Informazione

Quali coronavirus sono stati identificati nei cani procioni?


Christian Dorsten afferma in un'intervista (26 aprile) sul Guardian che i cani procione come fonte [intermedia] di coronavirus sono stati trascurati (in Cina):

D: Cosa sappiamo di quell'ospite intermedio - è il "povero pangolino", come è stato chiamato?

A: Non vedo alcun motivo per presumere che il virus sia passato attraverso i pangolini nel suo cammino verso l'uomo. C'è un'informazione interessante dalla vecchia letteratura Sars. Quel virus è stato trovato negli zibetti, ma anche nei cani procioni, cosa che i media hanno trascurato. I cani procione sono un'enorme industria in Cina, dove vengono allevati nelle fattorie e catturati in natura per la loro pelliccia. Se qualcuno mi desse qualche centinaio di migliaia di dollari e l'accesso gratuito alla Cina per trovare la fonte del virus, cercherei nei luoghi in cui vengono allevati i cani procioni.

Quindi quali studi ci sono finora sui coronavirus nei cani procioni? (Una rapida ricerca ha trovato un documento statunitense del 1992 secondo cui alcuni coronavirus [non sorprende] infettano anche i procioni. Ma non riesco a trovare molto altro. C'è un sondaggio più aggiornato? Inoltre, duh, i cani procioni non sono nemmeno gli stessi famiglia [Canidae vs Procyonidae].)


Ecco un abstract per un articolo del 2006: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16450706

Un test RT-nPCR è stato utilizzato per testare campioni fecali di cani, volpi, cani procioni e visoni per la presenza di coronavirus canino (CCV). Gli animali sono stati allevati in case, scuole di cani o fattorie... Tra 24 campioni di cani procioni, 22 erano positivi al CCV di tipo II e da questi 16 erano inoltre positivi di tipo I.

Ecco un altro documento del 2003: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12958366

Un nuovo coronavirus (SCoV) è l'agente eziologico della sindrome respiratoria acuta grave (SARS)... Prove di infezione da virus sono state rilevate anche in altri animali (incluso un cane procione, Nyctereutes procyonoides) e negli esseri umani che lavorano nello stesso mercato.

Quindi almeno un paio di tipi di coronavirus canino e altri ceppi strettamente correlati (ma non identici) al coronavirus che causa la SARS.


Virus emergente

Un virus emergente (o virus emergente) è un virus che è apparso di recente, con un notevole aumento dell'incidenza/dell'area geografica o che ha il potenziale per aumentare nel prossimo futuro. [1] I virus emergenti sono una delle principali cause di malattie infettive emergenti e sollevano sfide per la salute pubblica a livello globale, dato il loro potenziale di causare focolai di malattie che possono portare a epidemie e pandemie. [2] Oltre a causare malattie, i virus emergenti possono anche avere gravi implicazioni economiche. [3] Esempi recenti includono i coronavirus correlati alla SARS, che hanno causato l'epidemia di SARS nel 2002-2004 (SARS-CoV-1) e la pandemia di COVID-19 del 2019-20 (SARS-CoV-2). [4] [5] Altri esempi includono il virus dell'immunodeficienza umana che causa l'HIV/AIDS i virus responsabili dell'Ebola [6] il virus dell'influenza H5N1 responsabile dell'influenza aviaria [7] e l'H1N1/09, che ha causato la pandemia di influenza suina del 2009 [ 8] (un ceppo emergente precedente di H1N1 causò la pandemia di influenza spagnola del 1918). [9] L'emergenza virale nell'uomo è spesso una conseguenza della zoonosi, che comporta un salto interspecie di una malattia virale nell'uomo da altri animali. Poiché i virus zoonotici esistono nei serbatoi animali, sono molto più difficili da eradicare e possono quindi stabilire infezioni persistenti nelle popolazioni umane. [10]

I virus emergenti non devono essere confusi con i virus che riemergono o con i virus appena rilevati. Un virus riemergente è generalmente considerato un virus apparso in precedenza che sta vivendo una rinascita, [1] [11] per esempio il morbillo. [12] Un virus appena rilevato è un virus precedentemente non riconosciuto che circolava nella specie come infezioni endemiche o epidemiche. [13] I virus appena rilevati potrebbero essere sfuggiti alla classificazione perché non hanno lasciato indizi distintivi e/o non possono essere isolati o propagati nella coltura cellulare. [14] Gli esempi includono il rinovirus umano (una delle principali cause di raffreddore comune identificato per la prima volta nel 1956), [15] l'epatite C (eventualmente identificata nel 1989), [16] e il metapneumovirus umano (descritto per la prima volta nel 2001, ma ritenuto circola dal XIX secolo). [17] Poiché il rilevamento di tali virus è guidato dalla tecnologia, è probabile che il numero riportato aumenti.


Lo studio prevede da dove potrebbero avere origine i nuovi coronavirus

La potenziale scala della nuova generazione di coronavirus negli animali selvatici e domestici potrebbe essere stata molto sottovalutata, suggerisce una nuova ricerca dell'Università di Liverpool.

Pubblicato in Comunicazioni sulla natura, lo studio sull'apprendimento automatico identifica i mammiferi che sono potenziali fonti per la generazione di nuovi coronavirus, comprese le specie implicate in precedenti epidemie (come i pipistrelli ferro di cavallo, gli zibetti delle palme e i pangolini) e alcuni nuovi candidati.

Prevedere quali animali potrebbero essere potenzialmente la fonte di un futuro focolaio di coronavirus può guidare gli approcci per ridurre il rischio di insorgenza del coronavirus negli animali e di ricaduta sulle popolazioni umane.

“Nuovi coronavirus possono emergere quando due diversi ceppi co-infettano un animale, provocando la ricombinazione del materiale genetico virale. La nostra comprensione di quanto siano suscettibili i diversi mammiferi ai diversi coronavirus è stata limitata, ma tali informazioni potrebbero offrire spunti su dove potrebbe verificarsi la ricombinazione virale», ha spiegato la co-responsabile della ricerca, la dott.ssa Maya Wardeh dell'Institute of Infection, Veterinary and Ecological Sciences. .

I ricercatori hanno cercato di colmare questa lacuna di conoscenza utilizzando un approccio di apprendimento automatico per prevedere le relazioni tra 411 ceppi di coronavirus e 876 potenziali specie ospiti di mammiferi. Prevedono i mammiferi che hanno maggiori probabilità di essere coinfettati e quindi essere potenziali ospiti di ricombinazione per la produzione di nuovi coronavirus.

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I loro risultati suggeriscono che ci sono almeno 11 volte più associazioni tra specie di mammiferi e ceppi di coronavirus rispetto a quanto osservato fino ad oggi. Inoltre, stimano che ci siano oltre 40 volte più specie di mammiferi che possono essere infettate da una serie diversificata di ceppi di coronavirus rispetto a quanto precedentemente noto.

“Dato che i coronavirus subiscono frequentemente la ricombinazione quando coinfettano un ospite e che SARS-CoV-2 è altamente infettivo per l'uomo, la minaccia più immediata per la salute pubblica è la ricombinazione di altri coronavirus con SARS-CoV-2,' 8221 ha detto il dottor Marcus Blagrove, co-responsabile dello studio.

I ricercatori hanno continuato a identificare gli host in cui potrebbe potenzialmente verificarsi la ricombinazione SARS-CoV-2 e indicano che potrebbero esserci 30 volte più specie ospiti di quelle attualmente note. Tra i nuovi ospiti previsti di rilievo ci sono il cammello dormitorio, la scimmia verde africana e il pipistrello giallo asiatico minore.

Evidenziando, come esempio specifico, lo scenario ad alto rischio di ricombinazione che si verifica tra il SARS-CoV-2 altamente trasmissibile e il più mortale MERS-CoV, i ricercatori identificano anche 102 potenziali ospiti di ricombinazione dei due virus e raccomandano il monitoraggio per questo evento .

