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Qual è il ruolo dei RAGE?

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Secondo gli articoli che ho letto, gli AGE (prodotti finali della glicazione avanzata) attivano i RAGE (recettori per gli AGE). Questa attivazione aumenta i livelli di ROS (specie reattive dell'ossigeno) nelle cellule.

I radicali liberi possono causare danni alle cellule, il che sicuramente non va bene. Cosa ne pensi, qual è il ruolo dei RAGE, che è più importante del danno cellulare?


Segnalazione RAGE in biologia scheletrica

Scopo della revisione: Il recettore per i prodotti finali della glicazione avanzata (RAGE) e molti dei suoi ligandi sono stati implicati nell'insorgenza e nella progressione di patologie associate all'invecchiamento, all'infiammazione cronica e allo stress cellulare. In particolare, è stato studiato il ruolo di RAGE e dei suoi ligandi nel tessuto osseo sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Tuttavia, la misura in cui la segnalazione RAGE regola l'omeostasi ossea e l'insorgenza della malattia rimane poco chiara. Inoltre, non sono noti gli effetti di RAGE nelle diverse cellule ossee e se questi effetti siano specifici del tipo di cellula. L'obiettivo della presente revisione è descrivere la letteratura sulla segnalazione di RAGE nella biologia scheletrica e discutere il potenziale clinico di RAGE come bersaglio diagnostico e/o terapeutico nelle malattie ossee.

Risultati recenti: Il ruolo di RAGE e dei suoi ligandi durante l'omeostasi scheletrica, la riparazione dei tessuti e l'insorgenza/progressione della malattia sta cominciando a essere scoperto. Ad esempio, sono stati identificati effetti dannosi dei ligandi RAGE, prodotti finali di glicazione avanzata (AGE), per la vitalità/attività degli osteoblasti, mentre altri hanno osservato che l'esposizione a bassi livelli di AGE stimola l'autofagia degli osteoblasti, che successivamente promuove la vitalità e la funzione. Risultati simili sono stati riportati con HMGB1, un altro ligando RAGE, in cui alti livelli del ligando sono associati all'apoptosi degli osteoblasti/osteociti, mentre la somministrazione a basso livello/a breve termine stimola la differenziazione degli osteoblasti/la formazione ossea e promuove la guarigione della frattura. Inoltre, livelli elevati di diversi ligandi RAGE (AGE, HMGB1, proteine ​​S100) inducono l'apoptosi degli osteoblasti/osteociti e stimolano la produzione di citochine, che è associata ad una maggiore differenziazione/attività degli osteoclasti. Al contrario, l'esposizione diretta al ligando RAGE negli osteoclasti può avere effetti inibitori. Queste osservazioni supportano la conclusione che l'elevato riassorbimento osseo osservato in condizioni di alta circolazione dei ligandi e dell'espressione di RAGE è dovuto ad azioni su osteoblasti/osteociti piuttosto che ad azioni dirette sugli osteoclasti, sebbene sia necessario ulteriore lavoro per corroborare le osservazioni. Recenti studi hanno dimostrato che RAGE ei suoi ligandi svolgono un importante ruolo fisiologico nella regolazione dello sviluppo scheletrico, dell'omeostasi e della riparazione/rigenerazione. Al contrario, livelli elevati di RAGE e dei suoi ligandi sono chiaramente correlati a varie malattie associate a un aumento della perdita e della fragilità ossea. Tuttavia, nonostante i recenti progressi nel campo, molte domande riguardanti RAGE e i suoi ligandi nella biologia scheletrica rimangono senza risposta.

Parole chiave: Osteoblasti Osteoblasti Osteoclasti Osteoporosi RAGE.

Dichiarazione di conflitto di interessi

Lillian Plotkin, Alyson Essex e Hannah Davis non dichiarano alcun conflitto di interessi.


Recensione

Introduzione

Il recettore per i prodotti finali della glicazione avanzata [RAGE] è un membro della superfamiglia delle immunoglobuline, codificato nella regione di Classe III del complesso maggiore di istocompatibilità [1-4]. Questo recettore multiligando ha un dominio di tipo V, due domini di tipo C, un dominio transmembrana e una coda citoplasmatica. Il dominio V ha due siti di N-glicosilazione ed è responsabile della maggior parte (ma non di tutti) il legame del ligando extracellulare [5]. Si ritiene che la coda citoplasmatica sia essenziale per la segnalazione intracellulare, possibilmente legandosi a diafano-1 per mediare la migrazione cellulare [6]. Originariamente si pensava che i prodotti finali della glicazione avanzata (AGE) fossero i suoi principali ligandi attivanti, ma da allora sono stati identificati molti altri ligandi di RAGE, inclusi i pattern molecolari associati al danno (DAMP's) [1, 7, 8]. RAGE è quindi considerato un recettore di riconoscimento di pattern (PRR), con un'ampia varietà di ligandi [9-11].

RAGE è espresso sia come forme a lunghezza intera, legate alla membrana (fl-RAGE o mRAGE, da non confondere con RAGE di topo) sia come varie forme solubili prive del dominio transmembrana. Il RAGE solubile è prodotto sia dalla scissione proteolitica di fl-RAGE che dallo splicing alternativo dell'mRNA. Le isoforme solubili includono i domini extracellulari ma mancano dei domini transmembrana e citoplasmatici [12–15]. RAGE solubile derivato specificamente dalla scissione proteolitica è sRAGE, sebbene questa terminologia non sia coerente in letteratura - sRAGE a volte si riferisce a RAGE solubile in generale. RAGE è espresso a bassi livelli in un'ampia gamma di cellule adulte differenziate in modo regolato, ma nei pneumociti polmonari maturi di tipo I è espresso a livelli sostanzialmente più elevati rispetto ad altri tipi di cellule a riposo. È altamente espresso in quantità facilmente rilevabili nelle cellule embrionali [16]. RAGE è anche altamente espresso e associato a molti stati patologici correlati all'infiammazione come malattie vascolari, cancro, neurodegenerazione e diabete (Figura 1) [17, 18]. Le eccezioni sono i tumori polmonari e la fibrosi polmonare idiopatica, in cui l'espressione di RAGE diminuisce da un livello più alto nel tessuto sano [19, 20].

RAGE è al centro di molti processi biologici fondamentali. Concentrarsi su RAGE ci consente di visualizzare molti aspetti della biologia cellulare disordinata e delle malattie croniche associate. Lo stress cronico promuove un ampio spettro di malattie attraverso l'espressione e la segnalazione di RAGE, focalizzando la risposta infiammatoria e riparativa dell'ospite.

RAGE e RAGE solubile

L'mRNA umano di RAGE subisce uno splicing alternativo, proprio come con altre proteine ​​situate all'interno del locus MHC-III sul cromosoma 6. Una forma solubile con un nuovo C-terminale viene rilevata a livello della proteina, denominata "Endogenous Secretory RAGE" (esRAGE o RAGE_v1) [21]. Questa forma viene rilevata mediante immunoistochimica in un'ampia varietà di tessuti umani che non si colorano per quantità notevoli di fl-RAGE [22]. Finora sono state identificate oltre 20 diverse varianti di splicing per RAGE umano. Lo splicing umano di RAGE è molto dipendente dal tessuto, con l'mRNA di fl-RAGE più diffuso nelle cellule muscolari lisce polmonari e aortiche mentre l'mRNA di esRAGE è prevalente nelle cellule endoteliali. Molte delle sequenze di splicing sono potenziali bersagli della via del decadimento mediato da non senso (NMD) e quindi è probabile che vengano degradate prima dell'espressione della proteina. Molte altre mancano della sequenza segnale sull'esone1 e quindi la proteina espressa potrebbe essere soggetta a degradazione prematura. Le uniche varianti umane che sono state rilevate a livello proteico in vivo Sono fl-RAGE, sRAGE e esRAGE [17, 22].

Il fl-RAGE umano è anche soggetto a scissione proteolitica da parte della metalloproteinasi di membrana ADAM10, rilasciando il dominio extracellulare come isoforma solubile [12–14]. Gli anticorpi portati al nuovo C-terminale di esRAGE non riconoscono l'isoforma risultante dalla scissione proteolitica. Nel siero la specie predominante è la scissione proteolitica e non l'isoforma di splicing dell'mRNA [12]. Il potenziamento della scissione proteolitica aumenterà i livelli di RAGE solubili, mentre l'inibizione aumenterà i livelli di fl-RAGE. Questo processo di scissione è modulato dai livelli di Ca++ e, in seguito alla scissione proteolitica, il frammento C-terminale rimanente legato alla membrana è soggetto a ulteriore degradazione da parte della γ-secretasi [13, 14]. La scissione del frammento C-terminale da parte della γ-secretasi rilascerà un dominio intercellulare RAGE (RICD) nello spazio citosolico/nucleare. Anche se RICD non è stato ancora rilevato ed è presumibilmente degradato rapidamente, la sovraespressione di una forma ricombinante di RICD aumenterà l'apoptosi come misurato dal saggio TUNEL, indicando che l'elaborazione di RAGE ha un altro ruolo intercellulare [14].

Anche l'mRNA murino di fl-RAGE subisce splicing alternativo e alcuni dei prodotti di splicing sono ortologhi di esRAGE [23]. Ad oggi sono stati rilevati oltre 17 diversi splicing di mRNA. Come con le varianti di giunzione umana, le varianti di giunzione del topo sono espresse in modo dipendente dal tessuto e molte sono bersagli della NMD. Esistono diversi modelli di splicing comuni quando si confrontano RAGE umani e topi, sebbene le varianti che darebbero origine a un'isoforma solubile siano molto più rare nei topi [15].

RAGE ricombinante è stato clonato in una varietà di vettori di espressione e RAGE solubile nativo è stato purificato da polmone murino, bovino e umano [24-28]. Un'isoforma solubile ricombinante assume un fenotipo dominante-negativo e blocca la segnalazione. Il RAGE solubile può agire come un "recettore esca" extracellulare, antagonizzando fl-RAGE e altri recettori legando DAMP e altri ligandi e inibendo il reclutamento dei leucociti in una varietà di condizioni infiammatorie acute e croniche [4]. Sia esRAGE che sRAGE agiscono come recettori esca per il ligando HMGB1 [12]. Tuttavia RAGE solubile ha funzioni diverse dal semplice blocco della funzione fl-RAGE ed esercita proprietà pro-infiammatorie attraverso l'interazione con Mac-1 [10, 29]. Pertanto, sebbene RAGE solubile abbia proprietà protettive nel contesto dell'infiammazione cronica, potrebbe essere meglio descritto come un biomarcatore dell'infiammazione cronica [30, 12]. Non sono ancora disponibili informazioni sugli effetti a lungo termine del trattamento con RAGE solubile esogeno e non è stato ancora dimostrato che i livelli plasmatici di RAGE solubile siano sufficienti per agire efficacemente come recettore esca in vivo [18].

Le due diverse proprietà di RAGE solubile (recettore esca e pro-infiammatorio) e le diverse vie associate alla sua produzione potrebbero spiegare perché ci sono correlazioni sia positive che negative tra i suoi livelli nel siero umano e la malattia. La RAGE totale solubile nel siero è significativamente più bassa negli uomini non diabetici con malattia coronarica rispetto a quelli senza [31]. Come valutato dall'ipersensibilità di tipo ritardato e dalla colite infiammatoria, RAGE solubile ha soppresso l'infiammazione nei topi carenti di IL-10, ha ridotto l'attivazione di NFκB e ha ridotto l'espressione di citochine infiammatorie [32, 33]. I topi knockout RAGE hanno una capacità limitata di sostenere l'infiammazione e alterare l'elaborazione e la crescita del tumore. Pertanto, RAGE guida e promuove le risposte infiammatorie durante la crescita del tumore in più fasi e ha un ruolo centrale nell'infiammazione cronica e nel cancro [34].

Livelli più bassi di livelli solubili di RAGE si trovano nella sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e livelli più bassi di esRAGE predicono la mortalità cardiovascolare nei pazienti con malattia renale allo stadio terminale [35, 36]. Nei pazienti con diabete di tipo 2 livelli più elevati di RAGE solubile sono correlati positivamente con altri marcatori infiammatori come MCP-1, TNF-α, AGE e sVCAM-1 [37, 38]. RAGE solubile totale ma non esRAGE correla con l'albuminuria nel diabete di tipo 2 [39]. È interessante notare che, sebbene i cambiamenti nei livelli sierici umani di RAGE solubile si correlino molto bene con la progressione delle patologie correlate all'infiammazione, nel siero di topo RAGE solubile non è rilevabile [18]. Ciò contrasta l'importanza dello splicing e della scissione proteolitica che forma RAGE solubile nei topi e nell'uomo [15]. Una precauzione è che sebbene i test ELISA basati su RAGE solubile nel siero mostrino un'elevata precisione e riproducibilità, i livelli mostrano un'elevata variazione (500-3500 ng/L P < 0,05) tra donatori altrimenti sani [40]. I livelli solubili di RAGE sono correlati ai livelli di AGE anche in soggetti non diabetici [41]. Pertanto, sebbene una misurazione di RAGE solubile possa non essere sufficiente per predire uno stato patologico, i cambiamenti dei livelli nel tempo potrebbero essere predittivi dello sviluppo di una malattia.

La segnalazione di RAGE perpetua la risposta immunitaria e infiammatoria

Una recente revisione copre ampiamente il ruolo della segnalazione RAGE nel diabete e nella risposta immunitaria [18]. L'attivazione di più molecole di segnalazione intracellulare, tra cui il fattore di trascrizione NF-κB, le chinasi MAP e le molecole di adesione, vengono notate in seguito all'attivazione di RAGE. Il reclutamento di tali molecole e l'attivazione delle vie di segnalazione variano con i singoli ligandi RAGE. Ad esempio, HMGB1, S100B, Mac-1 e S100A6 attivano RAGE attraverso percorsi di trasduzione del segnale distinti [42, 43]. Ann Marie Schmidt ha postulato un modello "two-hit" per la perturbazione vascolare mediata da RAGE e dai suoi ligandi [9]. Questo modello "two-hit" ipotizza che il primo "hit" sia un aumento dell'espressione di RAGE e dei suoi ligandi espressi all'interno del sistema vascolare. Il secondo "colpo" è la presenza di varie forme di stress (es. stress ischemico, stimoli immunitari/infiammatori, stress fisico o lipoproteine ​​modificate), che portano a una risposta cellulare esagerata che promuove lo sviluppo di lesioni vascolari. Ancora più importante, l'impegno di RAGE perpetua l'attivazione di NF-kB mediante sintesi de novo di NF-kBp65, producendo così un pool in costante crescita di questo fattore di trascrizione pro-infiammatorio [44]. RAGE è associato a risposte amplificate dell'ospite in diverse condizioni patologiche, tra cui diabete, infiammazione cronica, tumori e disturbi neurodegenerativi [18]. Allo stesso modo, potremmo ipotizzare che durante i periodi di interruzione della barriera epiteliale che sia il segnale 1, uno stimolo del fattore di crescita, sia il segnale 2, varie forme di stress, in combinazione con i ligandi RAGE e RAGE, aiutino a mediare questo effetto.

RAGE Ligandi

I ligandi RAGE rientrano in diverse famiglie distinte. Includono le proteine ​​della famiglia del gruppo ad alta mobilità, tra cui il prototipo HMGB1/anfoterina, i membri della famiglia delle proteine ​​S100/calgranulina, proteine ​​di matrice come il collagene I e IV, il peptide Aβ e alcuni prodotti finali di glicazione avanzata come la carbossimetillisina (CML-AGE) [ 4, 6, 16, 45]. Non tutti i membri di queste famiglie sono stati identificati come ligandi RAGE e molti ligandi RAGE hanno una varietà di effetti indipendenti da RAGE [46]. Le molecole AGE sono prevalenti in condizioni patologiche caratterizzate da stress ossidativo, generazione di specie metossiliche e aumento della glicemia, come riscontrato nel diabete mellito di tipo 2 [6, 27]. La famiglia S100/calgranulina è costituita da polipeptidi leganti il ​​calcio strettamente correlati che agiscono come citochine extracellulari proinfiammatorie.

L'accumulo e l'impegno di ligandi a loro volta sovraregolano l'espressione di RAGE [2]. Non è noto perché alcuni ligandi (come HMGB1, alcuni S100 e CML-AGE) causino un forte segnale proinfiammatorio attraverso RAGE, mentre molecole simili (come pentosidina-AGE e pirralina-AGE) sembrano avere molto meno o nessun segnalazione. L'ipotesi più comunemente accettata per riconciliare queste differenze implica l'oligomerizzazione del ligando. Dei ligandi RAGE identificati, quelli che oligomerizzano attivano RAGE più fortemente [3]. Gli oligomeri dei ligandi potrebbero potenzialmente reclutare diversi recettori RAGE e recettori Toll-like [TLR] sulla superficie cellulare o sulle vescicole intracellulari e indurre il loro raggruppamento sulla superficie cellulare. Ad esempio, i dimeri S100 e i multimeri di ordine superiore legano diversi recettori tra cui TLR4 e il raggruppamento di RAGE potrebbe promuovere una risposta altrettanto forte [47]. Studi recenti mostrano che gli AGE e alcuni multimeri S100 raggrupperanno RAGE in questo modo [11, 48, 49]. Tuttavia questo non spiega completamente perché alcuni ligandi attivino RAGE fortemente mentre altri strutturalmente simili non sembrano attivarlo affatto [50].

Panoramica di HMGB1 e della famiglia di proteine ​​HMG

Le proteine ​​HMG (High Mobility Group) sono proteine ​​cromosomiche molto basiche, nucleari, non istoniche di cui HMGB1 è l'unico membro che ha dimostrato di attivare RAGE. Le proteine ​​HMG non devono essere confuse con il composto non correlato nella via del mevalonato "HMG-CoA" (3-idrossi-3-metilglutaril coenzima A) e "inibitori della HMG-CoA reduttasi" (statine) [51]. Le proteine ​​HMG sono state identificate per la prima volta nel timo di vitello nel 1973 e denominate per la loro elevata mobilità nei gel di separazione proteica [52]. Tipicamente hanno un'alta percentuale di amminoacidi carichi e hanno una massa inferiore a 30 kDa. Le proteine ​​HMG sono espresse in quasi tutti i tipi cellulari, relativamente abbondanti nel tessuto embrionale e si legano al DNA in modo dipendente dal contenuto ma indipendente dalla sequenza [53]. Sono importanti nel rimodellamento della cromatina e hanno molte altre funzioni. I dati knockout del mouse mostrano che la perdita di una qualsiasi delle proteine ​​HMG si tradurrà in cambiamenti fenotipici deleteri rilevabili. Di questi, i topi HMGB1 (-/-) muoiono di ipoglicemia entro 24 ore dalla nascita [54, 55]. Il reincrocio esteso dell'allele knockout in vari ceppi murini ha rivelato un fenotipo ancora più profondo con topi che muoiono per E15 di sviluppo [Marco Bianchi, comunicazione personale]. L'omologia tra topo e HMGB1 umano è straordinaria con solo due differenze di amminoacidi osservate. Una simile omologia profonda esiste in tutte le specie di vertebrati con l'85% di omologia con il pesce zebra.

Esistono tre sottoclassificazioni delle proteine ​​HMG: HMGA, HMGB e HMGN (Tabella 1). Esiste anche un insieme simile noto come proteine ​​del motivo HMG. Le proteine ​​del motivo HMG differiscono per il fatto che sono specifiche del tipo cellulare e legano il DNA in modo specifico della sequenza. Le proteine ​​HMGA (precedentemente HMGI/Y) si distinguono dalle altre proteine ​​HMG avendo tre sequenze AT-hook (che si legano a sequenze di DNA ricche di AT) [56, 57]. Hanno anche una coda C-terminale un po' acida, sebbene l'HMGA1c, scoperto di recente, non abbia una coda acida e solo due ganci AT. Le proteine ​​HMGN (precedentemente HMG14 e HMG17) hanno domini di legame nucleosomiali. Le proteine ​​HMGB (precedentemente da HMG1 a HMG4) si distinguono per avere due scatole di legame al DNA che hanno un'elevata affinità per il DNA CpG, nuclei apoptotici e strutture altamente piegate come giunzioni di Holliday a quattro vie e DNA platinato/platino modificato. Le proteine ​​HMGB hanno una lunga coda acida C-terminale ad eccezione di HMGB4, che recentemente è stata rilevata a livello proteico nel testicolo dove agisce come repressore trascrizionale [58]. La coda acida dell'HMGB è costituita da almeno 20 residui consecutivi di acido aspartico e glutammico. Una coda acida C-terminale di questa lunghezza e composizione è raramente vista in Natura, sebbene alcune altre proteine ​​​​correlate all'autofagia e all'apoptosi come la paratimosina abbiano un lungo tratto interno di peptidi acidi [59-61].

