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Confronto delle serie temporali di espressione genica in vitro e in vivo

Confronto delle serie temporali di espressione genica in vitro e in vivo



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Devo analizzare due set di dati costituiti da misurazioni di serie temporali dell'espressione genica. Un insieme sono in vivo dati dai profili di espressione ottenuti da pochi giorni prima della nascita a diversi giorni dopo il parto. Il secondo set di dati è stato ottenuto in una linea cellulare C2C12, dove t = 0 è stato definito come il giorno in cui è stata raggiunta la confluenza del 100%.

Esiste un modo ottimale per allineare le due serie temporali? Il semplice allineamento delle due serie utilizzando i due campioni t= 0 come punto di partenza sembra arbitrario.


Il confronto diretto del corso sarebbe difficile tra tessuti e cellule coltivate. Invece della scala temporale, potresti voler usare i marcatori. Ad esempio, Kislinger et al. mostrare che il picco di espressione di SIX1 è 2 giorni dopo la differenziazione; SMAD3, 4 giorni. Non sono la persona giusta che può dire quali marcatori sono buoni, ma credo che potresti trovare maggiori informazioni tramite la ricerca nella letteratura.

http://www.mcponline.org/content/4/7/887.full


Confronto dell'espressione genica durante lo sviluppo della retina postnatale in vivo e in vitro

Gli espianti di retina sono ampiamente utilizzati come modello di sviluppo neurale. Per definire le basi molecolari delle differenze tra lo sviluppo della retina in vivo e in vitro durante il primo periodo postnatale, abbiamo effettuato una serie di confronti di microarray utilizzando retine di topo. Circa il 75% di 8.880 geni espressi da espianti di retina ha mantenuto lo stesso volume di espressione e pattern della retina in vivo. Meno del 6% della popolazione genica totale è stata modificata in due momenti consecutivi e solo l'1% circa dei geni ha mostrato un cambiamento più di tre volte in qualsiasi momento studiato. La mappatura dell'ontologia genica funzionale (GO) sia per i geni modificati che per quelli invariati ha mostrato modelli di distribuzione simili, tranne per il fatto che sono stati modificati più geni nei cluster GO di risposta agli stimoli e metabolismo dei carboidrati. Negli espianti di retina sono stati osservati tre distinti modelli di espressione dei geni espressi preferenzialmente nei fotorecettori dei bastoncelli. Alcuni geni hanno mostrato un ritardo nell'aumento dell'espressione, alcuni non hanno mostrato alcun cambiamento e alcuni hanno continuato ad avere un livello di espressione ridotto. Una downregulation precoce della ciclina D1 nella retina espiantata potrebbe spiegare la riduzione del numero di precursori nella retina espiantata e suggerisce che sono necessari fattori esterni per il mantenimento della ciclina D1. La visione globale dei profili genici presentati in questo studio aiuterà a definire i cambiamenti molecolari negli espianti di retina nel tempo e fornirà criteri per definire cambiamenti futuri che migliorino questo sistema modello.


Fecondazione in vitro

La fecondazione in vitro (FIV) è una serie di procedure utilizzate per trattare la fertilità o problemi genetici e assistere il concepimento di un bambino. Il processo è in vitro (latino per in vetro), in contrasto con in vivo (latino per in qualcosa di vivo), perché la fecondazione avviene al di fuori del corpo. Un ciclo di fecondazione in vitro prevede 1) somministrazione di ormone follicolo-stimolante (FSH) per stimolare la produzione di follicoli nelle ovaie 2) estrazione di ovuli maturi dalle ovaie di una donna, 3) prelievo di un campione di sperma da un uomo e quindi 4) fecondazione manuale dell'uovo dallo sperma per produrre un embrione in un piatto da laboratorio. Uno o più embrioni vengono impiantati nell'utero. Il ciclo di fecondazione in vitro dura circa due settimane. Anche gli ovuli e gli embrioni di una procedura di fecondazione in vitro possono essere congelati. Perché avviene il contatto tra gameti e avviene la fecondazione, la prole ha ancora il DNA derivato da genitori sia maschi che femmine. Il primo essere umano concepito come risultato della fecondazione in vitro (il primo “bambino in provetta”) è nato nel 1978. Il CDC ora stima che l'1,5% dei bambini nati negli Stati Uniti sia concepito utilizzando le tecnologie di riproduzione assistita (ART).