I ricercatori osservano che i loro risultati si basano su dati limitati sui genomi del coronavirus e sulle associazioni virus-ospite e che esistono bias di studio per alcune specie animali, che presentano tutte incertezza nelle previsioni. Tuttavia, i recenti test su potenziali ospiti di mammiferi per la loro suscettibilità alla SARS-CoV-2 hanno già confermato alcune delle loro previsioni, come il cane procione, la capra domestica e l'alpaca.

“È importante notare che la ricombinazione virale è distinta dalle mutazioni. La ricombinazione avviene per periodi di tempo più lunghi e può generare ceppi o specie completamente nuovi. Il nostro lavoro può aiutare a indirizzare i programmi di sorveglianza per scoprire ceppi futuri prima che si riversino sugli esseri umani, dandoci un vantaggio nel combatterli, ha concluso il dottor Blagrove.

I ricercatori ora pianificano di espandere il loro modello per includere specie di uccelli, quindi, comprendendo l'intera gamma di importanti ospiti di coronavirus e una rete di contatti a livello di specie, che tenga conto del comportamento e dell'utilizzo dell'habitat delle specie ospiti, per fornire una panoramica più ampia del potenziale coronavirus. associazioni.

Fornito da: Università di Liverpool

Maggiori informazioni: Maya Wardeh et al. Predire gli ospiti dei mammiferi in cui possono essere generati nuovi coronavirus. Comunicazioni sulla natura (2021) DOI: 10.1038/s41467-021-21034-5


Breve panoramica del genoma SARS-CoV

I coronavirus sono suddivisi in tre gruppi in base a marcatori genetici e sierologici [22]. I gruppi I e II infettano i mammiferi mentre il gruppo III è specifico per le specie aviarie. I membri del gruppo I sono il virus della gastroenterite trasmissibile suino (TGEV) e il virus della diarrea epidemica (PEDV), il coronavirus felino e canino (FCoV e CCoV) e il coronavirus umano 229E (HCoV-229E). Il gruppo II comprende il virus dell'encefalomielite emoagglutinante suina (HEV), il virus dell'epatite murina (MHV), il coronavirus bovino, equino e di ratto (BCoV, ECoV e RtCoV) e il coronavirus umano OC43 (HCoV-OC43). Il gruppo III comprende il coronavirus del tacchino (TCoV), il coronavirus del fagiano e il virus della bronchite infettiva aviaria (IBV). Sebbene sia più strettamente correlato ai coronavirus del gruppo II, SARS-CoV, con alcune delle sue caratteristiche genetiche uniche, rappresenta un gruppo filogenetico distinto [22-24].

Ad oggi, sono state analizzate circa 61 sequenze genomiche di SARS-CoV che rappresentano diverse fasi dell'epidemia (precoce, media e tardiva) e due isolati ottenuti da civette delle palme [18]. L'RNA genomico SARS-CoV è di circa 30 kb ed è organizzato in 13-15 frame di lettura aperti (ORF) [25-27]. La disposizione strutturale del gene della SARS CoV segue lo stesso schema della maggior parte dei genomi del coronavirus: 5'- Replicasi (ORF 1a)-Proteasi (ORF 1b)-Spike (S)-Envelope (E)-membrana (M)-Nucleocapside (N)- 3' [27]. Tuttavia, contrariamente ad altri coronavirus, due ORF di funzione sconosciuta si trovano tra S ed E ORF e 3-5 ORF si trovano tra M e N. Inoltre, nonostante la sovrapposizione evolutiva tra le sequenze del genoma del coronavirus SARS-CoV e del gruppo II , il genoma della SARS manca di un gene per la proteina emoagglutinina-esterasi (HE), che è comune alla maggior parte dei coronavirus del gruppo II [25]. Per un'eccellente rappresentazione pittorica del genoma SARS-CoV con funzioni (o mancanza di) assegnate a ciascun ORF, fare riferimento alla recente revisione di Tan et al [21]. Una pietra miliare significativa nella biologia molecolare SARS-CoV è stata la costruzione di un plasmide contenente cDNA SARS-CoV a lunghezza intera da cui è possibile produrre RNA virale infettivo [28]. Questo sviluppo facilita lo studio delle funzioni del gene SARS-CoV e dovrebbe promuovere la delucidazione della funzione per gli ORF la cui funzione è ancora sconosciuta [29]. Sebbene sia stata la percezione che questi ORF non siano essenziali per la replicazione virale, possono svolgere un ruolo nella manifestazione o nella gravità della malattia.


Quali coronavirus sono stati identificati nei cani procioni? - Biologia

L'epidemia di sindrome respiratoria acuta grave (SARS) è stata causata da un coronavirus appena emerso (SARS-CoV). I pipistrelli di diverse specie nella Repubblica popolare cinese meridionale ospitano CoV simili alla SARS e possono essere ospiti di serbatoi per loro. Per determinare se anche i pipistrelli del Nord America ospitano coronavirus, abbiamo utilizzato la trascrizione inversa-PCR per rilevare l'RNA del coronavirus nei pipistrelli. Abbiamo trovato l'RNA del coronavirus in 6 dei 28 campioni fecali di pipistrelli di 2 delle 7 specie testate. La prevalenza della diffusione dell'RNA virale è stata elevata: 17% in Eptesicus fuscus e 50% in Myotis occultus. Analisi della sequenza di un amplicone di 440 bp nel gene 1b hanno mostrato che questi coronavirus dei pipistrelli delle Montagne Rocciose formavano 3 cluster nel gruppo filogenetico 1 che erano distinti dai coronavirus del gruppo 1 dei pipistrelli asiatici. A causa della possibilità che i coronavirus dei pipistrelli causino malattie negli esseri umani e negli animali, sono necessarie un'ulteriore sorveglianza e caratterizzazione dei coronavirus dei pipistrelli in Nord America.

Le malattie emergenti sono spesso zoonosi causate da virus a RNA (1,2). Sono garantite la difesa contro le malattie infettive emergenti, l'identificazione di serbatoi per tali virus, la sorveglianza degli eventi di salto dell'ospite e la delucidazione dei fattori virali e dell'ospite che possono facilitare tali eventi. L'epidemia di sindrome respiratoria acuta grave (SARS) nel 2002-2003 è stata causata da un nuovo coronavirus zoonotico (SARS-CoV) (ordine Nidovirales, famiglia Coronaviridae, genere Coronavirus). Anche altri coronavirus sono passati a nuove specie ospiti e hanno causato malattie emergenti. Ad esempio, il virus della diarrea epidemica suina è emerso nei suini europei da una specie ospite sconosciuta durante la fine degli anni '70 e ha causato una grave malattia enterica (3). Si ritiene che il coronavirus umano OC43 sia stato derivato dal coronavirus bovino (4). Inoltre, i genomi dei coronavirus canini e felini possono ricombinarsi in vivo e si sono sviluppati in diversi biotipi che sono trasmissibili in serie nelle loro nuove specie ospiti (5).

SARS-CoV è entrato nella popolazione umana a seguito di una trasmissione zoonotica nella Repubblica popolare cinese meridionale nel 2002. Studi epidemiologici hanno dimostrato che i primi casi umani di SARS sono stati causati da coronavirus strettamente correlati ai virus trovati negli zibetti delle palme mascherati (Paguma larvata) e cani procione (Nyctereutes procyonoides) nei mercati di animali vivi (6). Successivamente, nel sud-est asiatico sono state condotte indagini sui coronavirus negli animali domestici, nel bestiame, nel pollame e nella fauna selvatica per identificare i serbatoi di SARS-CoV. Sulla base della bassa prevalenza di CoV simili alla SARS negli zibetti mascherati selvatici e d'allevamento, si ritiene che questi animali siano un ospite intermedio piuttosto che un serbatoio primario per SARS-CoV (7). Durante queste indagini, è stata rilevata un'ampia varietà di coronavirus in molte specie di pipistrelli in Asia (811).