Delle proteine ​​HMG, HMGB1 ha un ruolo citosolico ed extracellulare aggiuntivo come proteina che promuove l'autofagia e come citochina senza leader, rispettivamente [62]. I macrofagi, le cellule NK e le DC mature secernono attivamente HMGB1 e le cellule necrotiche lo secernono passivamente. HMGB1 è stato anche rilevato nel citosol, a seconda del tipo di cellula, dove ha un ruolo positivo importante nella regolazione dell'autofagia [63].Sebbene HMGA1 abbia un ruolo nell'esportazione di HIPK2 (proteina chinasi 2 che interagisce con l'omeodominio, un attivatore proapoptotico di p53) dal nucleo al citoplasma [64], le proteine ​​HMG diverse da HMGB1 sono rilevate molto raramente al di fuori del nucleo. Questo probabilmente spiega perché HMGB1 è l'unico membro della famiglia che attiva RAGE [65]. Poiché HMGB1 trasloca tra il nucleo e il citosol, esiste la possibilità che possa legarsi a RAGE solubile nel citosol e quindi svolgere un ruolo nella regolazione della sua attività.

Biochimica di HMGB1

HMGB1 è una proteina altamente conservata composta da 215 aminoacidi. È espresso in quasi tutte le cellule di mammifero. L'HMGB1 umano condivide una somiglianza dell'80% con HMGB2 e HMGB3 [55]. Ha due scatole di legame del DNA ricche di lisina (A- e B-) separate da un breve linker. Le scatole sono separate dalla coda acida C-terminale da un'altra sequenza linker che termina in quattro lisine consecutive. È stata rilevata un'isoforma che si ritiene derivi dalla scissione della coda acida in vivo [66]. HMGB1 ha tre cisteine, di cui le prime due cisteine ​​vicinali (Cys 23 e 45, basate su Met1 come Met iniziale nella proteina immatura) possono formare un legame disolfuro interno all'interno dell'A-box. L'A-box e lo stato di ossidazione di queste due cisteine ​​giocano un ruolo importante nella capacità di HMGB1 di legare i substrati. L'ossidazione di queste due cisteine ​​ridurrà anche l'affinità di HMGB1 per CpG-DNA [67, 68]. L'aggiunta di A-box ricombinante antagonizza la capacità di HMGB1 di legare altri substrati [67, 69]. Resta da determinare se l'azione della A-box è il risultato di un'inibizione competitiva legandosi ad altri substrati o interferendo con la capacità della B-box di legarsi ai substrati. Le due scatole che agiscono di concerto riconosceranno il DNA piegato [70]. La terza cisteina (Cys106, nel B-box) rimane spesso ridotta ed è importante per la traslocazione nucleare [68]. La regione intorno a questa cisteina è l'area minima con attività di citochine [65]. HMGB1 subisce significative modificazioni post-traduzionali, inclusa l'acetilazione di alcune lisine, che influenzano la sua capacità di fare la spola tra il nucleo e il citosol [71, 72]. L'accessibilità del legame al DNA e della modifica post-traduzionale può essere modulata dalle interazioni della coda acida con la B-box di base [73-75]. Segnali HMGB1 attraverso TLR2, TLR4 e TLR9 oltre a RAGE [76, 77]. Si lega anche alla trombomodulina e al sindecano attraverso interazioni con il B-box [78].

Evoluzione di HMGB1

Le proteine ​​HMG possono essere trovate nei più semplici organismi multicellulari [79]. Le due scatole di DNA sono il risultato della fusione di due geni individuali di una scatola [80]. La struttura a due scatole lo rende particolarmente avido, specifico per il DNA piegato, ed è altamente conservato tra molti organismi [81, 82]. Questa somiglianza rende difficile la generazione di anticorpi specifici per HMGB1. La cross-reattività anticorpale potrebbe derivare dalla forte somiglianza di HMGB1 tra singole specie, HMGB1 ad altre proteine ​​HMGB e persino istoni da HMGB1 a H1 (Sparvero, Lotze e Amosato, dati non pubblicati). La possibilità di un'identificazione errata di HMGB1 deve essere accuratamente esclusa in qualsiasi studio. Un modo per distinguere le proteine ​​HMGB l'una dall'altra è dalla lunghezza della coda acida (30, 22 e 20 residui acidi consecutivi rispettivamente per HMGB1, 2 e 3, mentre HMGB4 non ne ha). Le code acide sono precedute da un sito di scissione del triptico prossimale e hanno tutte composizioni leggermente diverse. Ciò rende la spettrometria di massa in combinazione con la digestione triptica un mezzo attraente di identificazione.

Livelli normali/sani di HMGB1

L'espressione relativa di HMGB1 varia ampiamente a seconda delle condizioni e del tipo del tessuto. I tessuti indifferenziati e infiammati tendono ad avere una maggiore espressione di HMGB1 rispetto alle loro controparti. Milza, timo e testicoli hanno quantità relativamente grandi di HMGB1 rispetto al fegato. La posizione subcellulare varia, con il fegato HMGB1 che tende a trovarsi nel citosol piuttosto che nel nucleo [55, 83]. HMGB1 è presente in alcune cellule a livelli superati solo dall'actina e stimati fino a 1 × 10 6 molecole per cellula, o un decimo dell'abbondanza degli istoni del nucleo totale. Ma questo numero dovrebbe essere considerato con una certa cautela poiché include linee cellulari trasformate e non definisce i livelli di abbondanza di HMGB1 in vivo nella maggior parte delle linee cellulari [55]. I livelli sierici di HMGB1 (come determinato dal Western Blot) sono stati riportati con ampi intervalli: 7,0 ± 5,9 ng/mL in pazienti sani, 39,8 ± 10,5 ng/mL nel fegato cirrotico e 84,2 ± 50,4 ng/mL nel carcinoma epatocellulare [84 ]. Per confronto, i livelli di proteine ​​sieriche totali umane variano da circa 45-75 mg/mL e i livelli di proteine ​​citosoliche totali sono circa 300 mg/mL [85, 86]. Ciò pone il siero HMGB1 nell'intervallo basso di parti per milione in massa, rendendo difficile il rilevamento e la separazione da proteine ​​sieriche altamente abbondanti.

HMGB1 e RAGE nel cancro e nell'infiammazione

HMGB1, insieme a RAGE, è sovraregolato in molti tipi di tumore (Tabella 2). HMGB1 viene rilasciato passivamente dalle cellule necrotiche ma non dalla maggior parte delle cellule apoptotiche. La ragione di ciò è sconosciuta, ma è stato ipotizzato che sia il risultato di cambiamenti redox o sotto-acetilazione degli istoni nelle cellule apoptotiche [87, 88]. Le cellule necrotiche HMGB1(-/-) sono gravemente ostacolate nella loro capacità di indurre l'infiammazione. La segnalazione HMGB1, in parte attraverso RAGE, è associata alla segnalazione ERK1, ERK2, Jun-NH2-chinasi (JNK) e p38. Ciò si traduce nell'espressione di NFκB, molecole di adesione (ICAM e VCAM, che portano al reclutamento di macrofagi e neutrofili) e produzione di diverse citochine (TNFα, IL-1α, IL-6, IL-8, IL-12 MCP-1, PAI-1 e tPA) [89]. Una nozione emergente è che la molecola di per sé ha poca attività infiammatoria ma agisce insieme ad altre molecole come IL-1, ligandi TLR2, ligandi LPS/TLR4 e DNA. La segnalazione di HMGB1 attraverso TLR2 e TLR4 determina anche l'espressione di NFκB. Ciò promuove l'infiammazione attraverso un ciclo di feedback positivo poiché NFκB aumenta l'espressione di vari recettori tra cui RAGE e TLR2. La stimolazione con LPS dei macrofagi porterà al rilascio precoce di TNFα (entro diverse ore) e al successivo rilascio di HMGB1 (dopo diverse ore ed entro pochi giorni). Mirare a HMGB1 con anticorpi per prevenire la letalità dell'endotossina diventa quindi un'interessante possibilità terapeutica, poiché l'anti-HMGB1 è efficace nei topi anche se somministrato ore dopo la stimolazione con LPS [90]. La stimolazione di HMGB1 delle cellule endoteliali e dei macrofagi promuove la secrezione di TNFα, che a sua volta aumenta anche la secrezione di HMGB1 [91]. Un altro mezzo per indurre la secrezione di HMGB1 è con lo stress ossidativo [92]. Si ritiene che la forma attivamente secreta di HMGB1 sia almeno parzialmente acetilata, sebbene sia l'HMGB1 rilasciato attivamente che quello passivamente promuovano l'infiammazione [71].

Una prima osservazione che risale al 1973 è che le proteine ​​HMG si aggregano con proteine ​​meno basiche [52]. HMGB1 lega LPS e una varietà di citochine come IL-1β. Ciò si traduce in un aumento della produzione di interferone gamma (INFγ) da parte delle PBMC (cellule mononucleate del sangue periferico) che è molto maggiore rispetto alla sola HMGB1 o alle sole citochine. Il legame di HMGB1 a RAGE è potenziato dal DNA CpG. La capacità di HMGB1 di attivare RAGE può derivare maggiormente dalla sua capacità di formare un complesso con altre molecole pro-infiammatorie, con questo complesso che successivamente attiva RAGE [93]. Pertanto qualsiasi test di legame di RAGE esclusivamente da parte di HMGB1 dovrà tenerne conto, poiché la contaminazione anche con piccole quantità di LPS o CpG DNA aumenterà il legame. Thrombomodulin compete con RAGE per HMGB1 in vitro e il complesso risultante non sembra legare RAGE, suggerendo un possibile approccio per attenuare la segnalazione di RAGE-HMGB1 [78, 94]. Infatti il ​​legame alla trombomodulina può anche portare alla scissione proteolitica di HMGB1 da parte della trombina, con conseguente prodotto infiammatorio meno attivo [94].

Un peptide costituito solo dai residui 150-183 di HMGB1 (l'estremità della scatola B e il suo linker alla coda acida) mostra il legame RAGE e compete con successo con il legame HMGB1 in vitro [95]. Questa sequenza è simile ai primi 40 amminoacidi (la prima sequenza EF-hand helix-loop-helix) di diverse proteine ​​S100. Un mutante HMGB1 in cui gli amminoacidi 102-105 (FFLF, B-box centrale) sono sostituiti con due glicine induce un rilascio di TNFa significativamente inferiore rispetto all'HMGB1 a lunghezza intera nelle colture di monociti umani [96]. Questo mutante è anche in grado di inibire in modo competitivo la simulazione di HMGB1 in modo dose-dipendente quando vengono aggiunti entrambi.

HMGB1 è l'unico attivatore di RAGE della famiglia HMG?

Per tutti i motivi sopra indicati, HMGB1 è l'unico ligando HMG-box noto di RAGE. Nessuna delle altre proteine ​​nucleari HMG ha dimostrato di attivare RAGE. Le proteine ​​HMGB possono complessare il DNA CpG e strutture altamente piegate come le giunzioni di Holliday a quattro vie e il DNA platinato/modificato con platino mentre altri membri non possono. A differenza di altre proteine ​​HMGB, HMGB1 è abbondantemente espresso in quasi tutti i tessuti e quindi è prontamente disponibile per la traslocazione dal nucleo al citosol per la secrezione attiva e passiva. Sebbene, come nota cautelativa, anche HMGB2 e HMGB3 siano sovraregolati in alcuni tipi di cancro e potrebbero svolgere un ruolo come attivatori di RAGE oltre a HMGB1. La somiglianza di queste proteine ​​con HMGB1 suggerisce in vari saggi che possono essere erroneamente identificate e incluse nei livelli di HMGB1 riportati. I membri della famiglia HMG e S100 sono costituiti ciascuno da proteine ​​simili che hanno proprietà di attivazione di RAGE distinte e spesso non evidenti.

Proteine ​​S100 come ligandi RAGE e il loro ruolo nell'infiammazione

È stata pubblicata una recensione recente sulle proteine ​​S100 e fornisce dettagli più estesi di quelli forniti qui [97]. Ci concentreremo sugli elementi critici necessari per considerare il loro ruolo nel cancro e nell'infiammazione. Le proteine ​​S100 sono una famiglia di oltre 20 proteine ​​espresse esclusivamente nei vertebrati e caratterizzate da due motivi EF-hand leganti il ​​calcio collegati da una regione di cerniera centrale [98]. Oltre quarant'anni fa i primi membri furono purificati dal cervello bovino e gli fu dato il nome "S-100" per la loro solubilità in solfato di ammonio al 100% [99]. È stato scoperto che molte delle prime proteine ​​S100 identificate si legano a RAGE, e quindi è stato teorizzato che il legame a RAGE sia una proprietà comune di tutte le proteine ​​S100. Tuttavia, molti dei membri della famiglia identificati più di recente non legano RAGE. I geni situati su un cluster sul cromosoma umano 1q21 sono designati come s100a sottofamiglia e sono numerati consecutivamente a partire da s100a1. Ai geni S100 altrove viene assegnata una singola lettera, come s100b [100]. In generale, il cDNA di S100 murino e umano è omologo al 79,6-95% sebbene il genoma del topo manchi del gene per S100A12/EN-RAGE [101]. La maggior parte delle proteine ​​S100 esiste come omodimeri non covalenti all'interno della cellula [98]. Alcuni formano eterodimeri con altre proteine ​​S100, ad esempio l'eterodimero S100A8/S100A9 è in realtà la forma preferita che si trova all'interno della cellula. I due anelli di legame del Ca++ della mano EF sono ciascuno affiancato da α-eliche. L'ansa N-terminale non è canonica e ha un'affinità per il calcio molto inferiore rispetto all'ansa C-terminale. I membri di questa famiglia differiscono l'uno dall'altro principalmente per la lunghezza e la sequenza delle loro regioni di cerniera e la regione di estensione C-terminale dopo i loop di legame. Il legame del Ca++ induce un grande cambiamento conformazionale che espone un dominio di legame idrofobico (ad eccezione di S100A10 che è bloccato in questa conformazione) [47]. Questo cambiamento di conformazione consente a un dimero S100 di legare due proteine ​​bersaglio e formare essenzialmente un ponte tra di loro come eterotetramero [102]. Di conseguenza, le proteine ​​S100 sono state chiamate "sensori di calcio" o "interruttori regolati dal calcio". Alcune proteine ​​S100 legano anche Zn++ o Cu++ con alta affinità, e questo potrebbe influenzare la loro capacità di legare Ca++ [101].

Le proteine ​​S100 hanno modelli di espressione molto variabili (Tabella 3). Sono sovraregolati in molti tumori, sebbene S100A2, S100A9 e S100A11 siano stati segnalati come repressori del tumore [50]. Le proteine ​​S100 e le calgranuline sono espresse in vari tipi di cellule, inclusi neutrofili, macrofagi, linfociti e cellule dendritiche [2]. Le proteine ​​S100 senza leader specifiche dei fagociti vengono secrete attivamente attraverso un percorso alternativo, bypassando il Golgi [103]. Diverse proteine ​​S100 legano il dominio di tetramerizzazione di p53 e alcune legano anche il dominio regolatorio negativo di p53. Il legame del dominio di tetramerizzazione di p53 (controllando così il suo stato di oligomerizzazione) potrebbe essere una proprietà comune a tutte le proteine ​​S100 ma questo non è stato riportato [104]. Anche i loro ruoli nella regolazione del contrappeso tra autofagia e apoptosi non sono stati segnalati.

Le singole proteine ​​S100 sono prevalenti in una varietà di malattie infiammatorie, in particolare S100A8/A9 (che possibilmente segnala attraverso RAGE oltre ad altri meccanismi) e S100A12 (che sicuramente segnala attraverso RAGE). Queste malattie includono l'artrite reumatoide, l'artrite idiopatica giovanile, la malattia autoimmune sistemica e la malattia infiammatoria intestinale cronica. Il blocco dell'interazione S100-RAGE con RAGE solubile nei topi ha ridotto l'infiammazione del colon nei topi carenti di IL-10, ha inibito lo sviluppo dell'artrite e ha soppresso l'infiltrazione delle cellule infiammatorie [43, 33, 32, 105]. Alcune proteine ​​S100 hanno ruoli dipendenti dalla concentrazione nella guarigione delle ferite, nella crescita dei neuriti e nel rimodellamento dei tessuti.

Ci sono diverse domande importanti che devono essere affrontate quando si esaminano le interazioni S100-RAGE proposte: si verifica questa interazione? in vivo inoltre in vitro? Gli effetti osservati potrebbero essere spiegati da un meccanismo indipendente da RAGE (o anche in aggiunta a un meccanismo non RAGE)? Questa interazione è dipendente dallo stato oligomerico della proteina S100? (Lo stato oligomerico di S100 è esso stesso dipendente dalla concentrazione di Ca++ e altri ioni metallici, nonché dall'ambiente redox). Un'area che non ha ricevuto molta attenzione è la possibilità che S100 si leghi a un RAGE solubile nel citosol o nel nucleo (al contrario di RAGE solubile extracellulare).

Le proteine ​​S100 non sono ligandi RAGE universali

Molti dei membri della famiglia S100 non sono ligandi RAGE. Sebbene non vi sia un modo diretto per identificare la capacità di legame di RAGE sulla base delle sequenze amminoacidiche delle proteine ​​S100, è possibile trarre conclusioni sulla base delle proprietà biochimiche comuni dei noti non ligandi S100 di RAGE: il primo è che i non ligandi spesso mostrano un forte legame con Zn++. Il secondo è che il loro legame con il Ca++ è ostacolato o diverso in qualche modo dai ligandi S100 RAGE. Il terzo è che il loro stato di oligomerizzazione è alterato o inesistente.

Non ligandi di RAGE: S100A2, A3, A5, A10, A14, A16, G, Z

S100A2 è un omodimero che può formare tetrameri dopo il legame con Zn++ e questo legame con Zn++ inibisce la sua capacità di legare il Ca++. Sebbene anche due ligandi RAGE (S100B e S100A12) leghino molto bene lo Zn++, l'effetto su di essi è di aumentare la loro affinità per il Ca++ [106, 107]. Il relativo S100A3 lega male il Ca++ ma molto fortemente lo Zn++ [101]. S100A5 è anche un legante Zn++, ma lega Ca++ con un'affinità 20-100 volte maggiore rispetto ad altre proteine ​​S100. Può anche legare Cu++, il che ostacolerà la sua capacità di legare Ca++ [108]. S100A10 (o p11) è l'unico membro della famiglia S100 insensibile al Ca++. Ha alterazioni degli amminoacidi nei due domini di legame del Ca++ che bloccano la struttura in uno stato attivo indipendentemente dalla concentrazione di calcio [109]. Formerà un eterotetramero con l'annessina A2, ed è stato chiamato "catena leggera dell'annessina A2" [110]. S100A14 ha solo 2 dei 6 residui conservati nella mano EF C-terminale, e quindi la sua capacità di legare Ca++ è probabilmente ostacolata [111]. S100A16 lega male il Ca++, con un solo atomo per monomero di proteina. Tuttavia, dopo l'aggiunta di Zn++, si formano aggregati più elevati [112]. S100G era anche conosciuto come proteina legante il calcio dipendente dalla vitamina D, CABP intestinale, Calbindin-3 e Calbindin-D9k [113]. È principalmente un monomero in soluzione e al legame con il Ca++ non mostra i cambiamenti conformazionali che caratterizzano molte altre proteine ​​S100 [114]. S100Z è una proteina di 99 aminoacidi che lega S100P in vitro. Esiste come omodimero che lega il Ca++ ma il suo stato di aggregazione non è influenzato dal Ca++ [115].

Possibili ligandi di RAGE: S100A1, S100A8/9

S100A1 esiste normalmente come omodimero e il suo mRNA si osserva principalmente nel cuore, con livelli decrescenti in reni, fegato, pelle, cervello, polmone, stomaco, testicolo, muscolo, intestino tenue, timo e milza. S100A1 è presente nel citoplasma e nel nucleo: la linea cellulare del muscolo cardiaco di ratto H9c2 è per lo più nucleare, il muscolo scheletrico adulto per lo più citoplasmatico. S100A1 viene rilasciato nel sangue durante i periodi ischemici e S100A1 extracellulare inibisce l'apoptosi tramite l'attivazione di ERK1/2 [101]. S100A1 si lega sia alla tetramerizzazione che ai domini regolatori negativi di p53 [104]. S100A1 interagisce con S100A4 e si antagonizzano a vicenda in vitro e in vivo [116]. C'è ancora qualche dibattito se S100A1 si leghi a RAGE, anche se un recente lavoro con PET Imaging di S100A1 marcato con fluoro-18 somministrato a topi indica che co-localizza con RAGE [117].

