aspetti coinvolti nella respirazione. L'aria deve poter fluire dentro e fuori i polmoni. I gas devono poter essere scambiati tra l'aria e il sangue, nonché tra il sangue e le cellule del corpo. Tutti questi fattori devono essere sotto stretto controllo e il sistema respiratorio deve essere in grado di rispondere alle mutevoli esigenze quando necessario.

Inspirazione ed espirazione

L'aria viene introdotta nei polmoni dall'azione dei muscoli respiratori. Il diaframma ha la forma di una cupola ed è alla sua massima altezza quando è rilassato. Questa forma riduce il volume nella cavità toracica. Quando il diaframma si contrae, il diaframma si sposta verso il basso e i muscoli intercostali si spostano verso l'esterno. Queste azioni aumentano il volume nella cavità toracica e abbassano la pressione dell'aria all'interno dei polmoni. La pressione dell'aria più bassa nei polmoni fa sì che l'aria venga aspirata nei polmoni attraverso i passaggi nasali fino a quando le differenze di pressione non si uniformano. Quando il diaframma si rilassa di nuovo, lo spazio all'interno della cavità toracica diminuisce e l'aria viene espulsa dai polmoni.

Lo scambio di gas

L'aria viene immessa nei polmoni dall'ambiente esterno contiene l'ossigeno necessario per i tessuti del corpo. Quest'aria riempie minuscole sacche d'aria nei polmoni chiamate alveoli. Le arterie polmonari trasportano il sangue impoverito di ossigeno contenente anidride carbonica ai polmoni. Queste arterie formano vasi sanguigni più piccoli chiamati arteriole che inviano il sangue ai capillari che circondano milioni di alveoli polmonari. Gli alveoli polmonari sono ricoperti da una pellicola umida che dissolve l'aria. I livelli di ossigeno all'interno degli alveoli sono ad una concentrazione maggiore rispetto ai livelli di ossigeno nei capillari che circondano gli alveoli. Di conseguenza, l'ossigeno si diffonde attraverso il sottile endotelio degli alveoli nel sangue all'interno dei capillari circostanti. Allo stesso tempo, l'anidride carbonica si diffonde dal sangue negli alveoli e viene espirata attraverso i passaggi dell'aria. Il sangue ricco di ossigeno viene quindi trasportato al cuore dove viene pompato al resto del corpo.

Un simile scambio di gas avviene nei tessuti e nelle cellule del corpo. L'ossigeno utilizzato da cellule e tessuti deve essere sostituito. I prodotti di scarto gassosi della respirazione cellulare come l'anidride carbonica devono essere rimossi. Ciò si ottiene attraverso la circolazione cardiovascolare. L'anidride carbonica si diffonde dalle cellule al sangue e viene trasportata al cuore dalle vene. L'ossigeno nel sangue arterioso si diffonde dal sangue alle cellule.

Controllo del sistema respiratorio

Il processo di respirazione è sotto la direzione del sistema nervoso periferico (PNS). Il sistema autonomo del SNP controlla processi involontari come la respirazione. Il midollo allungato del cervello regola la respirazione. I neuroni nel midollo inviano segnali al diaframma e ai muscoli intercostali per regolare le contrazioni che avviano il processo di respirazione. I centri respiratori nel midollo controllano la frequenza respiratoria e possono accelerare o rallentare il processo quando necessario. I sensori nei polmoni, nel cervello, nei vasi sanguigni e nei muscoli monitorano i cambiamenti nelle concentrazioni di gas e avvertono i centri respiratori di questi cambiamenti. I sensori nei passaggi dell'aria rilevano la presenza di sostanze irritanti come fumo, polline o acqua. Questi sensori inviano segnali nervosi ai centri respiratori per indurre la tosse o gli starnuti per espellere le sostanze irritanti. La respirazione può anche essere influenzata volontariamente dalla corteccia cerebrale. Questo è ciò che ti consente di accelerare volontariamente la frequenza respiratoria o di trattenere il respiro. Queste azioni, tuttavia, possono essere annullate dal sistema nervoso autonomo.


Quali prodotti di scarto secernono le cellule in coltura e con quale velocità? - Biologia

La fermentazione del metano è una biotecnologia versatile in grado di convertire quasi tutti i tipi di materiali polimerici in metano e anidride carbonica in condizioni anaerobiche. Ciò è ottenuto come risultato della successiva degradazione biochimica dei polimeri in metano e anidride carbonica in un ambiente in cui una varietà di microrganismi che includono microbi fermentativi (acidogeni) produttori di idrogeno, microbi che formano acetato (acetogeni) e microbi produttori di metano (metanogeni) crescono armoniosamente e producono prodotti finali ridotti. Gli anaerobi svolgono un ruolo importante nello stabilire un ambiente stabile nelle varie fasi della fermentazione del metano.

La fermentazione del metano offre un mezzo efficace di riduzione dell'inquinamento, superiore a quello ottenuto tramite i processi aerobici convenzionali. Sebbene praticato da decenni, l'interesse per la fermentazione anaerobica si è concentrato solo di recente sul suo utilizzo nel recupero economico del gas combustibile dalle eccedenze industriali e agricole.