Pipistrelli naso a ferro di cavallo di diverse specie (sottordine Microchiroptera, famiglia Rhinolophidae, genere Rinolofo) provenienti da diverse località nella Repubblica popolare cinese meridionale e nella regione amministrativa speciale di Hong Kong sono stati trovati infetti da CoV simili alla SARS e alcuni dei pipistrelli avevano anticorpi contro questi coronavirus appena riconosciuti (10,12). L'analisi filogenetica delle sequenze complete del genoma dei CoV simili alla SARS dei pipistrelli ha mostrato che formano un clade ampio e diversificato all'interno del gruppo filogenetico 2b (chiamato anche gruppo 4), che include SARS-CoV da zibetto delle palme e umani ottenuti durante il 2002-2003 scoppio (10,12,13). Pertanto, il virus responsabile della pandemia di SARS potrebbe aver avuto origine dai pipistrelli, forse con lo zibetto delle palme come ospite intermedio. Oltre ai CoV simili alla SARS, in diverse specie di pipistrelli asiatici sono stati rilevati RNA di molti altri virus appartenenti ai gruppi di coronavirus 1 e 2a, e proposto il nuovo gruppo 5 (8,9,14,15). Ad oggi, nessun coronavirus di pipistrello infettivo è stato isolato in coltura cellulare.

Abbiamo studiato se i pipistrelli in Nord America ospitano anche i coronavirus. A nostra conoscenza, forniamo la prima prova di coronavirus nei pipistrelli nell'emisfero occidentale. Abbiamo studiato campioni orali, anali e fecali di 57 pipistrelli nella regione delle Montagne Rocciose e rilevato l'RNA del coronavirus in 6 dei 28 campioni fecali di 2 delle 7 specie di pipistrelli testate. L'analisi della sequenza limitata ha mostrato che questi virus sono nel gruppo filogenetico 1 e che differiscono dai coronavirus del gruppo 1 dei pipistrelli asiatici.

Materiali e metodi

Raccolta di campioni

I pipistrelli sono stati campionati in 4 siti nella regione delle Montagne Rocciose nell'agosto 2006. Nei siti 1 e 2, sono stati campionati pipistrelli di 2 specie in colonie che abitano 2 edifici a 480 km di distanza sui lati opposti dello spartiacque continentale delle Montagne Rocciose. Otto mioti occulte (Myotis occultus) e 1 pipistrello brasiliano dalla coda libera (Tadarida brasiliensis) sono stati catturati in reti da nebbia mentre emergevano da un posatoio in un edificio a Mancos nella contea di Montezuma nel Colorado sudoccidentale (sito 1) al tramonto del 19 agosto. In precedenza si pensava che questa specie fosse conspecifica con il piccolo pipistrello marrone (m. lucifugo) che è comune in tutto il Nord America (16). Grandi pipistrelli marroni (Eptesicus fuscus) sono stati campionati in un posatoio in un edificio a Fort Collins nella contea di Larimer nel Colorado centro-settentrionale (sito 2) il 7 agosto. Altri pipistrelli (n = 27) sono stati campionati nei siti 3 e 4 in occasione di indagini faunistiche in corso e non correlate . Una miotide occidentale dai piedi piccoli (m. ciliolabrum) e 1 miotide dalle orecchie lunghe (m. evotis) sono stati catturati in reti di nebbia sull'acqua l'8 agosto nell'area naturale di Soapstone Prairie nella contea di Larimer (sito 3). Quattro grandi pipistrelli marroni, 3 mioti dalle orecchie lunghe, 8 mioti occulti, 1 pipistrello brasiliano dalla coda libera, 7 mioti dalle gambe lunghe (m. volans), e 2 pipistrelli dal pelo argentato (Lasionycteris noctivagans) sono stati intrappolati in reti di nebbia durante le notti dal 14 al 20 agosto mentre bevevano o si nutrivano vicino all'acqua aperta in 2 lagune di trattamento delle acque reflue (a 9 km di distanza) (sito 4) nella contea di Montezuma, in Colorado. I pipistrelli sono stati catturati sotto l'autorità di una licenza di raccolta scientifica della divisione del Colorado per la fauna selvatica seguendo le procedure approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee of the US Geological Survey, Fort Collins Science Center. In genere, ogni pipistrello è stato campionato entro 5-10 minuti dalla cattura e quindi rilasciato.

Quando possibile, sono stati prelevati 3 tipi di campioni da ciascun pipistrello (tabella). Tamponi sterili di alginato di calcio sono stati utilizzati per campioni di area orale o anale che sono stati immediatamente inseriti in 2 mL di RNAlater (Ambion, Austin, TX, USA). I campioni fecali sono stati raccolti se il pipistrello ha prodotto un bolo fresco durante la manipolazione. I guanti monouso in lattice sono stati cambiati tra i campioni e le pinze multiple utilizzate per raccogliere i boli fecali sono state risciacquate, asciugate con etanolo e asciugate all'aria tra i campioni. I campioni sono stati numerati, conservati in un frigorifero in campo, conservati a 4°C e consegnati al laboratorio il 28 agosto.

Estrazione dell'RNA e trascrizione inversa (RT)

L'RNA da 140 μL di ciascuno dei 79 campioni è stato estratto utilizzando il mini kit QIamp viral RNA (QIAGEN, Valencia, CA, USA) seguendo le istruzioni del produttore. L'RNA estratto è stato eluito in 50 μL di acqua priva di RNasi e conservato a -80°C.Abbiamo utilizzato la trascrittasi inversa del virus della leucemia murina Moloney (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) con esameri casuali in una reazione di 20 μL per generare cDNA utilizzando 10 μL di RNA come modello secondo le istruzioni del produttore. Tutti i campioni sono stati estratti e analizzati in triplicato. I prodotti RT sono stati conservati a –20°C.

PCR e sequenziamento

Tutti i campioni sono stati sottoposti a screening mediante PCR e nested PCR. Sulla base di precedenti rapporti, PCR con una coppia di primer di consenso che prendono di mira una regione altamente conservata del gene del coronavirus 1b è stato utilizzato per lo screening dei campioni di cDNA (8). Tre microlitri di cDNA sono stati amplificati in una reazione di 50 μL contenente 1,5 mmol/L MgCl2, 0,2 mmol/L di deossinucleosidi trifosfato, 2,5 U di HotStarTaq (QIAGEN) e 0,2 μmol/L di primer 1 e 2: 5′-GGTTGGGACTATCCTAAGTGTGA-3′ (primer 1) e 5′-CCATCATCAGATAGAATCATCATA-3′ (primer 2) utilizzando il seguente programma PCR: 15 min a 95°C 45 cicli per 1 min a 95°C, 1 min a 48°C, e 1 min a 72°C e 10 min a 72°C.

Per la PCR annidata, 5 μL di ciascuna PCR sono stati amplificati in una reazione di 50 μL con il primer 2 e il primer 3 (5′-GTTGTACTGCTAGTGACAGG-3′), un primer interno basato sulle sequenze nucleotidiche degli ampliconi della PCR utilizzando 40 cicli del stesso programma PCR. Tutte le RT-PCR sono state condotte in una workstation per acidi nucleici chiusa dotata di luce UV (Clone Zone USA Scientific, Ocala, FL, USA) in una stanza separata dal laboratorio principale. I controlli dell'acqua in tutte le RT-PCR non hanno mostrato risultati falsi positivi. Per superare i possibili inibitori della PCR nei campioni fecali, la PCR è stata eseguita sia sul cDNA che su una diluizione 1:10 del cDNA. Gli ampliconi sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio. Per ogni campione positivo, gli ampliconi di 2 RT-PCR indipendenti sono stati sequenziati su un sequenziatore di DNA ABI 3730 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) presso l'Università del Colorado Health Science Center Cancer Center DNA Sequencing and Analysis Core. I campioni numerati sono stati quindi correlati con elenchi di campioni di pipistrelli.

