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Ci sono situazioni in cui i risultati in vivo funzionano meglio di quanto i risultati in vitro avrebbero mostrato?

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Fondamentalmente, se ho risultati scarsi in linee cellulari in vitro ma ho deciso di testarli comunque in vivo su un topo, quali sono le possibilità di avere risultati migliori nel modello di topo vivo in vivo che altrimenti non avrei mai saputo dai risultati in vitro?

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Differenze tra in vitro e in vivo i risultati sono (purtroppo) molto comuni!

In qualche modo, tutto è fallito test clinici (e molti studi preclinici) sono esempi su larga scala della discrepanza tra promettenti in vitro e reale in vivo risultati - che evidenzia anche il fatto che anche da uno in vivo sistema (es. topi) all'altro (es. umani), possono esserci differenze biologiche significative e imprevedibili. È l'opposto del tuo caso, in cui ti aspetti un miglioramento quando ti trasferisci in animali vivi, ma è anche più comune.

Per essenza, il tuo in vitro la cultura non sarà in grado di ricapitolare processi chiave come:

  • Segnali forniti dalla matrice extracellulare naturale. Le tue cellule sono probabilmente cresciute su polistirene, ma quel substrato è lontano dalla complessità delle molecole naturali che circondano le cellule in vivo: rigidità, molecole segnale immobilizzate…
  • Informazioni fornite da altri tipi di cellule. Gli organi sono formati da molte sottopopolazioni dinamiche (cellule staminali, cellule immunitarie, ecc.), alcune sconosciute, che interagiscono e controllano il comportamento cellulare su scala tissutale.
  • Informazioni fluttuanti come cicli e comportamenti biologici (ritmo circadiano, sonno, assunzione di cibo…)
  • Molti altri come ad esempio i processi immunitari, la (de)attivazione di piccole molecole da parte di enzimi in organi non correlati (fegato) o plasma...

Tutti questi fattori possono cambiare il tuo risultato in modi imprevedibili, rendendoli migliori o peggiori. Ma, e questo è importante, il più delle volte, i sistemi biologici complessi tendono a peggiorare le cose, poiché introducono rumore extra, effetti tampone ecc., quindi il più delle volte, le cose non saranno così buone in un vero animale come in una capsula di Petri. Può migliorare, certo, ma è estremamente improbabile!

Questo è uno dei motivi principali per cui le persone lo fanno in vitro lavorare prima: è più veloce, più economico e più etico, e il fallimento in vitro è di solito un buon predittore di guasto a valle in vivo.

Per favore, non scegliere una risposta che ti dice il contrario! È più facile e più confortante pensare che tutto funzionerà se ti trasferisci solo sugli animali, sì, ma molto probabilmente perderai tempo, denaro e vite di animali per risultati identici. Il mio consiglio (non richiesto) è di costruire un migliore in vitro modello, ciò ridurrà le possibili differenze tra i risultati delle cellule e i modelli animali: puoi imitare un ambiente biologicamente rilevante aggiungendo una matrice di proteine/zuccheri alle tue cellule? Riesci a trovare cellule primarie che si comporteranno in modo più naturale delle linee cellulari immortalizzate? Puoi fare colture cellulari miste per migliorare l'adeguatezza del tuo modello alla realtà? Se fai tutto questo, i tuoi risultati dovrebbero essere molto più affidabili e avrai un'idea migliore di cosa aspettarti in vivo.


Modellazione dell'assorbimento PBPK: stabilire il In vitro–In vivo Link—Prospettiva del settore

La costituzione di an in vitroin vivo correlazione (IVIVC) è considerata il gold standard da stabilire in vivo pertinenza di un metodo di dissoluzione e di utilizzare i dati di dissoluzione nel contesto di questioni di bioequivalenza normativa, compreso lo sviluppo di specifiche di dissoluzione. Tuttavia, diverse pubblicazioni recenti, inclusi sondaggi del settore e revisioni da parte delle agenzie di regolamentazione, hanno indicato un basso tasso di successo per gli IVVC, in particolare per le formulazioni a rilascio immediato. Negli ultimi anni, l'uso della farmacocinetica a base fisiologica (PBPK) e dei modelli di assorbimento, come strumento per facilitare lo sviluppo della formulazione, ha attirato maggiore attenzione. Questo manoscritto fornisce una prospettiva del settore sulle attuali sfide con la creazione di IVIVC e la potenziale offerta di modelli PBPK e di assorbimento per aumentare il loro impatto. Casi di studio su formulazioni sia a rilascio immediato che a rilascio prolungato di cinque aziende farmaceutiche sono utilizzati per dimostrare come IVIVC (PB-IVIVC) a base fisiologica può facilitare la comprensione del prodotto farmaceutico e per informare la valutazione della bioequivalenza e le specifiche clinicamente rilevanti. Infine, vengono proposte le migliori pratiche PB-IVIVC e una strategia per lo sviluppo e l'applicazione del modello.

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BREVE RAPPORTO DI RICERCA articolo

Alain Trautmann 1 * , Hugues Gascan 2 e Raouf Ghozzi 3 *
  • 1 Université de Paris, Institut Cochin, INSERM U1016, CNRS UMR8104, Parigi, Francia
  • 2 Institut de Génétique et Développement de Rennes (IGDR), Rennes, Francia
  • 3 Centre Hospitalier de Lannemezan, Lannemezan, Francia

Recentemente, il disulfiram è stato proposto come trattamento promettente per le persone che soffrono di sintomi persistenti della malattia di Lyme. Disulfiram ha diversi bersagli molecolari distinti. Il più noto è l'alcol deidrogenasi, un enzima chiave per la disintossicazione dell'organismo dopo l'ingestione di alcol. Altri bersagli e modalità d'azione del disulfiram, che possono presentare effetti collaterali problematici, sono menzionati meno comunemente. Il Federazione francese contro le malattie trasmesse da zecche (acronimo francese, FFMVT), che associa tre principali organizzazioni di pazienti di Lyme, medici e dottori di ricerca, è stato recentemente allertato di eventi tossici gravi e persistenti in un paziente affetto da una forma tardiva della malattia di Lyme a seguito dell'assunzione di disulfiram. La FFMVT ha reagito lanciando un appello nazionale per esaminare se si potessero identificare altri pazienti in Francia che seguono un trattamento simile e quali benefici o effetti collaterali potrebbero essere riportati. Le dichiarazioni di 16 pazienti che assumono disulfiram sono state raccolte e presentate qui. Tredici pazienti su 16 hanno riportato eventi tossici e sette su 16 hanno riportato benefici per almeno una parte dei loro sintomi. Sulla base delle osservazioni raccolte, sembra troppo presto per promuovere il disulfiram come un nuovo trattamento promettente fino a quando non saranno state esplorate le ragioni alla base delle tossicità segnalate e non saranno stati pubblicati i risultati di uno studio clinico in doppio cieco ben condotto. L'importanza di prendere in considerazione gli esiti riportati dai pazienti nella malattia di Lyme è sottolineata dal presente studio.


