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Meccanismo di legame dei residui di aminoacidi basici al DNA

Meccanismo di legame dei residui di aminoacidi basici al DNA



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Capisco che molti domini di legame del DNA proteico si legano al DNA tramite residui basici come l'arginina e la lisina. Ma qual è il meccanismo utilizzato per legarsi al DNA e dove si legherebbero sul DNA questi residui?


Questa domanda non ha una risposta particolare. Esistono diverse famiglie di proteine ​​leganti il ​​DNA, alcune delle quali si legano in modo specifico (ad esempio enzimi di restrizione come EcoRI che si lega e taglia GAATTC o fattori di trascrizione come il repressore lac che lega un punto particolare del genoma di e coli lungo circa 25 paia di basi) e alcune di questi si legano in modo semi-specifico (es. zinc finger che legano regioni ricche di GC), altri in modo non specifico (es. il morsetto scorrevole del DNA).

Per tutte queste proteine, avranno la tendenza ad avere amminoacidi carichi positivamente di fronte al DNA perché lo scheletro fosfato del DNA è caricato negativamente. Ci sono molti motivi proteici (come il motivo elica-elica) che si inserisce nel solco maggiore o minore del DNA. La lisina e l'argenina sono importanti perché sono gli amminoacidi carichi positivamente. Anche l'istidina è carica positivamente, ma non è così lunga e flessibile e non sembra adattarsi così spesso o altrettanto bene.

http://en.wikipedia.org/wiki/DNA-binding_protein


Farei un commento se potessi, ma il nostro laboratorio ha lavorato con molti peptidi di polilisina per legare il DNA. Nella nostra esperienza, la lisina funziona meglio dell'arginina ed entrambe funzionano molto meglio dell'istidina. L'istidina ha un pka più basso, quindi tende ad essere meno caricata positivamente a pH fisiologico. Per quanto riguarda le proteine ​​che si legano a una specifica sequenza di DNA, la doppia elica ha due solchi, maggiore e minore. I "lati" delle coppie di basi sono accessibili attraverso i solchi e le proteine ​​probabilmente riconoscono schemi in quei solchi. Una coppia AT presenta una forma diversa rispetto a una coppia G-C e le porzioni proteiche che legano il DNA possono discriminare queste protuberanze e legarsi all'elica.


3 Chimica organica di base per la biologia

La chimica organica è una branca della chimica che studia la struttura, le proprietà e le reazioni dei composti organici, che contengono carbonio nel legame covalente. Lo studio della struttura ne determina la composizione chimica e la formula. Lo studio delle proprietà include le proprietà fisiche e chimiche e la valutazione della reattività chimica per comprenderne il comportamento. Lo studio delle reazioni organiche comprende la sintesi chimica di prodotti naturali, farmaci e polimeri e lo studio delle singole molecole organiche in laboratorio e tramite studio teorico (in silico).

I composti organici costituiscono la base di tutta la vita terrena e costituiscono la maggior parte delle sostanze chimiche conosciute. I modelli di legame del carbonio, con la sua valenza di quattro legami formali singoli, doppi e tripli, oltre a strutture con elettroni delocalizzati, rendono la gamma di composti organici strutturalmente diversificata e la loro gamma di applicazioni enorme. Costituiscono la base o sono costituenti di molti prodotti commerciali, tra cui prodotti farmaceutici, petrolchimici e agrochimici, e prodotti derivati ​​da essi, inclusi lubrificanti, solventi, materie plastiche, combustibili ed esplosivi. Lo studio della chimica organica si sovrappone alla chimica organometallica e alla biochimica, ma anche alla chimica medicinale, alla chimica dei polimeri e alla scienza dei materiali.

La gamma di sostanze chimiche studiate in chimica organica comprende idrocarburi (composti contenenti solo carbonio e idrogeno) nonché composti a base di carbonio, ma contenenti anche altri elementi, in particolare ossigeno, azoto, zolfo, fosforo (compreso in molti prodotti biochimici) e gli alogeni.

Prima del XIX secolo, i chimici generalmente ritenevano che i composti ottenuti da organismi viventi fossero dotati di una forza vitale che li distingueva dai composti inorganici. Secondo il concetto di vitalismo (teoria della forza vitale), la materia organica era dotata di una "forza vitale". Durante la prima metà del XIX secolo furono riportati alcuni dei primi studi sistematici sui composti organici. Intorno al 1816 Michel Chevreul iniziò uno studio sui saponi a base di vari grassi e alcali. Separava gli acidi che, in combinazione con l'alcali, producevano il sapone. Trattandosi di singoli composti, dimostrò che era possibile effettuare una trasformazione chimica in vari grassi (che tradizionalmente provengono da fonti organiche), producendo nuovi composti, senza “forza vitale”. Nel 1828 Friedrich Wöhler produsse l'urea chimica organica (carbammide), un costituente dell'urina, da materie prime inorganiche (i sali di cianato di potassio e solfato di ammonio), in quella che oggi viene chiamata sintesi di Wöhler. Sebbene lo stesso Wöhler fosse cauto nell'affermare di aver smentito il vitalismo, questa era la prima volta che una sostanza ritenuta organica veniva sintetizzata in laboratorio senza materiali di partenza biologici (organici). L'evento è ora generalmente accettato come una vera confutazione della dottrina del vitalismo.

Una svolta cruciale per la chimica organica fu il concetto di struttura chimica, sviluppato indipendentemente nel 1858 sia da Friedrich August Kekulé che da Archibald Scott Couper. Entrambi i ricercatori hanno suggerito che gli atomi di carbonio tetravalenti potrebbero collegarsi tra loro per formare un reticolo di carbonio e che i modelli dettagliati del legame atomico potrebbero essere individuati da abili interpretazioni di reazioni chimiche appropriate.

Le molecole organiche sono comunemente descritte da disegni o formule strutturali, combinazioni di disegni e simboli chimici. La formula linea-angolo è semplice e non ambigua. In questo sistema, i punti finali e le intersezioni di ciascuna linea rappresentano un carbonio e gli atomi di idrogeno possono essere annotati esplicitamente o presumere che siano presenti come implicato dal carbonio tetravalente.

Figura 3.1: Questo diagramma mostra 5 diverse rappresentazioni strutturali del composto organico butano. La struttura più a sinistra è un disegno della linea di legame in cui vengono rimossi gli atomi di idrogeno. La seconda struttura ha gli idrogeni aggiunti raffigurati: i legami scuri incuneati indicano che gli atomi di idrogeno stanno venendo verso il lettore, i legami tratteggiati indicano che gli atomi sono orientati lontano dal lettore e gli stagni solidi (semplici) indicano che i legami sono nel piano dello schermo/carta. La struttura centrale mostra i quattro atomi di carbonio. La quarta struttura è una rappresentazione che mostra solo gli atomi e i legami senza 3 dimensioni. La struttura più a destra è una rappresentazione della struttura condensata del butano.

L'era dell'industria farmaceutica iniziò nell'ultimo decennio del XIX secolo, quando la Bayer iniziò la produzione di acido acetilsalicilico, più comunemente indicato come aspirina, in Germania. Nel 1910 Paul Ehrlich e il suo gruppo di laboratorio iniziarono a sviluppare l'arsfenamina a base di arsenico (Salvarsan), come primo trattamento medicinale efficace della sifilide, e quindi iniziarono la pratica medica della chemioterapia. Ehrlich ha reso popolari i concetti di farmaci "proiettili magici" e di miglioramento sistematico delle terapie farmacologiche. Il suo laboratorio ha dato un contributo decisivo allo sviluppo dell'antisiero per la difterite e alla standardizzazione dei sieri terapeutici.

Nella prima parte del 20 ° secolo, polimeri ed enzimi hanno dimostrato di essere grandi molecole organiche e il petrolio è stato dimostrato di essere di origine biologica.

La maggior parte dei composti chimici presenti negli organismi biologici sono composti di carbonio, quindi l'associazione tra chimica organica e biochimica è così stretta che la biochimica potrebbe essere considerata essenzialmente come una branca della chimica organica. Sebbene la storia della biochimica possa durare circa quattro secoli, la comprensione fondamentale del campo iniziò a svilupparsi solo alla fine del XIX secolo e il termine vero e proprio biochimica fu coniato all'inizio del XX secolo.


Fasi coinvolte nel meccanismo di sintesi proteica | Genetica | Biologia

Il meccanismo della sintesi proteica è stato studiato a fondo in E.coli. Il processo di sintesi proteica sui ribosomi 70S è descritto in dettaglio di seguito. Il riassunto delle varie fasi del meccanismo di sintesi proteica è mostrato in (Fig. 13).

Passaggio 1 — Trascrizione:

Un filamento della molecola di DNA funge da stampo per la formazione dell'mRNA. Questo mRNA contiene il messaggio per la sintesi della proteina. Non appena l'mRNA si forma, lascia il nucleo e raggiunge il citoplasma dove si attacca con la subunità 30S dei ribosomi.

Fase 2 — Collegamento dell'mRNA alla subunità 30S dei ribosomi:

Nelle cellule procariotiche, i ribosomi si trovano in uno stato dissociato e inattivo. L'mRNA si lega alla subunità 30S. Sequenze specifiche di 16 S rRNA della piccola subunità del ribosoma si legano alla sequenza complementare di mRNA. Il primo amminoacido, che di solito è N formil metionina-tRNA (F-met tRNA), si lega all'mRNA per formare il complesso di iniziazione.

Questo processo è aiutato da GTP e da tre fattori proteici (fattori IF1, IF2 e IF3). Il ribosoma è progettato in modo univoco per riunire mRNA e tRNA. L'mRNA è infilato attraverso il piccolo tunnel della subunità, mentre la grande e la subunità si uniscono per formare tasche di legame del tRNA. Dopo la formazione del complesso di inizio, la subunità 50S si unisce alla subunità più piccola per formare il ribosoma 70S.

Passaggio 3 — Trasferimento di amminoacidi al sito di sintesi proteica:

Durante questa fase, gli amminoacidi vengono trasportati dal pool di amminoacidi ai ribosomi. Ma gli amminoacidi si trovano nel citoplasma in uno stato inattivo. Ogni amminoacido è attivato da uno specifico enzima attivante noto come amminoacil sintetasi e ATP.

La cellula ha almeno 20 enzimi aminoacil sintetasi per i 20 aminoacidi. Ogni enzima è specifico e attiva l'amminoacido corretto. L'enzima viene riconosciuto dal sito enzimatico del tRNA e il residuo amminoacidico viene trasferito al sito di attacco dell'amminoacido del tRNA. L'amminoacido è legato al 3-OH all'estremità -CCA del tRNA. Di conseguenza, l'AMP e l'enzima vengono rilasciati e si forma il prodotto finale amminoacil-tRNA. Questo si sposta verso il sito della sintesi proteica.

Fase 4 — Inizio della sintesi proteica:

L'iniziazione comporta la formazione del complesso 70S ed è aiutata da fattori di iniziazione.

L'mRNA di solito ha AUG come primo codone. Codici AUG per la metionina. La metionina è formulata e svolge un ruolo importante nell'avviare il processo di sintesi proteica. Dopo che la sintesi proteica è completata, la formil metionina viene staccata dall'attività dell'enzima idrolitico.

La funzione della formil metionina è di assicurare che la sintesi proteica progredisca in una direzione specifica. Questo perché, nella formil metionina, l'NH2 viene bloccato dal gruppo formile lasciando che l'estremità -COOH reagisca con l' -NH2 gruppo del secondo amminoacido.

Il processo di iniziazione differisce significativamente nei procarioti e negli eucarioti. Tre fattori di iniziazione sono coinvolti nei procarioti – IF1, IF2 e IF3. L'iniziazione negli eucarioti è più complessa e richiede 8 fattori di iniziazione. (Tabella 8). Il primo amminoacido è la metionina negli eucarioti.

Passaggio 5 — Allungamento della catena polipeptidica:

Durante l'allungamento, gli amminoacidi sono collegati tra loro. Il processo di allungamento richiede fattori di allungamento, EF-Tu, Ef-G e EF-Ts. Un tRNA carico con l'anticodone complementare al codone dell'mRNA viene portato nel sito A del ribosoma. La formazione di peptidi avviene tra gli amminoacidi nel sito P e il sito A in presenza dell'enzima peptidil transferasi.

La reazione della peptidil transferasi trasferisce l'amminoacido, dal sito P all'aminoacil-tRNA nel sito A. Il secondo tRNA ora trasporta un dipeptide e il primo tRNA è senza amminoacido.

Il prossimo passo dell'allungamento è il movimento dei ribosomi di un codone lungo l'mRNA. Questo si chiama traslocazione. L'enzima coinvolto in questa reazione è la traslocasi. La traslocazione richiede energia, che è fornita dall'idrolisi del GTP. Quando si verifica la traslocazione, il tRNA con il dipeptide si trasloca nel sito P e un nuovo codone è disponibile nel sito A. Il primo tRNA si sposta ora nel sito ‘E’. Questo tRNA viene "espulso" dall'azione della transferasi, che è anche responsabile del ribaltamento della formil-metionina nel tRNA presente ora nel sito P.

In breve, l'intero processo prevede l'arrivo del complesso tRNA-amminoacido, la formazione e la traslocazione del legame peptidico. Mentre i ribosomi si spostano sull'mRNA nella direzione 5′ → 3′, tutti i codoni sono esposti nel sito A uno dopo l'altro e c'è una successiva crescita della catena polipeptidica.

Pertanto, il linguaggio del DNA viene trascritto nel linguaggio dell'mRNA che viene successivamente tradotto nel linguaggio dei polipeptidi. Il polipeptide appena sintetizzato è noto come polipeptide nascente. La sequenza di eventi in allungamento avviene molto rapidamente e in condizioni ottimali si può produrre una catena polipeptidica di 40 amminoacidi in 20 secondi.

Fase — 6 Terminazione e rilascio della catena polipeptidica:

Alla fine della catena dell'mRNA c'è un codone di arresto o terminatore. Ci sono tre codoni terminatore: UAA, UGA e UAG.

Quando la regione di elaborazione delle informazioni incontra un codone terminatore, segnala l'arresto della sintesi proteica. Un fattore di rilascio si unisce al codone di stop e questo aiuta l'idrolisi della catena polipeptidica completata dal sito P. Il ribosoma si separa dalla catena dell'mRNA e il ribosoma si dissocia in due subunità.