Oltre a formare omodimeri, S100A8 e S100A9 possono formare eterodimeri ed eterotetrameri tra loro in modo dipendente dal calcio e dall'ossidazione [101]. S100A8 e S100A9 non hanno dimostrato direttamente di attivare RAGE, ma vi sono prove funzionali sostanziali che molti dei loro effetti sono bloccati dalla soppressione o dal silenziamento di RAGE. S100A8/9 esercita un effetto pro-apoptotico ad alte concentrazioni, ma promuove la crescita cellulare a basse concentrazioni [118]. Gli effetti di S100A8/9 modificato con N-carbossimetil-lisina sono migliorati nei topi knockout per RAGE o mediante somministrazione di RAGE solubile a topi wild-type [119]. S100A8/9 si lega a eparan solfato, proteoglicani e N-glicani carbossilati [103]. Una piccola sottopopolazione (<2%) di RAGE espressa sulle cellule tumorali del colon è modificata in N-glicani carbossilati, ed è del tutto possibile che questa sottopopolazione sia attivata da S100A8/9 [120]. Le proteine ​​S100A8 e S100A9 sono secrete in modo dipendente dall'energia dai fagociti durante i processi infiammatori. Stimolano schemi infiammatori specifici nelle cellule endoteliali, interagendo con i componenti del citoscheletro, inclusi filamenti di cheratina, microtubuli, filamenti intermedi di tipo III e F-actina [121]. In presenza di calcio, S100A8 e S100A9 formano tetrameri e si legano direttamente ai microtubuli. S100A8/S100A9 modula anche il riarrangiamento del citoscheletro tubulina-dipendente durante la migrazione dei fagociti. S100A8 e S100A9 interagiscono sia con i filamenti intermedi di tipo III che con i filamenti di cheratina allo scopo di riparare le ferite.A livello extracellulare, il complesso S100A8/S100A9 mostra attività cistostatiche e antimicrobiche e inibisce l'attivazione dei macrofagi e la sintesi delle immunoglobuline da parte dei linfociti [122]. L'omodimero ridotto ma non ossidato S100A8 è fortemente chemiotattico per i leucociti [121]. La sovraregolazione di S100A8 e S100A9 nel tessuto polmonare premetastatico fornisce una nicchia per la migrazione delle cellule tumorali [123]. Questa sovraregolazione può essere indotta dalla secrezione di VEGF-A, TGFβ e TNFα da tumori distanti. La sovraregolazione nelle cellule endoteliali VE-caderina+ polmonari promuove il reclutamento e l'infiltrazione delle cellule mieloidi Mac1+, e quindi fornisce una nicchia per la migrazione delle cellule tumorali. Il blocco dell'espressione di S100A8 e S100A9 nella fase premetastatica potrebbe impedire la formazione di questa nicchia permissiva e quindi inibire la migrazione delle cellule tumorali.

Leganti di RAGE: S100A4, A6, A7/A7A/A15, A11, A12, A13, B, P

S100A4

S100A4 si lega a RAGE ed è stato implicato nella sovraregolazione di MMP-13 (Matrix Metalloproteinase 13) nell'osteoartrite, che porta al rimodellamento dei tessuti [124]. S100A4 è espresso negli astrociti, nelle cellule di Schwann e in altre cellule neuronali oltre ai condrociti [43]. S100A4 è sovraregolato dopo una lesione del tessuto nervoso. La crescita dei neuriti stimolata da S100A4 è stata osservata per la proteina allo stato oligomerico, non dimerico [121]. Questa proteina stimola anche l'angiogenesi attraverso la via di segnalazione ERK1/2. S100A4 si lega al dominio di tetramerizzazione ma non al dominio regolatorio negativo di p53 [104].

S100A6

S100A6 si trova principalmente nei neuroni di regioni ristrette del cervello [42]. S100A6 si trova anche nel mezzo extracellulare delle cellule del cancro al seno. S100A6 si lega al dominio di tetramerizzazione di p53 [104]. S100A6 si lega in modo significativo al dominio C2 di RAGE, al contrario dei domini V e/o C1 a cui si legano la maggior parte degli altri ligandi e quindi suggerisce che potrebbe avere una funzione discordante rispetto ad altri ligandi RAGE. S100A6 innesca la via JNK e successivamente la via Caspasi 3/7, con conseguente apoptosi [125].

S100A7/S100A7A/S100A15

S100A7, chiamata anche Psoriasin 1, fa parte di una sottofamiglia di diverse proteine ​​[101]. L'omologo S100A7A, un membro di questa sottofamiglia, era precedentemente noto come S100A15 ma questo nome è stato ritirato [113]. S100A7 e S100A7A sono funzionalmente distinti nonostante l'elevata somiglianza di sequenza [126]. S100A7 è altamente espresso nella malattia iperproliferativa epidermica e recluta linfociti CD4+ e neutrofili [102]. Sebbene diverse proteine ​​S100 siano sovraregolate in varie forme di cancro al seno, S100A7 è fortemente sovraregolato solo nel carcinoma duttale sul posto [127]. Ci sono alti livelli di S100A7 ad alto peso molecolare monomerico e reticolato covalentemente nell'essudato della ferita umana e nel tessuto di granulazione. Studi immunoistologici suggeriscono che S100A7 è prodotto dai cheratinociti che circondano la ferita e viene rilasciato nell'essudato della ferita. S100A7 esercita attività antibatterica e la regione centrale che include solo gli amminoacidi 35-80 è sufficiente per mediare questa attività [128]. Sebbene sia S100A7 che S100A7A siano espressi nei cheratinociti, S100A7A è espresso anche nei melanociti e nelle cellule di Langerhans dell'epidermide e nelle cellule endoteliali della muscolatura liscia cutanea [126]. Il legame, la segnalazione e la chemiotassi di S100A7 dipendono da Zn++ e RAGE in vitro, mentre S100A7A sembra segnalare attraverso una via indipendente da RAGE. S100A7 e S100A7A esercitano un effetto sinergico, favorendo l'infiammazione in vivo [126].

S100A11

S100A11 è sovraespresso in molti tumori [129]. È omodimerico e interagisce in modo Ca++ dipendente con l'annessina I [130]. È un mediatore chiave della crescita dei cheratinociti epidermici umani innescato da alti livelli di Ca++ o TGFβ [129]. In queste condizioni S100A11 viene fosforilato e trasportato al nucleo dalla nucleolina. S100A11 si lega al dominio di tetramerizzazione (ma non al dominio regolatorio negativo) di p53 [104]. S100A11 extracellulare è dimerizzato dalla transglutaminasi 2 e questo omodimero covalente acquisisce la capacità di segnalare attraverso la via p38 MAPK, accelerare l'ipertrofia dei condrociti e il catabolismo della matrice e quindi accoppiare l'infiammazione con l'attivazione dei condrociti per promuovere la progressione dell'osteoartrite [131].

S100A12/EN-RAGE

S100A12 (EN-RAGE) è espresso principalmente nei granulociti, ma anche nei cheratinociti e nelle lesioni psoriasiche. S100A12 rappresenta circa il 5% della proteina citosolica totale nei neutrofili a riposo. È espresso nell'infiammazione acuta, cronica e allergica. Interagisce con RAGE in modo dipendente dal Ca++, ma si lega anche al Cu++. Non c'è s100a12 gene nei topi, sebbene S100A8 sembri essere un omologo funzionale [132, 133]. S100A12 è up-regolato nella psoriasi e nel melanoma [101]. Si lega ai domini RAGE C1 e C2 invece del dominio V [49]. Può anche legarsi a RAGE espresso sulle cellule endoteliali, segnalando attraverso le vie NF-κB e MAPK. S100A12 condivide l'omologia di sequenza con il presunto dominio RAGE-binding di HMGB1 (residui 153-180). S100A12 secreto si lega a RAGE e migliora l'espressione della molecola di adesione intercellulare I (ICAM-1), della molecola di adesione cellulare vascolare I (VCAM-1), dell'NF-κB e del fattore di necrosi tumorale (TNF)-α [43]. S100A12 è un chemiotattico per monociti e mastociti, sebbene solo la regione cerniera sembri importante per questi ultimi [134]. Poiché i mastociti non esprimono la proteina RAGE o l'mRNA, la loro attivazione da parte di S100A12 avviene in modo indipendente da RAGE. S100A12 esiste come omodimero in condizioni di basso Ca++, ma formerà aggregati di esameri (tre dimeri) a concentrazioni millimolari di Ca++ [135]. S100A12, oltre a S100A13, si lega ai farmaci antiallergici cromolyn, tranilast e amlexanox in maniera Ca++ dipendente. Ciò suggerisce che S100A12 e S100A13 potrebbero essere coinvolti nella degranulazione dei mastociti in modo indipendente da RAGE [136].

S100A13

S100A13 ha un pattern di espressione molto ampio, in contrasto con le altre proteine ​​S100. S100A13 è espresso nelle cellule endoteliali, ma non nelle cellule muscolari lisce vascolari. È sovraregolato nelle lesioni dell'endometriosi extrauterina rispetto ai tessuti normali e può avere un ruolo nella vascolarizzazione [137]. La sua affinità per il Ca++ è bassa, ma il legame con il Ca++ porta a un cambiamento conformazionale esponendo un nuovo sito di legame per il Cu++ [138]. Dopo il legame con Cu++, regola il rilascio di FGF-1 dipendente dallo stress e svolge un ruolo nell'angiogenesi nei gliomi astrocitici di alto grado [139]. S100A13 oltre a S100A12 può essere coinvolto nella degranulazione dei mastociti [136].

S100B

S100B è espresso principalmente negli astrociti della corteccia umana e nei melanociti, nonché nelle cellule dendritiche mieloidi [42]. S100B, insieme a S100A1 e S100A6, sono le proteine ​​S100 più abbondanti nel cervello di diverse specie, inclusi topi e ratti. Livelli elevati di S100B sono stati trovati in pazienti a seguito di traumi cerebrali, ischemia/infarto, malattia di Alzheimer e sindrome di Down [42]. S100B è usato come marker di attivazione e morte delle cellule gliali [140]. Si ritiene che esista come una miscela di dimeri covalenti e non covalenti nel cervello poiché i test ELISA eseguiti in condizioni non ossidanti sottostimeranno la quantità di S100B [141, 142]. A questo proposito, i dimeri covalenti S100B possono essere utilizzati come marker di stress ossidativo [142]. S100B si lega sia al dominio di tetramerizzazione che al dominio regolatorio negativo di p53 [104]. S100B inibisce anche la microtubulina e gli assemblaggi di filamenti intermedi di tipo III. S100B lega entrambe le regioni variabile (V) e costante (C1) di RAGE, e gli oligomeri di S100B legano RAGE più fortemente [42, 48]. A concentrazioni equivalenti, S100B aumenta la sopravvivenza cellulare mentre S100A6 induce l'apoptosi tramite interazioni RAGE, dipendenti dalla generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Legandosi a RAGE e attivando la formazione di ROS intracellulari, S100B attiva la via PI 3-chinasi/AKT e successivamente la via NFκB, con conseguente proliferazione cellulare. S100B esercita effetti trofici su neuroni e astrociti a concentrazioni più basse e provoca apoptosi neuronale, attivando astrociti e microglia a concentrazioni più elevate [143-146]. L'attivazione di S100B di RAGE sovraregola l'espressione di IL-1β e TNF-α nella microglia e stimola l'attività trascrizionale di AP-1 attraverso la segnalazione di JNK. La sovraregolazione dell'espressione di COX-2, IL-1β e TNF-α nella microglia da parte di S100B richiede l'attivazione simultanea di NF-κB e AP-1.

S100P

S100P si lega a RAGE ed è importante nei tumori della prostata, del pancreas e dello stomaco [146, 147]. Viene anche rilevato nel polmone normale e nel tessuto canceroso del polmone ed è aumentato principalmente negli adenocarcinomi [148]. Il trattamento delle linee cellulari pancreatiche con S100P stimola la proliferazione cellulare, la migrazione, l'invasione e attiva le vie MAP chinasi e NFκB [149]. Il farmaco antiallergico cromoglicato lega S100P e bloccherà l'interazione S100P-RAGE. Inibisce la crescita del tumore e aumenta l'efficacia della gemcitabina in modelli animali sperimentali [150]. I farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) sono contemporaneamente pro-tumorigeni aumentando l'espressione di S100P e antitumorali diminuendo l'attività di Cox2 [151].

Proteine ​​S100: sottili differenze si traducono in grandi cambiamenti nel legame RAGE

Sebbene le proteine ​​S100 condividano molte somiglianze strutturali con i loro due domini di legame al Ca++ della mano EF fiancheggiati da α-eliche, solo alcuni dei membri attivano RAGE [97]. Sottili differenze strutturali che portano a diverse proprietà biochimiche (legame di Ca++ e Zn++ e stato di oligomerizzazione preferito) sembrano quindi portare a diverse capacità di attivare RAGE. Stati di oligomerizzazione più elevati tendono a portare all'attivazione di RAGE. RAGE si lega anche a diverse famiglie di proteine ​​che formano facilmente aggregati e oliogmers: peptide beta amiloide, collagene e AGE.

RAGE e Abeta

Il peptide beta-amiloide (Abeta) è un peptide più comunemente composto da 40 o 42 amminoacidi il cui accumulo nelle placche amiloidi è una delle caratteristiche del cervello di Alzheimer. Abeta esiste a livello extracellulare come monomero, oligomero solubile o fibrille e aggregati insolubili. Abeta si lega a RAGE sui neuroni e sulle cellule microgliali [152]. Sui neuroni, l'attivazione Abeta di RAGE genererà stress ossidativo e attiverà NF-KB. L'attivazione dell'abeta della microglia migliorerà la proliferazione e la migrazione cellulare [153, 154]. Tuttavia, anche altri recettori potrebbero mediare la tossicità di Abeta, poiché esistono anche effetti indipendenti da RAGE [155]. I domini V e C1 di RAGE si legano agli oligomeri e agli aggregati Abeta (rispettivamente), e il loro blocco preverrà la neurotossicità indotta da Abeta [156]. L'esposizione di una linea cellulare di neuroblastoma umano che esprime RAGE (SHSY-5Y) agli oligomeri di Abeta ha causato una morte cellulare massiccia, mentre l'esposizione a fibrille e aggregati di Abeta ha causato solo una morte cellulare minore. Il trattamento con anticorpi bloccanti specifici per i domini RAGE è stato in grado di proteggere dalla morte indotta dall'aggregato di Abeta o dagli oligomeri (ma non dalla morte indotta da fibrille).

RAGE e Collagene

A differenza di altri tessuti non embrionali, RAGE è altamente espresso nel polmone sano e la sua espressione diminuisce negli stati patologici. L'espressione di RAGE nel polmone è un marker di differenziazione delle cellule epiteliali alveolari di tipo I (AT I) ed è localizzato sulla membrana plasmatica basolaterale [20]. RAGE migliora l'aderenza di queste cellule alle superfici rivestite di collagene e induce la diffusione cellulare [16]. RAGE lega la laminina e il collagene I e IV in vitro, ma non la fibronectina. Pertanto RAGE svolge un ruolo nell'ancoraggio delle cellule AT I alla membrana basale polmonare, che è ricca di collagene IV [20, 157, 158]. L'assenza dell'espressione di RAGE nei topi (-/-) porta ad un aumento della fibrosi polmonare idiopatica spontanea (IPF). Il polmone umano di pazienti con IPF in fase avanzata ha mostrato una significativa down-regulation di RAGE rispetto al tessuto polmonare sano [20].

Prodotti finali di glicazione avanzata (AGE) un'ampia classe di prodotti non enzimatici di reazioni tra proteine ​​o lipidi e zuccheri aldosi [159]. La reazione tra la proteina e lo zucchero provoca il suo caratteristico imbrunimento nei prodotti alimentari. La dieta occidentale in particolare è piena di AGE. Sebbene la glicazione sia un termine generico per l'aggiunta di uno zucchero, in questo caso si riferisce specificamente all'aggiunta non enzimatica a una proteina. La "glicosilazione" viene spesso utilizzata per l'aggiunta enzimatica di zuccheri. La reazione di Maillard, partendo dalla glicazione delle proteine ​​e procedendo alla formazione degli AGE, è implicata nello sviluppo delle complicanze del diabete mellito, nonché nella patogenesi delle malattie cardiovascolari, renali e neurodegenerative [3, 119, 160, 161]. La reazione di Maillard inizia con gli zuccheri che formano le basi di Schiff e i prodotti Amadori. I gruppi carbonilici di questi precursori possono reagire con gruppi funzionali amminici, sulfidrilici e guanidinilici nelle proteine. Gli AGE non possono essere chimicamente riportati alle loro forme originarie ma può esserlo il loro precursore, i prodotti Amadori. Gli AGE sono una categoria diversificata di modificazioni non enzimatiche che risultano da queste reazioni e non tutte le proteine ​​modificate con AGE attivano RAGE. Sono state caratterizzate oltre venti diverse modificazioni di AGE, di cui le proteine ​​modificate dalla carbossimetil lisina (LMC) sono forti induttori della segnalazione di RAGE [3, 160]. Altre modifiche AGE alle proteine ​​(come la pentosidina e la pirralina) non aumentano la segnalazione di RAGE. Pertanto, è importante caratterizzare le modificazioni AGE delle proteine. Una tecnica promettente è la spettrometria di massa, in particolare la proteomica "bottom-up" che coinvolge la scissione delle proteine ​​seguita dall'analisi dei successivi peptidi [160].

RAGE e AGE nell'ambiente Redox

L'accumulo di AGE stesso è considerato una fonte di stress ossidativo. In ambienti iperglicemici, il glucosio può subire autoossidazione e generare radicali OH [161, 162]. I prodotti a base di Schiff e gli stessi prodotti Amadori causano la produzione di ROS [162]. I donatori di ossido nitrico possono eliminare i radicali liberi e inibire la formazione di AGE [163]. Nel tempo i depositi di AGE contribuiscono all'aterosclerosi diabetica nei vasi sanguigni. Quando un essere umano invecchia naturalmente, si generano alti livelli di AGE endogeni [164, 165].

RAGE è stato originariamente chiamato per la sua capacità di legare gli AGE, ma dal 1995 sono stati trovati molti più ligandi [8, 166]. La formazione di AGE è un modo per sostenere il segnale di un breve burst ossidativo in una proteina modificata post-traduzionale molto più longeva [119]. RAGE si legherà all'albumina AGE modificata ma non all'albumina non glicata [167]. L'attivazione AGE di RAGE si trova nel diabete, nella neurodegenerazione e nell'invecchiamento [168]. I tumori forniscono un ambiente che favorisce la generazione di AGE poiché secondo l'ipotesi originale di Warburg si basano principalmente sulla glicolisi anaerobica per l'energia e hanno un maggiore assorbimento di glucosio [169, 170]. Le cellule del carcinoma della prostata legano gli AGE attraverso il dominio V di RAGE [171]. Gli AGE sono stati infatti identificati nel tessuto canceroso, il che porta alla possibilità che l'attivazione AGE di RAGE contribuisca alla crescita del cancro [172]. Tuttavia ci sono anche altri ligandi RAGE in maggiore abbondanza. Le singole molecole di RAGE non legano bene gli AGE, ma gli oligomeri di RAGE li legano fortemente [11]. Ciò supporta l'idea che l'oligomerizzazione di RAGE sia importante per la segnalazione prolungata. Il collagene normalmente accumula un certo grado di glicazione in vivo, ma il collagene con modificazione sintetica dell'AGE migliorerà l'adesione e la diffusione dei neutrofili [173].

Sorbinil e zenarestat sono inibitori dell'aldoso reduttasi (ARI) attivi per via orale derivati ​​dalla chinazolina. Essi, oltre alla vitamina C ed E, hanno benefici migliorativi nel ridurre lo stress ossidativo intracellulare [174]. La vitamina E è efficace in parte a causa della sua struttura chimica. È in grado di donare un atomo di idrogeno dal suo gruppo ossidrile, combinandosi con i ROS e neutralizzandoli [175]. Purtroppo, molti degli studi clinici sugli antiossidanti non sono riusciti a modificare il cancro e in alcuni casi hanno migliorato il suo sviluppo, suggerendo che gli eventi extracellulari "aerobici" o ossidativi possono essere un mezzo preferito per limitare l'infiammazione cronica. L'iniezione di RAGE solubile previene il danno da riperfusione epatica e diminuisce i livelli di TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α), una citochina che segnala l'apoptosi e contribuisce all'infiammazione sistemica, e quindi riduce l'insulite [176]. La somministrazione di aminoguanidine riduce anche i livelli di albumina nel flusso sanguigno e riduce i livelli aortici e sierici di AGE, rallentando così la progressione dell'aterosclerosi [177].