La fecondazione in vitro può essere eseguita con gli ovuli di una donna e lo sperma di un maschio, oppure può coinvolgere ovuli, sperma o embrioni di un donatore che può essere noto o anonimo. In alcuni casi, una donna che non è la donatrice di ovuli può fungere da portatrice o surrogata facendo impiantare un embrione nel suo utero.


Espressione genica negli embrioni bovini preimpianto prodotti in vitro

Recenti studi hanno dimostrato la rilevanza di un profilo di espressione genica come caratteristica chiave clinicamente importante che determina la qualità dell'embrione durante il periodo preimpianto in vitro. Sebbene l'origine dell'ovocita possa svolgere un ruolo cruciale nella produzione di blastocisti, il periodo di coltura post-fertilizzazione ha un profondo effetto nel determinare la qualità della blastocisti con particolare riguardo all'abbondanza relativa di molti geni candidati importanti dal punto di vista dello sviluppo e clinicamente. Durante il periodo preimpianto, l'embrione subisce diversi eventi di sviluppo morfogenetico tra cui la maturazione dell'ovocita, le forme minori e maggiori di attivazione del genoma embrionale e la transizione della trascrizione dal controllo materno a quello embrionale. L'effetto di un pattern di espressione genica alterato sugli embrioni bovini prodotti in vitro, in particolare quando coltivati ​​in condizioni subottimali, è stato riflesso dal verificarsi di fenomeni clinicamente importanti come l'apoptosi e la sindrome della grande prole. Questa recensione tenta di concentrarsi sullo sviluppo morfogenetico dell'embrione e sul profilo di espressione genica negli embrioni bovini prodotti in vitro, con particolare enfasi sui diversi parametri che possono alterare il modello di espressione genica durante il periodo critico della coltura in vitro. Viene anche discusso l'effetto del sistema in vitro, come riflesso da alcuni fenomeni clinicamente importanti come l'apoptosi.


Astratto

Nuovi polimeri dendron iperramificati (HD) sono stati sintetizzati utilizzando un nucleo di poli(etileneimina) a basso peso molecolare (BPEI). Usando il successivo attacco di porzioni di etilenimmina al nucleo di PEI, il rapporto relativo delle strutture lineari e ramificate è stato abbassato da 1,17 a 0,70. Abbiamo scoperto che la ramificazione più ampia di PEI consente la condensazione del DNA plasmidico in nanostrutture con una dimensione di 70-100 nm. I complessi ottenuti erano stabili almeno per 3 settimane a 4°C. I complessi HD-DNA preparati utilizzando dendroni contenenti ammine secondarie e terziarie hanno esercitato una citotossicità molto bassa in vitro durante una co-incubazione con cellule per 48 ore. Usando la luciferasi di lucciola come marker dell'espressione proteica, abbiamo stabilito che i complessi HD erano efficienti nella trasfezione delle cellule in presenza di siero. In condizioni ottimizzate, l'attività di trasfezione con un rapporto azoto-fosfato (N/P) di 6 era circa sei volte superiore a quella del reagente di trasfezione policationico disponibile in commercio. L'imaging bioluminescente dell'espressione genica in vivo utilizzando un gene reporter della luciferasi ha mostrato l'aumento del segnale nel fegato e nei linfonodi sottomandibolari nei topi vivi. I nostri dati preliminari sull'espressione genica in vivo dimostrano il potenziale dei polimeri HD come agenti di trasfezione in vivo che potrebbero essere potenzialmente utili per la consegna del gene dei linfonodi.