Passaggio — 7 Modifica del polipeptide rilasciato:

Il polipeptide rilasciato è nella sua forma primaria. Subisce avvolgimento e acquisisce una struttura secondaria e terziaria. Può combinarsi con altri polipeptidi per assumere una struttura quaternaria. Le proteine ​​conosciute come chaperon aiutano nel ripiegamento delle proteine ​​per diventare funzionali.

Le proteine ​​sintetizzate sui ribosomi liberi vengono rilasciate nel citoplasma e funzionano come proteine ​​strutturali ed enzimatiche. Le proteine ​​formate sui ribosomi attaccati, passano attraverso il tunnel nei canali di ER e vengono esportate come secrezioni cellulari per esocitosi dopo il confezionamento nell'apparato di Golgi.

L'mRNA e il ribosoma sono riutilizzabili. A volte molti ribosomi leggono una molecola di mRNA alla volta. Formano polisomi o poliribosomi producendo molti polipeptidi identici. I polipeptidi quando rilasciati formano proteine ​​che possono assumere una struttura secondaria, terziaria o quaternaria. La sequenza di DNA che codifica per una catena polipeptidica è chiamata cistron o gene.


L'attività catalitica degli enzimi

Come tutti gli altri catalizzatori, gli enzimi sono caratterizzati da due proprietà fondamentali. In primo luogo, aumentano la velocità delle reazioni chimiche senza essere consumati o alterati in modo permanente dalla reazione. In secondo luogo, aumentano le velocità di reazione senza alterare l'equilibrio chimico tra reagenti e prodotti.

Questi principi di catalisi enzimatica sono illustrati nel seguente esempio, in cui una molecola ha agito da un enzima (indicato come substrato [S]) viene convertito in a Prodotto (P) come risultato della reazione. In assenza dell'enzima, la reazione può essere scritta come segue:

L'equilibrio chimico tra S e P è determinato dalle leggi della termodinamica (come discusso ulteriormente nella sezione successiva di questo capitolo) ed è rappresentato dal rapporto tra le velocità di reazione diretta e inversa (SP e PS, rispettivamente). In presenza dell'enzima appropriato, la conversione di S a P è accelerato, ma l'equilibrio tra S e P è inalterato. Pertanto, l'enzima deve accelerare allo stesso modo sia la reazione diretta che quella inversa. La reazione può essere scritta come segue:

Si noti che l'enzima (E) non viene alterato dalla reazione, quindi l'equilibrio chimico rimane invariato, determinato unicamente dalle proprietà termodinamiche di S e P.

L'effetto dell'enzima su tale reazione è meglio illustrato dai cambiamenti di energia che devono verificarsi durante la conversione di S a P (Figura 2.22). L'equilibrio della reazione è determinato dagli stati energetici finali di S e P, che non sono influenzati dalla catalisi enzimatica. Affinché la reazione possa procedere, tuttavia, il substrato deve prima essere convertito in uno stato energetico più elevato, chiamato stato di transizione. L'energia necessaria per raggiungere lo stato di transizione (l'energia di attivazione) costituisce una barriera all'andamento della reazione, limitando la velocità della reazione. Gli enzimi (e altri catalizzatori) agiscono riducendo l'energia di attivazione, aumentando così la velocità di reazione. La velocità aumentata è la stessa in entrambe le direzioni avanti e indietro, poiché entrambe devono passare attraverso lo stesso stato di transizione.

Figura 2.22

Diagrammi energetici per reazioni catalizzate e non catalizzate. La reazione illustrata è la semplice conversione di un substrato S a un prodotto P. Perché lo stato energetico finale di P è inferiore a quello di S, la reazione procede da sinistra a destra. Per il (più.)

L'attività catalitica degli enzimi comporta il legame dei loro substrati per formare un complesso enzima-substrato (ES). Il substrato si lega a una regione specifica dell'enzima, chiamata sito attivo. Mentre è legato al sito attivo, il substrato viene convertito nel prodotto della reazione, che viene quindi rilasciato dall'enzima. La reazione catalizzata dall'enzima può quindi essere scritta come segue:

Notare che E appare inalterato su entrambi i lati dell'equazione, quindi l'equilibrio non è influenzato. Tuttavia, l'enzima fornisce una superficie sulla quale le reazioni si convertono S a P può verificarsi più facilmente. Questo è il risultato di interazioni tra l'enzima e il substrato che abbassano l'energia di attivazione e favoriscono la formazione dello stato di transizione.


Discussione

ELYS svolge un ruolo chiave nell'assemblaggio NPC post-mitotico mediato dai nucleosomi 16,17,18. Infatti, ELYS secondo come riferito si lega al nucleosoma in vitro e co-purificato con gli istoni in vivo 23,24. Tuttavia, il meccanismo del legame ELYS-nucleosoma non è stato ancora chiarito. Nel presente studio, abbiamo ricostruito la struttura dell'ELYSC–complesso nucleosoma con il metodo cryo-EM (Figg. 3 e 4). La struttura crio-EM, combinata con la spettrometria di massa reticolata, ha dimostrato che la regione ELYS C-terminale, incluso lo stiramento RRK, è importante per il legame al patch acido sulla superficie del nucleosoma (Figg. 3-5). Coerentemente, le analisi biochimiche hanno rivelato che i residui di Arg e Lys nell'allungamento di ELYS RRK funzionano nel legame del nucleosoma (Figg. 1 e 2).

Il tratto RRK contenente residui di Arg-Arg-Lys è altamente conservato tra gli ortologhi ELYS (Fig. 2a). Tuttavia, l'importanza funzionale di questi residui non è stata chiarita. Qui abbiamo scoperto che l'allungamento RRK funziona nel legame con il cerotto acido nucleosomiale.Il cerotto acido comprende i residui di amminoacidi acidi H2A e H2B, che sono esposti su entrambi i lati della superficie del nucleosoma (Fig. 4). Le macchie acide del nucleosoma forniscono siti di legame per fattori associati alla cromatina, come RCC1, Sir3, PRC1, CENP-C e LANA 29,30,31,32,33. In queste proteine, la catena laterale dell'arginina si lega specificamente al patch acido sul nucleosoma ed è indicata come ancoraggio dell'arginina 27 . Nell'ELYSC–complesso nucleosoma, i residui di arginina nel tratto RRK di ELYSC può anche funzionare come un'ancora di arginina. Le nostre analisi mutazionali hanno mostrato che tutti e tre i residui di base, ma non ogni residuo, nel tratto RRK sono necessari per il legame del nucleosoma (Fig. 2). Pertanto, il meccanismo di legame di ELYSC alla chiazza acida del nucleosoma può essere leggermente diverso da quello del motivo dell'ancora di arginina convenzionale. In alternativa, uno dei due residui di arginina nel tratto RRK può funzionare in modo ridondante come ancora di arginina.

Coerentemente con i risultati precedenti, le nostre analisi biochimiche hanno rivelato che la regione AT-hook funziona anche nel legame del nucleosoma (Fig. 1). È importante sottolineare che le nostre analisi mutazionali hanno dimostrato che il contributo dell'allungamento RRK può essere superiore a quello della regione AT-hook nel legame del nucleosoma (Fig. 1). Nell'ELYSC–struttura complessa del nucleosoma, la regione AT-hook non era visibile, a causa della sua natura flessibile. La regione AT-hook di ELYS riferito si lega al DNA 22,23. Secondo quanto riferito, i motivi AT-hook di altre proteine ​​preferiscono legarsi a regioni ricche di AT contenenti DNA 22 . Pertanto, il legame al DNA della regione AT-hook può supportare il legame del nucleosoma ELYS, che è principalmente mediato dal legame del tratto RRK al cerotto acido.

Le analisi in vitro hanno rivelato che l'importina e la transportina si legano direttamente alla regione C-terminale di ELYS (2359–2408) ma non alla regione AT-hook34. L'importina β e la regione di legame di trasporto di ELYS contiene il tratto RRK. Pertanto, il legame ELYS-nucleosoma può competere con l'importina e il legame con la trasportina e può inibire il reclutamento di ELYS nella cromatina 34,35. Quindi il rilascio di ELYS da importina e transportina può essere un prerequisito per l'assemblaggio NPC 34,35. Secondo quanto riferito, RanGTP indebolisce le interazioni ELYS-importina ed ELYS-transportina 34,35. Pertanto, il rilascio di ELYS mediato da RanGTP dall'importina e dalla transportina può essere importante per l'associazione ELYS-cromatina, che è il passaggio principale per l'assemblaggio di NPC nella fase post-mitotica.


Astratto

Lo sviluppo di metodologie di rilevamento point-of-care per analiti biologicamente rilevanti che possono facilitare un trattamento rapido e appropriato è in prima linea negli attuali sforzi e interessi di ricerca. Tra i vari approcci, di particolare interesse sono quelli che sfruttano le chimiche host-guest in cui i segnali optoelettronici del sensore chimico possono essere modulati in seguito all'interazione con l'analita target. Nell'aiutare il loro sviluppo razionale, è fondamentale una selezione giudiziosa di gruppi funzionali periferici ancorati a motivi centrali con proprietà desiderate. Qui riportiamo un'indagine approfondita sul legame di tre sostanze psicoattive, MDAI, mexedrone e phenibut, ai recettori dei trasportatori delle monoamine per la dopamina, la noradrenalina e la serotonina, concentrandosi in particolare sul ruolo dei singoli residui di aminoacidi. Abbiamo prima valutato la flessibilità conformazionale dei ligandi confrontando le loro geometrie della struttura cristallina determinate sperimentalmente con quelle ottimizzate mediante meccanica quantistica e molecolare, osservando cambiamenti significativi nel caso del phenibut. Sono stati impiegati studi di docking molecolare per identificare i siti di legame preferenziali mediante punteggi di docking calcolati. In tutti i casi, indipendentemente dal trasportatore delle monoamine, le sostanze psicoattive hanno mostrato un'interazione preferita con S1 o sito centrale delle proteine, in linea con studi precedenti. Tuttavia, abbiamo osservato che le tendenze sperimentali per la loro potenza relativa sui tre trasportatori sono state riprodotte solo nel caso del mexedrone. Successivamente, per comprendere ulteriormente questi risultati e aprire la strada allo sviluppo razionale di sensori chimici superiori per queste sostanze, abbiamo calcolato i contributi individuali di ciascun residuo di amminoacido più vicino al legame con gli analiti target. È interessante notare che questi risultati sono ora in accordo con quelle tendenze di potenza sperimentale. Inoltre, queste osservazioni erano in tutti i casi associate a interazioni intermolecolari chiave con residui vicini, come tirosina e acido aspartico, nel legame dei ligandi al trasportatore della monoammina per la dopamina. Di conseguenza, riteniamo che questo lavoro sarà di interesse per coloro impegnati nello sviluppo razionale di sensori chimici per analiti di piccole molecole, nonché per coloro interessati all'uso di approcci computazionali per comprendere ulteriormente le interazioni proteina-ligando.


Meccanismo di legame dei residui di aminoacidi basici al DNA - Biologia

proteine sono una delle molecole organiche più abbondanti nei sistemi viventi e hanno la gamma di funzioni più diversificata di tutte le macromolecole. Le proteine ​​possono essere strutturali, regolatorie, contrattili o protettive, possono servire nel trasporto, nello stoccaggio o nelle membrane oppure possono essere tossine o enzimi. Ogni cellula di un sistema vivente può contenere migliaia di proteine, ognuna con una funzione unica. Le loro strutture, come le loro funzioni, variano notevolmente. Sono tutti, però, polimeri di aminoacidi, disposti in una sequenza lineare.

Figura 1. Gli amminoacidi hanno un carbonio asimmetrico centrale a cui sono attaccati un gruppo amminico, un gruppo carbossilico, un atomo di idrogeno e una catena laterale (gruppo R).

Aminoacidi sono i monomeri che compongono le proteine. Ogni amminoacido ha la stessa struttura fondamentale, che consiste in un atomo di carbonio centrale, noto anche come alfa (α) carbonio, legato a un gruppo amminico (NH2), un gruppo carbossilico (COOH) e un atomo di idrogeno. Ogni amminoacido ha anche un altro atomo o gruppo di atomi legato all'atomo centrale noto come gruppo R (Figura 1).

Il nome “amino acid” deriva dal fatto che contengono sia il gruppo amminico che il gruppo carbossilico nella loro struttura di base. Come accennato, ci sono 20 amminoacidi presenti nelle proteine. Nove di questi sono considerati amminoacidi essenziali nell'uomo perché il corpo umano non può produrli e sono ottenuti dalla dieta.

Per ogni amminoacido, il gruppo R (o catena laterale) è diverso (Figura 2).

Domanda pratica

Figura 2. Ci sono 20 amminoacidi comuni che si trovano comunemente nelle proteine, ognuno con un diverso gruppo R (gruppo variante) che ne determina la natura chimica.

Quali categorie di amminoacidi ti aspetteresti di trovare sulla superficie di una proteina solubile e quali ti aspetteresti di trovare all'interno? Quale distribuzione di amminoacidi ti aspetteresti di trovare in una proteina incorporata in un doppio strato lipidico?

La natura chimica della catena laterale determina la natura dell'amminoacido (cioè se è acido, basico, polare o non polare). Ad esempio, l'amminoacido glicina ha un atomo di idrogeno come gruppo R. Gli amminoacidi come la valina, la metionina e l'alanina sono di natura non polare o idrofobica, mentre gli amminoacidi come la serina, la treonina e la cisteina sono polari e hanno catene laterali idrofile. Le catene laterali di lisina e arginina sono cariche positivamente, e quindi questi amminoacidi sono anche conosciuti come amminoacidi basici. La prolina ha un gruppo R che è legato al gruppo amminico, formando una struttura ad anello. La prolina è un'eccezione alla struttura standard di un amminoacido poiché il suo gruppo amminico non è separato dalla catena laterale (Figura 2).

Gli amminoacidi sono rappresentati da una singola lettera maiuscola o da un'abbreviazione di tre lettere. Ad esempio, la valina è conosciuta con la lettera V o il simbolo di tre lettere val. Proprio come alcuni acidi grassi sono essenziali per una dieta, sono necessari anche alcuni aminoacidi. Sono conosciuti come aminoacidi essenziali e nell'uomo includono isoleucina, leucina e cisteina. Gli amminoacidi essenziali si riferiscono a quelli necessari per la costruzione delle proteine ​​nel corpo, sebbene non prodotti dall'organismo quali amminoacidi essenziali varia da organismo a organismo.