Analisi dei dati

Le sequenze virali sono state analizzate e allineate utilizzando ClustalW (http://workbench.sdsc.edu). Gli alberi filogenetici sono stati costruiti utilizzando il metodo neighbor-joining nel programma PAUP* versione 4.0 (Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, USA) radicato con il virus della sindrome respiratoria e riproduttiva suina (GenBank accession no. NC_001961). Le sequenze utilizzate per l'allineamento erano AF304460 (HCoV-229E), AY567487 (HCoV-NL63), DQ648858 (BtCoV 512), AY594268 (BtCoV HKU2), DQ249224 (BtCoV HKU6), DQ249226 (BtCoV HKU7) e DQ249228 (BtCo). Le sequenze dedotte da questo studio sono state depositate in GenBank con i nn. EF544563–EF544568.

Risultati

Identificazione dei coronavirus dei pipistrelli delle montagne rocciose (RM-Bt-CoVs)

Un totale di 79 campioni (28 campioni fecali, 29 campioni di tamponi anali e 22 campioni di tamponi orali) sono stati raccolti da 57 pipistrelli di 7 specie in 4 località nella regione delle Montagne Rocciose durante un periodo di 2 settimane nell'agosto 2006 (Tabella). Amplificatori PCR che prendono di mira una regione conservata nel gene 1b contenenti la RNA polimerasi RNA-dipendente comune a tutti i coronavirus sono stati rilevati nell'RNA a trascrizione inversa di 6 dei 79 campioni. Tutti i campioni positivi per l'RNA del coronavirus provenivano dai 28 campioni fecali testati (Tabella). Nessuno dei campioni della regione anale o del tampone orale è risultato positivo per l'RNA del coronavirus.

Nonostante il piccolo numero di pipistrelli campionati, c'era un'alta prevalenza di diffusione dell'RNA del coronavirus nei campioni fecali di 2 specie di pipistrelli. Cinque (50%) su 10 campioni fecali di mioti occulte e 1 (17%) su 6 campioni fecali di grandi pipistrelli marroni sono risultati positivi per il coronavirus nei test di screening. Il campione 1 positivo al coronavirus del grande pipistrello marrone (campione di pipistrello 65) proveniva dalle feci di 1 (33%) di 3 grandi pipistrelli marroni campionati nel sito 2 nel Colorado centro-settentrionale, mentre i campioni positivi della miotide occulta (campioni di pipistrello 3, 6, 11, 27 e 48) provenivano dai siti 1 e 4 nel sud-ovest del Colorado, 480 km dal sito 2 (tabella). La maggior parte dei campioni fecali era positiva solo nelle PCR con cDNA diluito 1:10, il che suggeriva che gli inibitori della PCR erano presenti nelle feci. Inoltre, la maggior parte dei campioni era positiva solo nelle PCR annidate, il che indicava che l'RNA era presente in piccole quantità o che i primer utilizzati non erano una corrispondenza ottimale per questi virus.

Analisi filogenetica di RM-Bt-CoVs

Figura 1. Allineamento della sequenza nucleotidica degli ampliconi da una regione del gene di 440 nt 1b dei coronavirus dei pipistrelli delle Montagne Rocciose (RM-Bt-CoV) rispetto ai coronavirus del gruppo 1 dei pipistrelli asiatici (BtCoV) e al coronavirus umano 229E.

Figura 2. Relazioni filogenetiche basate su una sequenza di 440 nt in una regione conservata del gene 1b dei coronavirus dei pipistrelli delle Montagne Rocciose (RM-Bt-CoVs) (mostrato in grassetto), coronavirus di gruppo 1 di pipistrelli asiatici (BtCoVs), e.

Una sequenza di 440 nt nella regione della RNA polimerasi RNA-dipendente del gene 1b è stato amplificato mediante RT-PCR dai 6 campioni positivi. L'analisi delle sequenze nucleotidiche di questi ampliconi ha mostrato che tutti e 6 gli RM-Bt-CoV sono membri del gruppo 1 del coronavirus (Figura 1). Sebbene queste sequenze fossero simili a quelle pubblicate per i coronavirus del gruppo 1 di pipistrelli asiatici, c'era abbastanza dissomiglianza in questa regione altamente conservata da suggerire che gli esemplari delle Montagne Rocciose rappresentano coronavirus unici (8,9). L'analisi filogenetica di questa regione del gene 1b suggerisce che il cluster RM-Bt-CoVs in 3 sottogruppi all'interno del gruppo 1. Tre dei 5 campioni della mioti occulta (campioni 6, 11 e 48) erano in 1 cluster e gli altri 2 (campioni 3 e 27) hanno formato un secondo cluster all'interno dei coronavirus del gruppo 1. Il campione 1 del grande pipistrello marrone (campione 65) era un coronavirus di gruppo 1 più lontanamente correlato (Figura 2).

Discussione

A nostra conoscenza, questa è la prima segnalazione di coronavirus nei pipistrelli nell'emisfero occidentale. Con >1.100 specie, i pipistrelli sono tra i mammiferi non umani più divergenti e ampiamente distribuiti (17). I pipistrelli sono serbatoi per il virus della rabbia e altri lyssavirus e recentemente è stato dimostrato che sono serbatoi per altri importanti virus emergenti. I pipistrelli della frutta del Vecchio Mondo (famiglia Pteropodidae) sono serbatoi per il virus Hendra, che ha causato piccoli focolai di gravi malattie respiratorie nei cavalli e nell'uomo in Australia (1824) e il virus Nipah, che ha causato vasti focolai di encefalite letale e malattie respiratorie nell'uomo e nei suini in Malaysia e a Singapore (2528). I pipistrelli della frutta del Vecchio Mondo possono anche essere gli ospiti tanto ricercati del serbatoio per i virus Ebola e Marburg (29,30). Più di 60 diversi virus a RNA sono stati isolati e rilevati nei pipistrelli, che svolgono un ruolo importante nel mantenimento e nella trasmissione di virus zoonotici (3133).

La necessità di comprendere l'ecologia e l'evoluzione dei coronavirus nella fauna selvatica è stata evidenziata dall'osservazione che i SARS-CoV che hanno causato 4 casi sporadici di SARS nel 2003-2004 erano più strettamente correlati ai virus degli zibetti delle palme trovati nel 2004 che all'epidemia umana ceppo di SARS-CoV (34). Il gene che codifica per la glicoproteina virale spike che lega l'enzima 2 di conversione dell'angiotensina umana del recettore del virus è stato uno dei geni ad adattamento più rapido di SARS-CoV durante l'epidemia del 2002-2003. Sostituzioni di aminoacidi non sinonime nella proteina spike che sono state selezionate durante il legame ottimizzato dell'epidemia del picco al suo recettore umano e una migliore trasmissione da uomo a uomo (34,35). Il sequenziamento dei genomi di SARS-CoV durante e dopo l'epidemia suggerisce che si sono verificati più eventi indipendenti di salto di specie di SARS-CoV dagli animali all'uomo.

Sebbene tutti i campioni che abbiamo testato provenissero da pipistrelli selvatici apparentemente sani, è stata rilevata un'alta prevalenza di RNA del coronavirus in 2 delle 7 specie di pipistrelli testati. Cinque (50%) su 10 mioti occulte e 1 (17%) su 6 grandi pipistrelli marroni testati contenevano bassi livelli di RNA del coronavirus nelle feci. Nessun RNA del coronavirus è stato rilevato nei tamponi della regione orale o anale testati. Allo stesso modo nei pipistrelli asiatici, l'RNA del coronavirus è stato trovato in una percentuale maggiore di campioni fecali rispetto ai campioni di saliva (8,9,14). Pertanto, i pipistrelli possono essere portatori persistentemente infetti che rilasciano bassi livelli di coronavirus nelle feci. Lo spargimento fecale persistente di coronavirus è stato riscontrato anche in maiali, gatti, cani e bovini.36). I meccanismi per la diffusione fecale persistente dei virus nei pipistrelli senza malattia apparente non sono stati ancora determinati (32,33).