Ligandi RAGE in neurobiologia

L'asse RAGE-NF-κB opera nella neuropatia diabetica. Questa attivazione è stata attenuata nei topi RAGE (-/-), anche 6 mesi dopo l'induzione del diabete. La perdita della percezione del dolore è invertita nei topi wild type trattati con RAGE solubile esogeno [178]. L'interazione tra HMGB1 e RAGE in vitro promuove la crescita dei neuriti delle cellule corticali, suggerendo un potenziale ruolo di RAGE come mediatore nello sviluppo neuronale [166]. Le concentrazioni nanomolari di S100B promuovono risposte di sopravvivenza cellulare come la migrazione cellulare e la crescita dei neuriti. Mentre l'interazione di RAGE con S100B può produrre segnali anti-apoptotici, concentrazioni micromolari di S100B produrranno ossiradicali, inducendo l'apoptosi. S100B attiva anche RAGE insieme a HMGB1, promuovendo la produzione del fattore di trascrizione NF-kB [144]. Un altro meccanismo proposto per il modo in cui RAGE può mediare la crescita dei neuriti coinvolge il sulfoglucuronyl carboidrato (SGC). L'esame di HMGB1 e SGC nel cervello di topo in via di sviluppo rivela che la quantità di RAGE espressa nel cervelletto aumenta con l'età. Gli anticorpi contro HMGB1, RAGE e SGC inibiscono la crescita dei neuriti, suggerendo che RAGE potrebbe essere coinvolto nel legame di queste molecole e nei loro processi a valle [179].

Poiché RAGE può essere coinvolto nella crescita e nella morte cellulare, è stato esaminato anche il suo ruolo nel recupero cellulare dopo un danno. Nei ratti con occlusione permanente dell'arteria cerebrale media, i livelli di RAGE aumentano come fanno nelle cellule PC12 a seguito di deprivazione di ossigeno e glucosio (OGD). Il blocco di RAGE riduce la citotossicità causata da OGD [180]. Il legame di RAGE ai suoi ligandi attiva la via NF-kB. La presenza di citochine regolate da RAGE, NF-κB e NF-κB nelle cellule CD4+, CD8+ e CD68+ reclutate nei nervi di pazienti con neuropatie vasculitiche suggerisce che la via RAGE può anche svolgere un ruolo nella sovraregolazione dell'infiammazione in questo contesto. 181]. Un altro ligando RAGE, AGE-CML, è presente nelle cellule mononucleate endoneuriali ed epinevrali nella polineuropatia demielinizzante infiammatoria cronica e nella polineuropatia vasculitica [182].

Nelle cellule di glioma, RAGE fa parte di un checkpoint molecolare che regola l'invasività, la crescita e il movimento delle cellule. A differenza delle cellule tumorali polmonari, le cellule di glioma normali esprimono meno RAGE rispetto alle cellule tumorali. L'aggiunta di AGE alle cellule stimola la proliferazione, la crescita e la migrazione.L'aggiunta di anticorpi mirati a RAGE inibisce al contrario la crescita e la proliferazione causate dagli AGE, aumentando il tempo di sopravvivenza e diminuendo le metastasi nei topi immunocompromessi portatori di cellule di glioma C6 di ratto impiantate [183].

RAGE nelle neoplasie epiteliali

L'interazione tra RAGE ei suoi vari ligandi gioca un ruolo considerevole nello sviluppo e nella metastasi del cancro. RAGE altera lo stimolo proliferativo delle cellule tumorali polmonari ed esofagee [184]. RAGE è altamente espresso nei pneumatociti di tipo I, specificamente localizzati nell'epitelio alveolare. È interessante notare che la sovraespressione di RAGE porta a una minore proliferazione e crescita cellulare, mentre la sottoregolazione di RAGE promuove lo sviluppo di tumori polmonari in stadio avanzato [19, 185]. Inoltre, il blocco delle interazioni AGE-RAGE porta a una ridotta crescita cellulare [186]. Le cellule che esprimono RAGE hanno una ridotta attivazione della via p42/p44-MAPK e la produzione del fattore di crescita (incluso IGF-1) è compromessa. I ligandi RAGE rilevati nei tumori polmonari includono HMGB1, S100A1 e S100P. Nelle cellule tumorali polmonari trasfettate con una forma di RAGE carente di segnale priva del dominio citoplasmatico, si nota un aumento della crescita rispetto alle cellule trasfettate con fl-RAGE. La sovraespressione di RAGE sulle cellule tumorali polmonari non aumenta la migrazione cellulare, mentre RAGE carente di segnale lo fa [187].

RAGE e cellule immunitarie

RAGE agisce anche come recettore di adesione endoteliale che media le interazioni con l'integrina β2 Mac-1 [29]. HMGB1 migliora le interazioni RAGE-Mac1 sulle cellule infiammatorie, collegandole alle risposte infiammatorie (Tabella 4) [71, 72]. I neutrofili e le cellule mielomonocitiche aderiscono a cellule RAGE immobilizzate o trasfettate con RAGE e questa interazione è attribuita alle interazioni Mac-1 [24, 71]. RAGE è altamente espresso nei macrofagi, nei linfociti T e nei linfociti B [188]. RAGE espresso su questi tipi di cellule contribuisce ai meccanismi infiammatori. L'attivazione di RAGE sui linfociti T è uno dei primi eventi che porta alla differenziazione dei linfociti T Th1+ [189]. RAGE è anche un controrecettore per le integrine leucocitarie, contribuendo direttamente al reclutamento di cellule infiammatorie in vivo e in vitro. Il RAGE solubile è stato ipotizzato come un inibitore diretto del reclutamento dei leucociti [190]. Il reclutamento di leucociti mediato da RAGE può essere particolarmente importante in condizioni associate a una maggiore espressione di RAGE, come diabete mellito, infiammazione cronica, aterosclerosi o cancro [33]. RAGE può mediare direttamente il reclutamento dei leucociti, agendo come recettore adesivo delle cellule endoteliali e attirando i leucociti. RAGE provoca un aumento "indiretto" del reclutamento di cellule infiammatorie dovuto all'attivazione cellulare mediata da RAGE e alla sovraregolazione delle molecole di adesione e dei fattori proinfiammatori [190]. S100A12 e S100B attivano le cellule muscolari lisce endoteliali, vascolari, i monociti e le cellule T tramite RAGE, con conseguente generazione di citochine e molecole di adesione proinfiammatorie [24, 67, 68].

L'espressione di RAGE sulle cellule T è necessaria per le risposte proliferative attivate dall'antigene [189]. Le cellule T carenti di RAGE riducono la produzione di IL-2, IFN-γ e Th1 mentre producono più IL-4 e IL-5 come citochine Th2. L'attivazione di RAGE gioca quindi un ruolo nel bilanciare l'immunità Th1 e Th2. Le cellule dendritiche carenti di RAGE sembrano mediare un'attività di presentazione dell'antigene piuttosto normale e sia la migrazione in vivo e in vitro. L'espressione di RAGE è tuttavia richiesta dalle DC in maturazione per migrare ai linfonodi drenanti [191].


Ruolo cruciale di RAGE nell'aumento inappropriato delle cellule muscolari lisce da pazienti con ipertensione arteriosa polmonare

Sfondo: Il rimodellamento vascolare polmonare dell'ipertensione arteriosa polmonare (PAH) è caratterizzato da un aumento inappropriato delle cellule vascolari. Il recettore per i prodotti finali della glicazione avanzata (RAGE) è una proteina transmembrana a passaggio singolo di tipo I appartenente alla superfamiglia delle immunoglobuline ed è coinvolta in un'ampia gamma di malattie iperproliferative. RAGE è anche implicato nell'eziologia della PAH ed è sovraespresso nelle cellule muscolari lisce dell'arteria polmonare (PASMC) nei pazienti con PAH. Abbiamo esaminato il ruolo di RAGE nell'aumento inappropriato di PASMC nei pazienti con PAH.

Metodi e risultati: I PASMC sono stati ottenuti da 12 pazienti con PAH inclusi 9 pazienti con PAH idiopatica (IPAH) e 3 pazienti con PAH ereditaria (HPAH) (2 pazienti con mutazione BMPR2 e un paziente con mutazione SMAD9) sottoposti a trapianto di polmone. L'analisi Western blot e la colorazione con immunofluorescenza hanno rivelato che RAGE e S100A8 e A9, ligandi di RAGE, erano sovraespressi in IPAH e HPAH-PASMC in assenza di qualsiasi stimolo di crescita esterno. PDGF-BB (10 ng/mL) ha sovraregolato l'espressione di RAGE in IPAH e HPAH-PASMC. I PAH-PASMC sono iperplastici in assenza di qualsiasi stimolo di crescita esterno come valutato dall'incorporazione di 3H-timidina. Questo risultato indica una crescita eccessiva caratterizzata da una crescita continua in una condizione di assenza di stimolazione della crescita nei PAH-PASMC. La stimolazione del PDGF-BB ha causato un tasso di crescita più elevato dei PAH-PASMC rispetto a quello dei non-PAH-PASMC. AS-1, un inibitore della segnalazione RAGE mediata dal dominio TIR, ha inibito significativamente la crescita eccessiva caratterizzata da una crescita continua in una condizione di assenza di stimolazione della crescita in IPAH e HPAH-PASMC (P<0.0001). Inoltre, AS-1 ha inibito significativamente la proliferazione stimolata da PDGF di IPAH e HPAH-PASMC (P<0.0001).

Conclusioni: RAGE svolge un ruolo cruciale nell'aumento inappropriato di PAH-PASMC. L'inibizione della segnalazione di RAGE può essere una nuova strategia terapeutica per la PAH.

Dichiarazione di conflitto di interessi

Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi concorrenti.

Cifre

Fig 1. Espressione di RAGE nei PASMC di...

Fig 1. Espressione di RAGE nelle PASMC di pazienti con PAH.

A. Colorazione immunoistochimica di RAGE...

Fig 2. Espressione S100A8/A9 in PASMC di…

Fig 2. Espressione di S100A8/A9 nelle PASMC di pazienti con PAH.

A. Colorazione immunoistochimica di S100A8...

Fig 3. Aumento dell'espressione di RAGE in...

Fig 3. Aumento dell'espressione di RAGE in PASMC di pazienti con PAH da stimolazione PDGF-BB...

Fig 4. Effetti inibitori di AS-1 o...

Fig 4. Effetti inibitori di AS-1 o RAGE aptamer sulla proliferazione di PAH-PASMC valutati da...


Astratto

Obbiettivo-

L'infiammazione svolge un ruolo chiave nell'aterosclerosi. Abbiamo ipotizzato che nuovi marcatori infiammatori possano predire il rischio di malattia coronarica (CHD).

Approccio e risultati—

Abbiamo studiato l'associazione di 16 biomarcatori infiammatori con il rischio di CHD in un sottoinsieme casuale di 839 individui privi di CHD in uno studio di coorte prospettico basato sulla popolazione. Un Bonferroni corretto P valore di 3,1×10 -3 è stato utilizzato come soglia di significatività statistica. L'età media al basale era di 72,8 anni. Durante un follow-up mediano di 10,6 anni, sono stati osservati 99 casi di CHD incidente. Tra tutti i biomarcatori infiammatori, s100a12 umano derivato dai neutrofili (recettore extracellulare recentemente identificato per la proteina legante i prodotti finali della glicazione avanzata [EN-RAGE]) ha mostrato l'associazione più forte con il rischio di CHD (P valore 2.0×10 −3 ). Dopo aggiustamento multivariabile per fattori di rischio cardiovascolare accertati, ogni aumento della deviazione standard nell'EN-RAGE naturale trasformato in log era associato a un rischio maggiore del 30% di CHD incidente (rapporto di rischio, 1,30 intervallo di confidenza al 95%, 1,06-1,59). Ulteriori aggiustamenti per i marker infiammatori precedentemente studiati non hanno attenuato l'associazione. Escludere gli individui con prevalente diabete mellito di tipo 2, funzionalità renale compromessa o individui che utilizzano farmaci antipertensivi non ha modificato le stime degli effetti. I rapporti di rischio causa-specifici hanno suggerito un'associazione più forte tra EN-RAGE e mortalità CHD rispetto a CHD stabile.

Conclusioni-

I nostri risultati evidenziano EN-RAGE come marker infiammatorio per la futura CHD in una popolazione generale, al di là dei tradizionali fattori di rischio CHD e dei marker infiammatori.

Introduzione

Con 7,3 milioni di decessi all'anno a livello globale, la malattia coronarica (CHD) è ancora la principale causa di mortalità al mondo. 1 Si ritiene che l'infiammazione svolga un ruolo chiave nella patogenesi dell'aterosclerosi e della malattia coronarica. 2 Di conseguenza, sono stati studiati i marcatori infiammatori per prevedere il rischio di CHD, uno sforzo che ha portato all'identificazione e alla convalida di diversi marcatori infiammatori per CHD. 3-6 Tuttavia, i marcatori infiammatori che sono stati studiati fino ad oggi rappresentano solo una parte minore delle diverse molecole che costituiscono la complessa risposta immunitaria umana. 7 Esplorare in modo prospettico l'associazione di marcatori infiammatori relativamente non studiati con CHD può svelare nuovi fattori di rischio infiammatorio per CHD e può far luce su ulteriori percorsi che potrebbero essere coinvolti nella patogenesi dell'aterosclerosi e della CHD.

Abbiamo ipotizzato che gli indicatori di infiammazione che non sono stati studiati in precedenza con l'incidenza di CHD sono associati a CHD incidente al di là dei tradizionali fattori di rischio e dei marker infiammatori precedentemente studiati. A tal fine, abbiamo studiato l'associazione di 16 biomarcatori di infiammazione con il rischio di CHD nel Rotterdam Study, uno studio di coorte prospettico basato sulla popolazione.

Materiali e metodi

Materiali e metodi sono disponibili nel Supplemento dati solo online.

Risultati

La Tabella 1 riassume le caratteristiche di base di 839 partecipanti (vedere la Tabella II nel Supplemento ai dati solo online per le caratteristiche di base in futuri casi di CHD e non). All'inizio dello studio, l'età media (±DS) era di 72,8 (7,5) e il 58% della popolazione era di sesso femminile. Durante un follow-up mediano di 10,6 anni (intervallo interquartile, 6,8-11,9), 2 sono stati persi al follow-up, 353 individui sono morti (302 non correlati a CHD) e 99 hanno sviluppato CHD (tasso di incidenza, 12,7 per 1000 anni-persona) . Dei 16 biomarcatori infiammatori (Figura 1), dopo la correzione di Bonferroni, solo il recettore extracellulare appena identificato per la proteina legante i prodotti finali della glicazione avanzata (EN-RAGE) era significativamente associato alla CHD quando aggiustato per età e sesso (Tabella III nella -solo Supplemento Dati). Il rischio di CHD era aumentato di quasi un terzo per aumento della deviazione standard nell'EN-RAGE naturale trasformato in log (hazard ratio [HR], 1,37 intervallo di confidenza al 95% (CI), 1,12-1,67 Tabella 2). Rispetto al terzile più basso, i partecipanti al terzile più alto hanno sperimentato un rischio circa 2,6 volte più elevato di sviluppare CHD rispetto ai partecipanti al terzile più basso (HR, 2,59 IC 95%, 1,52-4,40). Quando abbiamo aggiustato ulteriormente l'associazione per i fattori di rischio cardiovascolare tradizionali, le stime dell'effetto si sono leggermente attenuate (HR, 1,30 95% CI, 1,06-1,59). Ulteriori aggiustamenti per i marker infiammatori precedentemente studiati hanno prodotto stime degli effetti leggermente aumentate (Tabella 2 Tabella IV nel Supplemento dati solo online).

Figura 1. Diagramma di flusso dell'inclusione di biomarcatori infiammatori.

Tabella 1. Caratteristiche di base dei partecipanti a rischio di CHD

I valori più-meno sono mezzi±SD.

CHD indica una malattia coronarica.

* I valori sono presentati come mediana (intervallo interquartile).

Tavolo 2. L'associazione tra i livelli sierici di EN-RAGE e l'incidente CHD

Modello 1, aggiustato per età e sesso Modello 2, aggiustato per età, sesso, indice di massa corporea, pressione sanguigna sistolica, uso di farmaci antipertensivi, colesterolo HDL, colesterolo totale, abitudine al fumo (attuale, non corrente), diabete mellito di tipo 2 prevalente e modello eGFR 3, ulteriormente aggiustato per CD40ligando, Complemento 3, proteina C-reattiva, interleuchina 8, interleuchina 18, proteina chemiotattica dei monociti 1, fattore inibitorio della migrazione dei macrofagi, RANTES, resistina, recettore 2 del TNF e globuli bianchi.

Il BMI indica l'indice di massa corporea CHD, la malattia coronarica CI, l'intervallo di confidenza eGFR, la velocità di filtrazione glomerulare stimata EN-RAGE, il recettore extracellulare appena identificato per i prodotti finali della glicazione avanzata che legano la proteina HDL, lipoproteine ​​ad alta densità HR, rapporto di rischio SD, deviazione standard e TNF, fattore di necrosi tumorale.

* I rapporti di rischio sono rappresentati per aumento della deviazione standard in EN-RAGE trasformata in log.

Le curve di incidenza cumulativa per i terzili di EN-RAGE aggiustate per i rischi concorrenti sono illustrate nella Figura 2. La probabilità a 10 anni del primo evento incidente di CHD era 0,05 (95% CI, 0,03–0,08) per il primo terzile, 0,11 (95 % CI, 0,07-0,14) per il secondo terzile e 0,14 (95% CI, 0,10-0,18) per il terzo terzile.

Figura 2. Curve di incidenza cumulativa per il primo, secondo e terzo terzile di EN-RAGE sierico in relazione all'incidenza di malattia coronarica aggiustata per morte per malattia cardiaca non coronarica in competizione ≤ 10 anni di follow-up. EN-RAGE indica un recettore extracellulare appena identificato per la proteina che lega i prodotti finali della glicazione avanzata.

Dopo aver escluso i partecipanti con malattia renale cronica al basale, l'associazione tra EN-RAGE e CHD incidente si è leggermente attenuata (1,28 95% CI, 1,03-1,59 Tabella 3). Escludendo i partecipanti con diabete mellito di tipo 2, le stime degli effetti dell'associazione tra EN-RAGE e CHD non sono cambiate: rapporto di rischio 1,29 (IC 95%, 1,04-1,60) nel modello completamente aggiustato. Infine, dopo aver escluso i partecipanti che assumevano farmaci antipertensivi, il rapporto di rischio non è cambiato (HR, 1,40 95% CI, 1,05-1,87).

Tabella 3. L'associazione di EN-RAGE con CHD in assenza di pazienti con CKD, T2D o uso di antipertensivi

Modello 1, aggiustato per età e sesso Modello 2, aggiustato per età, sesso, BMI, pressione arteriosa sistolica, uso di farmaci antipertensivi, colesterolo HDL, colesterolo totale, abitudine al fumo (attuale e non), diabete mellito di tipo 2 prevalente ed eGFR.

BMI indica indice di massa corporea CHD, IC coronaropatia, intervallo di confidenza CKD, malattia renale cronica eGFR, velocità di filtrazione glomerulare stimata EN-RAGE, recettore extracellulare appena identificato per prodotti finali della glicazione avanzata che legano la proteina HDL, lipoproteine ​​ad alta densità HR, rischio rapporto e diabete di tipo 2, diabete mellito di tipo 2.

* I rapporti di rischio sono rappresentati per aumento della deviazione standard in EN-RAGE trasformata in log.

La tabella 4 mostra separatamente i risultati per le associazioni tra EN-RAGE e le diverse manifestazioni di CHD. Abbiamo osservato l'associazione più forte con la mortalità CHD (HR, 1,56 95% CI, 1,19-2,04) rispetto all'infarto miocardico e alla rivascolarizzazione, che non erano significative. Un ulteriore aggiustamento per i tradizionali fattori di rischio cardiovascolare non ha modificato la stima dell'effetto per la mortalità per CHD. Gli HR causa-specifici non erano significativamente più bassi per la rivascolarizzazione rispetto all'infarto miocardico (Lunn e McNeil, P=0.700), ma erano borderline-significativi per la mortalità CHD rispetto alla rivascolarizzazione (Lunn e McNeil, P=0.055).