Vengono qui discussi la biochimica e la microbiologia della degradazione anaerobica dei materiali polimerici in metano e il ruolo dei vari microrganismi coinvolti. Vengono esaminati i recenti progressi nella biologia molecolare dei metanogeni, vengono descritti nuovi digestori e vengono discussi anche i miglioramenti nel funzionamento di vari tipi di bioreattori.

La fermentazione del metano è la conseguenza di una serie di interazioni metaboliche tra vari gruppi di microrganismi. Una descrizione dei microrganismi coinvolti nella fermentazione del metano, basata su un'analisi dei batteri isolati dai digestori dei fanghi di depurazione e dal rumine di alcuni animali, è riassunta in Fig. 4-1. Il primo gruppo di microrganismi secerne enzimi che idrolizzano i materiali polimerici in monomeri come glucosio e amminoacidi, che vengono successivamente convertiti in acidi grassi più volatili, H 2 e acido acetico (Fig. 4-1 fase 1). Nella seconda fase, i batteri acetogeni produttori di idrogeno convertono gli acidi grassi volatili più elevati, ad esempio gli acidi propionico e butirrico, prodotti in H2, CO2 e acido acetico. Infine, il terzo gruppo, i batteri metanogeni convertono H 2 , CO 2 e acetato in CH 4 e CO 2 .

I materiali polimerici come lipidi, proteine ​​e carboidrati sono principalmente idrolizzati da idrolasi extracellulari, escreti dai microbi presenti nella fase 1 (Fig. 4-1). Gli enzimi idrolitici, (lipasi, proteasi, cellulasi, amilasi, ecc.) idrolizzano i rispettivi polimeri in molecole più piccole, principalmente unità monomeriche, che vengono poi consumate dai microbi. Nella fermentazione del metano di acque reflue contenenti elevate concentrazioni di polimeri organici, l'attività idrolitica relativa a ciascun polimero è di fondamentale importanza, in quanto l'idrolisi del polimero può diventare una fase limitante per la produzione di substrati batterici più semplici da utilizzare nelle successive fasi di degradazione .

Le lipasi convertono i lipidi in acidi grassi a catena lunga. È stata riportata una densità di popolazione di 10 4 - 10 5 batteri lipolitici per ml di fluido digestivo. Clostridi e micrococchi sembrano essere responsabili della maggior parte dei produttori di lipasi extracellulari. Gli acidi grassi a catena lunga prodotti sono ulteriormente degradati dalla p-ossidazione per produrre acetil CoA.

Le proteine ​​sono generalmente idrolizzate ad amminoacidi dalle proteasi, secrete da Bacteroides, Butyrivibrio, Clostridium, Fusobacterium, Selenomonas e Streptococcus. Gli amminoacidi prodotti vengono quindi degradati ad acidi grassi come acetato, propionato e butirrato e ad ammoniaca come si trova in Clostridium, Peptococcus, Selenomonas, Campylobacter e Bacteroides.

I polisaccaridi come cellulosa, amido e pectina vengono idrolizzati da cellulasi, amilasi e pectinasi. La maggior parte delle cellulasi microbiche è composta da tre specie: (a) endo-(3-l,4-glucanasi (b) eso-pl,4-glucanasi (c) cellobiasi o p-glucosidasi Questi tre enzimi agiscono sinergicamente sulla cellulosa idrolizzando efficacemente la sua struttura cristallina, per produrre glucosio L'idrolisi microbica dell'amido grezzo in glucosio richiede un'attività amilolitica, che consiste di 5 specie di amilasi: (a) a-amilasi che endoscludono a ±1-4 legami (b) p-amilasi che esocleano a legami ±1-4 (c) amiloglucosidasi che esocleano un legame ±l-4 e un ±l-6 (d) enzimi deramificanti che agiscono su legami ±l-6 (e) maltasi che agisce sul maltosio liberando glucosio.Le pectine sono degradate dalle pectinasi, comprese pectinesterasi e depolimerasi.Gli xilani vengono degradati con una ²-endo-xilanasi e una ²-xilosidasi per produrre xilosio.

Gli esosi e i pentosi sono generalmente convertiti in intermedi C2 e C3 e in portatori di elettroni ridotti (ad es. NADH) attraverso percorsi comuni. La maggior parte dei batteri anaerobici subisce il metabolismo dell'esoso attraverso la via Emden-Meyerhof-Parnas (EMP) che produce piruvato come intermedio insieme al NADH. Il piruvato e il NADH così generati, vengono trasformati in prodotti endo di fermentazione come lattato, propionato, acetato ed etanolo da altre attività enzimatiche che variano enormemente con le specie microbiche.

Pertanto, nell'idrolisi e nell'acidogenesi (Fig. 4-1 Fase 1), gli zuccheri, gli amminoacidi e gli acidi grassi prodotti dalla degradazione microbica dei biopolimeri vengono successivamente metabolizzati da prodotti endo di fermentazione come lattato, propionato, acetato ed etanolo da altri attività enzimatiche che variano enormemente con le specie microbiche.