Nessun pipistrello di nessuna specie si trova sia nell'emisfero orientale che in quello occidentale (37). Pertanto, è di grande interesse che ora i coronavirus del gruppo 1 siano stati trovati nei pipistrelli in Nord America e in Asia. È probabile che il confronto delle sequenze nucleotidiche dei coronavirus correlati di diverse specie di pipistrelli in diversi continenti fornisca informazioni sull'evoluzione del coronavirus. La Figura 2 mostra la filogenesi di RM-Bt-CoV in relazione ai coronavirus del gruppo 1 dall'Asia sulla base dell'amplicone di 440 nt nel gene 1b. Pipistrelli dei generi miotis e Eptesicus appartengono alla famiglia Vespertilionidae, che si è diversificata in molte specie diverse negli emisferi orientale e occidentale (17). Gli ampliconi di 3 dei 5 coronavirus (campioni 6, 11 e 48) della miotide occulta in Colorado hanno la più alta identità di sequenza nucleotidica con il coronavirus del pipistrello HKU6 trovato in un pipistrello asiatico dello stesso genere ma di una specie diversa, il bigfoot di Rickett miotide (m. riccioli, sottofamiglia Myotinae) (11,17). L'RNA del coronavirus nel grande pipistrello marrone (campione 65) del Colorado (sottofamiglia Vespertilioninae) era molto simile al coronavirus del pipistrello HKU2 trovato nei pipistrelli asiatici della famiglia Rhinolophidae (11) (Figura 2). I pipistrelli rinolofidi non si trovano nell'emisfero occidentale e sono filogeneticamente lontani dal grande pipistrello marrone (37,38).

Nel nostro piccolo studio iniziale sui coronavirus nei pipistrelli nordamericani, i campioni erano limitati in termini di dimensioni, posizione e varietà di specie di pipistrelli e abbiamo trovato solo coronavirus del gruppo 1. Quando si studia un numero maggiore di pipistrelli e altre specie di pipistrelli in Nord America, si possono scoprire ulteriori coronavirus di pipistrello con attributi filogenetici complessi, modelli biogeografici e forse attributi epizooziologici. Ad esempio, determinare se i coronavirus dei pipistrelli nordamericani sono specie-specifici fornirà informazioni utili. In Asia, diverse specie di pipistrelli appollaiati nella stessa grotta ospitano diversi coronavirus (9). Tuttavia, i pipistrelli di 1 specie possono anche ospitare diversi tipi di coronavirus in diverse località geografiche (9).

Una recente analisi delle sequenze del genoma dei coronavirus di pipistrelli, altri animali, umani e uccelli ha suggerito che i pipistrelli potrebbero essere gli ospiti originali da cui sono state derivate tutte le linee di coronavirus (15). Troviamo questa ipotesi intrigante, alla luce dell'elevata prevalenza e diversità dei coronavirus nei pipistrelli in Nord America riscontrata nel nostro piccolo sondaggio iniziale. Le specie nordamericane di pipistrelli che ospitano coronavirus del gruppo 1 comunemente si posano in edifici abitati da esseri umani (39), che fornisce una sovrapposizione ecologica tra questi pipistrelli e gli esseri umani. Prima dell'epidemia di SARS del 2002-2003, solo 2 coronavirus, HCoV-229E e HCoV-OC43, erano noti per causare malattie umane, principalmente infezioni lievi del tratto respiratorio superiore. Al contrario, SARS-CoV ha causato gravi malattie del tratto respiratorio inferiore con un tasso di mortalità del 10%. Recentemente, sono stati scoperti altri 2 coronavirus umani, HCoV-NL63 e HCoV-HKU1, che causano infezioni del tratto respiratorio superiore e inferiore in tutto il mondo (40).

È possibile che in futuro possa verificarsi un'altra epidemia causata da un coronavirus emergente. Come nell'epidemia di SARS, i pipistrelli potrebbero svolgere un ruolo nella futura comparsa di coronavirus nell'uomo o in altre specie. L'isolamento dei coronavirus infettivi dei pipistrelli e la delucidazione delle loro gamme di ospiti, delle specificità dei recettori e della diversità genetica saranno di grande aiuto nella nostra comprensione del loro potenziale di emergenza.

Il dottor Dominguez è un ricercatore di malattie infettive pediatriche presso il Children's Hospital di Denver, in Colorado, un affiliato dell'Università del Colorado Health Science Center. I suoi interessi di ricerca includono le malattie infettive emergenti, la sindrome di Kawasaki e le infezioni virali respiratorie pediatriche.

Ringraziamenti

Ringraziamo R. Pearce, L. Ellison ed E. Valdez per l'assistenza sul campo nella cattura dei pipistrelli C. Calisher, P. Cryan e S. Jeffers per la valutazione critica del manoscritto E. Travanty per l'assistenza nell'analisi filogenetica e C. Calisher per la fornitura di forniture e consulenza per il campionamento sul campo.

Questo studio è stato supportato dalla sovvenzione AI-P01-059576 del National Institutes of Health e dal premio Pediatric Infectious Disease Society Fellowship dei Roche Laboratories a S.R.D.

Riferimenti

Cifre
Tavolo

1 Questi autori hanno contribuito in egual modo a questo articolo.

Si prega di utilizzare il modulo sottostante per inviare la corrispondenza agli autori o contattarli al seguente indirizzo:

Kathryn V. Holmes, Dipartimento di Microbiologia, Centro di scienze della salute dell'Università del Colorado, MS 8333, 12800 E 19th Ave, Room P18-9117, PO Box 6511, Aurora, CO 80045, USA

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Lo studio prevede da dove potrebbero avere origine i nuovi coronavirus

Credito: Università di Liverpool

La potenziale scala della nuova generazione di coronavirus negli animali selvatici e domestici potrebbe essere stata molto sottovalutata, suggerisce una nuova ricerca dell'Università di Liverpool.

Pubblicato in Comunicazioni sulla natura, lo studio sull'apprendimento automatico identifica i mammiferi che sono potenziali fonti per la generazione di nuovi coronavirus, comprese le specie implicate in precedenti epidemie (come i pipistrelli ferro di cavallo, gli zibetti delle palme e i pangolini) e alcuni nuovi candidati.

Prevedere quali animali potrebbero essere potenzialmente la fonte di un futuro focolaio di coronavirus può guidare gli approcci per ridurre il rischio di insorgenza del coronavirus negli animali e di ricaduta sulle popolazioni umane.

"Nuovi coronavirus possono emergere quando due diversi ceppi co-infettano un animale, provocando la ricombinazione del materiale genetico virale. La nostra comprensione di come i diversi mammiferi siano sensibili ai diversi coronavirus è stata limitata, ma tali informazioni potrebbero offrire spunti su dove potrebbe verificarsi la ricombinazione virale. ", ha spiegato la co-responsabile della ricerca, la dott.ssa Maya Wardeh dell'Istituto di infezione, scienze veterinarie ed ecologiche.

I ricercatori hanno cercato di colmare questa lacuna di conoscenza utilizzando un approccio di apprendimento automatico per prevedere le relazioni tra 411 ceppi di coronavirus e 876 potenziali specie ospiti di mammiferi. Prevedono i mammiferi che hanno maggiori probabilità di essere coinfettati e quindi essere potenziali ospiti di ricombinazione per la produzione di nuovi coronavirus.

I loro risultati suggeriscono che ci sono almeno 11 volte più associazioni tra specie di mammiferi e ceppi di coronavirus rispetto a quanto osservato fino ad oggi. Inoltre, stimano che ci siano oltre 40 volte più specie di mammiferi che possono essere infettate da una serie diversificata di ceppi di coronavirus rispetto a quanto precedentemente noto.

"Dato che i coronavirus subiscono frequentemente la ricombinazione quando coinfettano un ospite e che SARS-CoV-2 è altamente infettivo per l'uomo, la minaccia più immediata per la salute pubblica è la ricombinazione di altri coronavirus con SARS-CoV-2", ha affermato il dott. Marcus Blagrove, co-responsabile dello studio.