Tabella 4. L'associazione tra EN-RAGE e infarto miocardico incidente, rivascolarizzazione coronarica e mortalità CHD

Modello 1, aggiustato per età e sesso Modello 2, aggiustato per età, sesso, indice di massa corporea, pressione arteriosa sistolica, uso di farmaci antipertensivi, colesterolo HDL, colesterolo totale, abitudine al fumo (attuale e non), diabete di tipo 2 prevalente ed eGFR.

Il BMI indica l'indice di massa corporea CHD, la malattia coronarica CI, l'intervallo di confidenza eGFR, la velocità di filtrazione glomerulare stimata EN-RAGE, il recettore extracellulare appena identificato per i prodotti finali della glicazione avanzata che legano la proteina HDL, lipoproteine ​​ad alta densità e HR, rapporto di rischio.

* I rapporti di rischio sono rappresentati per aumento della deviazione standard in EN-RAGE trasformata in log.

La statistica c del tradizionale modello di punteggio di rischio di Framingham per il rischio di CHD a 10 anni era 0,730 (IC 95%, 0,672-0,788). Quando abbiamo aggiunto EN-RAGE al modello, la statistica c è migliorata a 0,741 (95% CI, 0,683–0,799) con una differenza di 0,011 (95% CI, da -0,012 a 0,033 P=0.33). L'aggiunta di EN-RAGE al modello di punteggio di rischio di Framingham ha portato a un significativo indice di riclassificazione netto continuo di 0,36 (IC 95%, 0,05-0,67 P=0,02) e miglioramento della discriminazione integrata di 0,026 (IC 95%, 0,009–0,0437 P=3.3×10 −03 ).

Discussione

In questo studio di coorte prospettico basato sulla popolazione, abbiamo scoperto che livelli di EN-RAGE più elevati erano associati a un aumento del rischio di CHD oltre i fattori di rischio convenzionali. Ulteriori aggiustamenti per i marker infiammatori, così come l'esclusione di individui malati, non hanno modificato i risultati. Questi risultati suggeriscono l'EN-RAGE proinfiammatorio come nuovo marker di rischio infiammatorio per CHD che rappresenta un percorso infiammatorio distinto rispetto ad altri marker infiammatori.

Precedenti studi hanno osservato un aumento dei livelli di EN-RAGE in pazienti con disturbi infiammatori cronici, tra cui malattia infiammatoria intestinale, 8 diabete mellito di tipo 2, 9 malattia renale cronica, aterosclerosi subclinica, 10,11 e malattia coronarica. 12-16 Il disegno degli studi citati è principalmente trasversale e condotto in popolazioni di pazienti. Un'associazione positiva tra EN-RAGE e mortalità CHD è stata dimostrata in uno studio prospettico, che includeva pazienti in emodialisi. 17 Inoltre, un recente studio su individui CHD giapponesi ha osservato un'associazione significativa tra EN-RAGE e futuri eventi cardiaci avversi maggiori. 18 A nostra conoscenza, siamo i primi a indagare l'associazione tra EN-RAGE e CHD in uno studio di coorte prospettico basato sulla popolazione con follow-up a lungo termine.

Per affrontare la possibilità di confondimento, abbiamo adattato il modello multivariabile per i diversi fattori di rischio di CHD tradizionali e i marcatori infiammatori precedentemente studiati. Per rispondere alla domanda se i nostri risultati fossero guidati da un certo sottogruppo, abbiamo analizzato i dati escludendo i partecipanti con malattia renale cronica, diabete mellito di tipo 2 e uso di antipertensivi nelle analisi di sensibilità. In tutte queste analisi, c'è stato un effetto coerente di EN-RAGE sul rischio di CHD, anche dopo l'aggiustamento per i marcatori infiammatori stabiliti. Questi risultati suggeriscono un effetto di EN-RAGE sul rischio di CHD oltre le vie metaboliche e infiammatorie ben consolidate.

Abbiamo osservato un'associazione più forte tra EN-RAGE e futuro infarto miocardico e mortalità CHD rispetto alla rivascolarizzazione. Ciò suggerisce che EN-RAGE è più un determinante di eventi coronarici acuti con instabilità della placca piuttosto che una malattia coronarica stabile. Questa osservazione che EN-RAGE, un membro della famiglia delle proteine ​​S100, è un forte determinante di eventi coronarici acuti è in linea con studi precedenti che hanno riportato livelli più elevati di mRNA e livelli plasmatici delle proteine ​​della famiglia S100 (S100A8/9) in pazienti con Infarto miocardico con sopraslivellamento del tratto ST rispetto a casi stabili di malattia coronarica. 19 Inoltre, uno studio post mortem su persone morte per morte cardiaca improvvisa ha riscontrato livelli elevati di espressione di S100A12 nella muscolatura liscia dell'arteria coronaria nelle placche rotte, specialmente nei diabetici.20 Tuttavia, il rapporto di rischio causa-specifico per gli eventi CHD non era significativamente diverso utilizzando il metodo proposto da Lunn e McNeil. Potremmo non essere stati in grado di osservare una differenza significativa a causa del numero limitato di casi in queste analisi causa-specifiche.

Studiando il valore aggiunto di EN-RAGE nella previsione del rischio di CHD a 10 anni, abbiamo riscontrato un miglioramento nella previsione del rischio quando abbiamo aggiunto EN-RAGE al punteggio di rischio di Framingham. Ciò suggerisce che EN-RAGE, come marker non invasivo della futura CHD, potrebbe essere utile nel predire il rischio di CHD nella popolazione generale. Sebbene abbiamo corretto il cambiamento nella statistica c per ottimismo, pensiamo che siano necessari ulteriori studi per stabilire il ruolo potenziale di EN-RAGE nella previsione del rischio di CHD.

EN-RAGE, un membro della famiglia proteica S100 delle proteine ​​leganti il ​​calcio EF-hand, è un ligando infiammatorio prodotto in modo endogeno del recettore RAGE 21 e Toll-like 4. 22 RAGE è un membro della superfamiglia delle immunoglobuline delle molecole di superficie cellulare ed è espresso in più tessuti, comprese le cellule dell'endotelio, le cellule muscolari lisce vascolari e i macrofagi derivati ​​dai monociti. 23 Il legame di RAGE da parte di EN-RAGE attiva cascate infiammatorie, inclusa la via di segnalazione proinfiammatoria NF-kB, una via ben nota del sistema immunitario innato coinvolto nella patogenesi della CHD. 21,24 Inoltre, le vie di segnalazione intracellulare innescate da EN-RAGE possono alterare l'espressione genica e sovraregolare la sintesi della molecola di adesione delle cellule vascolari-1 e la sintesi della molecola di adesione intracellulare-1. 21 Considerando l'aterosclerosi come una malattia infiammatoria cronica, il coinvolgimento di RAGE da parte di EN-RAGE può svolgere un ruolo importante nella patogenesi dell'aterosclerosi e successivamente della CHD. In linea con questa evidenza, l'espressione di EN-RAGE nelle cellule muscolari lisce vascolari può modulare il rimodellamento della parete aortica e stimola la produzione di citochine e aumenta lo stress ossidativo. 25 Inoltre, EN-RAGE accelera l'aterosclerosi e la calcificazione vascolare nei topi con apolipoproteina E-null. 26 Recentemente, è stato dimostrato che EN-RAGE accelera lo sviluppo dell'ipertrofia cardiaca e della disfunzione diastolica nei topi con malattia renale cronica. 27 È stato anche osservato che l'effetto di attivazione dei monociti di EN-RAGE è dipendente dal recettore 4 Toll-like. 22 È stato dimostrato che EN-RAGE facilita l'attivazione dei monociti infiammatori da parte del recettore Toll-like 4 e che questo effetto è stato modulato da RAGE. I recettori Toll-like sono stati ampiamente studiati nel campo delle malattie cardiovascolari perché sono espressi nelle membrane cellulari vascolari e miocardiche. 28 L'importante ruolo di EN-RAGE nella patogenesi dell'aterosclerosi è ulteriormente enfatizzato da un recente studio in cui l'inibizione farmacologica dell'aterosclerosi mediata da S100A12 ha migliorato le caratteristiche della placca aterosclerotica, inclusi nuclei necrotici più piccoli, ridotta calcificazione e ridotto numero di cellule infiammatorie. 29

Questo studio ha alcuni punti di forza e limiti. Il disegno prospettico dello studio basato sulla popolazione, la diversità dei biomarcatori infiammatori disponibili e il follow-up a lungo termine della CHD possono essere indicati come i principali punti di forza del presente studio. Inoltre, i nostri risultati sono solidi per quanto riguarda il rigoroso Bonferroni P valore che abbiamo usato come soglia per le associazioni significative nella prima fase. Vanno inoltre riconosciuti diversi limiti. Innanzitutto, sebbene abbiamo aggiustato la nostra analisi per diversi potenziali confondenti, non possiamo escludere l'effetto di confondenti sconosciuti o non misurati. Tuttavia, poiché ci siamo adeguati ai fattori di rischio tradizionali e comunemente usati per CHD e vie infiammatorie, pensiamo che EN-RAGE come nuovo marker infiammatorio per CHD sia interessante perché potrebbe riflettere altre vie che portano alla CHD. In secondo luogo, abbiamo dovuto escludere i biomarcatori infiammatori con basse concentrazioni sieriche. Tuttavia, i biomarcatori selezionati hanno una completezza delle misurazioni >60%, il che indica una qualità accettabile della quantificazione. Terzo, la nostra popolazione ha ≥55 anni. Pertanto, la generalizzazione dei risultati a una categoria di età più giovane dovrebbe essere effettuata con cautela. Il nostro studio indica solo un'associazione, riteniamo che siano necessari ulteriori studi per stabilire il ruolo causale di EN-RAGE nella patogenesi della CHD.

In conclusione, il nostro studio suggerisce che livelli più elevati di EN-RAGE sierico sono associati all'incidenza di CHD al di là dei fattori di rischio cardiovascolare convenzionali e dei marker infiammatori. Questi risultati forniscono prove del ruolo di EN-RAGE nello sviluppo della CHD e suggeriscono questo marcatore come un potenziale bersaglio per la terapia farmacologica e la previsione del rischio.


Goldin A, Beckman JA, Schmidt AM, Creager MA (2006) Prodotti finali di glicazione avanzata: innescare lo sviluppo di lesioni vascolari diabetiche. Circolazione 114:597–605

Schmidt AM, Yan SD, Yan SF, Stern DM (2000) La biologia del recettore per i prodotti finali della glicazione avanzata e i suoi ligandi. Biochim Biophys Acta 1498:99–111

Schmidt AM, Yan SD, Yan SF, Stern DM (2001) Il recettore multiligando RAGE come fattore di progressione che amplifica le risposte immunitarie e infiammatorie. J Clin Invest 108: 949–955

Basta G, Lazzerini G, Massaro M, Simoncini T, Tanganelli P, Fu C, Kislinger T, Stern DM, Schmidt AM, De Caterina R (2002) I prodotti finali della glicazione avanzata attivano l'endotelio attraverso il recettore di trasduzione del segnale RAGE: un meccanismo di amplificazione delle risposte infiammatorie. Circolazione 105:816-822

Santilli F, Vazzana N, Bucciarelli LG, Davì G (2009) Forme solubili di RAGE nelle malattie umane: implicazioni cliniche e terapeutiche. Curr Med Chem 16:940–952

Bucciarelli LG, Wendt T, Qu W, Lu Y, Lalla E, Rong LL, Goova MT, Moser B, Kislinger T, Lee DC, Kashyap Y, Stern DM, Schmidt AM (2002) Il blocco RAGE stabilizza l'aterosclerosi stabilizzata nell'apolipoproteina E diabetica -null topi. Circolazione 106:2827–2835

Bucciarelli LG, Kaneko M, Ananthakrishnan R, Harja E, Lee LK, Hwang YC, Lerner S, Bakr S, Li Q, Lu Y, Song F, Qu W, Gomez T, Zou YS, Yan SF, Schmidt AM, Ramasamy R (2006) Recettore per prodotti finali di glicazione avanzata: modulatore chiave del danno ischemico miocardico. Circolazione 113:1226–1234

Raucci A, Cugusi S, Antonelli A, Barabino SM, Monti L, Bierhaus A, Reiss K, Saftig P, Bianchi ME (2008) Una forma solubile del recettore per prodotti finali di glicazione avanzata (RAGE) è prodotta dalla scissione proteolitica della membrana forma legata dalla sheddasi A Disintegrin e metalloproteasi 10 (ADAM10). FASEB Gv 22:3716–3727

Zhang L, Bukulin M, Kojro E, Roth A, Metz VV, Fahrenholz F, Nawroth PP, Bierhaus A, Postina R (2008) Il recettore per i prodotti finali di glicazione avanzata è soggetto a eliminazione dell'ectodominio proteico da parte delle metalloproteinasi. J Biol Chem 283:35507–35516

Parkin E, Harris B (2009) Uno spargimento di ectodominio mediato da disintegrina e metalloproteinasi (ADAM) di ADAM10. J Neurochem 108:1464–1479

Galichet A, Weibel M, Heizmann CW (2008) Proteolisi intramembrana regolata dal calcio del recettore RAGE. Biochem Biophys Res Commun 370:1–5

Hudson BI, Carter AM, Harja E, Kalea AZ, Arriero M, Yang H, Grant PJ, Schmidt AM (2008) Identificazione, classificazione ed espressione delle varianti di giunzione del gene RAGE. FASEB G 22:1572–1580

Forbes JM, Thorpe SR, Thallas-Bonke V, Pete J, Thomas MC, Deemer ER, Bassal S, El-Osta A, Long DM, Panagiotopoulos S, Jerums G, Osicka TM, Cooper ME (2005) Modulazione del recettore solubile per prodotti finali della glicazione avanzata mediante inibizione dell'enzima di conversione dell'angiotensina-1 nella nefropatia diabetica. J Am Soc Nephrol 16:2363–2372

Yamamoto Y, Miura J, Sakurai S, Watanabe T, Yonekura H, Tamei H, Matsuki H, Obata K, Uchigata Y, Iwamoto Y, Koyama H, Yamamoto H (2007) Analisi di forme solubili di recettori per prodotti finali di glicazione avanzata. Arterioscler Trombo Vasc Biol 27:e33

Ramasamy R, Yan SF, Herold K, Clynes R, Schmidt AM (2008) Recettore per prodotti finali di glicazione avanzata: ruoli fondamentali nella risposta infiammatoria: serpeggiando verso la patogenesi della disfunzione endoteliale e dell'aterosclerosi. Ann N Y Acad Sci 1126:7–13

Falcone C, Emanuele E, D'Angelo A, Buzzi MP, Belvito C, Cuccia M, Geroldi D (2005) Livelli plasmatici di recettore solubile per prodotti finali di glicazione avanzata e malattia coronarica in uomini non diabetici. Trombo arteriosclerico Vasc Biol 25:1032–1037

Lindsey JB, de Lemos JA, Cipollone F, Ayers CR, Rohatgi A, Morrow DA, Khera A e McGuire DK (2009) Associazione tra recettore solubile circolante per prodotti finali di glicazione avanzata (sRAGE) e aterosclerosi: osservazioni dal Dallas Heart Study. Cura del diabete 32: 218–1220

Catalano M, Cortelazzo A, Santi R, Contino L, Demicheli M, Yilmaz Y, Zorzetto M, Campo I, Lanati N, Emanuele E (2008) Il polimorfismo Pro12Ala del gene recettore-gamma2 attivato dal proliferatore dei perossisomi è associato a livelli plasmatici di RAGE solubile (Receptor for Advanced Glycation Endproducts) e la presenza di arteriopatia periferica. Clin Biochem 41:981–985

Lu L, Jin Pu L, Chen QJ, Wang L, Peng W, Yan X, Zhang Q, Yan Zhang R, Gong PH, Qiu JP, Shen WF (2008) L'aumento dell'albumina glicata e la diminuzione delle concentrazioni di esRAGE sono associati allo stent restenosi nei pazienti diabetici cinesi. Clin Chim Acta 396:33–37

Montaner J, Perea-Gainza M, Delgado P, Ribo M, Chacon P, Rosell A, Quintana M, Palacios ME, Molina CA, Alvarez-Sabin J (2008) Diagnosi eziologica dei sottotipi di ictus ischemico con biomarcatori plasmatici. Colpo 39:2280–2287

Emanuele E, D'Angelo A, Tomaino C, Binetti G, Ghidoni R, Politi P, Bernardi L, Maletta R, Bruni AC, Geroldi D (2005) Livelli circolanti di recettore solubile per prodotti finali di glicazione avanzata nella malattia di Alzheimer e nella demenza vascolare . Arch Neurol 62:1734–1736

Katakami N, Matsuhisa M, Kaneto H, Matsuoka TA, Sakamoto K, Yasuda T, Yamasaki Y (2008) Il RAGE secretorio endogeno ma non solubile è associato all'aterosclerosi carotidea nei pazienti con diabete di tipo 1. Diab Vasc Dis Ris 5:190–197

Katakami N, Matsuhisa M, Kaneto H, Matsuoka TA, Sakamoto K, Yasuda T, Umayahara Y, Kosugi K e Yamasaki Y (2008) Il livello di RAGE secretorio endogeno nel siero è un fattore di rischio indipendente per la progressione dell'aterosclerosi carotidea nel diabete di tipo 1. Aterosclerosi 204:288–292

Koyama H, Shoji T, Yokoyama H, Motoyama K, Mori K, Fukumoto S, Emoto M, Tamei H, Matsuki H, Sakurai S, Yamamoto Y, Yonekura H, Watanabe T, Yamamoto H, Nishizawa Y (2005) Livello plasma di la secrezione endogena RAGE è associata a componenti della sindrome metabolica e dell'aterosclerosi. Trombo arteriosclerico Vasc Biol 25:2587–2593

Katakami N, Matsuhisa M, Kaneto H, Yamasaki Y (2007) I livelli di RAGE secretori endogeni nel siero sono inversamente associati all'IMT carotideo nei pazienti diabetici di tipo 2. Aterosclerosi 190:22–23

Hudson BI, Harja E, Moser B, Schmidt AM (2005) Livelli solubili di recettore per prodotti finali di glicazione avanzata (sRAGE) e malattia coronarica: la prossima proteina C-reattiva? Arterioscler Trombo Vasc Biol 25: 879-882

Holman RR, Paul SK, Bethel MA, Matthews DR, Neil HA (2008) Follow-up di 10 anni del controllo intensivo del glucosio nel diabete di tipo 2. N Inglese J Med 359:1577–1589

Dluhy RG, McMahon GT (2008) Controllo glicemico intensivo negli studi ACCORD e ADVANCE. N Inglese J Med 358:2630–2633

Gerstein HC, Miller ME, Byington RP, Goff DC Jr, Bigger JT, Buse JB, Cushman WC, Genuth S, Ismail-Beigi F, Grimm RH Jr, Probstfield JL, Simons-Morton DG, Friedewald WT (2008) Effetti dell'intenso ipoglicemizzante nel diabete di tipo 2. N Inglese J Med 358:2545-2559

Patel A, MacMahon S, Chalmers J, Neal B, Billot L, Woodward M, Marre M, Cooper M, Glasziou P, Grobbee D, Hamet P, Harrap S, Heller S, Liu L, Mancia G, Mogensen CE, Pan C , Poulter N, Rodgers A, Williams B, Bompoint S, de Galan BE, Joshi R, Travert F (2008) Controllo intensivo della glicemia ed esiti vascolari nei pazienti con diabete di tipo 2. N Inglese J Med 358:2560-2572

Basta G, Sironi AM, Lazzerini G, Del Turco S, Buzzigoli E, Casolaro A, Natali A, Ferrannini E, Gastaldelli A (2006) Il recettore solubile circolante per i prodotti finali della glicazione avanzata è inversamente associato al controllo glicemico e alla proteina S100A12. J Clin Endocrinol Metab 91:4628–4634

Devangelio E, Santilli F, Formoso G, Ferroni P, Bucciarelli L, Michetti N, Clissa C, Ciabattoni G, Consoli A, Davì G (2007) Soluble RAGE nel diabete di tipo 2: associazione con stress ossidativo. Free Radic Biol Med 43:511–518

Davì G, Patrono C (2007) Attivazione piastrinica e aterotrombosi. N Inglese J Med 357:2482–2494

Geroldi D, Falcone C, Emanuele E, D'Angelo A, Calcagnino M, Buzzi MP, Scioli GA, Fogari R (2005) Riduzione dei livelli plasmatici del recettore solubile per prodotti finali della glicazione avanzata in pazienti con ipertensione essenziale. J Hypertens 23:1725–1729