Figura 3. La formazione del legame peptidico è una reazione di sintesi di disidratazione. Il gruppo carbossilico di un amminoacido è legato al gruppo amminico dell'amminoacido in entrata. Nel processo, viene rilasciata una molecola d'acqua.

La sequenza e il numero di amminoacidi determinano in definitiva la forma, le dimensioni e la funzione della proteina. Ogni amminoacido è attaccato ad un altro amminoacido da un legame covalente, noto come legame peptidico, che si forma per reazione di disidratazione. Il gruppo carbossilico di un amminoacido e il gruppo amminico dell'aminoacido in entrata si combinano, rilasciando una molecola di acqua. Il legame risultante è il legame peptidico (Figura 3).

I prodotti formati da tali legami sono chiamati peptidi. Man mano che più amminoacidi si uniscono a questa catena in crescita, la catena risultante è nota come polipeptide. Ogni polipeptide ha un gruppo amminico libero a un'estremità. Questa estremità è chiamata terminale N, o terminale amminico, e l'altra estremità ha un gruppo carbossilico libero, noto anche come terminale C o carbossilico. Mentre i termini polipeptide e proteina sono talvolta usati in modo intercambiabile, un polipeptide è tecnicamente un polimero di amminoacidi, mentre il termine proteina è usato per un polipeptide o polipeptidi che si sono combinati insieme, spesso hanno gruppi prostetici non peptidici legati, hanno una forma distinta e hanno una funzione unica. Dopo la sintesi proteica (traduzione), la maggior parte delle proteine ​​viene modificata. Queste sono note come modifiche post-traduzionali. Possono subire scissione, fosforilazione o possono richiedere l'aggiunta di altri gruppi chimici. Solo dopo queste modifiche la proteina è completamente funzionante.

Il significato evolutivo del citocromo c

Il citocromo c è un componente importante della catena di trasporto degli elettroni, una parte della respirazione cellulare, e si trova normalmente nell'organello cellulare, il mitocondrio. Questa proteina ha un gruppo prostetico eme e lo ione centrale dell'eme viene alternativamente ridotto e ossidato durante il trasferimento di elettroni. Poiché il ruolo di questa proteina essenziale nella produzione di energia cellulare è cruciale, è cambiato molto poco nel corso di milioni di anni. Il sequenziamento delle proteine ​​ha dimostrato che esiste una notevole quantità di omologia della sequenza di amminoacidi del citocromo c tra specie diverse, in altre parole, la parentela evolutiva può essere valutata misurando le somiglianze o le differenze tra le sequenze di DNA o proteine ​​di varie specie.

Gli scienziati hanno determinato che il citocromo c umano contiene 104 amminoacidi. Per ogni molecola di citocromo c di diversi organismi che è stata sequenziata fino ad oggi, 37 di questi amminoacidi appaiono nella stessa posizione in tutti i campioni di citocromo c. Ciò indica che potrebbe esserci stato un antenato comune. Confrontando le sequenze proteiche umane e di scimpanzé, non è stata trovata alcuna differenza di sequenza. Quando le sequenze umane e di scimmia rhesus sono state confrontate, l'unica differenza trovata era in un amminoacido. In un altro confronto, il sequenziamento da uomo a lievito mostra una differenza nella 44a posizione.


Tutti i codici Science Journal Classification (ASJC)

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In: Virologia, vol. 318, n. 1, 05.01.2004, pag. 204-213.

Risultati della ricerca : Contributo alla rivista › Articolo › peer-review

T1 - Analisi genetiche e funzionali della proteina legante il DNA øx174

T2 - Gli effetti delle sostituzioni dei residui amminoacidici che organizzano spazialmente i due domini di legame al DNA

N1 - Informazioni sul finanziamento: questa ricerca è stata supportata da una sovvenzione NSF (MCB0234976) a B.A. Fane.

N2 - La proteina di legame al DNA øX174 contiene due domini di legame al DNA, contenenti una serie di amminoacidi basici che legano il DNA, separati da una regione di collegamento ricca di prolina. All'interno di ciascun dominio di legame al DNA, c'è un residuo di glicina conservato. I residui di glicina e prolina sono stati mutati e sono stati esaminati gli effetti sulla struttura del virione. Le sostituzioni per i residui di glicina producono particelle con proprietà simili ai mutanti precedentemente caratterizzati con sostituzioni per i residui di legame al DNA. Entrambi i gruppi di mutazioni condividono un soppressore extragenico del secondo sito comune, suggerendo che i difetti causati dalle proteine ​​mutanti sono meccanicamente simili. Quindi, i residui di glicina possono ottimizzare i contatti DNA-proteina. I difetti conferiti dalle sostituzioni dei residui di prolina appaiono fondamentalmente diversi. Le proprietà delle particelle mutanti insieme alla struttura atomica del virione suggeriscono che i residui di prolina possono agire per guidare il DNA impacchettato verso l'unità asimmetrica quintuplice adiacente, prevenendo così una disposizione caotica dell'imballaggio.

AB - La proteina di legame al DNA øX174 contiene due domini di legame al DNA, contenenti una serie di amminoacidi basici che legano il DNA, separati da una regione di collegamento ricca di prolina. All'interno di ciascun dominio di legame al DNA, c'è un residuo di glicina conservato. I residui di glicina e prolina sono stati mutati e sono stati esaminati gli effetti sulla struttura del virione. Le sostituzioni per i residui di glicina producono particelle con proprietà simili a mutanti precedentemente caratterizzati con sostituzioni per residui di legame al DNA. Entrambi i gruppi di mutazioni condividono un soppressore extragenico del secondo sito comune, suggerendo che i difetti causati dalle proteine ​​mutanti sono meccanicamente simili. Quindi, i residui di glicina possono ottimizzare i contatti DNA-proteina. I difetti conferiti dalle sostituzioni dei residui di prolina appaiono fondamentalmente diversi. Le proprietà delle particelle mutanti insieme alla struttura atomica del virione suggeriscono che i residui di prolina possono agire per guidare il DNA impacchettato verso l'unità asimmetrica quintuplice adiacente, prevenendo così una disposizione caotica dell'imballaggio.


CH450 e CH451: Biochimica - Definizione della vita a livello molecolare

7.1 Revisione del concetto per le reazioni enzimatiche

Definizione di un enzima

Scissione del legame omolitico vs eterolitico

Nucleofili ed elettrofili

Spinta di elettroni

Costanti di dissociazione acida, pKa

Classificazioni degli enzimi primari

7.2 Panoramica dei meccanismi catalitici

Catalisi covalente

Catalisi acido-base

Catalisi elettrostatica

Desolvazione

Catalisi per approssimazione

Catalisi del coenzima

Deformazione distorsione

7.3 Esempi di meccanismi di reazione

Enzimi proteasi

Chinasi NMP

Endonucleasi di restrizione

Enzimi di RNA – Ribozimi

7.4 Riferimenti

7.1 Revisione del concetto per le reazioni enzimatiche

In questa sezione esamineremo alcuni fondamenti della chimica organica e biologica che sono utili per comprendere i meccanismi di reazione enzimatica.

Definizione di un enzima

Ricordiamo dal Capitolo 6, che gli enzimi sono catalizzatori biologici che riducono l'energia di attivazione necessaria affinché una reazione proceda nella direzione in avanti (Figura 7.1). Facilitano la formazione delle specie di stato di transizione all'interno della reazione e accelerano la velocità della reazione di un milione di volte rispetto alle reazioni non catalizzate. Si noti che gli enzimi NON alterano il G della reazione e NON hanno alcun effetto sulla spontaneità o sulla posizione di equilibrio della reazione. Anche gli enzimi, come altri catalizzatori, non vengono utilizzati durante la reazione. Gli enzimi hanno un'elevata specificità di substrato e possono persino mostrare una regiospecificità che porta alla generazione di prodotti stereospecifici.

Figura 7.1 Effetto di un enzima sulla riduzione dell'energia di attivazione richiesta per avviare una reazione dove (a) è non catalizzata e (b) è una reazione catalizzata da un enzima.

Scissione del legame omolitico vs eterolitico

scollatura del legame, o scissione, è la scissione dei legami chimici. Questo può essere generalmente indicato come dissociazione quando una molecola viene scissa in due o più frammenti. In generale, ci sono due classificazioni per la scissione dei legami: omoliticoe eterolitico, a seconda della natura del processo (Figura 7.2).

In scissione eterolitica, oeterolisi, il legame si rompe in modo tale che la coppia di elettroni originariamente condivisa rimanga con uno dei frammenti. Quindi, un frammento guadagna un elettrone, avendo entrambi gli elettroni di legame, mentre l'altro frammento perde un elettrone. [4] Questo processo è noto anche come fissione ionica.

In scissione omolitica, oomolisi, i due elettroni in un legame covalente scisso sono divisi equamente tra i prodotti. Questo processo è anche noto come fissione omolitica o fissione radicale.

Figura 7.2 Esempi di scissione del legame eterolitico e omolitico. Nella scissione eterolitica entrambi gli elettroni condivisi sono trattenuti da uno degli atomi del legame condiviso, mentre nella scissione omolitica un elettrone viene trattenuto da ciascun atomo di un legame condiviso formando intermedi radicali.

Nucleofili ed elettrofili

UN nucleofilo è un atomo o un gruppo funzionale con una coppia di elettroni (di solito una coppia di non legame o solitaria) che può essere condivisa. Lo stesso, però, si può dire di una base: infatti, le basi possono agire da nucleofili, ei nucleofili possono agire da basi. Qual è, allora, la differenza tra una base e un nucleofilo?

Una base di Brønsted-Lowry utilizza una coppia solitaria di elettroni per formare un nuovo legame con un protone acido. Ricorda che quando valutiamo la basicità – la forza di una base – parliamo in termini di termodinamica: dove risiede l'equilibrio in una reazione acido-base di riferimento?

Figura 7.3 Basi di Brønsted-Lowry. Il diagramma superiore e il diagramma inferiore mostrano le posizioni di equilibrio delle basi forti e deboli, rispettivamente.

UN nucleofilo condivide la sua coppia solitaria di elettroni con an elettrofilo – un atomo povero di elettroni diverso da un idrogeno, di solito un carbonio. Quando valutiamo la nucleofilia, pensiamo in termini di cinetica: quanto velocemente reagisce il nucleofilo con un elettrofilo di riferimento?

Figura 7.4 Nucleofili. I diagrammi superiore e inferiore mostrano rispettivamente nucleofili a reazione più rapida e a reazione più lenta.

Sia nella chimica organica di laboratorio che in quella biologica, gli atomi nucleofili più comuni sono ossigeno, azoto e zolfo, mentre i composti nucleofili e i gruppi funzionali più comuni sono ioni acqua/idrossido, alcoli, fenoli, ammine, tioli e talvolta carbossilati.

In determinate circostanze gli atomi di carbonio possono anche agire come nucleofili. Ad esempio, gli ioni enolato sono comuni nucleofili carbonio nelle reazioni biochimiche, mentre lo ione cianuro ( C N − ) è un esempio di nucleofilo carbonio comunemente usato in laboratorio (Figura 7.5).

Figura 7.5 Il carbonio può agire da nucleofilo in determinate circostanze.

Molte delle funzioni enzimatiche svolte nei sistemi viventi utilizzano le proteine ​​come catalizzatore. Tuttavia, alcune reazioni enzimatiche possono essere mediate da altre macromolecole come l'RNA e verranno discusse più dettagliatamente alla fine di questo capitolo. All'interno delle strutture proteiche, molti dei gruppi R di aminoacidi possono fungere da nucleofili e si trovano spesso nel sito attivo degli enzimi.Questi includono: cisteina, serina, treonina, tirosina, acido glutammico, acido aspartico, lisina, arginina e istidina (Figura 7.6).

Figura 7.6 Gruppi R di amminoacidi che comunemente agiscono come nucleofili. Gli amminoacidi reattivi, che possono fungere da nucleofili, si trovano spesso nel sito attivo degli enzimi e partecipano al meccanismo di reazione.

Spinta di elettroni

Freccia che spinge o spinta di elettroni è una tecnica utilizzata per descrivere la progressione dei meccanismi di reazione della chimica organica. È stato sviluppato per la prima volta da Sir Robert Robinson. Nell'usare la spinta della freccia, “frecce curve” o “frecce ricci” sono sovrapposte alle formule di struttura dei reagenti in un'equazione chimica per mostrare il meccanismo di reazione. Le frecce illustrano il movimento degli elettroni quando i legami tra gli atomi vengono rotti e formati. La spinta della freccia è anche usata per descrivere come le cariche positive e negative sono distribuite attorno alle molecole organiche attraverso la risonanza. È importante ricordare, tuttavia, che spingere la freccia è un formalismo e gli elettroni (o meglio, la densità elettronica) non si muovono in modo così ordinato e discreto nella realtà.

I chimici organici usano due tipi di frecce all'interno delle strutture molecolari per descrivere i movimenti degli elettroni. Le traiettorie di singoli elettroni’ sono indicate con frecce a punta singola, mentre le frecce a doppia punta mostrano il movimento delle coppie di elettroni (Figura 7.7).

Figura 7.7 Traiettoria di coppie di elettroni (diagramma superiore) e traiettoria di movimento di un singolo elettrone (diagramma inferiore).

Quando un legame viene rotto, gli elettroni lasciano il punto in cui si trovava il legame, questo è rappresentato da una freccia curva che punta lontano dal legame e da una freccia che termina verso il successivo orbitale molecolare non occupato. Allo stesso modo, i chimici organici rappresentano la formazione di un legame da una freccia curva che punta tra due specie.

Per chiarezza, quando si spingono le frecce, è meglio disegnare le frecce partendo da una coppia solitaria di elettroni o da un legame o π e terminando in una posizione che possa accettare una coppia di elettroni, consentendo al lettore di sapere esattamente quali elettroni si stanno muovendo e dove stanno finendo.