I ricercatori hanno continuato a identificare gli host in cui potrebbe potenzialmente verificarsi la ricombinazione SARS-CoV-2 e indicano che potrebbero esserci 30 volte più specie ospiti di quelle attualmente note. Tra i nuovi ospiti previsti di rilievo ci sono il cammello dormitorio, la scimmia verde africana e il pipistrello giallo asiatico minore.

Evidenziando, come esempio specifico, lo scenario ad alto rischio di ricombinazione che si verifica tra il SARS-CoV-2 altamente trasmissibile e il più mortale MERS-CoV, i ricercatori identificano anche 102 potenziali ospiti di ricombinazione dei due virus e raccomandano il monitoraggio per questo evento .

I ricercatori osservano che i loro risultati si basano su dati limitati sui genomi del coronavirus e sulle associazioni virus-ospite e che esistono bias di studio per alcune specie animali, che presentano tutte incertezza nelle previsioni. Tuttavia, i recenti test su potenziali ospiti di mammiferi per la loro suscettibilità alla SARS-CoV-2 hanno già confermato alcune delle loro previsioni, come il cane procione, la capra domestica e l'alpaca.

"È importante notare che la ricombinazione virale è distinta dalle mutazioni. La ricombinazione avviene per periodi di tempo più lunghi e può generare ceppi o specie completamente nuovi. Il nostro lavoro può aiutare a indirizzare i programmi di sorveglianza per scoprire ceppi futuri prima che si riversino sugli esseri umani, dando noi un vantaggio nel combatterli", ha concluso il dottor Blagrove.

I ricercatori ora pianificano di espandere il loro modello per includere specie di uccelli, quindi, comprendendo l'intera gamma di importanti ospiti di coronavirus e una rete di contatti a livello di specie, che tenga conto del comportamento e dell'utilizzo dell'habitat delle specie ospiti, per fornire una panoramica più ampia del potenziale coronavirus. associazioni.


MODELLARE IL COVID-19 IN MODELLI ANIMALI GENETICAMENTE ALTERATI

Diversi approcci sono stati impiegati per aumentare la suscettibilità all'infezione da SARS-CoV-2 nei topi di laboratorio. Questi includono l'alterazione genetica del virus in modo che sia in grado di legare il topo Ace2, espressione di ACE2 umano sotto una varietà di promotori e trasfezione di topi con cDNA di ACE2 umano utilizzando vettori virali. I modelli murini per SARS-CoV-2 sono riassunti nella Tabella 3 .

Tabella 3

Segni clinici, patologia polmonare ed extrapolmonare e distribuzione virale nei modelli murini di COVID-19

Replicazione virale e trofismo tissutaleSegni cliniciPatologia polmonarePatologia ExtrapolmonareLocalizzazione immunoistochimica di SARS-CoV-2
SARS-CoV-2 23 . adattato al mouse
RNA virale: polmone, turbinato nasale, trachea, feci, cuore e fegato fino a 7 DPI
Virus infettivo: turbinato nasale, polmone fino a 2 DPI (giovane), 4 DPI (invecchiato)
Diminuzione della malattia potenziata dall'età del peso corporeo di 3 dpi solo nei topi anzianiNon riportatoEssudazione focale ed emorragia, polmonite interstizialePolmone: CC10 (cellula club) bronchi e bronchioli, cellule alveolari di tipo 1
Chimerico SARS-Co-V/SARS-CoV-2 82
RNA virale: polmoneRemdesivir migliora la perdita della funzione polmonare (pletismografia total body)Emorragia polmonare a 5 dpi ridotta dal trattamento con remdesivirNoNon esaminato
murino mace2 esone 2-hACE2 knockin mouse81
RNA virale: Prevalentemente in trachea, polmone, cervelloMarcata perdita di peso negli animali anzianiPolmonite interstizialeLesione del sistema vascolarePolmone: cellule CC10+ Clara nelle vie aeree, cellule alveolari di tipo II surfactant protein C positive (SPC+)
murino mace2 promotore-hACE2 topo transgenico82
RNA virale: il virus viene espulso dal polmone per 1 settimana dopo l'infezione e brevemente dall'intestino 1𠄷 dpiPerdita di peso transitoria e recupero di 7 dpiPolmonite interstiziale modesta, infiammazione mononucleare e granulocitica interstiziale e intra-alveolareVasculite negli organi extrapolmonariPolmone: macrofagi e linfociti T
Promotore HFH4/FOXJ1 topo transgenico hACE283, 84
RNA virale: polmone, occhi, cuore, cervelloFenotipo clinico binario: perdita di peso, distress respiratorio e sintomi neurologici, muoiono di 6 dpi altri asintomatici e sopravvivonoInfiammazione interstiziale da lieve a grave con formazione di membrana ialinaEdema cardiomiocitario e neuroinvasione sporadica nel cervello di topi decedutiPolmone: cellule epiteliali bronchiali e cellule alveolari
Promotore K18-hACE2 topo transgenico85�
RNA virale: espresso ai massimi livelli nel polmone e nel cervello, evidente nel colon e nel siero in un sottogruppo di animali di 7 dpiSignificativa perdita di peso di 4 dpi, alcuni animali diventano moribondi di 7𠄸 dpiEdema, infiltrazione alveolare, interstiziale e perivascolare di neutrofili e cellule mononucleate e consolidamentoEncefalite, vasculite e meningite dopo 5 dpiPolmone: cellule epiteliali alveolari, macrofagi, epitelio nasale Occhio: strato nucleare interno Cervello: bulbo olfattivo, esteso nei neuroni
Adenovirus 5- topo trasfettato con hACE257 , 78
RNA virale: polmone, bassi livelli in milza, cuore, cervelloPerdita di peso transitoria nei topi BALB/c più anzianiInfiammazione da perivascolare a interstiziale, detriti necrotici, edema alveolare e congestione ed emorragia vascolare, più grave a 5 dpiNon descrittoPolmone: cellule epiteliali alveolari e bronchiolari
Virus adeno-associato (AAV9)-hACE2 topo93
RNA virale: limitato alle vie respiratorieNessuna perdita di peso o malattia clinicaPolmonite interstizialeNon descrittoPolmone: cellule epiteliali alveolari

Topi di tipo selvaggio e immunocompromessi

I topi wild-type non supportano un'infezione significativa da SARS-CoV-2 a causa dell'interazione insufficiente tra la proteina S virale e l'ACE2.86 murino. c, topi DBA/2J,87 e ICR88. Tuttavia, il legame virale all'ACE2 murino non è del tutto assente e la replicazione virale molto limitata è evidente nel polmone in Stat1−/− topi,87  Rag1 −/− topi privi di cellule B e T mature, 87 topi SCID, Il28r−/− topi, Ifnar1−/− topi,77 e AG129 (topi deficienti del recettore dell'interferone di tipo I e II87).

SARS-CoV-2 . adattato al mouse

Dinnon etਊl23 hanno ingegnerizzato Q498T/P499Y nel gene SARS-CoV-2 S per generare un virus ricombinante (SARS-CoV-2 MA) che potrebbe utilizzare l'ACE2 di topo per l'ingresso. SARS-CoV-2 MA si replica nelle vie aeree superiori e, in misura minore, inferiori di topi BALB/c sia giovani adulti che anziani. Rispetto ai topi giovani, i vecchi topi infetti da SARS-CoV-2 MA sviluppano una polmonite interstiziale più grave con una maggiore compromissione della funzione polmonare nella vita.