Norata GD, Garlaschelli K, Grigore L, Tibolla G, Raselli S, Redaelli L, Buccianti G, Catapano AL (2009) Il recettore solubile circolante per i prodotti finali della glicazione avanzata è inversamente associato all'indice di massa corporea e al rapporto vita/fianchi nella popolazione generale . Nutr Metab Cardiovasc Dis 19:129–134

Yilmaz Y, Ulukaya E, Gul OO, Arabul M, Gul CB, Atug O, Oral AY, Aker S e Dolar E (2009) Diminuzione dei livelli plasmatici del recettore solubile per prodotti finali di glicazione avanzata (sRAGE) in pazienti con steatosi epatica non alcolica. Clin Biochem 42(9):802–807

Santilli F, Bucciarelli L, Noto D, Cefalu AB, Davi V, Ferrante E, Pettinella C, Averna MR, Ciabattoni G, Davì G (2007) Diminuzione plasma solubile RAGE in pazienti con ipercolesterolemia: effetti delle statine. Radici liberi Biol Med 43:1255-1262

Hudson BI, Wendt T, Bucciarelli LG, Rong LL, Naka Y, Yan SF, Schmidt AM (2005) Malattia vascolare diabetica: è tutta la rabbia. Segnale Redox antiossidante 7:1588–1600

Grossin N, Wautier MP, Meas T, Guillausseau PJ, Massin P, Wautier JL (2008) La gravità delle complicanze microvascolari diabetiche è associata a un basso livello di RAGE solubile. Diabete Mt 34:392–395

Koyama H, Yamamoto H, Nishizawa Y (2007) RAGE e RAGE solubile: potenziali bersagli terapeutici per le malattie cardiovascolari. Mol Med 13:625–635

Humpert PM, Papadopoulos G, Schaefer K, Djuric Z, Konrade I, Morcos M, Nawroth PP, Bierhaus A (2007) sRAGE ed esRAGE non sono associati a neuropatia periferica o autonomica nel diabete di tipo 2. Horm Metab Ris 39:899–902

Semba RD, Ferrucci L, Fink JC, Sun K, Beck J, Dalal M, Guralnik JM, Fried LP (2009) Prodotti finali di glicazione avanzata e loro recettori circolanti e livello di funzione renale nelle donne anziane che vivono in comunità. Am J Rene Dis 53:51–58

Nin JW, Ferreira I, Schalkwijk CG, Prins MH, Chaturvedi N, Fuller JH, Stehouwer CD (2009) I livelli di recettore solubile per AGE sono trasversalmente associati a malattie cardiovascolari nel diabete di tipo 1 e questa associazione è parzialmente mediata da e disfunzione renale e da infiammazione di basso grado: lo studio EURODIAB sulle complicanze prospettiche. Diabetologia 52:705–714

Koyama H, Shoji T, Fukumoto S, Shinohara K, Emoto M, Mori K, Tahara H, Ishimura E, Kakiya R, Tabata T, Yamamoto H, Nishizawa Y (2007) Il recettore secretorio endogeno a bassa circolazione per gli AGE predice la mortalità cardiovascolare nei pazienti con malattia renale allo stadio terminale. Trombo arteriosclerico Vasc Biol 27:147–153

Hofmann MA, Drury S, Hudson BI, Gleason MR, Qu W, Lu Y, Lalla E, Chitnis S, Monteiro J, Stickland MH, Bucciarelli LG, Moser B, Moxley G, Itescu S, Grant PJ, Gregersen PK, Stern DM , Schmidt AM (2002) RAGE e artrite: il polimorfismo G82S amplifica la risposta infiammatoria. Geni Immun 3:123–135

Pullerits R, Bokarewa M, Dahlberg L, Tarkowski A (2005) Diminuzione dei livelli di recettore solubile per prodotti finali di glicazione avanzata in pazienti con artrite reumatoide che indicano un controllo infiammatorio carente. Artrite Res Ther 7: R817–R824

Chen YS, Yan W, Geczy CL, Brown MA, Thomas R (2009) I livelli sierici del recettore solubile per i prodotti finali della glicazione avanzata e delle proteine ​​S100 sono associati a marcatori di rischio infiammatori, autoanticorpi e classici di danno articolare e vascolare nell'artrite reumatoide . Artrite Res Ther 11: R39

Leach ST, Yang Z, Messina I, Song C, Geczy CL, Cunningham AM, Day AS (2007) Le proteine ​​del siero e della mucosa S100, la calprotectina (S100A8/S100A9) e S100A12, sono elevate alla diagnosi nei bambini con malattia infiammatoria intestinale. Scand J Gastroenterol 42:1321–1331

Kim W, Hudson BI, Moser B, Guo J, Rong LL, Lu Y, Qu W, Lalla E, Lerner S, Chen Y, Yan SS, D'Agati V, Naka Y, Ramasamy R, Herold K, Yan SF, Schmidt AM (2005) Recettore per prodotti finali di glicazione avanzata e suoi ligandi: un viaggio dalle complicanze del diabete alla sua patogenesi. Ann N Y Acad Sci 1043:553–561

Chen X, Walker DG, Schmidt AM, Arancio O, Lue LF, Yan SD (2007) RAGE: un potenziale bersaglio per la perturbazione cellulare mediata da Abeta nella malattia di Alzheimer. Curr Mol Med 7:735–742

Ghidoni R, Benussi L, Glionna M, Franzoni M, Geroldi D, Emanuele E, Binetti G (2008) Diminuzione dei livelli plasmatici del recettore solubile per i prodotti finali della glicazione avanzata nel decadimento cognitivo lieve. J Trasmissione neurale 115:1047–1050

Sternberg Z, Weinstock-Guttman B, Hojnacki D, Zamboni P, Zivadinov R, Chadha K, Lieberman A, Kazim L, Drake A, Rocco P, Grazioli E, Munschauer F (2008) Recettore solubile per prodotti finali di glicazione avanzata nella sclerosi multipla : un potenziale marker di gravità della malattia. Mult Scler 14:759–763

Ilzecka J (2008) Recettore solubile nel siero per livelli avanzati di prodotto finale di glicazione in pazienti con sclerosi laterale amiotrofica. Acta Neurol Scand 120:119–122

Logsdon CD, Fuentes MK, Huang EH, Arumugam T (2007) RAGE e ligandi RAGE nel cancro. Curr Mol Med 7:777–789

Abe R, Yamagishi S (2008) Sistema AGE-RAGE e carcinogenesi. Curr Pharm Des 14:940-945

Tesarova P, Kalousova M, Jachymova M, Mestek O, Petruzelka L, Zima T (2007) Recettore per prodotti finali di glicazione avanzata (RAGE) - forma solubile (sRAGE) e polimorfismi genici in pazienti con cancro al seno. Cancro Invest 25:720–725

Jang Y, Kim JY, Kang SM, Kim JS, Chae JS, Kim OY, Koh SJ, Lee HC, Ahn CW, Song YD, Lee JH (2007) Associazione del polimorfismo Gly82Ser nel recettore per prodotti finali di glicazione avanzata (RAGE ) gene con livelli circolanti di RAGE solubile e marcatori infiammatori in coreani non diabetici e non obesi. Metabolismo 56:199–205

Gu H, Yang L, Sun Q, Zhou B, Tang N, Cong R, Zeng Y, Wang B (2008) Il polimorfismo Gly82Ser del recettore per i prodotti finali di glicazione avanzata è associato ad un aumentato rischio di cancro gastrico in una popolazione cinese. Clin Cancer Ris 14:3627–3632

Mukherjee TK, Mukhopadhyay S, Hoidal JR (2008) Implicazione del recettore per il prodotto finale di glicazione avanzata (RAGE) nella salute polmonare e nella fisiopatologia. Respir Physiol Neurobiol 162:210–215

van Zoelen MA, Schouten M, de Vos AF, Florquin S, Meijers JC, Nawroth PP, Bierhaus A, van der Poll T (2009) Il recettore per i prodotti finali di glicazione avanzata compromette la difesa dell'ospite nella polmonite pneumococcica. J Immunol 182:4349–4356

Uchida T, Shirasawa M, Ware LB, Kojima K, Hata Y, Makita K, Mednick G, Matthay ZA, Matthay MA (2006) Il recettore per i prodotti finali della glicazione avanzata è un marker di danno cellulare di tipo I nel danno polmonare acuto. Am J Respir Crit Care Med 173:1008–1015

Bopp C, Bierhaus A, Hofer S, Bouchon A, Nawroth PP, Martin E, Weigand MA (2008) Revisione da banco a capezzale: il recettore RAGE per il riconoscimento del pattern che si perpetua nell'infiammazione come bersaglio terapeutico nella sepsi. Cura critica 12:201

Hudson BI, Schmidt AM (2004) RAGE: un nuovo bersaglio per l'intervento farmacologico nella malattia vascolare diabetica. Pharm Ris 21:1079–1086

Kalousova M, Germanova A, Jachymova M, Mestek O, Tesar V, Zima T (2008) A419C (E111A) polimorfismo del gene della gliossalasi I e complicanze vascolari nei pazienti in emodialisi cronica. Ann N Y Acad Sci 1126: 268–271

Sullivan CM, Futers TS, Barrett JH, Hudson BI, Freeman MS, Grant PJ (2005) Polimorfismi RAGE ed ereditarietà dell'insulino-resistenza: lo studio della famiglia Leeds. Diab Vasc Dis Ris 2:42–44

Zee RY, Romero JR, Gould JL, Ricupero DA, Ridker PM (2006) Polimorfismi nel gene del recettore specifico del prodotto finale della glicosilazione avanzata e rischio di infarto miocardico incidente o ictus ischemico. Colpo 37:1686–1690

Hudson BI, Stickland MH, Futers TS, Grant PJ (2001) Effetti di nuovi polimorfismi nel gene RAGE sulla regolazione trascrizionale e la loro associazione con la retinopatia diabetica. Diabete 50:1505–1511

Falcone C, Geroldi D, Buzzi MP, Emanuele E, Yilmaz Y, Fontana JM, Vignali L, Boiocchi C, Sbarsi I, Cuccia M (2008) Il polimorfismo -374T/A RAGE protegge da futuri eventi cardiaci in pazienti non diabetici con coronaria malattia. Arch Med Ris 39:320–325

Pettersson-Fernholm K, Forsblom C, Hudson BI, Perola M, Grant PJ, Groop PH, Finn-Diane Study Group (2003) Il polimorfismo del gene funzionale -374 T/A RAGE è associato a proteinuria e malattie cardiovascolari nei pazienti con diabete di tipo 1 . Diabete 52:891–894

Kim OY, Jo SH, Jang Y, Chae JS, Kim JY, Hyun YJ, Lee JH (2009) L'allele G a RAGE SNP82 è associato a marcatori proinfiammatori nei soggetti obesi. Nutr Ris 29:106–113

Studi Prevost G, Fajardy I, Besmond C, Balkau B, Tichet J, Fontaine P, Danze PM, Marre M, Genediab e DESIR (2005) Polymorphisms of the receptor of advanced glycation endproducts (RAGE) and the development of nephropathy in type 1 pazienti diabetici. Diabete Mt 31:35-39


Mirare alla segnalazione RAGE nella malattia infiammatoria

Il recettore per i prodotti finali della glicazione avanzata (RAGE) è un recettore di riconoscimento di pattern multiligando implicato in diversi stati infiammatori cronici. RAGE lega e media la risposta cellulare a una gamma di molecole di pattern molecolari associate al danno (DAMP) tra cui AGE, HMGB1, S100 e DNA. RAGE può anche agire come un sensore immunitario innato di molecole di pattern molecolari associate ai patogeni microbici (PAMP) tra cui endotossine batteriche, virus respiratori e DNA microbico. RAGE è espresso a bassi livelli in condizioni fisiologiche normali, ma è altamente sovraregolato in caso di infiammazione cronica a causa dell'accumulo di vari ligandi RAGE. Il blocco della segnalazione di RAGE in modelli cellulari e animali ha rivelato che prendere di mira RAGE compromette l'infiammazione e la progressione delle complicanze vascolari diabetiche, delle malattie cardiovascolari (CVD) e della progressione e delle metastasi del cancro. La rilevanza clinica di RAGE nella malattia infiammatoria è stata dimostrata in studi clinici emergenti su nuovi inibitori di RAGE a piccole molecole.


Astratto

Il recettore per AGE (RAGE) è un membro multi-ligando della superfamiglia delle immunoglobuline delle molecole di superficie cellulare. Il coinvolgimento di RAGE da parte dei suoi ligandi di trasduzione del segnale evoca l'infiltrazione e l'attivazione delle cellule infiammatorie nella parete del vaso. Nel diabete, quando alimentato da stress ossidativo, iperglicemia e stress sovrapposti come l'iperlipidemia o la lesione arteriosa acuta del palloncino/endoteliale, l'asse ligando-RAGE amplifica lo stress vascolare e accelera l'aterosclerosi e l'espansione neointimale. In questa breve sinossi, esaminiamo l'uso di modelli di roditori per testare questi concetti. Presi insieme, i nostri risultati supportano la premessa che RAGE è un passo di amplificazione nell'infiammazione vascolare e nell'accelerazione dell'aterosclerosi. Gli studi futuri devono testare rigorosamente il potenziale impatto del blocco RAGE in soggetti umani, tali studi sono all'orizzonte.

L'impegno del ligando del recettore per i prodotti finali di glicazione avanzata (RAGE) evoca infiammazione e perturbazione vascolare. Nel diabete, quando alimentato da ossidazione, iperglicemia e stress sovrapposti, l'asse ligando-RAGE accelera l'aterosclerosi e l'espansione neointimale. Gli studi su modelli di diabete nei roditori suggeriscono che è logico testare l'impatto del blocco RAGE su soggetti umani.

Il recettore per i prodotti finali della glicazione avanzata (RAGE) è un membro multi-ligando della superfamiglia delle immunoglobuline delle molecole di superficie cellulare. 1,2 La sua capacità di riconoscere più classi di ligandi, come prodotti finali di glicazione avanzata (AGE), S100/calgranuline, anfoterina, peptide amiloide-β e fibrille -sheet, e MAC-1, 3-8 suggerisce che il repertorio degli effetti RAGE-dipendenti nei tessuti possono essere diversi. In questo contesto, la funzione di questo recettore non sembra essere quella di degradare/disintossicare il ligando, ma piuttosto, mediante la trasduzione del segnale attivata dal dominio citosolico di RAGE, di propagare le risposte immunitarie/infiammatorie. 3,9

Sebbene gli AGE siano una classe eterogenea di composti, studi hanno dimostrato che una particolare classe di queste specie, gli addotti N carbossimetil lisina (LMC) di proteine/lipidi, sono specifici ligandi di trasduzione del segnale di RAGE. 9 Gli addotti modificati con LMC possono essere generati da una varietà di stimoli. Oltre alla generazione nell'iperglicemia, gli addotti della LMC possono anche essere generati dall'attivazione della via della mieloperossidasi. 10 Studi recenti hanno dimostrato che il perossinitrito può indurre la formazione di LMC per scissione di un prodotto Amadori e, inoltre, per generazione di α-ossoaldeidi reattive dal glucosio. 11 Queste considerazioni evidenziano il concetto che, una volta messi in moto, l'iperglicemia associata al diabete e lo stress ossidativo amplificano la produzione di un'ampia gamma di specie biochimiche che si accumulano per stimolare l'attivazione cellulare e sostenere la perturbazione dei tessuti.

Inoltre, nel diabete, possono essere coinvolti meccanismi distinti per alimentare ulteriormente il ciclo di generazione di AGE e lo stress ossidativo. 12 Un esempio specifico è la via del poliolo. Il glucosio viene ridotto a sorbitolo dall'aldosio reduttasi, l'enzima centrale di questa via. Ciò si traduce nella generazione di fruttosio il fruttosio viene convertito in fruttosio-3-fosfato dall'azione della 3-fosfochinasi. Un prodotto principale di questa reazione è il 3-desossiglucosone, un precursore chiave nella generazione di molteplici tipi di AGE, come gli addotti della LMC e altri. 13,14 È stato dimostrato che nell'insufficienza renale, i livelli plasmatici di 3-desossiglucosone aumentano parallelamente all'aumento dei livelli di aldoso reduttasi negli eritrociti. 14 La somministrazione di un inibitore dell'aldoso reduttasi, epalrestat, a soggetti con diabete ha determinato una riduzione dei livelli di addotti della LMC e dei loro precursori negli eritrociti e una diminuzione dei livelli plasmatici di sostanze reattive all'acido tiobarbiturico. 15 Queste considerazioni evidenziano il concetto che molteplici forze sono in gioco nel diabete per aumentare la generazione di specie biochimiche dannose ai tessuti che segnalano la perturbazione cellulare cronica.

Infatti, una volta formati gli AGE, la loro interazione con RAGE innesca la generazione di citochine proinfiammatorie, molecole di adesione e chemochine. L'attrazione di cellule infiammatorie come leucociti polimorfonucleati, fagociti mononucleati e linfociti T nel tessuto fornisce un meccanismo per sostenere la risposta infiammatoria. Nel contesto di RAGE, queste cellule possono ospitare S100/calgranuline proinfiammatorie e anfoterina. Una volta che queste molecole vengono rilasciate nel tessuto, l'interazione S100/calgranuline/anfoterina-RAGE può amplificare l'infiammazione e il danno tissutale per via autocrina e paracrina. 3,16-18

Modelli di aterosclerosi nel diabete

Molteplici indagini epidemiologiche supportano la premessa che il diabete acceleri l'aterosclerosi I soggetti umani con diabete mostrano una sorprendente accelerazione dell'aterosclerosi, oltre all'aumento dell'incidenza di eventi cardiaci, come infarti e ictus. 19-22 Studi su soggetti umani indicano che RAGE e i suoi ligandi di trasduzione del segnale sono espressi nel sistema vascolare diabetico e nelle placche aterosclerotiche. 23,24 Cipollone et al hanno mostrato che rispetto alle placche umane non diabetiche, le placche diabetiche erano caratterizzate da un maggior numero di fagociti mononucleati, linfociti T e cellule HLA-DR +, in parallelo con una maggiore espressione di RAGE, NF-kB attivato, cox -2 e metalloproteinasi di matrice. L'estensione dell'espressione di RAGE è risultata correlata ai livelli di emoglobina glicosilata. 24 Sebbene tali studi non delineino il legame biochimico/molecolare tra l'asse ligando/RAGE, l'infiammazione e l'aterosclerosi, questi esperimenti forniscono comunque supporto alla premessa che RAGE può partecipare all'aumento del danno vascolare e alla progressione dell'aterosclerosi.

Sono in corso studi su modelli murini per testare la premessa che RAGE contribuisce all'accelerazione dell'aterosclerosi nel diabete.

Modelli animali e aterosclerosi diabetica accelerata

Il primo modello murino a supportare il concetto che l'iperglicemia accelera l'aterosclerosi ha testato l'ipotesi che l'induzione del diabete con l'uso di streptozotocina a basse dosi multiple comporterebbe un aumento dell'aterosclerosi nei topi alimentati con una dieta di tipo occidentale. 25 In questi primi studi sono stati utilizzati topi BALB/c e C57BL/6 wild-type. In questi animali, la manipolazione genetica non è stata utilizzata come mezzo per innescare/migliorare lo sviluppo dell'aterosclerosi. Piuttosto, la modificazione della dieta ha indotto l'iperlipidemia. In questo studio, Kunjathoor et al hanno mostrato che i topi BALB/c alimentati con una dieta aterogenica e resi diabetici con streptozotocina hanno mostrato un aumento di 17 volte nell'area della lesione aterosclerotica rispetto ai topi trattati con citrato (non diabetici) alimentati con la stessa dieta aterogenica. Sebbene le lesioni fossero limitate a striature adipose, gli studi istologici hanno comunque rivelato la presenza sia di fagociti mononucleati in eccesso che di cellule muscolari lisce nelle placche. 25 È interessante notare che questi ricercatori hanno scoperto che non vi erano differenze nell'area della lesione aterosclerotica media tra i topi C57BL/6 diabetici (streptozotocina) rispetto a quelli non diabetici aterogenici alimentati con dieta. 25 Queste considerazioni sottolineano l'influenza critica che molteplici fattori possono esercitare sull'inizio e sul progresso dell'aterosclerosi, come il background genetico, la dieta e l'ambiente, specialmente nel contesto dell'iperglicemia sovrapposta.