Costanti di dissociazione acida, Ka e pKa

La definizione di Brønsted-Lowry di un acido è qualsiasi specie che può donare un protone, mentre una base è qualsiasi specie che può accettare un protone. La forza di un acido è misurata in termini del suo potenziale di dissociarsi all'interno di una soluzione ed è caratterizzata da uno specifico costante di dissociazione acida, Kun, (conosciuto anche come costante di acidità, o costante di ionizzazione acida). Il Ka è una misura quantitativa della forza di un acido in soluzione ed è la costante di equilibrio per una reazione chimica

nota come dissociazione nel contesto delle reazioni acido-base. La specie chimica HA è un acido che si dissocia in A − , la base coniugata dell'acido e uno ione idrogeno, H + . Si dice che il sistema è in equilibrio quando le concentrazioni dei suoi componenti non cambiano con il passare del tempo, perché entrambe le reazioni avanti e indietro si verificano alla stessa velocità.

La costante di dissociazione è definita da

dove le quantità tra parentesi quadre rappresentano le concentrazioni della specie all'equilibrio.

La costante di dissociazione acida è una conseguenza diretta della termodinamica sottostante alla reazione di dissociazione. il p Kun il valore è direttamente proporzionale alla variazione di energia libera di Gibbs standard per la reazione. Il valore del pKun cambia con la temperatura e può essere inteso qualitativamente in base al principio di Le Châtelier, come segue: quando la reazione è endotermica, Kun aumenta e p Kun diminuisce con l'aumentare della temperatura è vero il contrario per le reazioni esotermiche. Il valore di pKun dipende anche dalla struttura molecolare dell'acido.

Il comportamento quantitativo di acidi e basi in soluzione può essere compreso solo se il loro pKun i valori sono noti. In particolare, il pH di una soluzione può essere previsto quando la concentrazione analitica e pKun sono noti i valori di tutti gli acidi e le basi viceversa, è possibile calcolare la concentrazione di equilibrio degli acidi e delle basi in soluzione quando è noto il pH. Questi calcoli trovano applicazione in molte aree diverse della chimica, della biologia, della medicina e della geologia. Ad esempio, molti composti utilizzati per i farmaci sono acidi o basi deboli e una conoscenza del pKun valori, insieme al coefficiente di partizione acqua-ottanolo, possono essere utilizzati per stimare la misura in cui il composto entra nel flusso sanguigno. Negli organismi viventi, l'omeostasi acido-base e la cinetica enzimatica dipendono dalla pKun valori dei molti acidi e basi presenti nella cellula e nel corpo.

Classificazioni degli enzimi primari

Ricordiamo dal Capitolo 6 che ci sono sei classi principali di reazioni biochimiche che sono mediate da enzimi (Tabella 7.1). Questi includono reazioni di ossidoriduzione, reazioni di trasferimento di gruppo, reazioni di idrolisi, formazione/rimozione di doppi legami carbonio-carbonio, reazioni di isomerizzazione e reazioni di ligazione. Questa sezione ti fornirà una breve introduzione a questi sei tipi di reazioni.

Tabella 7.1 Sistema di classificazione degli enzimi primari da parte della Commissione degli enzimi (CE)

Reazioni di ossidoriduzione

Un reazione di ossidoriduzione (redox) è un tipo di reazione chimica che comporta un trasferimento di elettroni tra due atomi o composti. La sostanza che perde gli elettroni si dice ossidata, mentre la sostanza che acquista gli elettroni si dice ridotta. Redoxle reazioni devono sempre avvenire insieme. Se una molecola viene ossidata, allora un'altra molecola deve essere ridotta (cioè gli elettroni non appaiono dal nulla per essere aggiunti a un composto, devono sempre provenire da qualche parte!).

La variazione della composizione elettronica può essere valutata nella variazione del stato di ossidazione (o numero)di un atomo. Pertanto, an reazione di ossidoriduzione è qualsiasi reazione chimica in cui lo stato di ossidazione (numero) di una molecola, atomo o ione cambia acquistando o perdendo un elettrone. Impareremo come valutare lo stato di ossidazione di una molecola all'interno di questa sezione. Nel complesso, le reazioni redox sono comuni e vitali per alcune delle funzioni di base della vita, tra cui la fotosintesi, la respirazione, la combustione e la corrosione o la ruggine.

Come mostrato nella Figura 7.8, un semplice mnemonico per aiutarti a ricordare quale membro guadagna elettroni e quale membro perde elettroni è "LEO il leone dice GER", dove LEO sta per lose Eelettroni = ohossidato e GER sta per Gain Eelettroni = Redotto.

Figura 7.8. Le regole di ossidazione e riduzione. (Diagramma superiore) Il mnemonico LEO il leone dice GER è un modo utile per ricordare i concetti principali delle reazioni di ossidoriduzione, notando che quando una molecola losi Elezioni è ohossidato (LEO), e quando una molecola Gains Eelettroni è Ristruito (GER). (Diagramma inferiore) Un esempio di reazione redox con i componenti ossidati e ridotti indicati.

Reazioni di trasferimento di gruppo

In reazioni di trasferimento di gruppo, un gruppo funzionale verrà trasferito da una molecola che funge da molecola donatrice a un'altra molecola che fungerà da molecola accettore. Il trasferimento di un gruppo funzionale amminico da una molecola all'altra è un esempio comune di questo tipo di reazione ed è mostrato nella Figura 7.9 di seguito.

Figura 7.9 Trasferimento di un gruppo funzionale amminico. Una comune reazione di trasferimento di gruppo nei sistemi biologici è quella utilizzata per produrre α-amminoacidi che possono quindi essere utilizzati per la sintesi proteica. In questa reazione, un α-amminoacido funge da molecola donatrice e un α-chetoacido (queste molecole contengono un gruppo funzionale di acido carbossilico e un gruppo funzionale chetonico separato da un α-carbonio) funge da accettore. Nella molecola accettore, l'ossigeno carbonilico viene sostituito con il gruppo funzionale amminico, mentre nella molecola donatrice, il gruppo funzionale amminico viene sostituito da un ossigeno formando un nuovo gruppo funzionale chetonico.

Reazioni di idrolisi

La classificazione di reazioni di idrolisi comprendono sia le reazioni in avanti che comportano l'aggiunta di acqua a una molecola per romperla, sia la reazione inversa che comporta la rimozione dell'acqua per unire le molecole, denominata sintesi disidratazione (o condensazione)(Figura 7.7) .Quando l'acqua viene aggiunta a una molecola per romperla in due molecole, questa reazione viene chiamata idrolisi. Il termine 'lisi'significa rompere a pezzi, e il termine "idro"'si riferisce all'acqua. Quindi, il termine idrolisi significa rompersi con l'acqua. Il contrario di quella reazione comporta la rimozione dell'acqua da due molecole per unirle insieme in una molecola più grande. Poiché le due molecole stanno perdendo acqua, stanno diventando disidratato. Pertanto, la formazione di molecole attraverso la rimozione dell'acqua è nota come sintesi disidratazione. Poiché anche l'acqua è un sottoprodotto di queste reazioni, vengono anche comunemente chiamate reazioni di condensazione. Come abbiamo visto nel capitolo 6, la formazione delle principali classi di macromolecole nell'organismo (proteine, carboidrati, lipidi e acidi nucleici) avviene attraverso sintesi disidratazionedove l'acqua viene rimossa dalle molecole (Figura 7.10). Durante la normale digestione delle nostre molecole alimentari, le principali macromolecole vengono scomposte nei loro elementi costitutivi attraverso il processo di idrolisi.

Figura 7.10 Sintesi di idrolisi e disidratazione. Le reazioni di idrolisi mediano la scomposizione di polimeri più grandi nei loro blocchi monomerici mediante l'aggiunta di acqua alle molecole. L'inverso della reazione è la sintesi di disidratazione, in cui l'acqua viene rimossa dai blocchi costitutivi del monomero per creare la struttura polimerica più grande.

Come hai imparato durante questo termine, le principali macromolecole sono costruite mettendo insieme subunità monomeriche ripetute attraverso il processo di sintesi della disidratazione. È interessante notare che le unità funzionali organiche utilizzate nei processi di sintesi della disidratazione per ciascuno dei principali tipi di macromolecole hanno somiglianze tra loro. Pertanto, è utile esaminare le reazioni insieme (Figura 7.11)

Figura 7.11 Reazioni di sintesi di disidratazione coinvolte nella formazione di macromolecole. Vengono mostrate le principali reazioni organiche richieste per la biosintesi di lipidi, acidi nucleici (DNA/RNA), proteine ​​e carboidrati. Si noti che in tutte le reazioni c'è un gruppo funzionale che contiene due gruppi elettrontrattori (l'acido carbossilico, l'acido fosforico e l'emiacetale hanno ciascuno due atomi di ossigeno attaccati a un atomo di carbonio o fosforo centrale). Questo forma un atomo centrale reattivo parzialmente positivo (carbonio nel caso dell'acido carbossilico e dell'emiacetale, o fosforo nel caso dell'acido fosforico) che può essere attaccato dall'ossigeno o dall'azoto elettronegativo di un gruppo funzionale alcolico o amminico.

La formazione/rimozione dei doppi legami carbonio-carbonio

Le reazioni che mediano la formazione e la rimozione dei doppi legami carbonio-carbonio sono comuni anche nei sistemi biologici e sono catalizzate da una classe di enzimi chiamati liasi. La formazione o la rimozione di doppi legami carbonio-carbonio viene utilizzata anche nelle reazioni di chimica organica sintetica per creare le molecole organiche desiderate. Uno di questi tipi di reazioni è chiamato a reazione di idrogenazione, dove una molecola di idrogeno (H2) viene aggiunto attraverso un doppio legame C-C, riducendolo a un singolo legame C-C. Se ciò viene fatto utilizzando oli insaturi, i grassi insaturi possono essere convertiti in grassi saturi (Figura 7.12). Questo tipo di reazione è comunemente fatto per produrre oli parzialmente idrogenati convertendoli da liquidi a temperatura ambiente in solidi. Le margarine a base di olio vegetale sono prodotte in questo modo. Sfortunatamente, un sottoprodotto di questa reazione può essere la formazione di TAG contenenti trans doppi legami. Una volta riconosciuti i rischi per la salute derivanti dal consumo di grassi trans, la Food and Drug Administration (FDA) ha vietato l'inclusione di grassi trans trans grassi nei prodotti alimentari. Questo divieto è stato emanato nell'estate del 2015 e ha dato ai produttori di cibo tre anni per eliminarli dall'approvvigionamento alimentare, con una scadenza del 18 giugno 2018.

Figura 7.12 Idrogenazione degli oli per produrre margarina. Gli oli insaturi possono essere parzialmente o completamente idrogenati per produrre gli acidi grassi saturi per produrre margarine che rimarranno solide a temperatura ambiente. L'aggiunta dei nuovi atomi di idrogeno per creare gli idrocarburi saturi è mostrata in giallo nel prodotto finale.

Foto in alto fornita da Olio di semi di cotone e foto in basso fornita da Littlegun

Reazioni di isomerizzazione

In reazioni di isomerizzazione una singola molecola viene riarrangiata in modo tale da mantenere la stessa formula molecolare ma ora ha un diverso ordine di legame degli atomi che formano uno strutturale o stereoisomero. La conversione del glucosio 6-fosfato in fruttosio 6-fosfato è un buon esempio di reazione di isomerizzazione ed è mostrata nella figura 7.13

Figura 7.13 Isomerizzazione del glucosio 6-fosfato a fruttosio 6-fosfato.

Reazioni di legatura

Reazioni di legatura utilizzare l'energia dell'ATP per unire due molecole insieme. Un esempio di questo tipo di reazione è l'unione dell'amminoacido con la molecola di RNA di trasferimento (tRNA) durante la sintesi proteica. Durante la sintesi proteica le molecole di tRNA portano ciascuno degli amminoacidi al ribosoma dove possono essere incorporati nella nuova sequenza proteica in crescita. Per fare ciò, le molecole di tRNA devono prima essere attaccate all'amminoacido appropriato. Sono disponibili enzimi specifici chiamati amminoacil – tRNA sintetasi che mediano questa reazione. Gli enzimi sintetasi utilizzano l'energia dell'ATP per legare covalentemente l'amminoacido alla molecola di tRNA. Un diagramma di questo processo è mostrato nella Figura 7.14. Per ciascuno dei 20 amminoacidi, esiste una specifica molecola di tRNA e uno specifico enzima sintetasi che assicureranno il corretto attaccamento dell'amminoacido corretto con la sua molecola di tRNA.

Figura 7.14 Reazione di legatura Legando covalentemente la metionina con il tRNA appropriato. L'enzima aminoacil tRNA sintetasi per la metionina (mostrato in blu) lega in modo covalente la metionina (rosa chiaro) con la molecola di metionina tRNA (rosa scuro). Questa reazione richiede l'energia fornita dalla scomposizione della molecola di ATP in AMP, rilasciando energia con la rottura dei legami fosfato in due ioni fosfato inorganico (2 Pi).

7.2 Panoramica dei meccanismi catalitici

Le descrizioni seguenti descrivono i principali meccanismi utilizzati dagli enzimi per catalizzare le reazioni chimiche. Va notato che molti enzimi utilizzano più di una e talvolta diverse strategie catalitiche durante il loro meccanismo di reazione.

Catalisi covalente

Catalisi covalente comporta la formazione di un legame covalente tra l'enzima e almeno uno dei substrati coinvolti nella reazione. Spesso questo comporta catalisi nucleofila che è una sottoclasse della catalisi covalente. Come visto nella Sezione 7.1, diversi gruppi R di amminoacidi possono fungere da nucleofili e si trovano spesso nel sito attivo degli enzimi. Le catene laterali nucleofile sono spesso attivate dalla deprotonazione causata dalle catene laterali vicine, come l'istidina che può fungere da base. In alternativa, l'acqua può anche attivare il nucleofilo. La formazione del legame covalente intermedio tra l'enzima e il substrato consente la scissione del legame e la rimozione di un gruppo uscente.

Catalisi acido-base

Catalisi acido-base è coinvolto in qualsiasi meccanismo di reazione che richieda il trasferimento di un protone da una molecola all'altra. È molto comune vedere questo meccanismo combinato con la catalisi covalente poiché molti nucleofili vengono attivati ​​​​dalla rimozione di un protone, inclusi gruppi funzionali alcol, tiolo e ammina. Gli enzimi che utilizzano la catalisi acido-base possono essere ulteriormente raggruppati in entrambi acido-base specifico o acido-base generale reazioni. Acido specifico o base specifica catalisi si verifica se uno ione idronio (H3O + ) o uno ione idrossido (OH – ), rispettivamente, sono utilizzati direttamente nel meccanismo di reazione e il pH della soluzione influenza la velocità di catalisi. Reazioni generali acide e basi generali si verificano quando molecole diverse dallo ione idronio (H3O + ) o uno ione idrossido (OH – ) sono la fonte di donazione o accettazione di protoni. Più comunemente, un residuo amminoacidico del sito attivo viene utilizzato per accettare o donare un protone all'interno del meccanismo di reazione. In reazioni acido-base generali il pH è solitamente mantenuto costante all'interno di un sistema tamponato.