Introduzione

Le nanoparticelle di ossido di cerio (CeNP) possiedono una potente attività antiossidante attribuibile a una struttura reticolare cristallina con vacanze di ossigeno per l'acquisizione o il rilascio di elettroni durante la fluttuazione da uno stato Ce +3 a uno stato Ce +4 (Reed etਊl., 2014) . In cell-free e in vitro modelli cellulari/tessuti, questa attività catalitica imita la funzione degli enzimi endogeni catalasi (Pirmohamed etਊl., 2010) e superossido dismutasi (SOD) (Korsvik etਊl., 2007) al fine di neutralizzare una varietà di specie reattive dell'ossigeno ( ROS), tra cui ossido nitrico (Dowding etਊl., 2012), superossido (Pirmohamed etਊl., 2010) e perossinitrito (Dowding etਊl., 2013). Come altri nanomateriali, i CeNP possono essere prodotti con una serie di metodi di sintesi, ottenendo diverse dimensioni delle particelle, cariche superficiali e potenziali zeta. Inoltre, la funzionalizzazione delle particelle con stabilizzanti e materiali di rivestimento altera potenzialmente una varietà di fattori tra cui l'attività catalitica (Lee etਊl., 2013 Dunnick etਊl., 2015), le tendenze di aggregazione (Ould-Moussa etਊl., 2014), formazione della corona favorendo le particelle con un negativo in vitro potenziale zeta (Patil etਊl., 2007), probabilità di assorbimento cellulare (Patil etਊl., 2007) e modello di biodistribuzione, che varia anche con la via di somministrazione e la dimensione delle particelle (Yokel etਊl., 2009 Hardas et's xa0al., 2010 Hirst etਊl., 2013 Yokel etਊl., 2013).

Sebbene siano stati studiati gli effetti tossicologici dell'esposizione accidentale e professionale ai CeNP, i CeNP sono stati sempre più applicati a modelli di malattia, in particolare quelli che coinvolgono lo stress ossidativo (Heckman etਊl., 2013 Bailey etਊl., 2016 DeCoteau etਊl., 2016 Kwon etਊl., 2016 Naz etਊl., 2017). La somministrazione di CeNP si è recentemente dimostrata efficace in modelli di trauma cranico (Bailey etਊl., 2016), sclerosi laterale amiotrofica (SLA) (DeCoteau etਊl., 2016), danno polmonare indotto da radiazioni (Xu etਊl., 2016), epatopatia cronica (Oró etਊl., 2016) o danno renale (Manne etਊl., 2015a), peritonite (Manne etਊl., 2015b) e obesità (Rocca et& #xa0al., 2015). Anche se si è tentati di estrapolare l'applicabilità di questi risultati a Tutti CeNPs, anche solo in questi pochi studi, le particelle utilizzate variano da 3� nm di dimensione, hanno mostrato quantità variabili di aggregazione e sono state somministrate a dosi che vanno da 0,0007 mg/kg (Xu etਊl., 2016) a 20 mg /kg (DeCoteau etਊl., 2016) per i topi e da 0,05 mg/kg (Bailey etਊl., 2016) a 0,5 mg/kg (Rocca etਊl., 2015) per i ratti. Pertanto, mentre diverse formulazioni di CeNP hanno mostrato attività antiossidante, lo studio parallelo dell'attività catalitica e dell'efficacia biologica dei CeNP rafforzerebbe la nostra comprensione di come le caratteristiche uniche dei CeNP influenzino la loro funzione.

Studiamo CeNP personalizzati (CNRx) con caratteristiche distinte da altre formulazioni di nanoceria. Questi CeNP sono relativamente piccoli a 1.5𠄳.0 nm e sono stabilizzati con citrato ed EDTA. Sebbene i nanomateriali assorbano tipicamente un alto numero di proteine ​​nella loro corona (Monopoli etਊl., 2012), solo un numero relativamente piccolo di proteine ​​aderisce ai CeNP CNRx (Heckman etਊl., 2014): un profilo di molecole che promuovere l'assorbimento mediato dal recettore (ApoE) e la transcitosi (albumina). Questi CeNP esibiscono catalasi e attività simile alla SOD in vitro, consentendo la riduzione dei livelli di ROS nelle fette di cervello di ippocampo murino esposte ex vivo alle condizioni ischemiche (Estevez etਊl., 2019). Inoltre, i CeNP si oppongono ai cambiamenti indotti dal perossido o dall'ischemia nel potenziale di riduzione dell'ossidazione del tessuto cerebrale (DeCoteau etਊl., 2016). Questa attività antiossidante si traduce in in vivo efficacia in modelli murini di sclerosi multipla mediati da stress ossidativo [encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE)] (Heckman etਊl., 2013) e SLA (DeCoteau etਊl., 2016). I topi indotti con EAE trattati per via endovenosa con CNRx CeNP hanno mostrato una ridotta gravità della malattia clinica e hanno mantenuto la funzione motoria simile ai topi trattati con un farmaco attualmente prescritto, Fingolimod. Livelli ridotti intracellulari di ROS rilevati nel cervello degli animali trattati supportano un meccanismo di protezione antiossidante (Heckman etਊl., 2013).

Nonostante l'efficacia dei CeNP personalizzati CNRx nel modello EAE, il trattamento dei topi EAE con un'altra formulazione di CeNP non è riuscito a fornire protezione contro i sintomi e a preservare la funzione motoria, a meno che non fosse somministrato insieme al farmaco immunomodulatore lenalidomide (Eitan etਊl., 2015). Questa formulazione di CeNPs era caratterizzata da un raggio idrodinamico di 34 +/− 6.8 nm (in soluzione acquosa) (Eitan etਊl., 2015), una dimensione che potrebbe aver ostacolato l'afflusso nel cervello (il contenuto cerebrale di ceria era non presentato) e quindi può essere almeno in parte responsabile della mancanza di risultati biologici benefici in questo contesto. Tuttavia, la mancanza di analisi della deposizione tissutale e di caratterizzazione dei livelli di ROS o del danno nel cervello dei topi trattati rende difficile individuare il motivo preciso per cui quest'altra formulazione di CeNP non è riuscita a prevenire lo sviluppo di EAE in questo studio.

Pertanto, per riconciliare gli effetti differenziali osservati di distinte formulazioni di CeNP, abbiamo condotto un esperimento EAE per testare l'efficacia terapeutica di diverse formulazioni di CeNP in parallelo. In vitro la caratterizzazione di Cerion NRx custom CeNPs (CNRx CeNPs) (Heckman etਊl., 2013), Nanophase CeNPs (NP CeNPs) e Treibacher Industrie CeNPs (TI CeNPs) ha indicato caratteristiche fisiche distinte ma attività antiossidante ragionevolmente simile per i tre tipi di CeNPs nei sistemi privi di cellule, nel tessuto cerebrale ischemico e nei macrofagi attivati. Tuttavia, solo i CeNP CNRx esibiti in vivo efficacia, proteggendo i topi EAE dalla progressione dei sintomi e dai deficit motori. Queste osservazioni dimostrano che gli effetti biologici osservati con un tipo di CeNP non possono essere necessariamente generalizzati a Tutti forme di CeNP e, inoltre, che in vitro gli effetti biologici potrebbero non tradursi in effetti corrispondenti in vivo.


Le più ampie conseguenze di studi mal progettati

Molti dei problemi che affliggono la progettazione sperimentale nella ricerca sugli animali non sono unici. Il lavoro preliminare del gruppo di Sena, ad esempio, ha scoperto che gli studi preclinici in vitro spesso in realtà soffrono più degli studi sugli animali a causa di una progettazione sperimentale scadente. "Ho avuto uno studente universitario che lavorava con me che ha fatto un progetto pilota che esaminava il disegno di uno studio in vitro, e nessuno degli studi che ha esaminato nel suo campione è stato randomizzato, e nessuno di loro è stato cieco", dice Sena, osservando che il minor livello di controllo e il minor costo associati alla ricerca in vitro potrebbero essere fattori che contribuiscono.