Oltre alla modulazione dietetica del profilo lipidico, la modificazione genetica fornisce un mezzo per alterare il profilo lipidico nei topi. Per testare il ruolo dell'iperglicemia nella potenziale accelerazione dell'aterosclerosi, abbiamo utilizzato topi in cui la manipolazione genetica rendeva gli animali iperlipidemici mediante delezione dell'apolipoproteina E (apo E-/-). 26-27 topi Apo E-/- mostrano lesioni di fasi multiple di aterosclerosi distribuite in tutto l'albero arterioso. 28 Sulla normale dieta chow, il lavoro del gruppo Russell Ross ha mostrato che i topi apo E-/- mostravano lesioni delle cellule schiumose già a 8 settimane di età entro le 15 settimane di età, le lesioni avanzate erano evidenti. 28 Le lesioni avanzate consistevano in un cappuccio fibroso contenente cellule muscolari lisce circondate da una matrice di tessuto connettivo che ricopre un nucleo necrotico con macrofagi schiumosi. 28 All'induzione di una dieta di tipo occidentale, le lesioni erano generalmente più avanzate. 28

Sulla base dell'osservazione che i topi apo E-/- hanno sviluppato lesioni complesse caratteristiche delle placche umane avanzate, abbiamo cercato di testare l'ipotesi che l'induzione dell'iperglicemia in questi animali accelererebbe ulteriormente l'aterosclerosi e la complessità della lesione. Nei primi studi, abbiamo reso diabetici con streptozotocina topi maschi apo E-/- di 6 settimane. 29 Questi topi apo E-/- sono stati precedentemente reincrociati per >10 generazioni in C57BL/6. Dopo 6 settimane di diabete accertato, all'età da 13 a 14 settimane, i topi diabetici apoE-/- hanno mostrato lesioni discrete nei principali punti di diramazione nell'aorta toracica e nell'arco dell'aorta. Al contrario, i topi apoE-/- euglicemici di pari età non hanno mostrato lesioni nell'aorta prossimale. 30 L'analisi morfometrica quantitativa ha rivelato un aumento di 5 volte dell'area media della lesione a livello del seno aortico nei topi diabetici apoE-/- rispetto agli animali non diabetici apoE-/- (Figura 1a). L'analisi istologica di topi apoE-/- euglicemici ha rivelato tipiche striature grasse visualizzate con olio rosso O. A questa età, la maggior parte delle lesioni negli animali non diabetici non progrediva fino a stadi avanzati. Tuttavia, nei topi diabetici apoE-/- di pari età, sono state osservate placche fibrose più grandi e più avanzate con una propensione alla formazione del cappuccio (Figura 1b). 30 La complessità della lesione è stata definita dalla presenza di fessure di colesterolo, necrosi o formazione di cappe fibrose. 30

Figura 1. Il blocco di RAGE sopprime l'aterosclerosi accelerata nei topi diabetici apo E-/-: intervento precoce. I topi Apo E-/- sono stati resi diabetici con streptozotocina o trattati con tampone citrato (controllo). Nei topi diabetici, gli animali sono stati trattati con veicolo una volta al giorno, albumina sierica murina (MSA) o diverse dosi giornaliere di sRAGE. Dopo 6 settimane di diabete o trattamento di controllo, il cuore e l'aorta sono stati dissezionati. Viene mostrato l'impatto del blocco RAGE sull'area della lesione (a) e sulla complessità (b).

In questo modello, il diabete è stato seguito da un aumento tempo-dipendente del colesterolo totale plasmatico. 30 Dopo 6 settimane di diabete, è stato osservato un aumento 2 volte del colesterolo nei topi diabetici apoE-/- rispetto agli animali non diabetici, mentre i livelli di trigliceridi plasmatici sono rimasti invariati. Il frazionamento del colesterolo plasmatico mediante ultracentrifugazione in gradiente di densità ha rivelato aumenti significativi di chilomicroni/lipoproteine ​​a densità molto bassa (≈2,6 volte) e lipoproteine ​​a densità intermedia/lipoproteine ​​a bassa densità (LDL) (≈2,5 volte) nei diabetici di pari età rispetto ai topi euglicemici apoE-/-, mentre l'HDL era più modestamente alterato (≈1,5 volte più alto nei diabetici rispetto ai topi di controllo). 30 Al contrario, l'ultracentrifugazione in gradiente di densità ha mostrato differenze minime o nulle nel profilo dei trigliceridi plasmatici. 30

Parallelamente all'aumento del glucosio, è stata dimostrata una maggiore formazione di AGE nei topi diabetici apoE-/- da un aumento di 2,3 volte degli epitopi immunoreattivi AGE in materiale solubile in acido estratto dal tessuto renale dopo 6 settimane di diabete, rispetto all'apo euglicemico. E-/- controlli e aumento di 2,5 volte degli AGE plasmatici nei topi diabetici apoE-/- rispetto ai topi di controllo non diabetici. 30 Ulteriori studi hanno rivelato che i lisati aortici recuperati da topi diabetici apo E-/- mostravano livelli aumentati della famiglia dei ligandi RAGE proinfiammatori, epitopi S100/calgranulina, rispetto ai topi apo E-/- non diabetici della stessa età. 31

È interessante notare che sebbene Kunjathoor et al non abbiano riscontrato una sostanziale aterosclerosi nei topi diabetici (streptozotocina) C57BL/625, l'innesco dell'aterosclerosi, l'iperlipidemia indotta dalla dieta, differiva dai mezzi per indurre l'iperlipidemia nei topi apoE-/-. Questi risultati evidenziano il concetto che oltre al background genetico, altre influenze, come il grado e la natura dell'elevazione lipidica, possono influenzare in modo importante lo sviluppo e la progressione dell'aterosclerosi nel diabete.

Aterosclerosi diabetica accelerata: il ruolo di RAGE

In seguito allo sviluppo del modello streptozotocina-apo E-/- di aterosclerosi accelerata complessa nel diabete murino, è stato testato l'impatto del blocco di RAGE. Nei primi studi, è stato utilizzato RAGE solubile murino (sRAGE), i due terzi extracellulari del recettore che funziona per legare il ligando e quindi bloccare l'interazione e l'attivazione della superficie cellulare RAGE. 32 Solubile RAGE è stato somministrato una volta al giorno per via intraperitoneale a topi diabetici apo E-/-, iniziando immediatamente nel momento in cui si è sviluppata l'iperglicemia. Rispetto ai topi diabetici che ricevevano albumina sierica di topo (MSA), i topi diabetici apo E-/- trattati con sRAGE hanno mostrato una soppressione dose-dipendente dell'aterosclerosi accelerata (Figura 1a e 1b, rispettivamente). Oltre alla diminuita area della lesione aterosclerotica, la complessità della lesione è stata ridotta nei topi diabetici trattati con sRAGE. 30 Questo aspetto dell'impatto del blocco RAGE ha suggerito che l'antagonismo di questo asse ha il potenziale per sopprimere la progressione della lesione e, possibilmente, lo sviluppo di placche instabili altamente infiammate.

È importante sottolineare che il trattamento di topi diabetici con sRAGE non ha influenzato il grado di iperglicemia o il livello di insulinemia rispetto ai topi diabetici trattati con albumina sierica murina. Il colesterolo totale e i trigliceridi non sono stati similmente influenzati dal trattamento con sRAGE e anche la composizione delle particelle lipidiche non è stata modificata nei topi apoE-/- trattati con sRAGE diabetici rispetto ai topi che ricevevano albumina sierica murina. 30 Questi dati suggerivano che gli effetti benefici del blocco di RAGE erano sia indipendenti dalla glicemia che dai lipidi, indicando che i fattori unici dell'ambiente diabetico erano modulati favorevolmente. In questo contesto, ipotizziamo che l'iperglicemia e l'iperlipidemia alimentino la generazione di AGE, quindi sRAGE esercita il suo impatto a valle dei tradizionali fattori di rischio.

Coerentemente con questa premessa, i livelli di AGE renale e plasmatico nei topi diabetici sono stati soppressi ai livelli osservati negli animali non diabetici mediante somministrazione di sRAGE in modo dose-dipendente. Risultati simili sono stati osservati all'esame degli AGE plasmatici. 30 Questi risultati supportano la tesi che l'attivazione della formazione di AGE potrebbe anche essere soppressa dal blocco di RAGE. Per iniziare ad affrontare questo problema, LDL è stato isolato da topi trattati con sRAGE e con albumina di siero murino. La suscettibilità all'ossidazione indotta dal rame delle LDL 33 recuperate da topi diabetici apoE-/- trattati con sRAGE era diminuita rispetto ai topi diabetici trattati con albumina sierica murina, come valutato dal tempo medio di ritardo alla formazione di dieni coniugati. 30

Blocco di RAGE: intervento tardivo

Per determinare il potenziale impatto del blocco RAGE nelle lesioni aterosclerotiche accertate, è stato utilizzato il modello apo E-/- del diabete indotto da streptozotocina. 34 I topi sono stati resi diabetici con streptozotocina all'età di 6 settimane e non sono stati trattati fino all'età di 14 settimane. All'età di 14 settimane, alcuni topi diabetici apo E-/- sono stati soppressi per stabilire l'area/complessità della lesione aterosclerotica "di base".L'induzione del diabete era associata ad una maggiore area della lesione aterosclerotica rispetto ai controlli non diabetici all'età di 14 e 20 settimane (Figura 2b e 2a e 2d e 2c, rispettivamente). Nei topi diabetici trattati con sRAGE di età compresa tra 14 e 20 settimane, l'area della lesione aterosclerotica era significativamente ridotta rispetto ai topi trattati con albumina sierica murina (Figura 2e e 2d, rispettivamente). Le sezioni trasversali dell'aorta attraverso il seno aortico macchiate di olio rosso O hanno rivelato che rispetto ai topi non diabetici, i topi diabetici mostravano lesioni aterosclerotiche più grandi e più estese a 14 settimane (Figura 2f e 2g, rispettivamente) e 20 settimane (Figura 2h e 2i , rispettivamente). Nei topi diabetici trattati con sRAGE, le lesioni aterosclerotiche erano più piccole di quelle osservate nei topi diabetici trattati con veicolo all'età di 20 settimane (Figura 2j e 2i, rispettivamente).

Figura 2. Il blocco di RAGE sopprime l'aterosclerosi accelerata nei topi diabetici apo E-/-: intervento tardivo. I topi Apo E-/- sono stati resi iperglicemici usando streptozotocina o sono stati trattati con tampone citrato all'età di 6 settimane. All'età di 14 settimane, i topi sono stati trattati con sRAGE, 100 μg al giorno, o albumina sierica murina (MSA). I topi sono stati soppressi all'età di 20 settimane e le aorte sezionate e fotografate (da a a e). In altri studi, le sezioni alla radice aortica sono state preparate e colorate con olio rosso O (da f a j). Barra della scala: da a a e, 0,3 cm da f a j, 125 μm.

È stata eseguita un'analisi morfometrica quantitativa e ha confermato che i topi diabetici trattati con sRAGE a 20 settimane hanno mostrato una significativa diminuzione dell'area della lesione aterosclerotica media rispetto agli animali diabetici trattati con albumina di siero murino (Figura 3a). Sebbene l'area media della lesione fosse aumentata nei topi diabetici a 20 settimane rispetto a 14 settimane, l'area media della lesione nei topi diabetici trattati con sRAGE a 20 settimane non era significativamente diversa da quella osservata nei topi diabetici a 14 settimane (Figura 3a). 34 Inoltre, all'età di 20 settimane, l'area media della lesione nei topi diabetici trattati con sRAGE era significativamente ridotta rispetto alle lesioni negli animali non diabetici della stessa età (Figura 3a). 34

Figura 3. Il blocco di RAGE sopprime l'aterosclerosi consolidata nei topi diabetici apo E-/-: area della lesione e complessità. Sono stati determinati la quantificazione dell'area media della lesione aterosclerotica (a) e il numero medio di lesioni complesse per sezione (b).

Inoltre, abbiamo esaminato la complessità della lesione (come definito, cappucci fibrosi, cappucci di colesterolo o necrosi della lesione) 30 in questi animali. Nei topi diabetici trattati con sRAGE da 14 settimane a 20 settimane, il numero medio di lesioni complesse era significativamente ridotto rispetto agli animali diabetici trattati con albumina sierica murina e la complessità della lesione non era significativamente diversa nei topi diabetici trattati con sRAGE a 20 settimane rispetto con topi diabetici all'età di 14 settimane (Figura 3b). 34 Una tendenza alla riduzione della complessità delle lesioni è stata osservata nei topi diabetici trattati con sRAGE all'età di 20 settimane rispetto agli animali non diabetici della stessa età, sebbene i risultati non abbiano raggiunto una significatività statistica (Figura 3b). 34 Parallelamente alla stabilizzazione dell'area e della complessità della lesione aterosclerotica, il blocco di RAGE è stato associato a una ridotta espressione vascolare della molecola di adesione delle cellule vascolari-1, del peptide-1 chemiotattico dei monociti JE, della cicloossigenasi-2, degli epitopi della nitrotirosina, della metalloproteinasi della matrice-9 (antigene e attività) e epitopi del fattore tissutale (Figura 3b). 34

Oltre alle vie biochimiche e molecolari legate all'aterosclerosi, abbiamo esaminato il contenuto di collagene all'interno delle placche aterosclerotiche utilizzando la colorazione rossa di Picrosirius e la microscopia a luce polarizzata. Il diabete è stato associato a un aumento significativo dell'estensione del collagene per lesione nei topi diabetici rispetto ai controlli non diabetici a 20 settimane di età. In presenza del blocco RAGE, è stata osservata una significativa diminuzione del contenuto di collagene per lesione rispetto a quella osservata nei topi diabetici trattati con albumina sierica murina. 34 L'entità della deposizione di collagene nei topi diabetici trattati con sRAGE non era significativamente diversa da quella osservata negli animali non diabetici della stessa età o nei topi diabetici all'età di 14 settimane. 34 Proponiamo che nel diabete, l'aumento del numero di cellule muscolari lisce e il contenuto di collagene nelle placche aterosclerotiche diabetiche, l'aumento significativo del numero di fagociti mononucleati e il notevole potenziamento dei meccanismi proinfiammatori all'interno delle lesioni riescano a bilanciare l'equilibrio tra infiammazione e stabilità della lesione. Inoltre, specialmente nelle lesioni diabetiche, l'aumento dell'espressione/attività della metalloproteinasi della matrice e la generazione dell'antigene del fattore tissutale all'interno delle placche aumenta la probabilità di progressione e instabilità della placca.

Certamente, questi concetti richiedono ulteriori test in specie distinte come maiali o primati non umani per affrontare il ruolo potenziale del blocco RAGE nella soppressione dell'instabilità della placca.

Diabete e aterosclerosi: altri modelli per testare l'impatto di RAGE

È importante notare che gli effetti del blocco RAGE sull'aterosclerosi non erano limitati ai topi apo E-/-. Un ulteriore modello murino è stato utilizzato per innescare l'ipercolesterolemia basale su cui sovrapporre lo stress iperglicemico. Quando i topi carenti del recettore LDL sono stati resi diabetici e alimentati con una dieta a base di cibo normale, non arricchito di grassi, ne è derivato un aumento dell'area della lesione aterosclerotica. Con la somministrazione di sRAGE, l'aterosclerosi accelerata è stata attenuata. 35 Questi risultati erano in contraddizione con il lavoro di Reavan et al. Questi ricercatori hanno scoperto che l'induzione del diabete da parte della streptozotocina nei topi recettore-/- LDL alimentati con una dieta ricca di grassi per un periodo di tempo prolungato non ha provocato un'accelerazione dell'aterosclerosi. 36 Ipotizziamo che le differenze tra questi 2 risultati di studio possano essere attribuite, almeno in parte, alla premessa che alla radice aortica, il grado di aterosclerosi che può essere raggiunto sia finito. Pertanto, specialmente nel corso di corsi di lunga durata nei topi alimentati con dieta occidentale, le differenze tra i gruppi diabetici e non diabetici possono diventare meno evidenti man mano che l'aterosclerosi negli animali non diabetici continua a progredire.

Inoltre, abbiamo recentemente esteso questi concetti a modelli murini di diabete di tipo 2 insulino-resistente. Per ottenere ciò, abbiamo allevato topi apo E-/- sullo sfondo db/db. Questi animali, carenti nella segnalazione del recettore della leptina, mostrano una notevole iperinsulinemia, iperglicemia e obesità. Rispetto ai compagni di cucciolata apo E-/- non diabetici, i topi apo E-/-/db/db hanno mostrato un aumento dell'aterosclerosi, che è stata ridotta con la somministrazione giornaliera di sRAGE. 37

Diabete, aterosclerosi e topi iperlipidemici: effetto di interventi distinti

I modelli murini di topi diabetici apo E e LDL recettore-/- indotti da streptozotocina sono stati utilizzati anche da altri ricercatori per testare l'impatto di percorsi e interventi distinti. Ad esempio, Lin et al hanno dimostrato che la restrizione dietetica delle glicotossine fornisce una protezione antiaterogena nei topi apo E-/- trattati con streptozotocina, questi risultati forniscono ulteriore supporto all'ipotesi AGE nel danno vascolare. Nel gruppo AGE limitato di topi diabetici apo E-/-, l'immunoistochimica ha rivelato un diminuito accumulo di AGE e recettori AGE incluso RAGE, in parallelo con un numero ridotto di cellule infiammatorie ed espressione del fattore tissutale, molecola di adesione cellulare vascolare-1 e JE -monocita chemiotattico peptide-1 nelle lesioni vascolari. 38 Levi et al hanno dimostrato che il trattamento di topi diabetici LDL recettore-/- con gamma-agonisti attivati ​​dal proliferatore dei perossisomi come il rosiglitazone attenua l'aterosclerosi in questi animali, senza influire sui livelli di glucosio nel sangue. 39 Il ruolo dell'enzima di conversione dell'angiotensina è stato studiato da Candido et al. Questi ricercatori hanno mostrato che la somministrazione di perindopril per 20 settimane previene l'aterosclerosi associata al diabete in parallelo con una ridotta espressione aortica dell'enzima di conversione dell'angiotensina, fattore di crescita del tessuto connettivo e adesione delle cellule vascolari sovraespressione della molecola-1. 40 In altri studi, Tse et al hanno testato l'impatto del 17 -estradiolo in topi diabetici apo E-/− maschi e hanno dimostrato che il trattamento cronico con 17 β-estradiolo riduceva l'area della lesione in più segmenti vascolari di questi topi, in parallelo con una diminuzione glicemia e livelli di trigliceridi. 41

Pertanto, presi insieme, tali modelli murini di aterosclerosi diabetica forniscono un modello per la dissezione delle vie molecolari legate alla patogenesi delle complicanze macrovascolari del diabete e, anche, il potenziale impatto degli interventi terapeutici.

Diabete e problema della restenosi

Studi epidemiologici indicano che nei soggetti umani con diabete, una restenosi esagerata accompagna comunemente un danno arterioso acuto, come quello indotto dall'angioplastica terapeutica. 42-44 Gli studi hanno inoltre dimostrato che lo stent del vaso trattato non offre una protezione completa dalla restenosi e dagli eventi coronarici. 42,43 Anche con il recente sviluppo di stent rivestiti con Sirolimus, non è ancora chiaro se i soggetti diabetici trarranno pieno beneficio da questa nuova terapia. 45–47

Per sezionare gli eventi biochimici e molecolari legati all'aumento della restenosi nei soggetti umani diabetici, è stato prima necessario stabilire modelli animali per affrontare prontamente questi concetti.

Studi sui ratti

I primi studi su ratti diabetici sono stati condotti su ratti Zucker obesi con diabete di tipo 2 insulino-resistente. 48 È interessante notare che, rispetto all'induzione del diabete (tipo 1) nei ratti Sprague-Dawley da parte della streptozotocina in cui l'iperplasia neointimale non era esagerata, Park et al hanno mostrato che i ratti Zucker obesi sottoposti a lesione del palloncino carotideo hanno mostrato un aumento di >2 volte nell'area neointimale rispetto con ratti magri Zucker (non diabetici) il giorno 21 dopo l'infortunio. 48 Nell'intima di questi animali, la proliferazione cellulare è notevolmente aumentata, iniziando dal giorno 3 e persistendo fino al giorno 14. Questo modello animale è stato quindi utilizzato per testare il ruolo del blocco RAGE. La somministrazione di sRAGE è iniziata appena prima della lesione arteriosa ed è proseguita per tutta la prima settimana dopo la lesione del palloncino. Rispetto al trattamento con veicolo (albumina), i ratti trattati con sRAGE hanno mostrato una significativa diminuzione dell'espansione neointimale. 49 Una scoperta chiave in questo studio è stata la marcata riduzione dell'incorporazione di bromodeossiuridina nelle cellule muscolari lisce della neointima in espansione nei ratti trattati con sRAGE. Questi esperimenti hanno fortemente suggerito che le cellule muscolari lisce che esprimono RAGE, almeno in parte, hanno contribuito in modo importante all'espansione neointimale potenziata associata al diabete dopo una lesione acuta.