Pertanto, nell'idrolisi e nell'acidogenesi (Fig. 4-1 Fase 1), gli zuccheri, gli amminoacidi e gli acidi grassi prodotti dalla degradazione microbica dei biopolimeri vengono successivamente metabolizzati da gruppi di batteri e vengono principalmente fermentati in acetato, propionato, butirrato, lattato, etanolo, anidride carbonica e idrogeno (2).

Sebbene un po' di acetato (20%) e H 2 (4%) siano prodotti direttamente dalla fermentazione acidogena di zuccheri e amminoacidi, entrambi i prodotti derivano principalmente dall'acetogenesi e dalla deidrogenazione di acidi grassi più volatili (Fig. 4-1 Fase 2 ).

I batteri acetogeni che producono H 2 obbligati sono in grado di produrre acetato e H 2 da acidi grassi superiori. Solo Syntrophobacter wolinii, un decompositore propionato (3) e Sytrophomonos wolfei, un decompositore butirrato (4) sono stati finora isolati a causa di difficoltà tecniche nell'isolamento di ceppi puri, poiché l'H 2 prodotto inibisce gravemente la crescita di questi ceppi. L'uso di tecniche di co-coltura che incorporano consumatori di H 2 come metanogeni e batteri che riducono i solfati può quindi facilitare la delucidazione della scomposizione biochimica degli acidi grassi.

Le reazioni di degradazione complessive per gli acidi grassi a catena lunga sono presentate nelle Tabelle 4-1 e 4-2. La produzione di H 2 da parte degli acetogeni è generalmente energeticamente sfavorevole a causa degli elevati fabbisogni di energia libera ( a ”G o, > 0 Tabelle 4-1 e 4-2). Tuttavia, con una combinazione di batteri che consumano H 2 (Tabella 4-2, 4-3), i sistemi di co-coltura forniscono condizioni favorevoli per la decomposizione degli acidi grassi in acetato e CH 4 o H 2 S ( a ”G o , < 0). Oltre alla decomposizione degli acidi grassi a catena lunga, l'etanolo e il lattato vengono anche convertiti in acetato e H 2 rispettivamente da un acetogeno e da Clostridium formicoaceticum.

L'effetto della pressione parziale di H 2 sull'energia libera associata alla conversione di etanolo, propionato, acetato e H 2 /CO 2 durante la fermentazione del metano è mostrato in Fig. 4-2. Una pressione parziale estremamente bassa di H 2 (10 -5 atm) sembra essere un fattore significativo nella degradazione del propionato a CH 4 . Una pressione parziale così bassa può essere ottenuta in una co-coltura con batteri che consumano H 2 come descritto in precedenza (Tabella 4-2,4-3).

I metanogeni sono fisiologicamente uniti come produttori di metano nella digestione anaerobica (Fig. 4-1 Fase 3). Sebbene acetato e H 2 /CO 2 siano i principali substrati disponibili nell'ambiente naturale, anche il formiato, il metanolo, le metilammine e la CO vengono convertiti in CH 4 (Tabella 4-3).

Tabella 4-1 Reazioni proposte coinvolte nel catabolismo degli acidi grassi da Syntrophomonas wolfei

+ 2 H 2 O 2 CH 3 COO - + 2 H 2 + H +

CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 COO -

+ 4 H 2 O 3 CH 3 COO - + 4 H 2 + 2 H +

CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 COO -

+ 6 H 2 O 4 CH 3 COO - + 6 H 2 + 3 H +

+1 H 2 O CH 3 CH 2 COO - + CH 3 COO - +2 H 2 + H +

CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 COO -

+ 4 H 2 O CH 3 CH 2 COO - + 2 CH 3 COO - +4 H 2 + 2 H +

CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 COO -
|
CH 3

+ 2 H 2 O CH 3 CH 2 COO - + CH 3 COO - + 2 H 2 + H +
|
CH 3

Tabella 4-2 Variazioni di energia libera per reazioni che comportano ossidazione anaerobica in colture pure o in co-colture con H 2 -Utilizzando metanogeni o Desulfovibrio spp.