Conclusioni e direzioni future

Poiché la biologia sintetica si unisce ad altri campi medici e scientifici per affrontare le sfide globali, come la fornitura di diagnostica a basso costo e rapidamente implementabile, il successo continuerà a essere trovato nelle interfacce tra le discipline. Un esempio può includere l'uso della tecnologia per aumentare i circuiti genetici, come l'interruttore del toehold, con l'hardware. Come discusso qui, gli approcci ingegneristici della biologia sintetica hanno il potenziale per far avanzare in modo significativo la traduzione di tecnologie promettenti in strumenti pragmatici adatti per applicazioni del mondo reale. La piattaforma cartacea è destinata a svolgere un ruolo di primo piano nelle applicazioni in vitro perché soddisfa la necessità di strumenti diagnostici a basso costo, pratici e semplici da utilizzare al di fuori del laboratorio e il concetto sottostante può essere fuso con altre tecnologie e esteso in direzioni nuove ed entusiasmanti. Inoltre, i sensori in vivo esistenti inizieranno a passare dai loro attuali modelli di ricerca alle applicazioni per i pazienti per il monitoraggio in tempo reale e la diagnosi precoce e personalizzata. È anche interessante immaginare la biologia sintetica in vitro incorporata in dispositivi diagnostici indossabili per pazienti, personale medico, personale militare o persino atleti, consentendo il rilevamento sia personale che ambientale. I dispositivi indossabili a base biologica potrebbero anche fungere da interfaccia per la diagnostica in vivo, avvisando i pazienti con condizioni preesistenti dei cambiamenti presintomatici nella fisiologia. In definitiva, sarà la creatività incarnata nella biologia sintetica collaborativa che guiderà questo campo nel futuro.


4. DISCUSSIONE

Il presente studio mirava a determinare se il carico meccanico di C2C12 SkM bioingegnerizzato con fibrina in vitro ricapitola la firma trascrizionale e di metilazione del DNA di SkM umano e roditore dopo RE in vivo. I dati qui presentati suggeriscono che il caricamento meccanico di SkM bioingegnerizzato nel topo in vitro ha indotto risposte trascrizionali comparabili a SKM umano e roditore dopo RE in vivo. Tuttavia, mentre alcune modifiche della metilazione del DNA sono state rilevate dopo il caricamento, tali modifiche non imitavano da vicino la risposta della metilazione del DNA all'RE acuto nell'uomo.

Il presente studio ha prima cercato di convalidare se il caricamento meccanico di SkM bioingegnerizzato di topo utilizzando il bioreattore qui impiegato fosse in grado di evocare una risposta meccano-trascrizionale, simile a quella precedentemente osservata utilizzando sistemi di bioreattori consolidati. Infatti, sono stati osservati aumenti nei geni meccano-sensibili, IGF-IEa, MGF e MMP-9, insieme a un modesto aumento di IGF-I, come precedentemente riportato in seguito al caricamento nel muscolo bioingegnerizzato a matrice di collagene (Aguilar-Agon et al. ., 2019 Cheema et al., 2005 Player et al., 2014). Per confrontare direttamente la risposta trascrizionale e di metilazione del DNA al carico meccanico nel muscolo bioingegnerizzato di topo con quella osservata dopo RE acuta nel muscolo umano e di roditore, l'espressione dell'mRNA di geni che sono stati recentemente identificati per dimostrare la metilazione differenziale (dopo un'analisi imparziale del DNA dell'intero genoma metilazione) e le corrispondenti alterazioni nell'espressione genica post RE nell'uomo (Seaborne et al., 2018a, 2018b) sono state analizzate dopo il caricamento. È interessante notare che il 93% (14 su 15 geni, inclusi UBR5, ODF2, RSU1, SETD3, GRIK2, RPL35a, AXIN1, TRAF1, STAG1, PLA2G16, KLHDC1, HEG1, AFF3, ZFP2 e BICC1) di questi geni non ha mostrato differenze significative nell'espressione genica tra muscolo bioingegnerizzato di topo caricato e muscolo umano a 0,5 ore dopo il caricamento e RE, rispettivamente. Inoltre, non sono state osservate differenze tra muscolo bioingegnerizzato caricato e RT programmata nei roditori per nessuno di questi geni. Nel complesso, suggerendo cambiamenti di espressione genica simili nel muscolo bioingegnerizzato caricato meccanicamente a quello osservato nel muscolo umano e di ratto dopo RE in vivo. Nel tentativo di identificare se il carico meccanico del muscolo bioingegnerizzato imitava il profilo di espressione genica temporale dopo RE acuta negli esseri umani per un periodo di tempo più lungo, l'espressione di mRNA di geni che erano sovraregolati attraverso set di dati di trascrittoma pubblicati RE post-acuta negli esseri umani (Turner et al. , 2019b) con la corrispondente ipometilazione degli stessi geni (Seaborne et al., 2018b, 2018a) sono stati analizzati in SkM bioingegnerizzato caricato. Questi geni sono stati quindi analizzati a 0,5, 3 e 24 ore dopo il caricamento nel muscolo di topo bioingegnerizzato per consentire un confronto diretto con l'uomo dopo RE acuto. Innanzitutto, la maggior parte di questi geni aumentava prevalentemente a 3 ore dopo il caricamento e tornava ai livelli basali a 24 ore. Questo profilo di regolazione del gene temporale è stato osservato più volte in risposta all'esercizio in vivo in cui l'espressione genica tende a raggiungere il picco 3-8 ore dopo l'esercizio (Barrès et al., 2012 Chen et al., 2002 Drummond et al., 2008 Knuiman et al., 2018 Kuang et al., 2020) e generalmente ritorna ai livelli basali entro 24 ore (Egan & Zierath, 2012 Liu et al., 2010 Yang et al., 2005). Confrontando i cambiamenti nell'espressione genica a 3 h con i dati del trascrittoma umano, l'83% di questi geni (MSN, CTTN, FLNB, TIMP3, ITGB3, LAMA5, COL4A1, CRK, CD63, GSK3β, SMAD3, WNT9A, ITPR, STAT3, RARA, F2LR3, KDR, DOT1L) non hanno mostrato differenze significative nell'espressione tra muscolo bioingegnerizzato di topo caricato e muscolo umano dopo RE acuta. L'espressione genica per questi geni è stata anche confrontata tra muscolo bioingegnerizzato caricato e RT nei roditori in vivo. È interessante notare che solo 2 geni su 22 erano statisticamente diversi, il che suggerisce che il 91% ha risposto in modo simile tra il tessuto muscolare bioingegnerizzato e quello dei roditori. Nel complesso, insieme ai dati sopra menzionati, questi risultati suggeriscono che il caricamento meccanico nel muscolo bioingegnerizzato di topo ricapitola sufficientemente la risposta trascrizionale di SkM dopo RE in vivo.