Tuttavia, i costi associati a studi mal progettati sono amplificati per la ricerca sugli animali a causa delle difficili questioni etiche che sollevano e stanno iniziando ad avere conseguenze reali per la comunità scientifica man mano che aumenta la consapevolezza pubblica nei loro confronti. In Svizzera, ad esempio, oltre a procedure più rigorose per la licenza degli animali, si sta sviluppando una pressione politica per ridurre o eliminare la sperimentazione animale. Ad aprile, il governo federale ha annunciato che avrebbe tenuto un referendum nazionale sul divieto totale degli esperimenti sugli animali dopo che una campagna per tale voto, lanciata da un gruppo di cittadini svizzeri, ha ottenuto più di 100.000 firmatari. La mossa ha suscitato critiche da parte del Fondo nazionale svizzero per la scienza e di swissuniversities, un gruppo di istituti di istruzione superiore, che affermano che l'approvazione di una legge del genere ostacolerebbe la ricerca. Il voto dovrebbe svolgersi intorno al 2022.

Il dibattito dovrebbe fungere da campanello d'allarme per i ricercatori che lavorano con gli animali, afferma Würbel. "[Gli scienziati] devono convincere le persone che ciò che [stanno] facendo è utile, valido e prendono sul serio le preoccupazioni etiche", spiega. "Ma puoi farlo in modo convincente solo se ti assicuri che la scienza sia rigorosa e che hai fatto tutto il possibile per assicurarti che il danno imposto agli animali sia il minimo possibile".


Modelli di leucemogenesi che coinvolgono FLT3

Numerosi modelli hanno studiato il ruolo potenziale della segnalazione FLT3 nella leucemogenesi. La trasfezione di linee cellulari dipendenti da fattori non maligni con forme costitutivamente attivate di FLT3 determina una crescita indipendente dal fattore e leucemia quando queste cellule vengono iniettate in topi singenici. 18 Tuttavia, la trasfezione retrovirale di cellule primarie del midollo osseo murino con mutazioni FLT3 non causa leucemia, ma piuttosto provoca una malattia mieloproliferativa oligoclonale fatale (MPD) con un tempo medio di sviluppo di 40-60 giorni. 19 La mancanza di policlonalità potrebbe essere un indizio che i siti di inserzione retrovirale potrebbero attivare altri geni che potrebbero contribuire al fenotipo MPD. Quando le mutazioni FLT3 sono combinate con altre alterazioni genetiche, si verifica la completa trasformazione in leucemia. Ad esempio, quando le mutazioni FLT3/ITD vengono utilizzate per infettare retrovirus BM da topi transgenici MRP8 PML-RARα che modellano l'APL, la trasformazione completa in leucemia acuta avviene con un tempo di ritardo ridotto rispetto alla malattia che si verifica nei topi senza infezione da FLT3/ITD (da una mediana di 250 giorni senza a 105 giorni con un FLT3/ITD). 20 Inoltre, questi topi tendono ad avere l'iper-leucocitosi che caratterizza la LMA M3 nei pazienti con mutazioni FLT3/ITD. Anche in questo caso la malattia è oligoclonale, il che implica che anche i siti di inserzione retrovirale potrebbero contribuire. Altre alterazioni genetiche che provocano la leucemia quando combinate con mutazioni FLT3 attraverso l'infezione retrovirale del midollo osseo murino includono: NUP98-Hox, AML1-ETO, MLL-ENL e MLL-SEPT6.

Sono stati riportati anche modelli murini transgenici che esprimono mutazioni FLT3. Quando un FLT3/ITD viene espresso per via transgenica sotto il controllo del promotore vav, risulta in MPD con una latenza della malattia di 6-12 mesi nella maggior parte delle linee fondatrici e una malattia linfoide B o T in altre due linee fondatrici. 21 Il grande ritardo nello sviluppo di MPD potrebbe implicare che altre alterazioni siano necessarie per cooperare con la segnalazione FLT3/ITD per dare MPD o neoplasie linfoidi.

C'è anche qualche evidenza da un modello murino che l'attivazione costitutiva di FLT3 wild-type può contribuire alla leucemogenesi. Ciò deriva da un esperimento in cui il trapianto di topi irradiati in modo letale con cellule staminali/progenitrici del midollo osseo murino trasdotte con un costrutto che esprime FL ha sviluppato leucemie linfoidi o mieloidi dopo un lungo periodo di latenza. 22


Astratto

I biologi sono stati a lungo incuriositi dalla possibilità che le cellule possano cambiare la loro identità, un fenomeno noto come plasticità cellulare. La scoperta che le cellule differenziate in modo terminale possono essere indotte sperimentalmente a diventare pluripotenti ha rinvigorito il campo e studi recenti hanno dimostrato che i cambiamenti nell'identità cellulare non sono limitati al laboratorio. In particolare, alcune cellule adulte mantengono la capacità di de-differenziare o transdifferenziare in condizioni fisiologiche, come parte della normale risposta al danno di un organo. Studi recenti hanno evidenziato la misura in cui la plasticità cellulare contribuisce all'omeostasi dei tessuti, risultati che hanno implicazioni per la terapia cellulare.


Introduzione

Il lavaggio delle mani con acqua e/o sapone è un metodo importante ed economico per prevenire la trasmissione dell'infezione perché è efficace nel rimuovere dalle mani i contaminanti, inclusi batteri o virus patogeni. 1-3 Al giorno d'oggi, l'industria produce una varietà di saponi commerciali descritti come "antibatterici" o "antimicrobici". Il sapone antibatterico si riferisce al sapone contenente ingredienti con attività antimicrobica attiva, d'altra parte il sapone normale non contiene tali ingredienti. 3 Milioni di consumatori negli USA usano sapone antibatterico per le mani e prodotti per il bagno, 4 spendendo quasi 1 miliardo di dollari all'anno: l'aspettativa è che questi prodotti forniscano una maggiore protezione dagli agenti patogeni rispetto al semplice sapone. 5

Nel dicembre 2013, il Center for Drug Evaluation and Research (CDER) della FDA statunitense ha proposto un emendamento alla monografia provvisoria finale (TFM) del 1994 relativa ai prodotti antisettici da banco. 6 Ciò ha affermato che i produttori di saponi per le mani antibatterici destinati all'uso con acqua devono dimostrare di essere più sicuri e più efficaci del semplice sapone e acqua quando si tratta di prevenire malattie e/o la diffusione di infezioni. Se il produttore non è in grado di fornire prove scientifiche a sostegno delle affermazioni, questi prodotti dovranno essere riformulati o rietichettati per rimanere sul mercato.