1. Batteri acetogeni che riducono i protoni (produttori di H2)

A. CH 3 CH 2 CH 2 COO - + 2H 2 O 2 CH 3 COO - + 2H 2 + H +

B. CH 3 CH 2 COO - + 3H 2 O CH 3 COO - + HCO 3 - + H + + 3H 2

2. H 2 -usando metanogeni e desulfovibrios

C. 4H 2 + HCO 3 - + H + CH 4 + 3 H 2 O

D. 4H 2 + S0 4 2- + H + HS - + 4 H 2 O

A + C 2 CH 3 CH 2 CH 2 COO - + HCO 3 - + H 2 O 4 CH 3 COO - + H + + CH 4

A + D 2 CH 3 CH 2 CH 2 COO - + S0 4 2- 4 CH 3 COO - + H + + HS -

B + C 4 CH 3 CH 2 COO - + 12H 2 4 CH 3 COO - + HCO 3 - + H + + 3 CH 4

B + D 4 CH 3 CH 2 COO - + 3 S0 4 2 " 4 CH 3 COO - + 4 HCO 3 - + H + + 3 HS -

Tabella 4-3 Reazioni di produzione di energia dei metanogeni

CO 2 + 4 H 2 ® CH 4 + 2H 2 O

HCO 3 - + 4 H 2 + H + ® CH 4 + 3 H 2 O

CH 3 COO - + H 2 O ® CH 4 + HCO 3 -

HCOO - + H + ® 0.25 CH 4 + 0.75 CO 2 + 0.5 H 2 O

CO + 0,5 H 2 O ® 0,25 CH 4 + 0,75 CO 2

CH 3 OH ® 0.75 CH 4 + 0.25 CO 2 + 0.5 H 2 O

CH 3 NH 3 + + 0,5 H 2 O ® 0,75 CH 4 + 0,25 CO 2 + NH 4 +

(CH 3 ) 2 NH 2 + + H 2 O ® 1,5 CH 4 + 0,5 CO 2 + NH 4 +

(CH 3 ) 2 NCH 2 CH 3 H + + H 2 O ® 1,5 CH 4 + 0,5 CO 2 + + H 3 NCH 2 CH 3

(CH 3 ) 3 NH+ 1,5H 2 O ® 2,25 CH 4 + 0,75 CO 2 + NH 4 +

Poiché i metanogeni, in quanto anaerobi obbligati, richiedono un potenziale redox inferiore a -300 mV per la crescita, il loro isolamento e coltivazione è stato alquanto elusivo a causa delle difficoltà tecniche incontrate nel maneggiarli in condizioni completamente prive di O2. Tuttavia, come risultato di tecniche di isolamento del metanogeno notevolmente migliorate sviluppate da Hungate (6), sono stati ora isolati più di 40 ceppi di metanogeni puri. I metanogeni possono essere suddivisi in due gruppi: H 2 /CO 2 - e consumatori di acetato. Sebbene alcuni dei consumatori di H 2 /CO 2 siano in grado di utilizzare il formiato, l'acetato viene consumato da un numero limitato di ceppi, come Methanosarcina spp. e Methanothrix spp. (ora, Methanosaeta), che non sono in grado di usare il formiato. Poiché nell'ambiente naturale viene prodotta una grande quantità di acetato (Fig. 4-1), Methanosarcina e Methanothrix svolgono un ruolo importante nel completamento della digestione anaerobica e nell'accumulo di H 2 , che inibisce gli acetogeni ei metanogeni. Anche i metanogeni che consumano H 2 sono importanti per mantenere bassi i livelli di H 2 atmosferico.

I metanogeni che consumano H 2 /CO 2 riducono la CO 2 come accettore di elettroni attraverso i livelli di formile, metenile e metile attraverso l'associazione con coenzimi insoliti, per produrre infine CH 4 (7) (Fig. 4-3). La reazione acetoclastica complessiva può essere espressa come:

Poiché una piccola parte della CO 2 è formata anche dal carbonio derivato dal gruppo metilico, si sospetta che il potenziale ridotto prodotto dal gruppo metilico possa ridurre la CO 2 a CH 4 (8).

Sulla base dell'analisi della sequenza omologa degli rRNA 16S, i metanogeni sono stati classificati in uno dei tre regni primari degli organismi viventi: gli Archaea (Archaebacteria). Gli Archaea comprendono anche importanti gruppi di organismi come i termofili e gli alofili. Sebbene gli Archaea possiedano una struttura e un'organizzazione delle cellule procariotiche, condividono caratteristiche comuni con gli eucarioti: sequenze omologhe in rRNA e tRNA, presenza di inn-one nei loro genomi, organizzazione simile della subunità della RNA polimerasi, omologie immunologiche e sistemi di traduzione.

La tecnologia del DNA ricombinante è una delle tecniche più potenti per caratterizzare la regolazione biochimica e genetica della metanogenesi. Ciò richiede la selezione di marcatori genetici, un efficiente sistema di trasformazione genetica e un sistema di vettori per la ricombinazione genetica come prerequisiti.

I ceppi geneticamente marcati sono prerequisiti per gli studi genetici: questi ceppi possono essere impiegati per sviluppare un sistema di scambio genetico nei metanogeni basato su un efficiente sistema di selezione. Poiché la crescita di M. thermoautotrophicum è inibita dal fluorouracile, i ceppi resistenti agli analoghi sono stati isolati mediante mutazione spontanea. Altri mutanti resistenti alla DL-etionina o al 2-bromoetano solfonato (analogo del coenzima M), oltre ai mutanti autotrofi, sono stati ottenuti mediante trattamento mutageno. Diversi ceppi autotrofi sono stati ottenuti anche per il metanogeno acetoclastico, M. voltae. Questi ceppi mutanti sono elencati nella Tabella 4-4.