Studi sui modelli murini

Questi risultati hanno suggerito che era logico analizzare ulteriormente il ruolo di RAGE nel danno arterioso. Nei modelli di ratto, tuttavia, l'incapacità di utilizzare approcci transgenici/knockout ha limitato questo approccio. Inoltre, studi diretti su modelli murini faciliterebbero il test su topi geneticamente modificati con RAGE, supportando in tal modo la premessa che l'obiettivo principale di sRAGE fosse il recettore stesso. Pertanto, per utilizzare modelli murini, è stata indotta una lesione endoteliale dell'arteria femorale acuta secondo un modello precedentemente stabilito e convalidato. 50 È stata eseguita una lesione indotta da filo guida all'arteria femorale ed è stato testato l'impatto della modificazione sia farmacologica che genetica di RAGE. RAGE e i suoi ligandi, CML-AGE e S100/calgranuline, sono stati sovraregolati nella parete del vaso femorale dopo la lesione, in particolare nelle cellule muscolari lisce. 51 Il giorno 28 dopo l'infortunio, è stata osservata una diminuzione dose-dipendente del rapporto intima/media (I/M) nei topi trattati con sRAGE rispetto al veicolo (albumina sierica murina). 51 È importante sottolineare che i topi omozigoti RAGE-/- hanno mostrato una riduzione del rapporto I/M il giorno 28 dopo l'infortunio rispetto agli animali di controllo della cucciolata sottoposti a denudazione arteriosa (Figura da 4a a 4c). Il numero di cellule muscolari lisce proliferanti era significativamente ridotto nei topi RAGE-/- rispetto ai controlli. 51

Figura 4. Topi omozigoti RAGE (0) e topi transgenici che esprimono un deficit di segnalazione di RAGE dominante negativo (DN) nelle cellule muscolari lisce mostrano una ridotta espansione neointimale conseguente a danno arterioso acuto. Topi omozigoti RAGE-/- (da a a c) e topi transgenici che esprimono selettivamente DN RAGE nelle cellule muscolari lisce (guidate dal promotore alfa SM22) (d) e cuccioli di tipo selvatico sono stati sottoposti a lesioni del filo guida dell'arteria femorale. Il rapporto intima/media è stato determinato il giorno 28 dopo l'infortunio (a, d). La colorazione elastica di Von Gieson è stata eseguita su una sezione rappresentativa dell'arteria femorale da un cuscinetto RAGE wild-type (b) e da un topo RAGE-/- (c). Barra della scala: 50 μm.

Poiché i topi omozigoti RAGE-/- non esprimono RAGE in nessun tipo di cellula, è stata utilizzata una strategia aggiuntiva per analizzare in modo specifico il ruolo delle cellule muscolari lisce RAGE nel modulare l'espansione neointimale sul danno arterioso acuto. Precedenti studi hanno mostrato che la delezione del dominio citosolico di RAGE impartiva un effetto dominante negativo (DN) quando cellule vascolari o fagocitarie mononucleate portatrici di RAGE wild-type venivano trasfettate con costrutti che codificavano DN RAGE, un effetto DN derivato dall'incubazione con RAGE ligandi come S100B o CML-AGE. 3,9 Poiché le cellule muscolari lisce erano le principali cellule che esprimono RAGE nella neointima in espansione, 51 questi concetti sono stati testati in topi transgenici che esprimono DN RAGE specificamente nelle cellule muscolari lisce guidate dal promotore SM22α. Rispetto ai compagni di cucciolata di tipo selvatico, i topi transgenici SM22 DN RAGE sottoposti a danno arterioso hanno mostrato una significativa diminuzione del rapporto I/M il giorno 28 (Figura 4d). Pertanto, questi esperimenti hanno fornito ulteriore supporto per i ruoli di RAGE nell'espansione neointimale. Oltre al blocco farmacologico di RAGE, i topi RAGE geneticamente modificati (delezione o interruzione della trasduzione del segnale delle cellule muscolari lisce) hanno mostrato una ridotta espansione neointimale innescata da lesioni.

Tuttavia, una limitazione dell'induzione di lesioni arteriose nei topi C57BL/6 è che ci sono poche prove di afflusso di cellule infiammatorie nella parete del vaso danneggiato negli animali selvatici. Per affrontare questo concetto, la lesione dell'arteria femorale è stata indotta nei topi apo E-/- sulla base della premessa che la perturbazione vascolare basale secondaria all'iperlipidemia aumenterebbe la risposta al danno arterioso, inclusa la migrazione delle cellule infiammatorie. Abbiamo scoperto che i rapporti I/M erano più alti, riflettendo una maggiore espansione neointimale nei vasi dei topi apo E-/- 28 giorni dopo l'infortunio rispetto ai topi C57BL/6 (rapporto I/M ≈2 volte più alto). 51 In topi euglicemici apo E-/-, la somministrazione di sRAGE ha diminuito il rapporto I/M il giorno 28. Parallelamente, è stato ridotto anche il numero di fagociti mononucleati che si infiltrano nell'arteria lesa. 51 Pertanto, i topi apo E-/- possono fornire un sistema superiore per testare il ruolo delle cellule muscolari lisce e dei fagociti mononucleati RAGE nella risposta al danno arterioso acuto.

Inoltre, questi studi hanno evidenziato il ruolo della segnalazione Jak/Stat dipendente da RAGE nelle cellule muscolari lisce. Nei vasi femorali dopo la lesione, sebbene sia stata osservata un'aumentata fosforilazione di ERK 1/2, protein chinasi B (akt) e Jak2/Stat3 rispetto al trattamento fittizio, sRAGE sembrava esercitare i suoi effetti solo sulla segnalazione di Jak2/Stat3. 51

Diabete e restenosi: altri modelli e interventi distinti

Sono stati testati anche modelli di roditori diabetici di lesioni arteriose per l'impatto di interventi distinti sull'espansione neointimale. Phillips et al hanno utilizzato topi apo E-/- alimentati con dieta occidentale per dimostrare che questi topi sviluppano diabete insulino-resistente la somministrazione di rosiglitazone ha impedito lo sviluppo di iperglicemia e iperinsulinemia. 52 In parallelo, l'espansione neointimale è stata ridotta del 65% dopo lesione arteriosa in topi gamma agonisti attivati ​​dal proliferatore del perossisoma (rosiglitazone) rispetto a topi apo E-/- alimentati con veicolo. Anche l'infiltrazione dei macrofagi nella neointima in espansione è stata ridotta da questo intervento. 52 Si noti che questi studi sono in contraddizione con quelli di Levi et al 39 per quanto riguarda l'effetto del rosiglitazone sull'iperglicemia. Nello specifico, negli studi di Levi, i topi apo E-/- sono stati resi francamente diabetici da una relativa carenza di insulina usando streptozotocina 39 negli studi di Phillips, l'iperglicemia è stata indotta dall'alimentazione con la dieta occidentale, causando così la resistenza all'insulina. 54

In altri studi, Min et al hanno somministrato troglitazone a ratti grassi Otsuka Long-Evans Tokushima e hanno scoperto che la proliferazione delle cellule muscolari lisce era notevolmente ridotta, in parallelo con una ridotta espansione neointimale dopo lesione del palloncino carotideo. 53 Il ruolo delle glicotossine dietetiche (AGE) sull'espansione neointimale è stato testato direttamente nei topi apo E-/- da Lin et al. I topi sono stati randomizzati a dieta ad alto o basso AGE (quest'ultimo con contenuto di AGE 10 volte inferiore) e sottoposti a lesioni dell'arteria femorale. Parallelamente alla diminuzione dell'espansione neointimale nei topi alimentati con dieta a basso AGE, il contenuto di AGE è stato ridotto nella parete del vaso danneggiato. 54

La natura complessa dei modelli murini/roditori nella dissezione della risposta biologica al danno arterioso sovrapposto all'iperglicemia cronica è stata sottolineata dagli studi di Stephenson et al. 55 Questi ricercatori hanno riferito che i topi db/db mostravano un'espansione neointimale marcatamente diminuita conseguente alla lesione del filo endoluminale dell'arteria femorale rispetto ai controlli wild-type. 55 Quattro ore dopo la lesione arteriosa acuta, la morte della muscolatura liscia mediale era ridotta nei topi db/db rispetto ai topi wild-type. Tuttavia, la proliferazione delle cellule muscolari lisce non sembra differire tra i topi db/db rispetto a quelli wild-type. 55 Questi risultati suggeriscono ruoli importanti per la leptina nella modulazione delle proprietà delle cellule muscolari lisce stimolate. Oda et al hanno riferito che la leptina stimola la fosforilazione e l'attivazione della MAP chinasi e dell'attività della fosfatidilinositolo 3-chinasi in cellule muscolari lisce in coltura, una conseguenza della quale è stata l'aumento della proliferazione e della migrazione delle cellule muscolari lisce. 56 Prese insieme, queste considerazioni sottolineano la complessità di questi sistemi modello e suggeriscono che i test preclinici di nuovi bersagli terapeutici nella restenosi richiedono in definitiva l'uso di specie come maiali, conigli o primati non umani prima di eseguire test su soggetti umani. 57,58

Conclusioni

L'obiettivo finale dei nostri studi è determinare il ruolo potenziale del blocco RAGE come strategia terapeutica nelle complicanze macrovascolari del diabete. Pertanto, lo sviluppo di modelli chiave per testare il ruolo del recettore in modo tempo-specifico e cellulare ha fornito un modello per una dissezione approfondita del ruolo di RAGE nella patologia vascolare. La scoperta che il blocco di RAGE offre benefici nei topi portatori di diabete insulino-deficiente e insulino-resistente supporta ulteriormente il ruolo di questo recettore negli stati iperglicemici. Queste considerazioni sottolineano il concetto che i prodotti degli effetti a valle dell'alto glucosio e dello stress ossidativo generano specie che sono ligandi di trasduzione del segnale del recettore.

È importante sottolineare che i meccanismi dipendenti da RAGE nella stimolazione vascolare non sono limitati al diabete. Poiché il sistema vascolare nelle placche aterosclerotiche euglicemiche è anche suscettibile allo stress ossidativo, all'infiammazione e, quindi, alla generazione di AGE, anche se in misura minore, era logico testare l'impatto del blocco RAGE.Pertanto, non è stato sorprendente che la somministrazione di sRAGE a topi euglicemici apo E-/- di età compresa tra 14 e 20 settimane abbia attenuato l'area e la complessità della lesione aterosclerotica, senza un impatto sui livelli lipidici. 34

In conclusione, questi risultati sottolineano l'utilità dei modelli di roditori, e in particolare di topi, nella dissezione dei meccanismi che collegano RAGE all'aterosclerosi accelerata e alla restenosi, in particolare nel diabete. Spinti da dati convincenti in modelli animali, proponiamo che il test del blocco RAGE in un approccio multi-mirato nel diabete possa portare a una riduzione efficace delle complicanze macrovascolari del diabete di tipo 1 e 2. Gli studi clinici per affrontare questi problemi in soggetti umani sono all'orizzonte.


REGOLAZIONE DI RAGE MEDIANTE MODULAZIONE DI PREASSEMBLAGGIO

Come indicato sopra, il preassemblaggio di RAGE è necessario per l'attivazione e la segnalazione a valle. La formazione di multimeri è favorita da elevate concentrazioni superficiali di RAGE sulla superficie cellulare. I dati disponibili hanno aiutato a sviluppare un modello per l'inizio della cascata del segnale mediante l'interazione RAGE/ligando. Tuttavia, ci sono solo dati rari sul meccanismo che blocca il segnale. Ci sono prove che diversi meccanismi controllano la concentrazione superficiale di RAGE segnale-competente e alcuni potenziali meccanismi sono descritti di seguito.

L'internalizzazione del recettore dopo l'attivazione è un meccanismo ben noto per spegnere la segnalazione di un complesso recettore/ligando attivo. L'internalizzazione delle proteine ​​S100, legandosi a RAGE in strutture granulari, è stata già osservata da Hsieh et al. [156]. L'immunofluorescenza e la colorazione istochimica di diversi tipi cellulari hanno rivelato RAGE nella membrana citoplasmatica e intracellulare, nelle strutture vescicolari o granulari [56, 157–162]. Successivamente, è stato dimostrato che il complesso RAGE/S100B è internalizzato tramite zattere lipidiche [163, 164]. Allo stesso modo, il complesso RAGE/AGE è stato internalizzato ed è stato monitorato nelle strutture vescicolari [165] (Fig. 3, in basso).

D'altra parte, la concentrazione superficiale di un recettore può essere aumentata immediatamente mediante fusione di vescicole contenenti il ​​recettore con la membrana citoplasmatica. L'endocitosi e il riciclaggio dei recettori sono descritti per una pletora di recettori e sono un processo strettamente regolato. La disregolazione del traffico dei recettori può portare a gravi disturbi, incluso il cancro [166-168]. L'evidenza dell'esposizione mediata da vescicole di RAGE sulla superficie endoteliale proviene da studi di Frommhold et al. [63, 64]. Gli autori hanno osservato che su uno stimolo proinfiammatorio, RAGE si presenta in pochi minuti sull'endotelio, agendo come controrecettore per i leucociti che innescano l'adesione e la trasmigrazione. L'apparizione quasi immediata di RAGE sulla superficie indica che non si è verificata alcuna sintesi de novo di RAGE, ma piuttosto che RAGE è stato mobilitato dai depositi interni. Tale trasporto di RAGE alla superficie è in accordo con l'osservazione di strutture vescicolari intracellulari che ospitano RAGE. Tali vescicole potrebbero essere dirette alla membrana citoplasmatica e fondersi lì, determinando un rapido aumento della concentrazione superficiale di RAGE.

Un'ulteriore opzione per modulare la segnalazione di RAGE è la produzione e la secrezione di specie RAGE solubili (esRAGE, sRAGE) mediante splicing alternativo o eliminazione del recettore. Come il recettore a lunghezza intera, il RAGE solubile può legare i ligandi di RAGE e bloccare efficacemente la segnalazione di RAGE. Nella maggior parte degli studi, si presume che RAGE solubile agisca come recettore esca, in competizione con RAGE a lunghezza intera per i ligandi. I livelli delle specie RAGE solubili devono essere strettamente controllati, poiché i cambiamenti nel livello di RAGE solubili sono associati a diabete, disturbi cardiovascolari e alcuni tipi di cancro [148, 169, 170].

Tuttavia, i livelli di RAGE solubile rimangono piuttosto bassi rispetto a RAGE a lunghezza intera [145], sollevando la questione di come le basse quantità di RAGE solubile extracellulare possano competere efficacemente con RAGE a lunghezza intera. Proponiamo che RAGE solubile non agisca come un semplice concorrente ma attenui l'attivazione di RAGE a lunghezza intera disturbando il preassemblaggio del recettore sulla superficie cellulare. È stato dimostrato che le interazioni RAGE-RAGE avvengono tramite il dominio V e C1, consentendo a sRAGE di interagire con RAGE a tutta lunghezza legato alla membrana. Gli eteromultimeri risultanti non sarebbero competenti per la segnalazione, poiché sRAGE è privo del dominio citoplasmatico. Questo modello è corroborato da studi che utilizzano un mutante di delezione di RAGE che contiene l'elica transmembrana ma manca del dominio citoplasmatico. Questa variante di RAGE ha dimostrato di esercitare un effetto dominante negativo sulla segnalazione di RAGE. La coespressione di questo mutante di delezione citoplasmatica con RAGE a lunghezza intera potrebbe abrogare la segnalazione di RAGE, sebbene siano presenti molecole recettoriali intatte. Questo fenotipo dominante-negativo è facilmente spiegato dalla formazione di eterodimeri non funzionali tra la forma troncata e quella intera di RAGE. È ragionevole supporre che RAGE solubile, privo di membrana e dominio citoplasmatico, formi eteromultimeri incompetenti nel segnale simili con RAGE a lunghezza intera (Fig. 3, in basso).

Due ulteriori varianti di splicing alternative espresse a livelli osservabili mostrano delezioni o inserzioni nel dominio extracellulare di legame del ligando e non sono, quindi, in grado di legare i ligandi di RAGE [148]. Poiché le interazioni omofile di RAGE sono mediate oltre che tramite il dominio C1, è molto probabile che queste varianti siano ancora in grado di formare eterodimeri con RAGE a lunghezza intera. Di conseguenza, questi multimeri recettoriali potrebbero non essere attivati, poiché i ligandi si legano solo a una frazione delle molecole legate alla membrana e non riescono a stabilizzare un complesso segnale-competente.


Discussione

Nel presente studio sono stati ottenuti tre risultati principali. Innanzitutto, RAGE, S100A8 e S100A9 sono stati sovraespressi in IPAH e HPAH-PASMC in assenza di qualsiasi stimolo di crescita esterno. In secondo luogo, PDGF-BB ha sovraregolato l'espressione di RAGE in IPAH e HPAH-PASMC. Terzo, AS-1, un inibitore della segnalazione RAGE, ha inibito significativamente la crescita eccessiva in condizioni di assenza di stimolazione della crescita e proliferazione stimolata da PDGF di IPAH e HPAH-PASMC. RAGE svolge un ruolo importante nell'aumento inappropriato di PAH-PASMC e la sua inibizione potrebbe essere una nuova strategia terapeutica per la PAH.

Diversi ricercatori hanno riportato che i livelli di espressione di RAGE erano aumentati nel siero o nel plasma, nelle piccole arterie polmonari e nelle PASMC di pazienti con PAH [9, 19, 20]. Qui, abbiamo dimostrato che RAGE era sovraespresso nei PASMC non solo dei pazienti con IPAH ma anche dei pazienti con HPAH, compresi i pazienti con BMPR2 mutazione e SMAD9 mutazione. Pertanto, RAGE è un fattore esacerbante comune nella PAH. Per quanto riguarda i ligandi per RAGE, Greenway et al. hanno riferito che S100A4/Mts1 è stato espresso nelle cellule muscolari lisce di lesioni che mostrano formazione neointimale e con maggiore intensità nei vasi con neointima occlusiva e lesioni plessiformi di pazienti con ipertensione polmonare secondaria a cardiopatia congenita [21]. Meloche et al. hanno riportato che l'attivazione di RAGE da parte di S100A4 ha diminuito l'espressione di BMPR2 nelle PASMC umane [9]. Abbiamo dimostrato che anche S100A8 e A9 erano sovraespressi in IPAH e HPAH-PASMC. Abbiamo precedentemente riportato che S100A8/A9 induceva la fosforilazione di RAGE e portava all'attivazione di diversi effettori di segnale come Rac1, Akt, p38, JNK, IKK e NFkB nelle cellule HEK293 e 293-hMD2-CD14 [6]. Sono necessari ulteriori studi per chiarire il ruolo preciso di S100A8 e A9 nella patogenesi della PAH.

Abbiamo precedentemente riportato che la stimolazione del PDGF-BB ha causato un tasso di crescita più elevato delle PASMC coltivate da pazienti con IPAH rispetto a quello delle cellule di controllo [3, 10]. Qui abbiamo dimostrato che PDGF-BB ha anche sovraregolato l'espressione di RAGE in IPAH e HPAH-PASMC.

Abbiamo recentemente riportato che la proteina adattatrice contenente il dominio del recettore Toll/IL-1 (TIR) ​​(TIRAP) trasduce la segnalazione di RAGE e che l'interazione funzionale tra RAGE e TLR regola in modo coordinato l'infiammazione, la risposta immunitaria e altre funzioni cellulari [6]. Un mimetico sintetico TIR/BB-Loop a basso peso molecolare, AS-1, inibisce la segnalazione mediata dal dominio TIR [22]. AS-1 infine inibisce la segnalazione di RAGE. AS-1, un inibitore della segnalazione RAGE, ha inibito significativamente la crescita eccessiva in condizioni di assenza di stimolazione della crescita e proliferazione stimolata da PDGF di IPAH e HPAH-PASMC.

Questo studio è stato condotto su una piccola popolazione di pazienti. Pertanto, non è stato possibile eseguire l'analisi quantitativa della colorazione. Questa è una limitazione dello studio. Sono necessari ulteriori studi.

In conclusione, RAGE gioca un ruolo cruciale nell'aumento inappropriato di PAH-PASMC. L'inibizione della segnalazione di RAGE può essere una nuova strategia terapeutica per la PAH.


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