Vale anche la pena sottolineare che l'ubiquitina ligasi E3, UBR5, era il gene più sovraregolato a 3 ore dopo il caricamento nel solo muscolo bioingegnerizzato rispetto a qualsiasi gene analizzato nel presente manoscritto, aumentato significativamente di 1,77 volte a 0,5 ore e 2,34- piega a 3 h. È interessante notare che questa ubiquitina ligasi E3 del dominio HECT è stata ipometilata e sovraregolata dopo RE acuta e cronica in partecipanti umani non addestrati, con una maggiore ipometilazione ed espressione genica dopo un successivo riaddestramento (Seaborne et al., 2018a, 2018b, 2019). Tali alterazioni sono state correlate positivamente con i cambiamenti nella massa magra (Seaborne et al., 2018a, 2018b, 2019). Nel muscolo dei roditori, un lavoro recente ha anche confermato che l'espressione del gene UBR5 e i livelli proteici aumentano in risposta all'ipertrofia in vivo, senza cambiamenti osservati nelle ben caratterizzate ligasi atrogene E3, MuRF1 e MAFbx (Seaborne et al., 2019). Inoltre, il suo ruolo nella regolazione della massa muscolare è stato recentemente determinato per mezzo del quale l'RNAi induce il silenziamento in Drosophila risultati in larve di dimensioni più piccole (Hunt et al., 2019) e RNAi elettroporati nel muscolo TA di topo in vivo portano all'atrofia attraverso la sintesi proteica ridotta e la segnalazione disfunzionale ERK/Akt (Hughes et al., 2020). Nel loro insieme, tali dati supportano l'idea che UBR5 sia importante per l'anabolismo e l'ipertrofia indotti dal carico. È interessante notare che l'espressione del gene UBR5 è aumentata in misura simile a 0,5 ore dopo il caricamento in C2C12 SkM bioingegnerizzato (1,77 volte) con quella RE post-acuta osservata nel tessuto SkM umano (