Virus chimerici SARS-CoV/SARS-CoV-2

Un virus chimerico composto da SARS-CoV adattato al topo (che consente l'infezione tramite il legame mACE2) e RNA polimerasi SARS-CoV-2 RNA-dipendente consente di testare l'efficacia antivirale di remdesivir.89 L'incorporazione del metabolita attivo remdesivir trifosfato avviene preferenzialmente al substrato naturale ATP e provoca la terminazione della catena 3 nucleotidi a valle dell'incorporazione. I topi producono un'esterasi sierica, la carbossil esterasi 1c (Ces1c), che è assente nell'uomo e riduce l'emivita di remdesivir. Pertanto gli studi sui topi con remdesivir devono essere eseguiti in C57Bl/6 . transgenico Ces1c−/− i topi. In questo modello,89 l'istopatologia non viene mostrata, tuttavia, viene riportata una riduzione significativa dell'emorragia polmonare grossolanamente osservabile a 5 dpi con il trattamento con remdesivir nonostante la perdita di peso simile nei gruppi trattati con veicolo e remdesivir.

Murine mAce2 Exon 2-hACE2 Knockin Mouse

Utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9, Sun etਊl 52 hanno inserito il cDNA di hACE2 nell'esone 2 del mace2 gene per interrompere mace2 espressione genica e guidano l'espressione di hACE2 sotto il controllo di Mazza2 promotore. L'espressione di hACE2 si verifica nei polmoni, nell'intestino tenue, nella milza e nei reni. Nel polmone, hACE2 è espresso nelle cellule CC10+ Clara delle vie aeree e in una sottopopolazione di cellule alveolari di tipo II positive per la proteina C surfattante. Alte cariche virali di SARS-CoV-2 sono evidenti nel polmone, nella trachea e nel cervello (nonostante la bassa espressione di hACE2) in caso di infezione intranasale. I giovani animali inoculati non mostrano sintomi clinici evidenti ma sviluppano polmonite interstiziale e lesioni del sistema vascolare. La malattia più grave è osservata nell'hACE2 di età avanzata. Questi mostrano una perdita di peso più marcata, una diffusione virale più prolungata (anche dalle feci) e una polmonite più grave accompagnata da risposte più forti delle citochine. L'inoculazione intragastrica di SARS-CoV-2 induce infezione produttiva e malattie polmonari.

Topi transgenici hACE2

I topi transgenici per hACE2 sono stati sviluppati oltre un decennio fa per studiare la SARS-CoV e per consentire la creazione di una malattia significativamente maggiore di quella indotta nei topi wild-type. Gli stessi modelli consentono anche l'infezione da SARS-CoV-2 e i loro effetti differiscono dal promotore che guida l'espressione di hACE2.

Murino mace2 promotore-hACE2 topo transgenico

Originariamente descritto da Yang etਊl,90 topi infetti da SARS-CoV– che esprimono hACE2 nei polmoni, nel cuore, nei reni e nell'intestino consentono una maggiore replicazione virale e sviluppano lesioni polmonari più gravi rispetto ai topi wild-type. Si nota vasculite negli organi extrapolmonari e antigene virale nel cervello, ma l'encefalite non si verifica. I topi transgenici ICR-hACE2 inoculati con SARS-CoV-288 sperimentano una perdita di peso transitoria e un recupero di 7 dpi. Il virus viene espulso dal polmone per 1 settimana dopo l'infezione e brevemente dall'intestino 1𠄷 dpi. Si sviluppa una polmonite interstiziale relativamente lieve ed è caratterizzata da infiammazione mononucleare e granulocitica interstiziale e intra-alveolare. SARS-CoV-2 è evidente immunoistochimicamente nei macrofagi e nei linfociti T.

Promotore HFH4/FOXJ1 topi transgenici hACE2

Originariamente sviluppato nel 2016,91 il promotore HFH4/FOXJ1 specifico delle cellule epiteliali ciliate del polmone guida l'espressione di hACE2 ad alti livelli di hACE2 nel polmone e, a vari livelli, nel cervello, nel fegato, nei reni e nel tratto gastrointestinale. I topi inoculati con SARS-CoV-292 sperimentano fenotipi clinici binari, in cui alcuni perdono peso, mostrano difficoltà respiratoria e sintomi neurologici e muoiono di 6 dpi, mentre altri sopravvivono senza evidenza di disagio clinico. È interessante notare che i primi sono maschi, forse ricapitolando la suscettibilità maschile alla mortalità da COVID-19. È evidente uno spettro di patologie polmonari che va da lieve a grave infiammazione interstiziale con formazione di membrana ialina. È evidente l'edema dei cardiomiociti e la neuroinvasione sporadica nel cervello di topi deceduti. I topi morenti soffrono di linfopenia, uno dei principali segni clinici della grave malattia da COVID-19.

Promotore K18-hACE2 topi transgenici

I topi che esprimono hACE2 sotto il controllo del promotore K18 sono stati sviluppati per studiare SARS-CoV.93,94 Quando infettati da SARS-CoV-2,95,96 la patologia polmonare è tra le più gravi di quella descritta nei modelli murini96,97 ed è accompagnata da profonda infiammazione mononucleare perivascolare con minima infezione endoteliale virale.97 Si notano letalità significativa e bias maschile nella gravità della malattia.97 Nei topi emizigoti K18-hACE2,96 l'espressione è più alta nei polmoni, seguiti da cuore, cervello, colon e reni livelli nel duodeno, nell'ileo e nella milza. I livelli polmonari di hACE2 diminuiscono nel corso della malattia.96 I topi K18-hACE2 a cui è stato somministrato SARS-CoV-2 per via intranasale mostrano una significativa perdita di peso di 4 dpi,95,96 con molti animali che diventano moribondi di 7 dpi.96,97 L'RNA virale è espresso a livelli più alti nel polmone ed è evidente nel colon e nel siero solo in un sottogruppo di animali di 7 dpi. L'istopatologia polmonare è grave e caratterizzata da consolidamento, edema, infiltrazione alveolare e interstiziale e perivascolare di neutrofili e cellule mononucleate. L'RNA virale è evidente dall'ibridazione in situ nelle cellule epiteliali alveolari polmonari e nei macrofagi97 così come negli epiteli nasali. K18-hACE2 I topi TG sperimentano una significativa infezione del sistema nervoso centrale in seguito all'infezione con SARS-CoV93, 94 e SARS-Cov-2,53, 54, 97 Simili aumenti di citochine (polmone) e chemochine (cervello) sono descritti nei topi K18 infetti da SARS-CoV-2. .54 I singoli topi esprimono l'RNA virale nella retina97 e nel bulbo olfattivo e in tutto il cervello,53, 97accompagnato da encefalite, vasculite e meningite da 5਍pi.96� Mediante ibridazione in situ, l'RNA virale è presente nelle cellule NeuN +, implicante infezione neuronale nei topi97 e nei pazienti umani COVID-19.53 Rare trombosi sono state notate nel cervello murino.97 La presenza virale nelle cellule endoteliali murine all'interno del cervello è carente53 tuttavia, si nota rimodellamento vascolare nelle regioni di infezione virale neuronale. Al contrario, l'invasione endoteliale da parte del virus è evidente nei pazienti COVID-19 che presentano infarti ischemici ed emorragici.53 Le lesioni neurologiche nei topi infetti da SARS-Cov-2– sono coerenti con gli studi originali che utilizzano SARS-Co-V in questo modello in cui il virus extrapolmonare si diffonde al cervello attraverso il tratto olfattivo e uccide tutti i topi di 7 dpi.93,94 L'infezione midollare è associata a polmonite ab ingestis che complica l'interpretazione della patologia polmonare. Sia il polmone che il cervello esprimono un aumento delle citochine infiammatorie (chemochina (motivo CXC) ligando 1 (CXCL-1), chemochina (motivo CXC) ligando 10 (CXCL-10), interleuchina-6 (IL-6) e interleuchina-61 beta ( IL-1beta)). Questo è accompagnato da una significativa infiammazione nel polmone ma morte neuronale senza infiammazione nel cervello.94 È interessante notare che le regioni infette da SARS-CoV-2– del cervello umano allo stesso modo mancano di infiammazione.53