Catalisi elettrostatica

Catalisi elettrostatica si verifica quando il sito attivo dell'enzima stabilizza lo stato di transizione della reazione formando interazioni elettrostatiche con il substrato. Le interazioni elettrostatiche possono essere interazioni ioniche, ioniche-dipolo, dipolo-dipolo o idrofobiche. Il legame idrogeno è una delle interazioni elettrostatiche più comuni che si formano nel sito attivo.

Desolvazione

I siti attivi degli enzimi possono diventare privi di acqua e imitare le caratteristiche di reazione della fase gassosa. Questo può destabilizzare lo stato polarizzato di gruppi carichi come acidi e basi. Pertanto, la forma neutra di questi tipi di residui diventa lo stato favorito. Ciò è dovuto a significative alterazioni nel pKa dei residui del sito attivo all'interno dell'ambiente non polare. Ciò può far sì che residui normalmente acidi come il glutammato astraggano un protone dall'istidina e si comportino, ad esempio, come una base.

Catalisi per approssimazione

Nella catalisi per approssimazione, l'enzima aumenta la velocità di reazione legandosi a più substrati e posizionandoli favorevolmente in modo che la reazione possa procedere. Il legame con l'enzima riduce l'entropia rotazionale dei substrati che altrimenti sarebbero fluttuanti in modo casuale in soluzione e consente il corretto posizionamento dei substrati per la reazione. La perdita di entropia, che non è favorevole, è compensata dall'energia di legame rilasciata con l'interazione substrato-enzima.

Oltre a posizionare correttamente i substrati per interagire tra loro, la catalisi per approssimazione converte una reazione che sarebbe stata del secondo ordine, con substrati che sono liberi di galleggiare in soluzione, in una reazione del primo ordine, in cui tutti i substrati sono tenuti in posizione dall'enzima e si comportano come una singola molecola. Ciò può migliorare notevolmente la velocità catalitica della reazione da 10 5 a 10 7 volte più veloce, a seconda del sistema enzimatico.

Deformazione distorsione

In chimica organica, hai appreso che alcune strutture come le strutture ad anello a tre e quattro membri, come gli epossidi, erano altamente reattive a causa della distorsione della deformazione inerente agli angoli di legame sfavorevoli inerenti all'anello. I siti attivi degli enzimi possono anche utilizzare la distorsione del ceppo all'interno di un substrato legato per aumentare la reattività della molecola e favorire la formazione dello stato di transizione. Molti enzimi che funzionano secondo il modello di adattamento indotto utilizzano anche la distorsione del ceppo all'interno del loro meccanismo catalitico.All'interno dello stato non legato rimangono in uno stato catalitico basso, tuttavia l'interazione con il substrato induce la destabilizzazione del sito attivo dell'enzima o può indurre lo sforzo all'interno del substrato provocando l'inizio dell'attività catalitica dell'enzima.

Catalisi del cofattore

cofattori sono molecole che si legano agli enzimi e sono necessarie per l'attività catalitica dell'enzima. Si possono dividere in due grandi categorie: metalli e coenzimi. cofattori metallici che si trovano comunemente negli enzimi umani includono: ferro, magnesio, manganese, cobalto, rame, zinco e molibdeno. coenzimi sono piccole molecole organiche che spesso derivano da vitamine, che sono nutrienti organici essenziali consumati all'interno della dieta. coenzimi possono legarsi liberamente con l'enzima e avere la capacità di legarsi e rilasciare dal sito attivo, oppure possono legarsi strettamente e non avere la capacità di liberarsi facilmente dall'enzima. I coenzimi a legame stretto sono indicati come gruppi protesici. Gli enzimi che non sono ancora associati a un cofattore richiesto sono chiamati apoenzimi, mentre gli enzimi che sono legati con i loro cofattori richiesti sono chiamati oloenzimi.A volte molecole organiche e metalli si combinano per formare coenzimi, come nel caso del cofattore eme (Figura 7.15). Il coordinamento dei cofattori dell'eme con le loro controparti enzimatiche spesso implica interazioni elettrostatiche con i residui di istidina, come mostrato nell'enzima succinato deidrogenasi mostrato nella Figura 7.15.

Figura 7.15 Il cofattore eme. La famiglia dei cofattori eme contiene un metallo di ferro coordinato con una struttura ad anello di porfirina come mostrato nella pannello di sinistra all'interno della struttura dell'eme B. Nel riquadro di destra, l'eme B è mostrato complessato con l'enzima succinato deidrogenasi del ciclo di Kreb.

La struttura dell'eme B mostrata nel pannello di sinistra è di: Yikrazuul e la struttura cristallina della succinato deidrogenasi complessata con l'eme B è di: Richard Wheeler.

Come esempio di come le vitamine possono essere utilizzate come cofattori, la tabella 7.2 mostra le comuni vitamine del gruppo B e la coenzimiderivate dalle loro strutture. Molte carenze vitaminiche causano stati patologici a causa dell'inattività di apoenzimi che non sono in grado di funzionare senza il corretto collegamento coenzima.

Tabella 7.2 Vitamine B essenziali e loro cofattori enzimatici modificati

cofattori può aiutare a mediare le reazioni enzimatiche attraverso l'uso di una qualsiasi delle diverse strategie catalitiche sopra elencate. Possono fungere da nucleofili e mediare la catalisi covalente o formare interazioni elettrostatiche con il substrato e stabilizzare lo stato di transizione. Possono anche causare distorsione da deformazione o facilitare la catalisi acido-base. La catalisi aiutata da metalli può spesso utilizzare meccanismi di reazione omolitica che coinvolgono intermedi radicali. Questo può essere importante in reazioni come quelle che si verificano nella catena di trasporto degli elettroni che richiedono il movimento sicuro di singoli elettroni.

7.3 Esempi di meccanismi di reazione

Enzimi proteasi

Gli enzimi proteolitici (chiamati anche peptidasi, proteasi e proteinasi) sono in grado di idrolizzare i legami peptidici nelle proteine. Possono essere trovati in tutti gli organismi viventi, dai virus agli animali e all'uomo. Gli enzimi proteolitici hanno una grande importanza medica e farmaceutica per il loro ruolo chiave nei processi biologici e nel ciclo di vita di molti agenti patogeni. Le proteasi sono enzimi ampiamente applicati in diversi settori dell'industria e della biotecnologia, inoltre, numerose applicazioni di ricerca richiedono il loro utilizzo, compresa la produzione di frammenti di Klenow, sintesi di peptidi, digestione di proteine ​​indesiderate durante la purificazione dell'acido nucleico, coltura cellulare e dissociazione dei tessuti, preparazione di anticorpi ricombinanti frammenti per la ricerca, la diagnostica e la terapia, e l'esplorazione delle relazioni struttura-funzione.

Gli enzimi proteolitici appartengono alla classe degli enzimi idrolasi e sono raggruppati nella sottoclasse delle idrolasi peptidiche o peptidasi. A seconda del sito di azione enzimatica le proteasi possono anche essere suddivise in esopeptidasi o endopeptidasi. Le esopeptidasi, come le aminopeptidasi e le carbossipeptidasi, catalizzano l'idrolisi dei legami peptidici rispettivamente vicino alle estremità N – o C -terminali del substrato (Figura 7.16). Le endopeptidasi (Figura 7.16) scindono i legami peptidici in posizioni interne all'interno della sequenza peptidica. Le proteasi possono anche essere aspecifiche e scindere tutti i legami peptidici allo stesso modo oppure possono essere altamente specifiche per la sequenza e scindere i peptidi solo dopo determinati residui o all'interno di specifiche sequenze localizzate.

Figura 7.16 Reazioni comuni della peptidasi. Le aminopeptidasi (diagramma superiore) e le carbossipeptidasi (diagramma centrale) rimuovono i residui di amminoacidi terminali, mentre le endopeptidasi (diagramma inferiore) scindono le sequenze proteiche nei siti interni. Le frecce rosse mostrano i legami peptidici da scindere.

L'azione degli enzimi proteolitici è essenziale in molti processi fisiologici. Ad esempio, le proteasi funzionano nella digestione delle proteine ​​alimentari, nel turnover proteico, nella divisione cellulare, nella cascata della coagulazione del sangue, nella trasduzione del segnale, nell'elaborazione degli ormoni polipeptidi, nell'apoptosi e nel ciclo di vita di diversi organismi che causano malattie, inclusa la replicazione di retrovirus come come il virus dell'immunodeficienza umana (HIV). A causa del loro ruolo chiave nel ciclo di vita di molti ospiti e agenti patogeni, hanno una grande importanza medica, farmaceutica e accademica.

In precedenza è stato stimato che circa il 2% dei geni umani codifica per enzimi proteolitici e, a causa della loro necessità in molti processi biologici, le proteasi sono diventate importanti bersagli terapeutici. Sono intensamente studiati per esplorare le loro relazioni struttura-funzione, per studiare le loro interazioni con i substrati e gli inibitori, per sviluppare agenti terapeutici per terapie antivirali o per migliorare la loro termostabilità, efficienza e per modificare la loro specificità mediante l'ingegneria proteica per scopi industriali o terapeutici.

Sulla base del meccanismo catalitico e della presenza di residui amminoacidici nel sito attivo, le proteasi possono essere raggruppate come proteasi aspartiche, proteasi cisteina, proteasi glutammiche, metalloproteasi, asparagina proteasi, serina proteasi, treonina proteasi e proteasi con mista o meccanismo catalitico sconosciuto. Qui esploreremo il meccanismo di reazione e la specificità di sequenza della famiglia delle serina proteasi.

L'elenco delle serina proteasi è piuttosto lungo. Sono raggruppati in due grandi categorie: 1) quelli che sono simili alla chimotripsina e 2) quelli che sono simili alla subtilisina. Sebbene gli enzimi di tipo subtilisina e chimotripsina utilizzino lo stesso meccanismo d'azione, inclusa la triade catalitica, gli enzimi non sono altrimenti correlati tra loro per sequenza e sembrano essersi evoluti indipendentemente (Figura 7.17). Sono, quindi, un esempio di evoluzione convergente – un processo in cui l'evoluzione di forme diverse convergono su una struttura per fornire una funzione comune.

Figura 7.17 Evoluzione convergente delle proteasi serina, chimotripsina e subtilisina. La struttura cristallina dell'eucariota, chimotripsina bovina (pannello di sinistra) con triade catalitica indicata in verde. La struttura cristallina della subtilisina BPN procariotica dal batterio Bacillus subtilis (pannello di destra) con la triade catalitica e le mutazioni comuni indicate utilizzando i modelli a sfera e bastone. Si noti che la formazione della triade catalitica è sorprendentemente simile tra le due strutture, mentre le strutture e la sequenza proteiche circostanti non mostrano omologia o antenati correlati.

Immagine della chimotripsina bovina modificata da Mattyjenjen e immagine della subtilisina BNP da Romero-Garcia, E.R., et al. (2009) J Biomed Biotech 2009(1):201075

Gli enzimi serina proteasi simili alla chimotripsina scindono il legame peptidico sul lato dell'acido carbossilico di specifici amminoacidi e la specificità è determinata dalla dimensione/forma/carica della catena laterale dell'amminoacido che si inserisce nella tasca di legame S1 dell'enzima (Figura 7.18). Tre membri della famiglia simili alla chimotripsina che condividono l'omologia ad alta sequenza sono gli enzimi digestivi pancreatici, la tripsina, la chimotripsina e l'elastasi. I siti di scissione delle proteine ​​di questi enzimi variano. La tripsina scinde le proteine ​​sul lato carbossilico dei residui basici, come lisina e arginina, mentre la chimotripsina scinde gli amminoacidi idrofobici aromatici, come fenilalanina, tirosina e triptofano, e l'elastasi scinde i piccoli residui idrofobici, come glicina, alanina, e valina. Come mostrato nella Figura 7.18, le variazioni nei residui di amminoacidi all'interno della tasca di legame di queste proteasi, consentono interazioni elettrostatiche con il substrato e determinano la specificità della sequenza.

Figura 7.18 Specificità del substrato di tripsina, chimotripsina ed elastasi. Il pannello superiore mostra le strutture cristalline che riempiono lo spazio di tripsina, chimotripsina ed elastasi, rispettivamente, con la tasca di legame del substrato S1 indicata. Il pannello inferiore descrive i domini di legame S1 di ciascuna proteasi in modo più dettagliato con importanti gruppi R di amminoacidi indicati. Per la tripsina, un residuo di aspartato nella porzione inferiore della tasca S1 favorisce le interazioni elettrostatiche con i residui basici del substrato. La tasca di legame della chimotripsina S1 è grande e di natura idrofoba e accoglie i residui aromatici del substrato, mentre la tasca di legame dell'elastasi S1 è piccola e idrofoba, consentendo solo ad altri gruppi R piccoli e idrofobici di attraccare in questa posizione.

Le serina proteasi utilizzano quattro dei principali meccanismi catalitici durante il ciclo di reazione: catalisi acido-base, catalisi covalente, interazioni elettrostatiche e desolvatazione. Il sito attivo della serina proteasi contiene una triade catalitica di tre amminoacidi: His, Ser (da cui il nome “serina proteasi”) e Asp. Questi tre amminoacidi chiave svolgono ciascuno un ruolo essenziale nella capacità di scissione delle proteasi. Mentre i membri amminoacidici della triade si trovano lontano l'uno dall'altro nella sequenza primaria della proteina, a causa del ripiegamento, saranno molto vicini l'uno all'altro nel cuore dell'enzima.

Durante un evento di catalisi, si verifica un meccanismo ordinato in cui vengono generati diversi intermedi. La catalisi della scissione peptidica può essere vista come a catalisi da ping pong, in cui un substrato si lega (in questo caso, il polipeptide che viene scisso), viene rilasciato un prodotto (l'N-terminale “ metà” del peptide), un altro substrato si lega (in questo caso, acqua) e un altro prodotto viene rilasciato (il C-terminale “metà” del peptide). La Figura 7.19 illustra in dettaglio il processo catalitico.