1,7 volte Seaborne et al., 2018a, 2019), a seguito di RT programmata nei ratti (1,5 volte Seaborne et al., 2019) e a 3 ore dal carico meccanico in miotubi umani in monostrato (1,6 volte, dati non pubblicati dal nostro gruppo). Tuttavia, nel presente studio non è stata osservata alcuna ipometilazione corrispondente dopo il caricamento nel muscolo bioingegnerizzato. In effetti, GRIK2 era l'unico gene che era significativamente ipometilato dopo il caricamento. Tali risultati sono interessanti dato che GRIK2 è stato significativamente ipometilato dopo un singolo periodo di esercizio in vivo, che è stato mantenuto

22 settimane dopo durante l'addestramento, il detraining e il retraining (Seaborne et al., 2018b), indicativo di una firma di memoria epigenetica. Inoltre, la recente analisi del metiloma del sovraccarico acuto nel muscolo plantare di topo ha rivelato un'ipometilazione specifica della regione intronica dei geni GRIK3 e GRIK4 rispettivamente nei mionuclei e nelle cellule interstiziali (Von Walden et al., 2020), suggestiva di un ruolo specifico delle cellule della famiglia GRIK geni in risposta all'esercizio/carico. Infine, TRAF1, MSN e CTTN erano significativamente ipermetilati, in contrasto con l'ipometilazione osservata nel muscolo umano. La mancanza di cambiamenti nella metilazione del DNA, tuttavia, è interessante dato che il programma trascrizionale era ancora simile. Una spiegazione può implicare la necessità di contrazioni concentriche poiché il modello impiegato qui assomiglia solo all'allungamento eccentrico del muscolo bioingegnerizzato. Pertanto, questi dati potrebbero suggerire che l'input neurale indotto dalla contrazione concentrica potrebbe essere un driver più potente delle perturbazioni della metilazione del DNA in risposta all'esercizio in vivo. Infatti, le contrazioni concentriche attive richiedono un sostanziale ciclo delle concentrazioni di calcio citosolico. Questo segnale di calcio potrebbe guidare la fosforilazione della proteina 2 legante il metil CpG (MeCP2) associata all'induzione di alterazioni nella metilazione del DNA (recensione in Seaborne & Sharples, 2020). L'assenza di prodotti secretori da altri tipi di cellule all'interno del C2C12 i costrutti muscolari bioingegnerizzati possono anche spiegare parzialmente la risposta epigenetica differenziale a RE in vivo poiché lavori recenti riportano che la comunicazione tra vescicole extracellulari e miofibre influenza la risposta al carico nel muscolo del topo (Murach et al., 2020). Per contestare questa ipotesi, studi futuri, forse con l'inclusione della stimolazione elettrica per guidare la contrazione concentrica e l'uso di roditori (Khodabukus & Baar, 2015c) o cellule derivate da muscoli primari umani (Martin et al., 2013) sarebbero una strada importante di ricerca (rivisto in Kasper et al., 2018).


Confronto dell'espressione genica globale tra xenotrapianti di tessuto testicolare suino e testicolo suino in situ

Centro per la transgenesi animale e la ricerca sulle cellule germinali, 147 Myrin Building, New Bolton Center, University of Pennsylvania, 382 West Street Road, Kennett Square, PA 19348. Cerca altri articoli di questo autore

Centro per la transgenesi animale e la ricerca sulle cellule germinali, Scuola di medicina veterinaria, Università della Pennsylvania, Kennett Square, Pennsylvania

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Dipartimento di Biologia, Università della Pennsylvania, Filadelfia, Pennsylvania