Sebbene siano stati clonati alcuni geni del metanogeno come i geni biosintetici degli amminoacidi e delle purine, i geni dei macchinari di trascrizione e traduzione e i geni delle proteine ​​strutturali, i geni che codificano per gli enzimi coinvolti nella metanogenesi sono stati scelti qui come "geni del metano".

La metil CoM reduttasi (MR Fig. 4-3) costituisce circa il 10% della proteina totale nelle colture metanogeniche. L'importanza e l'abbondanza della RM hanno inevitabilmente focalizzato l'attenzione iniziale sulla delucidazione della sua struttura e dei meccanismi che ne guidano la sintesi e la regolazione. I geni codificanti per MR sono stati clonati e sequenziati da Methanococcus vanielli, M. voltae, Methanosarcina barkeri, Methanobacterium thermoautotrophicum e M. fervidus.

La formilmetanofurano transferasi (FTR) catalizza il trasferimento di un gruppo formile dal formilmetanofurano (MFR) alla tetraidrometanopterina (H 4 MPT) (Fig. 4-3, 4-2). Il gene codificante FTR di M. thermoautotrophicum è stato clonato, sequenziato ed espresso funzionalmente in E. coli. Il formiato deidrogenasi (FDH) può talvolta rappresentare il 2-3% delle proteine ​​solubili totali nelle colture metanogeniche. I due geni che codificano per le subunità a ± e a ² di FDH sono stati clonati e sequenziati da M formicicum. Inoltre, sono stati clonati anche i geni che codificano per l'idrogenasi riducente F 420 (Fig. 4-3), la ferredossina e l'ATPasi.

Tabella 4-4 Mutanti auxotrofi e resistenti ai farmaci applicabili agli esperimenti di trasferimento genico


Patogenesi

La patogenicità di B anthracis dipende da due fattori di virulenza: una capsula polipeptidica dell'acido poli-y-D-glutammico, che la protegge dalla fagocitosi da parte dei fagociti difensivi dell'ospite, e una tossina prodotta nella fase logaritmica della crescita. Questa tossina è costituita da tre proteine: antigene protettivo (PA) (82,7 kDa), fattore letale (LF) (90,2 kDa) e fattore di edema (EF) (88,9 kDa). Le proteasi dell'ospite nel sangue e sulla superficie delle cellule eucariotiche attivano l'antigene protettivo tagliando un segmento di 20 kDa, esponendo un sito di legame per LF ed EF. Il polipeptide attivato da 63 kDa PA si lega a recettori specifici sulla superficie della cellula ospite, creando così un sito di legame secondario per il quale competono LF ed EF. Il complesso (PA+LF o PA+EF) viene internalizzato per endocitosi e, in seguito all'acidificazione dell'endosoma, l'LF o l'EF attraversano la membrana nel citosol tramite canali conduttivi ionici mediati da PA. Questo è analogo al modello A-B struttura-funzione della tossina del colera con PA che si comporta come la frazione B (vincolante) (Fig. 15-3). L'EF, responsabile del caratteristico edema dell'antrace, è un'adenilato ciclasi calmodulina-dipendente. (La calmodulina è il principale recettore del calcio intracellulare nelle cellule eucariotiche.) L'unica altra adenilato ciclasi batterica nota è prodotta da Bordetella pertussis (vedi Cap 31), ma le due tossine condividono solo piccole omologie. LF sembra essere una metalloproteasi zinco-dipendente sebbene il suo substrato e la modalità d'azione debbano ancora essere chiariti.

Figura 15-3

Meccanismo d'azione della tossina dell'antrace. La tossina è composta da tre proteine. L'antigene protettivo (PA) si lega a un sito appropriato sulla membrana della cellula ospite. Una proteasi della superficie cellulare scinde un pezzo di 20 kDa dall'antigene protettivo e quindi (altro.)

La tossina e la capsula di B anthracis sono codificati su due grandi plasmidi chiamati pXO 1 (110 MDa) e pX02 (60 MDa), rispettivamente. I ceppi privi di uno di questi plasmidi hanno una virulenza notevolmente ridotta (Fig.15-4). Il ceppo del vaccino vivo attenuato sviluppato da Sterne nel 1937, che è ancora la base della maggior parte dei vaccini contro l'antrace per il bestiame, manca di pX02 ed è quindi Cap – Tox + . La protezione offerta da tali vaccini è apparentemente correlata principalmente ad anticorpi specifici per il componente antigene protettivo della tossina. Al contrario, i ceppi vaccinali attenuati sviluppati da Pasteur 110 anni fa sono stati inavvertitamente curati da pXO1 (mediante subcoltura da 42° a 43ଌ) questi ceppi di Pasteur sono quindi Cap + Tox –. Ceppi di questo tipo non inducono immunità protettiva la parziale efficacia dei vaccini di Pasteur si ritiene oggi sia dovuta alle cellule residue non curate (Cap + Tox + ) che contenevano, e questo spiegherebbe anche la parziale virulenza di questi ceppi.