Nei passaggi da 1 a 2, il substrato polipeptidico entra nel sito attivo ed è posizionato con l'orientamento corretto vicino al residuo di serina del sito attivo attraverso interazioni elettrostatiche nella tasca per rilegatura S1. Il carbonio carbonilico del substrato è posizionato vicino al residuo di serina del sito attivo. L'idrogeno dell'alcol serina viene estratto dal residuo catalitico di istidina attraverso catalisi acido-base.Ciò è reso possibile dall'azione del residuo di aspartato del sito attivo. In questo caso, il residuo di aspartato estrae un protone dall'istidina, consentendo all'istidina di rimuovere il protone dall'alcol serina. Normalmente, questa sarebbe una cosa strana per l'aspartato, in quanto il pKa del gruppo R dell'aspartato è molto inferiore a quello dell'istidina in un ambiente acquoso. Tuttavia, quando il substrato peptidico attracca nel sito attivo dell'enzima, questo esclude l'acqua dall'area attraverso a desolvazioneprocesso e crea un microambiente idrofobo. Questo aumenta effettivamente il pKa di aspartato e favorisce la forma non carica o protonata del residuo, provocando l'estrazione del protone dall'istidina.

Nei passaggi da 2 a 3 catalisi covalente è abilitato poiché il sito attivo serina media l'attacco nucleofilo sul carbonio carbonilico del substrato formando un tetraedrico ossianione intermedio. L'ossianione intermedio nel percorso viene quindi stabilizzato da interazioni elettrostatiche con una regione della proteasi nota come buco dell'ossianione. Qui la carica negativa dell'ossianione è stabilizzata da interazioni elettrostatiche con azoti ammidici dalla spina dorsale della proteasi. Il rimbalzo dell'ossianione per riformare il doppio legame carbonilico porta alla scissione del legame peptidico. La porzione C-terminale della proteina può quindi lasciare il sito attivo dell'enzima.

Una volta che il peptide C-terminale lascia il sito attivo, l'acqua può entrare e reidratare il sito attivo, come visto nei passaggi da 5 a 6. Una molecola d'acqua è orientata in prossimità del carbonio carbonilico del peptide N-terminale che è ancora legato a il residuo di serina del sito attivo. L'ossigeno dell'acqua agisce da nucleofilo e attacca il carbonio carbonilico, ricreando un ossianione intermedio che viene stabilizzato dal interazioni elettrostatiche del foro ossianionico. Poiché questo ossianione rimbalza per riformare il carbonile, il residuo di serina agisce come un gruppo uscente e il peptide N-terminale viene rilasciato dall'enzima. La presenza di acqua nel sito attivo, ristabilisce il residuo di serina e gli stati nativi dei residui di istidina e acido aspartico.

Nel complesso, ogni amminoacido della triade svolge un compito specifico in questo processo:

  • La serina ha un gruppo -OH che è in grado di agire da nucleofilo, attaccando il carbonio carbonilico del legame peptidico scissile del substrato (catalisi covalente).
  • Una coppia di elettroni sull'azoto istidina ha la capacità di accettare l'idrogeno dal gruppo serina -OH, coordinando così l'attacco del legame peptidico (catalisi acido/base).
  • Il gruppo carbossilico sull'acido aspartico a sua volta si coordina con l'istidina, rendendo l'atomo di azoto sopra menzionato molto più elettronegativo attraverso il processo di desolvazione.

Interazioni elettrostatiche sono fondamentali per (1) legare il substrato nella tasca di legame S1 (2) stabilizzare lo stato di transizione ossianione e (3) coordinare la molecola d'acqua per mediare l'attacco nucleofilo sull'intermedio legato all'enzima.

Figura 7.19 Meccanismo di reazione delle proteasi simili alla chimotripsina. Il meccanismo di reazione è stato suddiviso in un processo in otto fasi. Nei passaggi 1-3 il substrato proteico si lega alla proteasi ed è orientato a posizionare il carbonio carbonilico del substrato in prossimità del residuo di serina del sito attivo. La catalisi acido-base consente l'attivazione del residuo di serina per mediare l'attacco nucleofilo sul substrato proteico. L'ossianione intermedio covalente mostrato in 3 e 4 è stabilizzato dal foro ossianionico. Il rimbalzo degli elettroni per riformare il gruppo carbonilico provoca la scissione del legame peptidico e la rimozione della porzione C-terminale del peptide dal sito attivo, mostrata in 5. L'acqua entra nel sito attivo e media l'attacco nucleofilo sul carbonio carbonilico dell'intermedio enzima-substrato, come mostrato in 6 e 7. Quando il legame carbonilico viene riformato, la serina agisce come un gruppo uscente e il peptide N-terminale viene rilasciato dall'enzima. La triade catalitica nel sito attivo dell'enzima viene recuperata e l'enzima viene ripristinato per un altro ciclo di attività catalitica, come mostrato in 8.

Adenilato chinasi

Adenilato chinasi (conosciuto anche come AK o miochinasi) è un enzima fosfotransferasi che catalizza l'interconversione dei nucleotidi di adenina (ATP, ADP e AMP). Monitorando costantemente i livelli di nucleotidi fosfato all'interno della cellula, gli enzimi AK svolgono un ruolo importante nell'omeostasi energetica cellulare. La reazione chimica di base mediata da questa classe di enzimi è la conversione di 2 molecole di ADP in 1 ATP e 1 AMP (Figura 7.20A). La reazione inversa può verificarsi anche formando un equilibrio basato sulle concentrazioni cellulari dei vari stati di fosforilazione.

Ad oggi sono state identificate nove isoforme di proteine ​​AK umane. Mentre alcuni di questi sono onnipresenti in tutto il corpo, alcuni sono localizzati in tessuti specifici. Ad esempio, AK7 e AK8 si trovano entrambi solo nel citosol delle cellule e AK7 si trova nel muscolo scheletrico mentre AK8 no. Non solo variano le posizioni delle varie isoforme all'interno della cellula, ma sono diversi anche il legame del substrato all'enzima e la cinetica del trasferimento del fosforo. AK1, l'isoenzima AK citosolico più abbondante, ha un Km circa mille volte superiore al Km di AK7 e 8, indicando un legame molto più debole di AK1 ad AMP. La localizzazione subcellulare degli enzimi AK viene eseguita da sequenze di targeting uniche presenti nella proteina. Ogni isoforma ha anche preferenze diverse per gli NTP’. Alcuni utilizzeranno solo ATP, mentre altri accetteranno GTP, UTP e CTP come vettore di fosforile.

Gli enzimi AK possono essere coinvolti nella regolazione delle concentrazioni di nucleotidi e fungono da sistema di collegamento tra i pool cellulari e mitocondriali di nucleotidi di adenina, come mostrato nella Figura 7.20B. Gli enzimi AK possono anche fungere da sensore per il carico energetico all'interno della cellula e possono portare all'attivazione di sistemi sensibili all'AMP all'interno della cellula quando i livelli di energia sono bassi (Figura 7.20C).

Figura 7.20. Attività enzimatica dell'adenilato chinasi (AK). (A) La reazione fondamentale delle AMP Chinasi. (B) le reazioni degli enzimi AK possono funzionare in meccanismi a cascata per fornire segnalazione e comunicazione tra diverse regioni della cellula, inclusi il citoplasma e i mitocondri, e (C) gli enzimi AK sono spesso usati come monitor metabolici del carico energetico, portando alla attivazione o inibizione degli enzimi a valle.

Il trasferimento di fosforile durante la reazione AK avviene solo dopo la chiusura di una struttura a "coperchio aperto" nell'enzima attraverso il catalisi per approssimazione meccanismo (Figure 7.21 e 7.22). Ciò provoca l'esclusione delle molecole d'acqua che avvicinano i substrati e abbassa efficacemente la barriera energetica per l'attacco nucleofilo da parte del gruppo γ-fosforile dell'ATP sull'α-fosforile dell'AMP. Nella struttura cristallina dell'enzima AK da E. coli con l'inibitore Ap5A (Figura 7.21C), il residuo Arg88 coordina l'Ap5A al gruppo α-fosfato attraverso interazioni elettrostatiche. È stato dimostrato che la mutazione di Arg88 in Gly (R88G) determina una perdita del 99% dell'attività catalitica di questo enzima, suggerendo che questo residuo è intimamente coinvolto nel trasferimento del fosforo. Un altro residuo altamente conservato è Arg119, che si trova nella regione di legame dell'adenosina dell'AK, e agisce per avvolgere l'adenina nel sito attivo. È stato suggerito che la promiscuità di questi enzimi nell'accettare altri NTP’s sia dovuta a queste interazioni relativamente irrilevanti della base nella tasca di legame dell'ATP. Una rete di residui positivi e conservati (Lys13, Arg123, Arg156 e Arg167 in AK da E. coli) stabilizzano l'accumulo di carica negativa sul gruppo fosforile durante il trasferimento. Due residui di aspartato distale si legano alla rete di arginina, provocando il ripiegamento dell'enzima e riducendo la sua flessibilità. UN magnesiocofattore è anche richiesto, essenziale per aumentare l'elettrofilia del fosfato su AMP, sebbene questo ione magnesio sia trattenuto solo nella tasca attiva da interazioni elettrostatiche e si dissocia facilmente.

La flessibilità e la plasticità consentono alle proteine ​​di legarsi ai ligandi, formare oligomeri, aggregarsi ed eseguire lavori meccanici. Grandi cambiamenti conformazionali nelle proteine ​​svolgono un ruolo importante nella segnalazione cellulare. AK agisce come una proteina di trasduzione del segnale, quindi l'equilibrio tra le conformazioni regola l'attività della proteina. AK ha una conformazione ‘aperta’ (Figura 7.21A) che viene indotta nella conformazione ‘chiusa’ e biologicamente attiva al momento del legame con il substrato.

Figura 7.21 Struttura cristallina dell'enzima adenilato chinasi. Strutture degli stati aperto (A, PDB ID: 4AKE) e chiuso (B, PDB ID: 1AKE). Il LID e i domini NMP sono mostrati rispettivamente in rosso e arancione. Il dominio CORE e il resto della proteina sono mostrati in blu. (C) Immagine PDB 3HPQ che mostra lo scheletro dell'enzima AK nel cartone animato e i residui chiave come bastoncini ed etichettati in base alla loro posizione nel E. coli Enzima AK, cristallizzato con inibitore Ap5A.

I due sottodomini (LID e NMP) possono piegarsi e dispiegarsi indipendentemente l'uno dall'altro a seconda del legame al substrato. Il legame al substrato induce spostamenti regionali nella struttura proteica verso conformazioni parzialmente chiuse o completamente chiuse. La conformazione completamente chiusa ottimizza l'allineamento dei substrati per il trasferimento del fosforo e aiuta con la rimozione dell'acqua dal sito attivo per evitare l'idrolisi dispendiosa dell'ATP.

Figura 7.22 Percorso di transizione conformazionale e meccanismo catalitico proposto di AK. Modello a, substrato AK esente da una conformazione aperta. Modello b, forma associata ad ATP di ADK con un dominio LID chiuso. Modello c, forma legata ad ATP e AMP di AK con una conformazione chiusa. Modello d, due forme legate ad ADP di AK con una conformazione chiusa. Modello e, una forma di AK legata ad ADP con un dominio NMP chiuso.

Endonucleasi di restrizione

UN enzima di restrizione, endonucleasi di restrizione, o restringereè un enzima che scinde il DNA in frammenti in corrispondenza o in prossimità di specifici siti di riconoscimento all'interno di molecole note come siti di restrizione. Gli enzimi di restrizione sono una classe del più ampio gruppo di enzimi endonucleasici. Gli enzimi di restrizione sono comunemente classificati in cinque tipi, che differiscono nella loro struttura e se tagliano il loro substrato di DNA nel loro sito di riconoscimento, o se i siti di riconoscimento e di scissione sono separati l'uno dall'altro. Per tagliare il DNA, tutti gli enzimi di restrizione praticano due incisioni, una volta attraverso ciascuna spina dorsale zucchero-fosfato (cioè ogni filamento) della doppia elica del DNA. Qui ci concentreremo sugli enzimi di restrizione di tipo II che sono abitualmente utilizzati nelle applicazioni di biologia molecolare e biotecnologia.

Come con altre classi di enzimi di restrizione, gli enzimi di restrizione di tipo II si verificano esclusivamente in forme di vita microbiche unicellulari - principalmente batteri e archaea (procarioti) - e si pensa che funzionino principalmente per proteggere queste cellule da virus e altre molecole di DNA infettive. All'interno di un procariota, gli enzimi di restrizione vengono selettivamente tagliati straniera DNA in un processo chiamato restrizione della digestione nel frattempo, il DNA dell'ospite è protetto da un enzima di modifica (una metiltransferasi) che modifica il DNA procariotico e blocca la scissione. Insieme, questi due processi formano il sistema di modifica delle restrizioni.

Il primo enzima di restrizione di tipo II scoperto fu HindII dal batterio Haemophilus influenzae Rd. L'evento è stato descritto da Hamilton Smith (Figura 7.23) nella sua conferenza per il Nobel, pronunciata l'8 dicembre 1978:

“In uno di questi esperimenti ci è capitato di usare il DNA marcato del fago P22, un virus batterico con cui avevo lavorato per diversi anni prima di venire a Hopkins. Con nostra sorpresa, non siamo riusciti a recuperare il DNA estraneo dalle cellule. Con il recente rapporto di Meselson nelle nostre menti, abbiamo immediatamente sospettato che potesse essere sottoposto a restrizione e la nostra esperienza con la viscometria ci ha detto che questo sarebbe stato un buon test per tale attività. Il giorno seguente sono stati allestiti due viscosimetri, uno contenente DNA P22 e l'altro Haemophilus DNA. L'estratto cellulare è stato aggiunto a ciascuno e abbiamo iniziato a prendere rapidamente le misurazioni. Man mano che l'esperimento procedeva, diventammo sempre più eccitati poiché la viscosità di il Haemophilus Il DNA è rimasto stabile mentre la viscosità del DNA P22 è diminuita. Eravamo fiduciosi di aver scoperto un nuovo enzima di restrizione altamente attivo. Inoltre, sembrava richiedere solo Mg 2+ come cofattore, suggerendo che si dimostrerebbe un enzima più semplice di quello da E. coli K o B.