Triclosano (C12h17Cl3oh2 2,4,4′-tricloro-2′-idrossidifenil etere) è l'ingrediente antisettico attivo più comune utilizzato nel sapone. Il triclosan è un agente antimicrobico fenossifenolo sviluppato per la prima volta nei primi anni '60 ed è stato ampiamente utilizzato come agente antibatterico o antimicotico dagli anni '70. 3 Viene aggiunto a vari prodotti per la cura della persona e cosmetici, inclusi sapone, dentifricio, lozioni e shampoo, nonché ad altri prodotti, come vestiti, stoviglie, mobili e giocattoli, con l'obiettivo di ridurre o prevenire la contaminazione e la crescita batterica. 7, 8 La maggior parte dei saponi liquidi per le mani commercializzati come "antibatterici" contengono triclosan come ingrediente attivo. 9 Uno studio condotto nel 2001 ha rilevato che circa il 76% dei saponi liquidi per le mani e il 29% delle saponette conteneva triclosan. 10

Il triclosan ha attività antibatterica contro batteri, funghi e virus infatti, non ci sono dubbi che il composto abbia attività antimicrobica. 11, 12 Tuttavia, l'uso del triclosan rimane controverso perché sono stati segnalati vari effetti avversi, tra cui allergie, resistenza agli antibiotici, disturbi endocrini, tossicità acuta/cronica e bioaccumulo, uno studio ha persino identificato impurità cancerogene. 9, 11, 13-19 Inoltre, l'efficacia del sapone antibatterico è stata inconcludente e rimangono dubbi sul fatto che il sapone antibatterico sia più efficace del sapone normale. Ci sono state due revisioni della letteratura sull'efficacia del sapone antibatterico. 9, 20 Aiello et al. 9 hanno concluso che i saponi antibatterici contenenti triclosan non erano più efficaci del semplice sapone. D'altra parte, Montville e Schaffner 20 hanno concluso che i saponi antibatterici hanno portato a riduzioni significativamente maggiori della conta batterica rispetto ai saponi semplici, sebbene le differenze fossero piccole (differenza di riduzione di circa 0,5 log). Queste preoccupazioni sulla sicurezza e l'efficacia hanno fornito lo sfondo per la proposta di decisione della FDA. 6

La maggior parte degli studi ha esaminato l'attività antibatterica del triclosan determinandone la MIC. 12, 21-26 Tuttavia, la FDA sostiene che il test MIC non è rilevante quando si valuta l'efficacia degli ingredienti antisettici, poiché il test MIC richiede chiaramente un lungo tempo di esposizione (almeno 1 giorno), questo non replica il tipico tempo di esposizione di un consumatore a prodotti contenenti antimicrobici. 6 La FDA ha recentemente raccomandato che il "test modificato del tempo di uccisione" venga utilizzato per fornire prove dell'efficacia degli ingredienti antisettici attivi e che la concentrazione del composto e il tempo di contatto dovrebbero riflettere situazioni di vita reale. 6 Inoltre, hanno raccomandato che in vitro gli studi dovrebbero essere eseguiti utilizzando ceppi di riferimento e isolati clinici rappresentativi [20 ceppi (nove generi) 10 Gram-positivi e 10 Gram-negativi]. 6 I nove generi sono i seguenti: Campylobacter, Enterococco, Escherichia, Listeria, Salmonella, Stafilococco, Streptococco, Shigella e Pseudomonas (Tabella 1).

I 20 ceppi batterici proposti dalla FDA statunitense che sono stati testati nel presente studio

Ceppo batterico. Numero ATCC.
Gram positivo
Enterococcus faecalis19433
Enterococcus faecalis29212
Staphylococcus aureus6538
Staphylococcus aureus29213
MRSA 33591
MRSA 33592
Streptococcus pyogenes14289
Streptococcus pyogenes19615
Listeria monocytogenes7644
Listeria monocytogenes19115
Gram-negativi
Campylobacter jejuni33291
Campylobacter jejuni49943
Escherichia coli11775
Escherichia coli25922
Pseudomonas aeruginosa15442
Pseudomonas aeruginosa27853
Salmonella enteritidis 13076
Salmonella Typhimurium 14028
Shigella sonnei9290
Shigella sonnei25931
Ceppo batterico. Numero ATCC.
Gram positivo
Enterococcus faecalis19433
Enterococcus faecalis29212
Staphylococcus aureus6538
Staphylococcus aureus29213
MRSA 33591
MRSA 33592
Streptococcus pyogenes14289
Streptococcus pyogenes19615
Listeria monocytogenes7644
Listeria monocytogenes19115
Gram-negativi
Campylobacter jejuni33291
Campylobacter jejuni49943
Escherichia coli11775
Escherichia coli25922
Pseudomonas aeruginosa15442
Pseudomonas aeruginosa27853
Salmonella enteritidis 13076
Salmonella Typhimurium 14028
Shigella sonnei9290
Shigella sonnei25931

I 20 ceppi batterici proposti dalla FDA statunitense che sono stati testati nel presente studio

Ceppo batterico. Numero ATCC.
Gram positivo
Enterococcus faecalis19433
Enterococcus faecalis29212
Staphylococcus aureus6538
Staphylococcus aureus29213
MRSA 33591
MRSA 33592
Streptococcus pyogenes14289
Streptococcus pyogenes19615
Listeria monocytogenes7644
Listeria monocytogenes19115
Gram-negativi
Campylobacter jejuni33291
Campylobacter jejuni49943
Escherichia coli11775
Escherichia coli25922
Pseudomonas aeruginosa15442
Pseudomonas aeruginosa27853
Salmonella enteritidis 13076
Salmonella Typhimurium 14028
Shigella sonnei9290
Shigella sonnei25931
Ceppo batterico. Numero ATCC.
Gram positivo
Enterococcus faecalis19433
Enterococcus faecalis29212
Staphylococcus aureus6538
Staphylococcus aureus29213
MRSA 33591
MRSA 33592
Streptococcus pyogenes14289
Streptococcus pyogenes19615
Listeria monocytogenes7644
Listeria monocytogenes19115
Gram-negativi
Campylobacter jejuni33291
Campylobacter jejuni49943
Escherichia coli11775
Escherichia coli25922
Pseudomonas aeruginosa15442
Pseudomonas aeruginosa27853
Salmonella enteritidis 13076
Salmonella Typhimurium 14028
Shigella sonnei9290
Shigella sonnei25931

Per quanto a nostra conoscenza, nessuno studio pubblicato ha esaminato l'efficacia antibatterica del triclosan nel sapone contro tutti i 20 ceppi elencati. Pertanto, gli obiettivi del presente studio erano: (i) esaminare gli effetti battericidi del triclosan nei saponi contro tutti i 20 ceppi a temperatura ambiente (22°C) e in acqua calda (40°C) dopo un breve tempo di esposizione (20 S) (in vitro studio) e (ii) confrontare la capacità del sapone normale e del sapone antibatterico di rimuovere/inattivare Serratia marcescens inoculato artificialmente su mani umane (in vivo studio).


CIRCOLARIZZAZIONE IN VITRO

L'ampia presenza di circRNAs in vivo e lo studio delle loro proprietà strutturali e funzionali hanno causato la richiesta di metodi che consentano una preparazione efficiente di RNA circolari in vitro. È disponibile una scelta di protocolli chimici ed enzimatici, la maggior parte tuttavia più adatta a RNA di piccole e medie dimensioni. Questi nella maggior parte dei casi possono essere sintetizzati chimicamente garantendo estremità 5' e 3' omogenee. In vitro la trascrizione è spesso associata all'eterogeneità terminale, diminuendo drasticamente la resa della legatura per la circolarità. Questo può essere superato mediante l'uso di protocolli speciali ( 60). Tuttavia, la circolarità di RNA più grandi rimane impegnativa. Qui, in particolare, gli introni del gruppo I modificati con introni ed esoni permutati (strategia PIE) hanno mostrato grandi promesse. In generale, le strategie di legatura di splint chimiche o enzimatiche sono più facilmente adattabili a qualsiasi sequenza di interesse, mentre i metodi PIE e relativi catalizzati da RNA soffrono di limitazioni di sequenza. Il corretto ripiegamento dell'RNA insieme ai requisiti di sequenza nel sito attivo dei catalizzatori di RNA sono gravi restrizioni associate a queste procedure. Tuttavia, ci sono anche esempi impressionanti della preparazione di grandi molecole di RNA circolari.