Figura 15-4

Genetica della produzione di fattori di virulenza da B. anthracis. I plasmidi pX01 e pX02 codificano, rispettivamente, la tossina e la capsula dell'antrace. La polimerizzazione dei batteri di pX01 produce un ceppo incapsulato, non tossico e non protettivo. La polimerizzazione di pX02 produce (altro.)

L'unico altro Bacillo specie per le quali sono stati identificati fattori di virulenza è B cereus. In modelli animali è stato dimostrato che un complesso proteico da 38 a 46 kDa causa necrosi della pelle o della mucosa intestinale (Fig. 15-5), induce accumulo di liquidi nell'intestino ed è una tossina letale. Si ritiene che questa proteina sia responsabile della natura necrotica e tossica di gravi B cereus infezioni e per la forma diarroica di intossicazione alimentare. Bacillus cereus produce anche due emolisina una di queste, la cereolisina (58 kDa), è una potente tossina necrotica e letale. Sebbene questa tossina sia neutralizzata dal colesterolo sierico, probabilmente contribuisce alla patogenesi del B cereus infezioni. Al momento si sa poco dell'altra emolisina. Fosfolipasi prodotte da B cereus possono agire come fattori esacerbanti degradando le membrane delle cellule ospiti a seguito dell'esposizione dei loro substrati fosfolipidici in ferite o altre infezioni. L'agente responsabile del tipo emetico di B cereus l'intossicazione alimentare non è stata chiaramente identificata. L'emesi può essere indotta da prodotti di degradazione derivanti dall'azione di uno o più B cereus enzimi sul cibo.

Figura 15-5

Necrosi della mucosa ileale di coniglio 4 ore dopo l'introduzione di un filtrato di coltura priva di cellule tossigene di B cereus. (A) aspetto grossolano della superficie luminale dell'ileo rispetto a una sezione dell'ileo di controllo. (B) Aspetto istologico di una sezione trasversale (più.)


Metabolismo degli aminoacidi [torna in cima]

Il metabolismo degli aminoacidi avviene nel fegato e si compone di tre fasi:

In questa reazione un gruppo amminico viene trasferito da un amminoacido a un chetoacido, per formare un diverso amminoacido.

Aminoacido 1 + Chetoacido 2 Chetoacido 1 + Aminoacido 2

In questo modo si possono ricavare amminoacidi scarsi da quelli abbondanti. Negli esseri umani adulti solo 11 dei 20 amminoacidi possono essere prodotti per transaminazione. Gli altri si chiamano aminoacidi essenziali, e devono essere forniti nella dieta.

In questa reazione un gruppo amminico viene rimosso da un amminoacido per formare ammoniaca e un chetoacido. L'esempio più comune è la deaminazione del glutammato:

Questa reazione è catalizzata dall'enzima glutammato deidrogenasi. La maggior parte degli altri amminoacidi viene prima transaminata dal glutammato, che viene poi deaminato. Il NADH prodotto viene utilizzato nella catena respiratoria, l'a-chetoglutarato entra nel ciclo di Krebs e l'ammoniaca viene convertita in urea nel ciclo dell'urea.

In questa reazione l'ammoniaca viene convertita in urea, pronta per essere escreta dai reni.

L'ammoniaca è altamente tossica, a causa dell'inversione della reazione della glutammato deidrogenasi che esaurirebbe tutto l'a-chetoglutarato e fermerebbe così il ciclo di Krebs. L'urea è meno tossica dell'ammoniaca, quindi è più sicura da avere nel flusso sanguigno. Lo svantaggio è che "costa" 3 molecole di ATP per produrre una molecola di urea. Questa non è infatti una singola reazione, ma è un riassunto di un'altra via ciclica, chiamata the ciclo dell'urea (o ciclo orthno). È stato il primo percorso ciclico scoperto.


Conclusioni e altre domande

Numerosi rapporti storici nell'ultimo decennio hanno cementato le intime connessioni tra oncogeni e metabolismo del glucosio nei tumori e hanno dimostrato che la dipendenza delle cellule trasformate dall'effetto Warburg potrebbe essere sfruttata sperimentalmente per sopprimere la crescita del tumore. La prossima ondata di interesse per il metabolismo dei tumori probabilmente concentrerà una maggiore attenzione sulla gestione cellulare della glutammina e dovrebbe rivalutare la questione se l'appetito per la glutammina mostrato dai tumori possa essere usato contro di loro. I diversi contributi della glutammina al metabolismo intermedio, alla segnalazione cellulare, all'espressione genica e alla cachessia sostengono il tentativo di sviluppare strategie razionali per limitare l'assorbimento di glutammina tumorale e per visualizzare il metabolismo della glutammina nei tumori. Presumibilmente, tali manovre sarebbero particolarmente utili nei tumori che contengono una maggiore attività di c-Myc.