Dopo diverse false partenze e molte ore noiose con il nostro laborioso, ma sensibile test viscosimetrico, Wilcox ed io siamo riusciti a ottenere una preparazione purificata dell'enzima di restrizione. Successivamente abbiamo usato la centrifugazione in gradiente di saccarosio per dimostrare che l'enzima purificato si degradava selettivamente DNA P22 duplex, ma non a singolo filamento, a frammenti di lunghezza media di circa 100 bp, mentre Haemophilus Il DNA presente nella stessa miscela di reazione non è stato toccato. Durante la reazione non sono stati rilasciati nucleotidi liberi, né è stato possibile rileviamo eventuali scheggiature nei prodotti del DNA. Pertanto, l'enzima era chiaramente un'endonucleasi che produceva rotture del doppio filamento ed era specifico per il DNA estraneo. Poiché i prodotti finali (limite) della digestione del DNA estraneo sono rimasti grandi, è ci sembrava che la scollatura dovesse essere specifica del sito. Questo si è rivelato essere il caso e siamo stati in grado di dimostrarlo direttamente sequenziando i terminali dei frammenti di scissione.'

Figura 7.23. Hamilton Smith e Daniel Nathans alla conferenza stampa del Premio Nobel, 12 ottobre 1978 (riprodotto con il permesso di Susie Fitzhugh). Repository originale: Alan Mason Chesney Medical Archives, Daniel Nathans Collection.

Gli enzimi di restrizione sono denominati in base alla tassonomia dell'organismo in cui sono stati scoperti. La prima lettera dell'enzima si riferisce al genere dell'organismo e la seconda e la terza alla specie. Questo è seguito da lettere e/o numeri che identificano l'isolato. I numeri romani sono usati per specificare diversi enzimi dello stesso organismo. Ad esempio, l'enzima 'HindIII' è stato scoperto in Haemophilus influenzae, sierotipo d, ed è distinto dalle endonucleasi HindI e HindII presenti anche all'interno di questo batterio. Le DNA-metiltransferasi (MTasi) che accompagnano gli enzimi di restrizione sono denominate allo stesso modo e ricevono il prefisso "M.". Quando c'è più di una MTasi, sono preceduti da "M1", "M2", ecc., Se sono proteine ​​separate o "M1∼M2" quando sono unite.

Gli enzimi di restrizione che riconoscono la stessa sequenza di DNA, indipendentemente da dove tagliano, sono chiamati "isoschizomeri" (iso = uguale skhizo = diviso). isoschizomeri che tagliano la stessa sequenza in posizioni diverse sono ulteriormente definiti 'neoschizomeri' (neo = nuovo). isoschizomeri che tagliati nella stessa posizione sono frequentemente, ma non sempre, versioni evolutivamente derivate dello stesso enzima (ad esempio BamHI e OkrAI). Neoschizomeri, d'altra parte, sono spesso enzimi evolutivamente non correlati (es.EcoRII e MvaI).

Gli enzimi di restrizione di tipo II sono un conglomerato di molte proteine ​​diverse che, per definizione, hanno la capacità comune di scindere il DNA duplex in una posizione fissa all'interno o vicino alla loro sequenza di riconoscimento. Questa scissione genera frammenti di DNA riproducibili e modelli prevedibili di elettroforesi su gel, proprietà che hanno reso questi enzimi preziosi reagenti per la manipolazione e l'indagine del DNA in laboratorio. Quasi tutti gli enzimi di restrizione di tipo II richiedono cationi bivalenti, solitamente Mg 2+ , come componenti essenziali dei loro siti catalitici. Ca 2+, d'altra parte, agisce spesso come un inibitore degli enzimi di restrizione di tipo II.

Le sequenze di riconoscimento degli enzimi di restrizione di tipo II sono: palindromoin natura, con due possibili tipi di sequenze palindromiche. Il palindromo speculare è simile a quelli trovati nel testo ordinario, in cui una sequenza legge lo stesso avanti e indietro su un singolo filamento di DNA, come in GTAATG. Il palindromo ripetuto invertito è anche una sequenza che legge lo stesso avanti e indietro, ma le sequenze avanti e indietro si trovano in filamenti di DNA complementari (cioè di DNA a doppio filamento), come in GTATAC (GTATAC è complementare a CATATG). Palindromi ripetuti invertiti sono più comuni e hanno una maggiore importanza biologica di palindromi speculari.La posizione della scissione all'interno della sequenza palindromica può variare a seconda dell'enzima e può produrre sequenze sporgenti a singolo filamento (estremità appiccicose) o prodotti di DNA con estremità smussate.

L'enzima di restrizione EcoRI produce estremità appiccicose:

considerando che la scissione dell'enzima di restrizione SmaI produce estremità smussate:

La metilazione può essere utilizzata dall'ospite per proteggere il proprio genoma dalla scissione. Ad esempio, la metilazione della sequenza di riconoscimento EcoRI da parte della M.EcoRI metiltransferasi (MTase), cambia la sequenza da GAATTC a GAm6ATTC (m6A = N6-metiladenina). Questa modifica protegge completamente la sequenza dalla scissione da parte di EcoRI.

Gli enzimi di restrizione di tipo II inizialmente si legano in modo non specifico con il DNA e procedono a far scorrere la scansione del DNA per le sequenze di riconoscimento (Fig 7.24). Legandosi alla corretta sequenza palindromica, l'enzima si associa al cofattore metallico e media la scissione catalitica del DNA utilizzando il meccanismo di distorsione da deformazionee catalisi per approssimazione.

Figura 7.24 Riconoscimento e scissione del DNA da parte delle endonucleasi di restrizione di tipo II. (A) Vista pittorica di un dimero EcoRV che scansiona in modo non specifico lungo il DNA fino a quando non viene riconosciuto un sito di legame specifico. Ciò causa l'accoppiamento con il cofattore metallico e la distorsione del ceppo del DNA. L'idrolisi del legame fosfodiestere è mediata e i prodotti di scissione del DNA vengono rilasciati dall'enzima. (B) mostra un modello di riempimento dello spazio del riconoscimento e della scissione del DNA di EcoRV.

Una delle domande più importanti riguardanti il ​​meccanismo catalitico di un'idrolasi è se l'idrolisi coinvolga un intermedio covalente, come è tipico delle proteasi descritte in precedenza. Questo può essere deciso analizzando il corso stereochimico della reazione. Questo è stato fatto prima per EcoRI e poi per EcoRV. È stato scoperto che entrambi gli enzimi scindono il legame fosfodiestere con l'inversione della stereoconfigurazione al fosforo, il che è contrario alla formazione di un intermedio covalente enzima-DNA. Pertanto, si propone che la scissione implichi l'attacco nucleofilo diretto del substrato da parte di una molecola d'acqua, come mostrato nella Figura 7.25.

Figura 7.25 Un meccanismo generale per la scissione del DNA di EcoRI ed EcoRV. Una molecola d'acqua attivata attacca il fosforo in linea con il legame fosfodiestere da scindere, che procede con l'inversione di configurazione. X, Y e Z sono rispettivamente una base generale, un acido di Lewis e un acido generale.

Gli enzimi di restrizione di tipo II formano tipicamente un omodimero quando si legano al DNA, come mostrato nella struttura cristallina di BglII nella Figura 7.26B. BglII catalizza la scissione del legame fosfodiestere alla spina dorsale del DNA attraverso un trasferimento di fosforile all'acqua. Gli studi sul meccanismo degli enzimi di restrizione hanno rivelato diverse caratteristiche generali che sembrano essere vere in quasi tutti i casi, sebbene il meccanismo effettivo per ciascun enzima sia molto probabilmente una variazione di questo meccanismo generale (Figura 7.25). Questo meccanismo richiede una base per generare lo ione idrossido dall'acqua, che agirà da nucleofilo e attaccherà il fosforo nel legame fosfodiestere. È inoltre necessario un acido di Lewis per stabilizzare la carica negativa extra del fosforo dello stato di transizione pentacoordinato, nonché un acido generale o uno ione metallico che stabilizza il gruppo uscente (3'-O - ). In alcuni enzimi di restrizione di tipo II, sono richiesti due cofattori metallici bivalenti (come in EcoRV e BamHI), mentre altri enzimi richiedono solo un cofattore metallico bivalente (come in EcoRI e BglII).

Gli studi strutturali delle endonucleasi hanno rivelato un'architettura simile per il sito attivo con i residui che seguono la sequenza consenso debole Glu/Asp-(X)9-20-Glu/Asp/Ser-X-Lys/Glu. BglII’s il sito attivo è simile ad altre endonucleasi’, seguendo la sequenza Asp-(X)9-Glu-X-Gln. Nel suo sito attivo si trova un catione metallico bivalente, molto probabilmente Mg 2+ , che interagisce con Asp-84, Val-94, un ossigeno fosforilico e tre molecole d'acqua. Una di queste molecole d'acqua, è in grado di agire come nucleofilo a causa della sua vicinanza al gruppo fosforile scissile (Figura 7.26A). La molecola nucleofila dell'acqua è posizionata per l'attacco al gruppo fosforilico mediante un legame idrogeno con l'ossigeno ammidico della catena laterale di Gln-95 e il suo contatto con il catione metallico. L'interazione con il catione metallico riduce efficacemente il suo pKun, promuovendo la nucleofilia dell'acqua (Figura 7.26 A). Durante l'idrolisi, il catione bivalente è in grado di stabilizzare il gruppo uscente 3′-O – e coordinare l'estrazione del protone da una delle molecole d'acqua coordinate (Figura 7.26A).

Figura 7.26 Meccanismo di reazione proposto per l'endonucleasi di restrizione di tipo II, BglII. (A) Diagramma schematico del meccanismo catalitico che dimostra l'utilità degli ioni Mg2+ e dei residui di amminoacidi polari all'interno del sito attivo per attivare e posizionare una molecola d'acqua per l'attacco nucleofilo sul legame fosfodiestere del substrato del DNA. (B) Struttura cristallina del dimero BglII con DNA a doppio filamento e (C) Coordinamento del cofattore Mg2+ all'interno del sito attivo dell'enzima BglII.

Ribozimi

ribozimi (riboacido nucleico enzimes) sono molecole di RNA che hanno la capacità di catalizzare specifiche reazioni biochimiche, incluso lo splicing dell'RNA nell'espressione genica, simile all'azione degli enzimi proteici. Nel 1982, l'introne del gruppo I auto-splicing è stato segnalato come il primo RNA catalitico scoperto. È stato descritto nei protozoi ciliati Tetrahymena termofila da Sidney Altman e Thomas Czech, che hanno ricevuto il Premio Nobel per la Chimica nel 1989. Introni simili si possono trovare in alcuni genomi procarioti e nei mitocondri e nel DNA dei cloroplasti di diversi eucarioti. Il secondo esempio di ribozima da scoprire era l'RNAsi P coinvolta nella maturazione del tRNA, che aveva un ruolo biologico chiave e una presenza ubiquitaria sia nei procarioti che negli eucarioti. Il terzo RNA catalitico riportato era un minuscolo ribozima (

50 nt), il ribozima martello autopulente (HHR), che è stato trovato in un gruppo di patogeni vegetali atipici con piccoli genomi di RNA circolare (circRNA) come RNA satellite virale e viroidi. Da allora, sono stati scoperti alcuni altri esempi di ribozimi naturali o artificiali, incluso il ribosoma, un singolare RNA catalitico che catalizza la formazione del legame peptidico, la reazione chimica centrale nella biologia esistente. Questo panorama supporta fortemente l'ipotesi di un mondo a RNA prebiotico, in cui i primi organismi autoreplicanti erano basati sull'RNA sia come materiale genetico che come catalizzatore. Mentre le proteine ​​moderne avrebbero sostituito la maggior parte di questi antichi RNA catalitici, alcune di esse sono rimaste negli attuali organismi che svolgono funzioni diverse. Tra tutti i ribozimi conosciuti, c'è l'enigmatica famiglia dei piccoli (<200 nt) RNA autopulenti, che catalizzano una semplice transesterificazione intramolecolare in modo altamente sequenza-specifico. Questa reazione, che può avvenire spontaneamente nell'RNA, inizia da un SnAttacco nucleofilo simile a 2 dell'ossigeno 2′ all'adiacente 3′-fosfato, con conseguente scissione del legame fosfodiestere per formare un fosfato 2′-3′-ciclico e un prodotto di RNA 5′-idrossile (Figura 7.27A) .

Figura 7.27 Il ribozima martello. (UN) Meccanismo della reazione di transesterificazione interna nell'RNA. La reazione di scissione procede con un attacco della porzione idrossile a 2' al gruppo fosfato a 3', seguito da uno stato di transizione bipiramidale. I prodotti di scissione sono un fosfato 2′-3′-ciclico nel prodotto 5′ RNA e un 5′-idrossile nel prodotto 3′ RNA (B) Schema del ribozima martello. I riquadri neri indicano i nucleotidi altamente conservati nel nucleo catalitico. Strutture secondarie di (C) Struttura tridimensionale del ribozima Hammerhead.

Simile alle proteine ​​​​ribonucleasi come l'RNAsi A, i piccoli ribozimi autodistaccanti stabilizzano la formazione dello stato di transizione ossifosforano bipiramidale attraverso diverse strategie catalitiche, come l'orientamento atomico in linea, la neutralizzazione elettrostatica e la catalisi acido-base generale. In questo modo, i ribozimi nucleolitici sono in grado di catalizzare la scissione dell'RNA a una velocità solo poche volte più lenta rispetto alle loro controparti proteiche. Finora sono state descritte almeno nove classi di piccoli ribozimi autopulenti presenti in natura: il martello (Figura 7.27C), la forcina, l'epatite umana-δ, il satellite Varkud, il GlmS, il twister, il twister sister, l'accetta e i ribozimi a pistola. Dalla sua scoperta 30 anni fa, l'HHR è stato ampiamente utilizzato come ribozima modello per studi strutturali, biochimici e biologici. È composto da un centro catalitico comprendente 15 nucleotidi altamente conservati circondati da tre doppie eliche (da I a III), che adottano una struttura secondaria che ricorda la forma di una testa di squalo martello. A seconda dell'elica aperta, ci sono tre possibili forme permutate circolarmente, denominate tipo I, II o III (Figura 7.27B). Il motivo HHR, come altri piccoli ribozimi come la forcina e l'epatite-δ, è stato storicamente considerato come una peculiarità biologica dei genomi circolari subvirali dell'RNA. Tuttavia, ora sappiamo che piccoli RNA catalitici come l'HHR possono verificarsi numerosi nei genomi del DNA dai batteri agli eucarioti, incluso il nostro genoma, e svolgere diverse funzioni biologiche che stiamo appena iniziando a riconoscere.