Legatura/sintesi chimica

La legatura chimica dei filamenti di acido nucleico è stata introdotta da Shabarova et al. utilizzando bromuro di cianogeno (BrCN) insieme a derivati ​​morfolinici come l'acido 2-(N-morfolino)-etan solfonico (MES) per collegare due filamenti di DNA che trasportano gruppi terminali 5'-idrossile e 3'-fosfato ( 61) (confrontare la Figura 4 ).

Circolarizzazione dell'RNA mediante ligazione chimica con bromuro di cianogeno in presenza di un derivato morfolino come attivatore. R = CH3 CH2CH2COSÌ3H.

Circolarizzazione dell'RNA mediante ligazione chimica con bromuro di cianogeno in presenza di un derivato morfolino come attivatore. R = CH3 CH2CH2COSÌ3H.

Successivamente, altri agenti di condensazione come l'etil-3-(3'-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC) sono stati utilizzati per supportare la formazione del legame fosfodiestereo, tuttavia, BrCN sembra essere il reagente più ampiamente utilizzato (62, 63). Le strategie di ligazione chimica sono utili anche per gli esperimenti di circolarizzazione (64, 65) (Figura 4), a condizione che le due estremità di un filamento lineare di acido nucleico siano avvicinate (confrontare la Figura 5). Ciò è tipicamente ottenuto da una stecca oligonucleotidica che interagisce con i due terminali e consente quindi la circolarità. Naturalmente, la legatura intermolecolare è una reazione severa di competizione, che però può essere soppressa lavorando con piccole concentrazioni dell'acido nucleico da circolarizzare. Una reazione collaterale ancora più grave associata alla legatura chimica dei filamenti di RNA rispetto al DNA è la formazione di legami 2', 5'-fosfodiestere invece del naturale 3', 5'-fosfodiestere. Per aggirare questo problema, spesso vengono utilizzati oligonucleotidi con una frazione 2′-deossizucchero all'estremità 3′ dell'oligonucleotide da circolarizzare (65, 66) (Dati supplementari, Protocolli S1 e S2).

Strategie per giustapporre le estremità reattive per la legatura enzimatica. Si ottiene il pre-orientamento di 5′-p e 3′-OH del substrato di RNA (un) per ibridazione a una stecca. Questa strategia può essere utilizzata per la ligasi con T4 DNA ligasi (necessaria una stecca di DNA), T4 RNA ligasi 1 (necessaria una stecca di RNA) e T4 RNA ligasi 2 (stecca di DNA o RNA) ( 68) (B) da oligonucleotidi a forcina e aiutanti lineari ( 87) (C) da una stecca gap che dopo l'ibridazione lascia i due o tre nucleotidi terminali di entrambe le estremità a singolo filamento alla giunzione di ligazione ( 88) (D) da strutture intrinseche favorevoli (ovvero pieghe con manubri ( 17)). Le strategie (b), (d) e (c) sono favorevoli alla ligasi con T4 RNA ligasi 1. Tutte le strategie possono essere utilizzate anche per la ligazione chimica dell'RNA. Si noti che in questo caso un gruppo 3'-fosfato e un gruppo 5'-OH sono favorevoli.

Strategie per giustapporre le estremità reattive per la legatura enzimatica. Si ottiene il pre-orientamento di 5′-p e 3′-OH del substrato di RNA (un) per ibridazione a una stecca. Questa strategia può essere utilizzata per la ligasi con T4 DNA ligasi (necessaria una stecca di DNA), T4 RNA ligasi 1 (necessaria una stecca di RNA) e T4 RNA ligasi 2 (stecca di DNA o RNA) ( 68) (B) da oligonucleotidi a forcina e aiutanti lineari ( 87) (C) da una stecca gap che dopo l'ibridazione lascia i due o tre nucleotidi terminali di entrambe le estremità a singolo filamento alla giunzione di ligazione ( 88) (D) da strutture intrinseche favorevoli (ovvero pieghe con manubri ( 17)). Le strategie (b), (d) e (c) sono favorevoli alla ligasi con T4 RNA ligasi 1. Tutte le strategie possono essere utilizzate anche per la ligazione chimica dell'RNA. Si noti che in questo caso un gruppo 3'-fosfato e un gruppo 5'-OH sono favorevoli.

Nel 1999, Micura et al. hanno riportato un approccio per la sintesi in fase solida di RNA circolari di lunghezza 2-21 nucleotidi (67). La procedura combina la chimica standard della fosforamidite per l'assemblaggio della catena e la chimica del fosfotriestere per la chiusura dell'anello. Un elemento chiave della procedura è il nucleoside iniziale che viene collegato tramite un fosfodiestere 3' al supporto polimerico. Dopo che l'assemblaggio della catena è terminato, la detritilazione finale genera un gruppo ossidrile 5'-terminale per l'attacco nucleofilo sull'esclusivo fosfodiestere 3'-terminale, portando alla circolarità mentre l'oligonucleotide è ancora legato al polimero. La successiva scissione dei gruppi cianoetilici consente il distacco selettivo degli RNA circolari. Questo è possibile, perché solo i circRNA sono legati attraverso fosfotriesteri tramite an o-clorofenile alla resina e quindi può essere selettivamente rimosso mediante trattamento con tetrametilguanidinio piridina-2-aldossimato. Gli oligoribonucleotidi rimanenti non circolari o mal collegati non vengono rimossi a causa dei loro legami fosfodiestere più stabili. Questo metodo ha permesso la produzione di RNA circolari con una resa media del 15% (67).

Legatura enzimatica

Sono stati sviluppati numerosi protocolli per la ligazione enzimatica di oligonucleotidi sintetici ( 68). Tipicamente, vengono utilizzate tre diverse ligasi polinucleotidiche, in grado di legare nick in costrutti di RNA a singolo e/o doppio filamento: T4 DNA ligasi (T4 Dnl), T4 RNA ligasi 1 (T4 Rnl 1) e T4 RNA ligasi 2 (T4 Rnl 2), tutti codificati nel genoma del batteriofago T4 (69, 70). Catalizzano la formazione di un legame fosfodiestere tra i gruppi terminali 5'-fosfato (donatore) e 3'-idrossile (accettore) nel DNA o nell'RNA in una reazione ATP-dipendente.