Trasduzione virale di hACE2 utilizzando l'Adenovirus 5

I topi hACE2 BALB/c e C57BL/6 trasdotti con adenovirus infettati da SARS-CoV-264 sperimentano una durata della malattia acuta ma transitoria di 7�ꃚys. Le lesioni polmonari comprendono infiammazione da perivascolare a interstiziale, detriti necrotici, edema alveolare e congestione vascolare ed emorragia, la più grave a 5 dpi. La sovraregolazione dei geni che codificano per i mediatori dell'infiammazione e i componenti delle risposte adattative e innate avviene di 2 dpi ed è seguita dalla comparsa di anticorpi neutralizzanti il ​​virus e dalle risposte CD4 e CD8 alle proteine ​​virali N e S, rispettivamente, di 10 dpi. La clearance virale è compromessa e il fenotipo polmonare peggiorato dalla deplezione di CD4/CD8 o dalla segnalazione alterata dell'interferone conferita da Stat1−/− genotipo. Al contrario, la clearance virale è accelerata e il fenotipo è migliorato dalla vaccinazione, dall'induzione di IFN di tipo I mediante poli I:C, dal trasferimento passivo di anticorpi da topi guariti o dal trasferimento di siero da pazienti COVID-19. In un modello simile, la patologia polmonare nei topi infettati da AdV-hACE2– e SARS-CoV-2– può essere peggiorata con mAb anti-Ifnar1 o migliorata mediante pretrattamento con mAb anti-SARS-CoV-2.87

Mouse adeno-associato Virus-hACE2

I topi trasdotti con virus adeno-associato-hACE2 e successivamente infettati da SARS-CoV-2 non sperimentano perdita di peso o malattia clinica.99 La polmonite interstiziale è accompagnata da sovraregolazione di citochine e geni stimolati dall'interferone e infiltrazione di macrofagi derivati ​​​​da monociti e cellule linfoidi attivate . Gli anticorpi neutralizzanti compaiono di 7 dpi.


Spettro del coronavirus Sars

L'epidemia di coronavirus di Wuhan ha una somiglianza con l'epidemia di Sars (sindrome respiratoria acuta grave) del 2002-03 (Sars-CoV). L'epidemia di Sars-CoV, iniziata nel sud della Cina, è durata oltre nove mesi. Si è diffuso in 37 paesi, causando la malattia di 8.098 persone e la morte di 774.

Quasi il 10% di quelli confermati per essere infetti ha continuato a morire. La natura mortale della malattia, la frequente diffusione da uomo a uomo e l'infezione del personale clinico in prima linea hanno contribuito alla gravità dell'epidemia.

Sars-CoV è stato rintracciato in diversi animali, tra cui zibetti e cani procioni, venduti come cibo nei mercati. Gli animali infetti non avevano sintomi. La chiusura dei mercati con l'abbattimento degli animali insieme al trattamento e al contenimento dei pazienti ha portato all'arresto dell'epidemia.

I cani procione potrebbero aver diffuso la Sars. Stanislav Duben/Shutterstock

Ulteriori indagini hanno rintracciato virus simili alla Sars in pipistrelli a ferro di cavallo trovati in una grotta in Cina. Si pensa che gli zibetti possano aver preso l'infezione dai pipistrelli e poi diffonderla agli umani nei mercati cittadini.

La Sars non si vedeva dal 2003 e si pensa che il virus sia ormai estinto. Il nuovo coronavirus di Wuhan non è il Sars-CoV, ma è simile ai virus ritenuti precursori della Sars nei pipistrelli.


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Origini animali degli HCoV

Tutti e quattro gli HCoV acquisiti in comunità che causano sintomi lievi sono stati ben adattati agli esseri umani. Da un'altra prospettiva, potrebbe anche essere vero che gli esseri umani si sono ben adattati a questi quattro HCoV. In altre parole, entrambi potrebbero essere i sopravvissuti alle antiche pandemie di HCoV. Gli HCoV che causano gravi malattie negli esseri umani e gli esseri umani che hanno sviluppato gravi malattie da HCoV sono stati eliminati. Perché ciò accada, gli HCoV devono replicarsi negli esseri umani in misura sufficiente per consentire l'accumulo di mutazioni adattative che contrastano i fattori di restrizione dell'ospite. In questo senso, più a lungo persiste l'epidemia di SARS-CoV-2 e più persone infetta, maggiori sono le possibilità che si adatti completamente all'uomo. Se si adatta bene, la sua trasmissione nell'uomo sarebbe difficile da fermare con la quarantena o altre misure di controllo delle infezioni.

Per molti anni, i quattro CoV acquisiti in comunità circolano nelle popolazioni umane, innescando il raffreddore comune nei soggetti immunocompetenti. Questi virus non hanno bisogno di un serbatoio animale. Al contrario, SARS-CoV e MERS-CoV altamente patogeni non si sono adattati bene agli esseri umani e la loro trasmissione all'interno degli esseri umani non può essere sostenuta. Hanno bisogno di mantenersi e propagarsi nei loro serbatoi zoonotici e cercano la possibilità di riversarsi su bersagli umani suscettibili, possibilmente attraverso uno o più ospiti intermedi e amplificanti. SARS-CoV-2 ha caratteristiche simili sia a SARS-CoV/MERS-CoV che ai quattro HCoV acquisiti dalla comunità. È altamente trasmissibile come gli HCoV acquisiti dalla comunità, almeno per il momento. Tuttavia, è più patogeno degli HCoV acquisiti in comunità e meno patogeno di SARS-CoV o MERS-CoV. Resta da vedere se si adatterà completamente agli esseri umani e circolerà all'interno degli esseri umani senza un serbatoio o un ospite animale intermedio.

Prima di discutere le origini animali degli HCoV, ci servirà per discutere le definizioni e le caratteristiche degli ospiti evolutivi, naturali, di riserva, intermedi e di amplificazione degli HCoV. Un animale funge da ospite evolutivo di un HCoV se ospita un antenato strettamente correlato che condivide un'elevata omologia a livello di sequenza nucleotidica. Il virus ancestrale è solitamente ben adattato e non patogeno in questo ospite. Allo stesso modo, un host serbatoio ospita HCoV continuamente e per lungo termine. In entrambi i casi, gli ospiti sono naturalmente infetti e sono gli ospiti naturali di HCoV o del suo virus parentale. Al contrario, se l'HCoV viene introdotto di recente in un ospite intermedio subito prima o intorno alla sua introduzione nell'uomo, non è ben adattato al nuovo ospite ed è spesso patogeno. Questo ospite intermedio può fungere da fonte zoonotica dell'infezione umana e svolgere il ruolo di ospite amplificatore consentendo al virus di replicarsi transitoriamente e quindi trasmettendolo all'uomo per amplificare la scala dell'infezione umana. Un HCoV può subire un'infezione senza uscita se non può sostenere la sua trasmissione all'interno dell'ospite intermedio. Al contrario, gli HCoV possono anche adattarsi all'ospite intermedio e persino stabilire endemicità a lungo termine. In questo caso, l'ospite intermedio diventa un ospite serbatoio naturale.


Ringraziamo il Genome Technology Centre (RGTC) di Radboudumc per l'utilizzo del Sequencing Core Facility (Nijmegen, Paesi Bassi), che ha fornito il servizio di sequenziamento PacBio SMRT sulla piattaforma Sequel II. Ringraziamo anche Damian Baranski per l'aiuto con l'isolamento del DNA e la preparazione della libreria e Norbert Peter e Dorian D. Dörge per aver fornito i campioni.

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Parole chiave: assemblaggio e annotazione del genoma, SARS-CoV-2, Carnivora, cane procione (Nyctereutes procyonoides), cromosoma B

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Ricevuto: 25 gennaio 2021 Accettato: 24 marzo 2021
Pubblicato: 29 aprile 2021.

Gabriele Bucci, Ospedale San Raffaele (IRCCS), Italia

Andrea Spitaleri, Ospedale San Raffaele (IRCCS), Italia
Shilpa Garg, Harvard Medical School, Stati Uniti

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