Ci sono anche una serie di questioni biologiche fondamentali che meritano ulteriori studi. Ad esempio, come fanno le cellule ad allocare adeguatamente la glutammina nei numerosi percorsi che la utilizzano? Esistono meccanismi per incanalare la glutammina verso gli enzimi e i compartimenti cellulari che ne hanno più bisogno e questi sistemi sono sensibili agli stress che modificano i modelli cellulari dell'uso di glutammina? L'osservazione che alcune cellule richiedono l'esportazione di glutammina per attivare la segnalazione di mTOR pone la domanda su come queste cellule possano percepire quando la glutammina è abbastanza abbondante da consentirne la secrezione. Sarà anche interessante determinare come i segnali relativi all'abbondanza/deprivazione di glutammina vengano trasmessi al nucleo per influenzare l'espressione genica. Una comprensione più profonda di questi problemi dovrebbe aiutare a spiegare perché la glutammina pervade così tanti aspetti della biologia cellulare e dovrebbe supportare gli sforzi futuri per manipolare il metabolismo della glutammina nel cancro e in altre malattie.


‘Il monitoraggio dei bug’ rivela il segreto del metabolismo delle cellule cancerose

Uno dei segni distintivi del cancro è un cambiamento nel metabolismo cellulare, una serie di reazioni chimiche così fondamentali per la vita che la loro alterazione fa sembrare le cellule cancerose terribilmente malevole.

Le cellule sane assorbono lo zucchero nel sangue (molecole di glucosio), che scompongono per estrarre energia. Ciò avviene in due fasi: una fase che si svolge nel citoplasma e una fase successiva che si verifica all'interno di compartimenti cellulari chiamati mitocondri.

Si pensa che le cellule cancerose saltino per lo più la fase mitocondriale che produce alta energia, compensando l'energia a cui rinunciano aumentando la prima fase e abbattendo rapidamente il glucosio per secernere grandi quantità di lattato, una forma di glucosio parzialmente digerito che è stata a lungo considerata come un "prodotto di scarto".

Alcune parti di questa ipotesi devono essere vere perché le cellule tumorali assorbono più glucosio rispetto alle cellule sane, questo aumento dell'assorbimento di glucosio è abbastanza significativo da essere la base di una tecnica di imaging utilizzata per diagnosticare il cancro in clinica.

D'altra parte, è stato difficile capire come le cellule potessero permettersi di scartare la maggior parte dell'energia e della sostanza che possono essere prodotte dal glucosio, come i tester di cibo reali che prendono solo un boccone di ogni "piatto".

"È stato un argomento molto confuso nella ricerca sul cancro per molto tempo - apparentemente paradossale - che le cellule tumorali potessero essere così dispendiose", ha affermato Gary J. Patti, professore associato di chimica in Arts & Sciences presso la Washington University di St. Louis.

Nel numero anticipato online del 12 settembre di Nature Chemical Biology, Patti e l'allora dottoranda Amanda (Ying-Jr) Chen descrivono i risultati sorprendenti di un esperimento apparentemente semplice. Originariamente intraprese per testare una nuova metodologia, le loro scoperte hanno inaspettatamente messo in discussione questa nozione di metabolismo del cancro.

Studiando il lattato, hanno dimostrato che le cellule cancerose possono gestire la loro produzione di energia in modo diverso da quanto si pensasse. Hanno la capacità di importare il lattato "prodotto di scarto" nei mitocondri dove può essere estratto il resto dell'energia del glucosio.

"Se cerchi il lattato nel nostro libro di testo di biochimica universitaria, si dice che il lattato è secreto come prodotto di scarto", ha detto Patti, "ma la nostra ricerca mostra che non è necessario che possa essere utilizzato in modo produttivo".

Il puzzle di Warburg

La maggior parte dell'energia di cui le cellule hanno bisogno per vivere è prodotta nei mitocondri, la cosiddetta centrale elettrica della cellula. Solo il 5% dell'energia del glucosio può essere estratto nel citoplasma, mentre il 95% può essere estratto nei mitocondri. Per produrre energia nei mitocondri, è necessario ossigeno.

Nel 1924, il fisiologo tedesco Otto Warburg scoprì che le cellule cancerose tendono a fermentare il glucosio in lattato anche in presenza di ossigeno. Apparentemente passano dal metabolizzare il glucosio nei mitocondri alla scomposizione della maggior parte del glucosio nel citoplasma.

Questa osservazione, chiamata effetto Warburg, ha a lungo sconcertato i ricercatori sul cancro. Perché le cellule in rapida crescita dovrebbero passare a una forma di metabolismo che genera meno energia? Che vantaggio conferisce?

Nonostante molti sforzi per risolvere questo problema, non è mai andato via. "Se guardi le mappe metaboliche in letteratura", ha detto Patti, "di solito c'è solo una freccia che mostra il lattato che esce dalla cellula. È solo una freccia singola, ma fa una grande differenza nel modo in cui pensiamo".

Un vicolo cieco che non era

Per studiare il metabolismo in modo imparziale, il laboratorio di Patti applica tag (etichette isotopiche) sui nutrienti in modo che possano tracciare ciò che accade di loro quando vengono metabolizzati dalle cellule.