Indipendentemente dalla preparazione chimica o enzimatica del precursore lineare, il 5'-terminale deve essere fosforilato per fornire la funzionalità richiesta per la ligazione. La fosforilazione può essere eseguita chimicamente o enzimaticamente ( 71) seguita direttamente dalla reazione di circolarizzazione ( 72) (Dati supplementari, Protocolli S3 e S4). Nel caso di substrati di RNA preparati enzimaticamente, il trifosfato 5′-terminale risultante dalla in vitro La reazione di trascrizione deve essere rimossa prima della fosforilazione da parte di una polinucleotide chinasi. Per aggirare i due passaggi enzimatici di de- e rifosforilazione, GMP-innescato in vitro la trascrizione da parte della T7 RNA Polimerasi è un modo elegante per ottenere substrati di RNA lineare 5′-monofosforilati ( 73, 74), che possono essere utilizzati direttamente per la circolarizzazione dell'RNA ( 16, 75). Nella maggior parte delle pubblicazioni vengono descritti i protocolli per la DNA ligasi T4 e la circolarizzazione mediata dalla RNA ligasi di RNA corti (<500 nt). Substrati di grandi dimensioni in scala kb richiedono strategie diverse, a causa di sfide strutturali. Pertanto, come menzionato sopra, per la circolarizzazione di grandi RNA, i protocolli che utilizzano la strategia PIE (descritta di seguito) possono essere l'alternativa migliore.

T4 DNA ligasi

Quando si utilizza la DNA ligasi T4, il sito di legatura deve essere situato all'interno di una regione a doppio filamento dell'acido nucleico. Le regioni a filamento singolo non sono legate. Una stecca oligonucleotidica può essere utilizzata per creare la regione a doppio filamento richiesta attorno al sito di legatura e oltre a garantire la giustapposizione dei terminali 5'-fosfato e 3'-idrossile nel DNA o RNA duplex (76) (Figura 5a). È evidente che temperatura, stechiometria e lunghezza della stecca devono essere regolate per ogni substrato. Se l'RNA è altamente strutturato, possono essere vantaggiose stecche più lunghe fino all'appaiamento di basi a tutta lunghezza (77). However, this enhances the risk of unfavorable structures in the splint itself. The temperature optimum for the enzyme is 16°C accordingly ligations are carried out preferentially at lower temperatures. T4 DNA ligase-mediated RNA ligation was pioneered by Moore and Sharp ( 78, 79), and ever since has been used in a number of protocols. The method was shown suitable also for RNA circularization. A representative example is the circularization of a 453-nt long RNA that, in its circular form, was successfully translated in vitro ( 16) (Supplementary data, Protocol S5).

T4 RNA ligase 1

T4 RNA ligase 1 assists in the formation of 3′, 5′-phosphodiester bonds in single-stranded RNA molecules. Already in the early 1970s it has been shown that the enzyme can be used to produce a single-stranded circular product from a linear precursor with 3′-hydroxyl and 5′-phosphate termini ( 80). As mentioned above, intermolecular ligation is competing with ring formation. However, under suitable conditions, circularization can be made the predominant event. RNA chains with a minimal length of six to eight nucleotides could be circularized ( 81, 82) (Supplementary data, Protocol S6). T4 RNA ligase 1 has different preferences for donor and acceptor nucleotides at the ligation site: A > G ≥ C > U for the 3′-terminal nucleotide acceptor, and pC > pU > pA > pG for the 5′-terminal nucleotide donor ( 83, 84).

T4 RNA ligase 1 was used for circularization in a number of applications with short and long RNAs as substrates (for exemplary protocols see Supplementary data (Protocols S7 ( 81) and S8 ( 85)). An impressive example is the circularization of a linear RNA strand to yield an authentic infectious circular RNA of the citrus exocortis viroid strain A (CEV-A) ( 86). Furthermore, circular hammerhead ribozymes were synthesized from linear oligoribonucleotides using T4 RNA ligase 1 ( 87). The authors observed that circularization efficiency is strongly dependent on the nature of the RNA substrate some of the linear RNAs could not be efficiently circularized under standard conditions. For those RNA substrates, helper deoxyoligonucleotides, preventing the RNA substrate from folding into unsuitable structures, were used (Figure 5b). In the presence of the helper strands, circular ribozymes as small as 15 nucleotides in length could be efficiently synthesized at concentrations as high as 50 μM in the ligation reaction. Linear and hairpin type helper oligonucleotides were used. In the presence of the linear helper oligonucleotide circRNA was generated with 40% yield, the hairpin helper allowed for ring formation with nearly 100% yield ( 87) (Protocol S9, Supplementary data). The circular products retained their biological activity some displayed even increased catalytic activity and decreased need for divalent cations. In general, helper oligonucleotides have proven useful for proper orientation of the reactive ends. In addition to helper oligonucleotides that assist in ligation by interaction with the substrate in a distance from the ligation site (Figure 5b), also splints may be used that bring the reactive ends close together, but leave the terminal two to three nucleotides of both donor and acceptor single stranded. This is a common procedure for ssRNA ligation with T4 RNA ligase 1 ( 88, 89), and should be a suitable strategy also for circularization (Figure 5c). Another scenario uses internal base pairing of the linear precursor to promote ligation (Figure 5d). Beaudry and Perreault developed a procedure for the synthesis of circular RNAs of any sequence based on internal secondary structures to position the 5′- and 3′-termini as single-stranded region, but held in close proximity for subsequent ligation ( 90). In another approach, dumb-bell-shaped RNAs were synthesized by closing the loops of linear but secondary folded precursors with T4 RNA ligase 1 ( 17, 22, 91–93) (for representative protocols see Supplementary data, Protocol S10).

T4 RNA ligase 2

Inter- and intramolecular ligation activity of T4 RNA ligase 2 was described by Ho and Shuman in 2002 ( 94). However, compared with its close relative T4 RNA ligase 1, this RNA ligase is much more efficient in joining nicks in dsRNA substrates, rather than connecting the ends of ssRNA ( 95, 96). This characteristic feature was used to circularize a specific RNA substrate in vitro with the donor and acceptor ends hold in proximity by internal secondary structures ( 75) (see Supplementary data, Protocol S11). A detailed mechanistic and kinetic analysis of T4 RNA ligase 2 is described in ( 94). There is a homologous protein to T4 RNA ligase 2 occurring in vibriophage KVP40. It also catalyzes RNA circularization of single-stranded small (such as 18 mers) RNAs in an ATP-dependent manner (see ( 97) for detailed comparison and kinetic data of T4 and KVP40 RNA ligase 2-dependent circularization). Furthermore, a truncated version of T4 RNA ligase 2 with 249 amino acid residues is commercially available. It ligates the enzymatically or chemically pre-adenylated 5′-end of DNA (AppDNA) or RNA (AppRNA) to the 3′-end of RNA in the absence of ATP ( 94, 98), and thus potentially can also be used for circularization.

Other RNA ligases with potential for in vitro RNA circularization

Apart from the three most widely used ligases described above, there are a number of other ligases capable of supporting RNA circularization. For example, tRNA ligases from wheat germ and a similar ‘ligase’ from Saccharomyces cerevisae may be applied for RNA ligation in vitro ( 99–101). Compared with RNA ligases 1 and 2, these ligases accept substrates with 5′-terminal phosphate donors and 2′-terminal phosphate acceptors ( 99, 102). The formed internucleotide bond is a 2′-phosphomonoester, 3′, 5′-phosphodiester structure, as appearing in tRNA splicing intermediates in vivo ( 99, 100). A recombinant yeast RNA ligase was shown to convert linear introns to their circular counterparts, although notably slower than wild-type Arabidopsis tRNA ligase ( 55).