Il ribosoma funziona anche come ribozima mediando la formazione del legame ammidico durante la sintesi proteica. La sintesi proteica da uno stampo di mRNA avviene su un ribosoma, una nanomacchina composta da proteine ​​e RNA ribosomiale (rRNA). Il ribosoma è composto da due unità strutturali molto grandi che sono un amalgama di proteine ​​e molecole di rRNA (Figura 7.28). L'unità più piccola (denominata 30S e 40S rispettivamente nei batteri e negli eucarioti) coordina il corretto accoppiamento di basi del codone tripletta sull'mRNA con un altro piccolo RNA adattatore, transfer o tRNA, che porta un amminoacido connesso in modo covalente al sito.

Figura 7.28 La subunità ribosomiale piccola di Thermus thermophilus. L'RNA ribosomiale 16S è mostrato in arancione con proteine ​​ribosomiali attaccate in blu.

La formazione del legame peptidico si verifica quando un'altra molecola di tRNA-amminoacido si lega a un codone adiacente sull'mRNA. Il tRNA ha una struttura terziaria a quadrifoglio con una struttura secondaria legata all'H intrastranded. Gli ultimi tre nucleotidi all'estremità 3′ del tRNA sono CpCpA. L'amminoacido è esterificato al terminale 3’OH del terminale A da un enzima proteico, l'aminoacil-tRNA sintetasi.

La formazione di un legame ammidico covalente tra il secondo amminoacido e il primo, formando un dipeptide, avviene al centro della peptidil transferasi, situato sulla subunità ribosomiale più grande (rispettivamente 50S e 60S nei batteri e negli eucarioti). Il ribosoma abbassa l'mRNA in modo che il dipeptide-tRNA si trovi ora nel sito P o peptide, in attesa di un nuovo tRNA-amminoacido nel sito A o amminico. La Figura 7.29 mostra uno schema del ribosoma con mRNA legato sulla subunità 30S e tRNA legati in modo covalente all'amminoacido (o al peptide in crescita) nel sito A e P, rispettivamente.

Figura 7.29 Rappresentazione schematica di un ribosoma batterico. Le subunità 50s (giallo) e 30s (blu) del ribosoma sono composte da proteine ​​e rRNA. L'mRNA (filo lineare rosso) è mostrato agganciato alla subunità 30s. I siti P e A sono pieni di molecole di tRNA (verde e rosso).

Un probabile meccanismo per la formazione del legame ammidico tra un peptide in crescita sul tRNA del sito P e l'amminoacido sul tRNA del sito A è stato derivato da strutture cristalline con substrati legati e analoghi dello stato di transizione ed è mostrato nella Figura 7.30. La catalisi non coinvolge nessuna delle proteine ​​ribosomiali (non mostrate) poiché nessuna è abbastanza vicina al centro della peptidil transferasi per fornire amminoacidi che potrebbero partecipare alla catalisi acido/base generale. Quindi l'rRNA deve fungere da enzima (cioè è un ribozima). Inizialmente si pensava che un'adenosina prossimale con un pKa perturbato potesse, a pH fisiologico, essere protonata/deprotonata e quindi agire come acido/base generale nella reazione. Tuttavia, nessuno è stato trovato. Il meccanismo più probabile per stabilizzare lo stato di transizione dell'ossianione nel sito di attacco del carbonio elettrofilo è l'acqua localizzata con precisione, che è posizionata nel foro dell'ossianione dai legami H all'uracile 2584 sull'rRNA. Il meccanismo di scissione coinvolge il rimescolamento concertato dei protoni mostrato nella Figura 7.30. In questo meccanismo, il substrato (Peptide-tRNA) assiste la propria scissione in quanto il 2’OH è in posizione per avviare il meccanismo della navetta proteica. (Potrebbe verificarsi un meccanismo simile per facilitare l'idrolisi della proteina completamente allungata dal tRNA del sito P.) Naturalmente tutto ciò richiede un posizionamento perfetto dei substrati e non è che quali enzimi fanno meglio? I principali meccanismi di catalisi della formazione del legame peptidico da parte del ribosoma (come ribozima) sono la catalisi intramolecolare e la stabilizzazione dello stato di transizione da parte della molecola d'acqua opportunamente posizionata.

Figura 7.30 Meccanismo di formazione del legame peptidico. La formazione del legame peptidico è probabilmente mediata da un meccanismo di navetta protonica che è stabilizzato da una molecola d'acqua coordinata all'interno del foro dell'ossianione.

La struttura cristallina del ribosoma eucariotico è stata recentemente pubblicata (Ben-Shem et al). È significativamente più grande (40%) della controparte procariota, con una massa di circa 3吆 6 Dalton. La subunità 40S ha una catena di rRNA (18S) e 33 proteine ​​associate, mentre la subunità 60S più grande ha 3 catene di rRNA (25S, 5.8S e 5S) e 46 proteine ​​associate. Le maggiori dimensioni del ribosoma eucariotico facilitano maggiori interazioni con le proteine ​​cellulari e una maggiore regolazione degli eventi cellulari. La struttura di un ribosoma eucariotico 80S che mostra interazioni tra rRNA e proteine ​​è mostrata nella Figura 7.31.

Figura 7.31 Ribosoma 80S eucariotico. La subunità 40S è a sinistra, la subunità 60S a destra. Il nucleo dell'RNA ribosomiale (rRNA) è rappresentato come un tubo grigio, i segmenti di espansione sono mostrati in rosso. Le proteine ​​universalmente conservate sono mostrate in blu. Queste proteine ​​hanno omologhi negli eucarioti, negli archei e nei batteri. Le proteine ​​condivise solo tra eucarioti e archaea sono mostrate in arancione e le proteine ​​specifiche per gli eucarioti sono mostrate in rosso. Identificatori PDB 4a17, 4A19, 2XZM allineati a 3U5B, 3U5C, 3U5D, 3U5E


Controllo del metabolismo attraverso la regolazione degli enzimi

Le cellule regolano i loro processi biochimici inibendo o attivando gli enzimi.

Obiettivi formativi

Spiegare l'effetto di un enzima sull'equilibrio chimico

Punti chiave

Punti chiave

  • Nell'inibizione competitiva, una molecola inibitrice compete con un substrato legandosi al sito attivo dell'enzima in modo che il substrato venga bloccato.
  • Nell'inibizione non competitiva (nota anche come inibizione allosterica), un inibitore si lega a un sito allosterico, il substrato può ancora legarsi all'enzima, ma l'enzima non è più nella posizione ottimale per catalizzare la reazione.
  • Gli inibitori allosterici inducono un cambiamento conformazionale che cambia la forma del sito attivo e riduce l'affinità del sito attivo dell'enzima per il suo substrato.
  • Gli attivatori allosterici inducono un cambiamento conformazionale che cambia la forma del sito attivo e aumenta l'affinità del sito attivo dell'enzima per il suo substrato.
  • L'inibizione del feedback comporta l'uso di un prodotto di reazione per regolare la propria ulteriore produzione.
  • I cofattori inorganici e i coenzimi organici promuovono l'orientamento e la funzione ottimali degli enzimi.
  • Le vitamine agiscono come coenzimi (o precursori di coenzimi) e sono necessarie per il funzionamento degli enzimi.

Parole chiave

  • coenzima: Una molecola organica necessaria per il funzionamento di un enzima.
  • sito allosterico: Un sito diverso dal sito attivo su un enzima.
  • cofattore: Una molecola inorganica necessaria per il funzionamento di un enzima.

Controllo del metabolismo attraverso la regolazione degli enzimi

Le esigenze e le condizioni cellulari variano da cellula a cellula e cambiano all'interno delle singole cellule nel tempo. Ad esempio, una cellula dello stomaco richiede una quantità di energia diversa rispetto a una cellula della pelle, una cellula di accumulo di grasso, una cellula del sangue o una cellula nervosa. La stessa cellula dello stomaco può anche aver bisogno di più energia subito dopo un pasto e meno energia tra i pasti.

La funzione di una cellula è incapsulata dalle reazioni chimiche che può svolgere. Gli enzimi abbassano le energie di attivazione delle reazioni chimiche nelle cellule, promuovono quelle reazioni che sono specifiche della funzione delle cellule. Poiché gli enzimi determinano in ultima analisi quali reazioni chimiche una cellula può svolgere e la velocità con cui possono procedere, sono fondamentali per la funzionalità cellulare.

Inibizione competitiva e non competitiva

La cellula utilizza molecole specifiche per regolare gli enzimi al fine di promuovere o inibire determinate reazioni chimiche. A volte è necessario inibire un enzima per ridurre la velocità di reazione, e questa inibizione può verificarsi in più di un modo. Nell'inibizione competitiva, una molecola inibitrice è abbastanza simile a un substrato da potersi legare al sito attivo dell'enzima per impedirgli di legarsi al substrato. “compete” con il substrato per legarsi all'enzima.

Nell'inibizione non competitiva, una molecola inibitrice si lega all'enzima in una posizione diversa dal sito attivo (un sito allosterico). Il substrato può ancora legarsi all'enzima, ma l'inibitore cambia la forma dell'enzima quindi non è più nella posizione ottimale per catalizzare la reazione.

Inibizione enzimatica: L'inibizione competitiva e non competitiva influenzano la velocità di reazione in modo diverso. Gli inibitori competitivi influenzano la velocità iniziale, ma non influenzano la velocità massima, mentre gli inibitori non competitivi influenzano la velocità massima.

Inibizione e attivazione allosterica

Nell'inibizione allosterica non competitiva, le molecole inibitorie si legano a un enzima nel sito allosterico. Il loro legame induce un cambiamento conformazionale che riduce l'affinità del sito attivo dell'enzima per il suo substrato. Il legame di questo inibitore allosterico modifica la conformazione dell'enzima e il suo sito attivo, quindi il substrato non è in grado di legarsi. Ciò impedisce all'enzima di abbassare l'energia di attivazione della reazione e la velocità di reazione viene ridotta.

Tuttavia, gli inibitori allosterici non sono le uniche molecole che si legano ai siti allosterici. Gli attivatori allosterici possono aumentare le velocità di reazione. Si legano a un sito allosterico che induce un cambiamento conformazionale che aumenta l'affinità del sito attivo dell'enzima per il suo substrato. Ciò aumenta la velocità di reazione.

Inibitori e attivatori allosterici: Gli inibitori allosterici modificano il sito attivo dell'enzima in modo che il legame al substrato sia ridotto o impedito. Al contrario, gli attivatori allosterici modificano il sito attivo dell'enzima in modo che l'affinità per il substrato aumenti.

Cofattori e Coenzimi

Molti enzimi funzionano solo se legati a molecole helper non proteiche chiamate cofattori e coenzimi. Il legame a queste molecole promuove una conformazione e una funzione ottimali per i rispettivi enzimi. Queste molecole si legano temporaneamente attraverso legami ionici o idrogeno o permanentemente attraverso legami covalenti più forti.

I cofattori sono ioni inorganici come ferro (Fe 2+ ) e magnesio (Mg 2+ ). Ad esempio, la DNA polimerasi richiede uno ione zinco (Zn 2+ ) per costruire molecole di DNA. I coenzimi sono molecole ausiliarie organiche con una struttura atomica di base costituita da carbonio e idrogeno. I coenzimi più comuni sono le vitamine alimentari. La vitamina C è un coenzima per più enzimi che partecipano alla costruzione del collagene, un componente importante del tessuto connettivo. La piruvato deidrogenasi è un complesso di diversi enzimi che richiede un cofattore e cinque diversi coenzimi organici per catalizzare la sua reazione chimica. La disponibilità di vari cofattori e coenzimi regola la funzione enzimatica.

Vitamine: Le vitamine sono importanti coenzimi o precursori di coenzimi e sono necessarie per il corretto funzionamento degli enzimi. Le capsule multivitaminiche contengono solitamente miscele di tutte le vitamine in percentuali diverse.

Compartimentazione degli enzimi

Nelle cellule eucariotiche, le molecole come gli enzimi sono solitamente compartimentate in diversi organelli. Questa organizzazione contribuisce alla regolazione degli enzimi perché alcuni processi cellulari sono contenuti in organelli separati. Ad esempio, gli enzimi coinvolti nelle fasi successive della respirazione cellulare svolgono reazioni esclusivamente nei mitocondri. Gli enzimi coinvolti nella digestione dei detriti cellulari e dei materiali estranei si trovano all'interno dei lisosomi.

Inibizione del feedback nelle vie metaboliche

L'inibizione del feedback è quando un prodotto di reazione viene utilizzato per regolare la propria ulteriore produzione. Le cellule si sono evolute per utilizzare l'inibizione a feedback per regolare l'attività enzimatica nel metabolismo, utilizzando i prodotti delle reazioni enzimatiche per inibire un'ulteriore attività enzimatica. Le reazioni metaboliche, come i processi anabolici e catabolici, devono procedere secondo le richieste della cellula. Al fine di mantenere l'equilibrio chimico e soddisfare le esigenze della cellula, alcuni prodotti metabolici inibiscono gli enzimi nella via chimica mentre alcuni reagenti li attivano.

Inibizione del feedback: Le vie metaboliche sono una serie di reazioni catalizzate da più enzimi. L'inibizione del feedback, in cui il prodotto finale del percorso inibisce un passaggio precedente, è un importante meccanismo di regolazione nelle cellule.

La produzione di entrambi gli amminoacidi e nucleotidi è controllata attraverso l'inibizione del feedback. Per un esempio di inibizione del feedback, si consideri l'ATP. È il prodotto del metabolismo catabolico dello zucchero (respirazione cellulare), ma funge anche da regolatore allosterico per gli stessi enzimi che lo hanno prodotto. L'ATP è una molecola instabile che può dissociarsi spontaneamente in ADP se fosse presente troppo ATP, la maggior parte andrebbe sprecata. Questa inibizione del feedback impedisce la produzione di ATP aggiuntivo se è già abbondante. Tuttavia, mentre l'ATP è un inibitore, l'ADP è un attivatore allosterico. Quando i livelli di ADP sono alti rispetto ai livelli di ATP, l'ADP innesca il catabolismo dello zucchero per produrre più ATP.