"Abbiamo sviluppato questa tecnologia", ha detto Patti. "E abbiamo pensato, 'OK, qual è la prima cosa su cui dovremmo testarlo?' Abbiamo deciso che una molecola ovvia con cui iniziare era il lattato, che è spesso chiamato un vicolo cieco. Ci aspettavamo che dare alle cellule cancerose questo tag avrebbe dimostrato che la nostra tecnologia funziona, perché non ne vedremmo molto convertita in altre molecole".

Ma quando Chen ha fatto l'esperimento, non è andato come previsto. "Abbiamo visto migliaia di segnali etichettati", ha detto. “Quasi tutti i lipidi nella cellula sono stati etichettati. È stato molto inaspettato ed emozionante.” Le cellule non solo estraevano energia extra dal lattato, ma usavano i suoi atomi per creare altri importanti elementi costitutivi essenziali per la crescita delle cellule cancerose.

"È una grande transizione", ha detto Patti. "Stiamo passando dal dire che qualcosa viene buttato via al dire che è usato per produrre efficacemente un'intera classe di molecole nelle cellule tumorali".

Poiché la scoperta è stata così sorprendente, il team ha condotto una serie di esperimenti per assicurarsi che il lattato stesse effettivamente entrando nei mitocondri. Gli esperimenti non solo hanno confermato che il lattato può essere trasportato nei mitocondri, ma hanno anche dimostrato che un enzima all'interno dei mitocondri metabolizza il lattato per produrre energia e blocchi cellulari.

Avere la tua torta e mangiarla anche tu

Allora perché sprecare sforzi per convertire il glucosio in lattato se verrà comunque trasportato nei mitocondri?

Quando le cellule metabolizzano il glucosio nel citoplasma, producono elettroni. Devono mettere gli elettroni da qualche parte, o le reazioni metaboliche strettamente regolate si fermano. Le cellule sane spostano gli elettroni nei mitocondri, ma le cellule cancerose producono gli elettroni più velocemente di quanto il trasporto possa tenere il passo. Questo costringe le cellule tumorali ad attaccare gli elettroni sul lattato ed espellerlo, o almeno così si pensava.


Riferimenti

DeRisi JL, Iyer VR, Brown PO: Esplorare il controllo metabolico e genetico dell'espressione genica su scala genomica. Scienza. 1997, 278: 680-686. 10.1126/science.278.5338.680.

Herrgard MJ, Lee BS, Portnoy V, Palsson BO: l'analisi integrata delle reti regolatorie e metaboliche rivela nuovi meccanismi regolatori in Saccharomyces cerevisiae. Genoma Ris. 2006, 16: 627-635. 10.1101/gr.4083206.

Moxley JF, Jewett MC, Antoniewicz MR, Villas-Boas SG, Alper H, Wheeler RT, Tong L, Hinnebusch AG, Ideker T, Nielsen J, Stephanopoulos G: Collegamento di fenotipi di flusso metabolico ad alta risoluzione e regolazione trascrizionale nel lievito modulato dal regolatore globale Gcn4p. Proc Natl Acad Sci USA. 2009, 106: 6477-6482. 10.1073/pnas.0811091106.

Bradley PH, Brauer MJ, Rabinowitz JD, Troyanskaya OG: Cambiamenti coordinati di concentrazione di trascritti e metaboliti in Saccharomyces cerevisiae. PLoS Comput Biol. 2009, 5: e1000270-10.1371/journal.pcbi.1000270.

Monod J: La tecnica della cultura continua, teoria e applicazioni. Annls Inst Pasteur. 1950, 79: 390-410.

Gutteridge A, Pir P, Castrillo JI, Charles PD, Lilley KS, Oliver SG: Controllo dei nutrienti della crescita delle cellule degli eucarioti: uno studio di biologia dei sistemi nel lievito. BMC Biol. 2010, 8: 68-

Castrillo JI, Zeef LA, Hoyle DC, Zhang N, Hayes A, Gardner DC, Cornell MJ, Petty J, Hakes L, Wardleworth L, Rash B, Brown M, Dunn WB, Broadhurst D, O'Donoghue K, Hester SS, Dunkley TP, Hart SR, Swainston N, Li P, Gaskell SJ, Paton NW, Lilley KS, Kell DB, Oliver SG: Controllo della crescita della cellula eucariotica: uno studio di biologia dei sistemi nel lievito. J Biol. 2007, 6: 4-10.1186/jbiol54.

Boer VM, Crutchfield CA, Bradley PH, Botstein D, Rabinowitz JD: metaboliti intracellulari che limitano la crescita nel lievito che cresce sotto diverse limitazioni di nutrienti. Cella Mol Biol. 2010, 21: 198-211. 10.1091/mbc.E09-07-0597.

Kacser H, Burns JA: Le basi molecolari del dominio. Genetica. 1981, 97: 639-666.


Guarda il video: Le Colture Cellulari (Agosto 2022).