Another RNA ligase was found in Pyrococcus abyssi, termed Pap1020. It performs the ATP-dependent circularization of oligoribonucleotides in vitro. Ring formation occurs by intramolecular reaction between the 3′- and 5′-termini of the RNA, whereby in contrast to T4 RNA ligase 1 or 2 no oligomerization was observed as side reaction ( 103). A wide range of temperatures from 20 to 95°C was screened and found suitable for efficient ligation. Varying the ATP concentration from 5 μM to 1 mM revealed that circularization activity decreases with increasing ATP concentration (see Supplementary data, Protocol S12).

Yet another ligase, named RtcB, was described by Tanaka and Shuman ( 104). It belongs to an Escherichia coli RNA repair operon with still unknown mechanistic features. Unlike classic ligases, RtcB seals broken RNAs with 3′-phosphate and 5′-OH termini. The reaction is dependent on GTP, which in the first step is bound to the protein via a histidinyl residue. The 3′-phosphate end takes over the guanylate and forms a polynucleotide-(3′)-pp-(5′)G intermediate. Subsequently, the 3′, 5′-phosphodiester bond is formed by nucleophilic attack of the 5′-terminal hydroxyl group onto the activated 3′-phosphate of the intermediate ( 105). The authors tested several GTP concentrations for RNA ligation and circularization, finding increasing yields of circRNA with increasing GTP concentration, up to complete ligation at 6.25 μM GTP (see Protocol S13, Supplementary data).

Artificial rolling circle replication and HPR supported circularization

As described above, viroids and other small infectious RNAs replicate via the double rolling circle mechanism ( 1, 50–51). An application using the rolling circle reaction and the self-splicing activity of the HPR for the generation of circular RNA was described by Kool and Diegelman ( 106). Circular single-stranded DNA templates were used for in vitro transcription by either T7 or E. coli RNA polymerase resulting in a multimeric repeating RNA sequence harboring the HPR element. Thus, upon transcription, RNA cleaved itself in monomer-length segments. The authors observed the subsequent formation of circular monomers and suggested that circularization occurs because of the intrinsic HPR activity ( 107). Data from our laboratory ( 75) and others ( 108, 109) further support the idea of HPR-derived RNA circularization. We have demonstrated that specifically designed linear RNAs harboring the HPR structure undergo self-processing and circularization ( 75). Dallas et al. demonstrated that freezing stimulates the self-ligation (circularization) of linear forms of the HPR containing 2′,3′-cyclic phosphate and 5′-OH termini ( 108). In a similar study, self-processing of the 5′- and 3′-ends of a transcribed HPR derived precursor RNA followed by ligation of the processed ends to produce a circular RNA was shown ( 109).

PIE method (RNA cyclase ribozyme)

In contrast to the methods of chemical and enzymatic ligation, which can be merely applied in vitro, a spontaneous group I intron self-splicing system, designated as the PIE method, allows circular RNA production in vitro e in vivo (Figure 6). In 1992, Puttaraju and Been first reported that circularly permuted group I intron precursor RNAs derived from Tetrahymena o Anabena, containing end-to-end fused exons that interrupt half intron sequences (comp. Figure 6a), self-splice to generate a circular RNA exon in vitro ( 110). Ford and Ares Jr extended this work by demonstrating that foreign sequences can be placed in the exon of a permuted group I intron self-splicing system (here termed ‘cyclase ribozyme’) derived from the phage T4 td gene and made circular in vitro ( 111). This is possible, because the exon sequence does not participate in the self-splicing reaction. Expression of such constructs in E. coli and yeast resulted in the accumulation of circular RNAs ( 111). Mechanistically, the PIE method includes two transesterifications at defined splice sites as occurring in the normal group I intron self-splicing reaction. However, after splicing in the normal intron exons are ligated, whereas in the PIE are circularized (Figure 6b). The first transesterification leads to release of the 3′-terminal sequence (5′-half intron) of the PIE construct. The newly generated free 3′-OH group of the 3′-half exon attacks the 3′-splice site in the second transesterification. This results in circRNA and release of the 3′-half intron (Figure 6c).

Comparison of group I intron self-splicing with the permuted intron exon method. (un) Illustration of the circular permutation of the intron. (B) Upon splicing in the normal intron, exons are ligated and the intron is circularized. (C) In the permuted intron, exons are circularized and split introns appear.

Comparison of group I intron self-splicing with the permuted intron exon method. (un) Illustration of the circular permutation of the intron. (B) Upon splicing in the normal intron, exons are ligated and the intron is circularized. (C) In the permuted intron, exons are circularized and split introns appear.

Based on the PIE method, a wide variety of circular RNAs were generated. For example, circular RNA aptamers were produced in vitro e in vivo ( 21, 112–114) as well as circular hammerhead ribozymes ( 115) and HDV ribozymes ( 116, 117). Basically, it is possible to create any desired circular RNA by inserting the sequence into a particular site of a plasmid, creating a new RNA cyclase ribozyme gene. Circular RNAs in the range of 71–1130 nt were generated ( 118).

With the studies cited above, production of RNA circles by the PIE method in E. coli as well as in yeast was experimentally verified. However, so far the strategy has not been shown to work in mammalian cells.

Modified group II introns

It is also possible to modify group II introns for inverse splicing in vitro generating RNA circles ( 119, 120). Mikheeva et al. engineered a derivative of a yeast self-splicing group II intron that catalyzes the formation of a circular human exon in vitro ( 119). RNA circles were formed by inverse splicing, which requires arranging the exons consecutively, positioning the branch point upstream and intronic sequences up- and downstream of the exons. This design allows exon circularization upon two transesterifications, excluding any intronic sequences in the circle. An advantage of this strategy in comparison to group I intron mediated exon circularization is the somewhat higher efficiency and the complete sequence variability (for group I intron mediated exon circularization the 3′-terminal residue of the 5′-exon must be U). However, based on the group II intron self-splicing mechanism, circRNAs produced via this pathway carry a 2′,5′-phosphodiester at the ligation/circularization site.


The Cost of IVF: 4 Things I Learned While Battling Infertility

When I found out that I was a carrier for the single-gene genetic disorder Tay-Sachs, a degenerative neurological condition that is fatal for children born with it, there was absolutely nothing to worry about…unless my husband was also a carrier.

The odds of that in my case, I had been told, were “one in a million,” so I wasn’t terribly concerned.

So my heart skipped a beat when I saw I had a missed call on my cell phone from my reproductive endocrinologist two weeks after my husband had finally gotten tested.

“You can imagine my surprise,” she began, “when Matt’s test results came across my desk this morning … and he’s a Tay-Sachs carrier.”

That’s when I found out I would be one of more than 85,000 women in the U.S. annually who undergo in-vitro fertilization, or IVF, as a way to create a family. Utilizing IVF and pre-implantation genetic diagnosis or PGD, the team of doctors and embryologists at our infertility practice would be able to create embryos, and then biopsy those embryos to ensure that only those not affected by Tay-Sachs were among those selected to create a pregnancy.

As I began researching IVF, I also dove into the financial details of the treatment.

Unraveling the seemingly foreign language of clinical terminology and insurance verbiage can be a heavy added stress on a patient struggling with infertility I offer the below as an introduction to anyone also beginning this process. Here are four things I learned in our journey thus far.

1. How Much IVF Actually Costs

My husband and I were back at our reproductive endocrinologist’s office a week after that first phone call, to learn more about the process … and its costs.

On average, nationally, a “fresh” IVF cycle costs $12,000, before medications, which typically run another $3,000 to $5,000. In a “fresh” IVF cycle, eggs are harvested transvaginally after a closely monitored period of ovulation-inducing medications and then “mixed” with fresh sperm. One or two of the best-looking of the resulting embryos are then transferred to the uterus via a thin catheter.

The PGD step of the process meant we were looking at another $3,000 to $6,000. Altogether, conservatively speaking, about $20,000 … for each attempt to have a healthy child utilizing a procedure that is successful (most optimistically) about 40% of the time, depending upon factors such as maternal age and the specific medical circumstances of the parents.

One of the most complex aspects of an infertility diagnosis is that for a patient to have her best chances for conception with IVF, she needs to act as quickly (to ensure that her eggs are as young and thus as viable as possible) as she can upon diagnosis. This biological urgency doesn’t exactly complement the equally pragmatic need to invest in the time to budget and save for treatment.

For some individuals undergoing IVF, if a fresh cycle doesn’t result in a pregnancy, and the remaining embryos from this fresh cycle can subsequently be used during a “frozen” cycle. “Frozen” cycles, often abbreviated as FET or Frozen Embryo Transfer, are much more economical, as they use “frozen” (technically, vitrified) embryos stored for future use. FET averages anywhere from $3,000 to $5,000 per cycle and annual storage fees for frozen embryos are typically an additional few hundred for each year.

Many practices offer “refund” and “discounted multi-cycle” programs. Practices with these kinds of programs offer various plans that provide patients with multiple IVF cycles for a single, discounted fee that costs about 30% to 40% less than the same exact treatment plan if you were to pay for it on a cycle-by-cycle basis.

Should you choose to go with a multi-cycle discount or refund package, you play an odds game. The packages only apply to one child at a time that is, if you pre-pay for three cycles and get pregnant the first time, you can’t use the subsequent cycles for your future attempts to conceive. Keep in mind, though, that to qualify for these programs, patients must undergo a pre-qualification evaluation, evaluating their odds of conceiving within the first cycle of treatment.

2. The Various Payment Options

In thinking about how to finance your treatments, remember that taking money out of your retirement fund comes with penalties and translates into money that will not be available—and not accruing interest—when it comes time for you to retire.

Using your credit cards as a quick loan will force you into a situation with high-penalty fees and interest, not to mention a swift hit to your credit score. During our research we learned of the Springstone loan program, which is geared toward infertility treatment financing and is reasonable in underwriting, interest rates, and repayment times.

If passed, The Family Act of 2013 would create a new tax credit for the out-of-pocket costs associated with IVF and fertility preservation. The proposed Family Act tax credit will only apply to those whose adjusted gross income falls below a certain combined, determined amount.

Infertility care is medical, and you may also deduct medical expenses that exceed 10% of your adjusted gross income on your taxes each year. Many parts of your infertility treatment will qualify for this kind of deduction, as preventive care, treatment, surgeries and prescription medications are all deductible.

Alternately, you can also put some of your income into a Flexible Spending Account, or FSA, which allows individuals to set aside pre-tax dollars for out-of-pocket health care costs. You may set aside up to $2,500 per individual in an FSA. While you can’t deduct expenses paid for from an FSA on your federal income tax return, you also do not have to meet the 10% adjusted gross income requirements needed for medical expense deductions.

3. How Insurance Coverage Works

One of the biggest misunderstandings when it comes to insurance coverage and infertility is what your insurance will actually cover, whether or not the actual physician you are seeing is “in-network.”

Fifteen states (Arkansas, California, Connecticut, Hawaii, Illinois, Louisiana, Maryland, Massachusetts, Montana, New Jersey, New York, Ohio, Rhode Island, Texas and West Virginia) have laws requiring varying levels of insurance coverage for infertility treatments.

Resolve, the National Infertility Association, offers an excellent state-by-state breakdown of these various benefits by state on its website. Even if you do live in a state with a mandate, not all mandates from state to state ensure the same level of coverage of care, so do familiarize yourself with your individual state’s policies.

Some insurance plans, such as my own, provide coverage only for the diagnostic phase of infertility treatment. A good rule of thumb in understanding what your insurance will and will not cover should you have such a plan is to ask if the procedure is something that will determine whether or not infertility does in fact exist and, if so, the cause of this infertility. Keep in mind that when the diagnostic phase ends, any subsequent treatment will not be covered, thus requiring you to pay out-of-pocket regardless of whether you are in- or out-of-network.

Other plans will cover the diagnostic phase and some infertility treatment services, but not all treatment services. If your plan offers some infertility treatment coverage, check with your individual plan to see their coverage policies for all possible avenues of care, from oral ovulation drugs to injectable ovulation induction medications to intrauterine insemination (IUI).

Remember to investigate all the plan options available to you compare the policy through which you currently have coverage with ones that might be offered by your partner’s employer, and compare its costs and benefits to see if it might offer more comprehensive infertility coverage.

Likewise, the new state and federal Health Insurance Marketplace now open as a result of the Affordable Care Act also allow you to see all possible plans available for purchase in your state. A new plan may come at a higher premium than what you’re currently paying, but could potentially save you tens of thousands of dollars.

4. How to Work With Your Practice’s Financial Services Department

Don’t forget to ask your physician’s office whether the prices for care quoted to you include all blood work, ultrasounds, monitoring and medications, or whether those will all be additional “à la carte” fees.

For example, when a plan covers injectable fertility medications, most plans have a “preferred” brand which they will in fact pay for, and they will deny payment on any of the others. So, if medically appropriate, your physician can choose the one that will be paid for by your insurance company as opposed to the one that will not.

Likewise, most insurance companies have a “preferred” lab to which they send routine lab work. If your practice sends the lab work to the lab that your insurance company recognizes, they will pay for it (if the lab tests are covered by your plan). If those same tests are sent to a lab that is not in-network for your plan, the plan will not pay. Make sure both you and your providers know the ins and outs of your plan.

The Affordable Care Act’s (or ACA) defining attribute is the mandating that certain insurance plans include what is now qualified as “essential health benefits.” Unfortunately, infertility treatment is not classified as an “essential health benefit.”

A huge win for those in the infertility community, however, is that, because of ACA, your insurance company can no longer discriminate against pre-existing conditions, of which an infertility diagnosis is one. That means your insurance company can no longer charge you a higher premium than someone who will not need infertility treatment, nor can you be denied coverage should you be seeking private insurance because of the diagnosis.

Where We Are Now

Because my husband’s and my need for IVF is due to a genetic disorder, there are some interesting questions to be asked—and still to be determined—on the implication of the Affordable Care Act as it defines preventive care.

As our need for IVF is to prevent a child from being born with, and subsequently dying from, Tay-Sachs disease, we have argued to our insurance company that under the Affordable Care Act, our IVF would qualify as preventive care, and thus be required to be covered as outlined by the law.

Pursuing IVF was the right next step for my husband and me. We’ve already taken the very first steps in our IVF journey, submitting DNA samples for the creation of the custom probe which will be used to test the biopsies from our future embryos. We will hopefully begin our first cycle next month. Though we know there is a long road ahead of us, we take such great comfort in knowing that, though the exact circumstances may vary, there are so many other individuals out there also pursuing a similar path.

This time of great uncertainty, a little anxiety, and many things beyond my control seem like the best preparation I could possibly receive as I prepare to become a parent … and plan for my family’s financial future.


Guarda il video: Marco Mengoni - Sai che Videoclip (Agosto 2022).