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Astratto

Il tessuto testicolare di animali donatori di mammiferi immaturi, innestato ectopicamente in ospiti di topo immunodeficienti, può subire una spermatogenesi completa con la produzione di spermatozoi competenti per la fecondazione. Per caratterizzare ulteriormente gli xenotrapianti di tessuto testicolare come modello per la funzione testicolare in situ, l'obiettivo di questo studio era confrontare l'espressione genica tra xenotrapianti di tessuto testicolare suino e tessuto testicolare in situ. Pezzi di tessuto testicolare di maialini di 1 settimana sono stati innestati su topi maschi immunodeficienti ed è stato allevato un suinetto figliato per il confronto come controllo. La spermatogenesi completa era presente negli xenotrapianti di tessuto testicolare a 8 mesi dopo il trapianto in ospiti di topo e nel tessuto testicolare suino di controllo di 8 mesi. L'RNA totale è stato isolato da xenotrapianti e tessuto di controllo e l'RNA è stato etichettato e ibridato alla matrice del genoma suino. Analizzando l'espressione di 23.256 trascritti, abbiamo scoperto che 71 geni erano espressi in modo differenziale con una differenza almeno quadrupla tra xenotrapianti e tessuto di controllo. È interessante notare che nessuna delle 56 trascrizioni presenti sull'array che sono state annotate nel testicolo suino ha mostrato un'espressione differenziale tra xenotrapianti e testicolo di controllo. Questa analisi indica che l'espressione genica globale negli xenotrapianti di testicolo suino appare paragonabile al tessuto testicolare in situ. Questi risultati supportano l'ipotesi che gli xenotrapianti di tessuto testicolare possano fornire un modello rappresentativo per studiare la spermatogenesi dei mammiferi. Mol. Riprod. Dev. 74: 674–679, 2007. © 2006 Wiley-Liss, Inc.


RISULTATI

Marcatori di identità regionale nell'intestino fetale umano

Molti geni con identità regionale differenziale nell'intestino tenue sono stati identificati nell'intestino dell'uomo adulto e del topo, dove l'espressione genica riflette la funzione intestinale specifica della regione adulta, nonché nell'intestino murino in via di sviluppo.Tuttavia, nell'intestino umano in via di sviluppo/fetale, i geni corrispondenti alla funzione adulta sono espressi a livelli molto bassi (Finkbeiner et al., 2015b), e quindi i marcatori dello stadio adulto non identificano fedelmente l'identità regionale nell'embrione. Fortunatamente, diversi marcatori di identità regionale sono stati descritti nell'intestino fetale di topo (Battle et al., 2008 Dusing et al., 2001 Gao e Kaestner, 2010 Sherwood et al., 2009). Per identificare una coorte di marcatori che sono espressi a livello regionale nell'intestino umano, abbiamo valutato l'espressione di geni e proteine ​​ortologhe a quelle arricchite nelle regioni embrionali di topo mediante qRT-PCR, sul posto ibridazione e colorazione immunofluorescente (Fig. 1 n=5, campioni biologici indipendenti che vanno da 14-19 settimane di gestazione). Sono stati prelevati intestini da feti umani e divisi in terzi, corrispondenti alle regioni prossimale, media e distale dell'intestino tenue. Abbiamo osservato che PDX1 e TM4SF4 sono stati arricchiti nell'intestino prossimale, simile all'intestino prossimale embrionale di topo (Sherwood et al., 2011), mentre l'espressione di GATA4 e ONECUT2 hanno mostrato tendenze non statisticamente significative di maggiore espressione nell'intestino umano prossimale (Fig. 1A). Da notare che alcuni campioni individuali avevano un'espressione specifica della regione più pronunciata di GATA4 e ONECUT2 quando sono state esaminate le repliche tecniche (Fig. S1) ed è stata confermata l'espressione regionale specifica per ONECUT2 usando sul posto ibridazione (Fig. 1C), suggerendo che l'espressione genica specifica della regione può essere dinamica nel tempo o può variare in modo significativo tra i campioni biologici, tuttavia, saranno necessari ulteriori studi in ogni momento per valutare in modo più conclusivo la variazione biologica o i cambiamenti dipendenti dal tempo. Guca2a, Osr2, Muc2, Fzd10, Cib2 e diversi geni Hox hanno livelli di espressione genica distale più elevati nei topi (Gao e Kaestner, 2010 Sherwood et al., 2009). Nell'intestino fetale umano, GUCA2A, OSR2 e MUC2 ha mostrato una maggiore espressione nell'intestino tenue distale (Fig. 1B), insieme a HOXB6 (Fig. S1). Abbiamo confermato l'arricchimento prossimale di PDX1 e ONECUT2 e l'arricchimento distale di MUC2 e GUCA2A utilizzando l'immunofluorescenza e sul posto ibridazione (Fig. 1C). Insieme, questi dati identificano una coorte di marcatori molecolari che sono espressi a livello regionale nell'intestino tenue fetale umano e dimostrano che alcuni di questi identificatori regionali sono conservati tra il topo e l'intestino tenue fetale umano.

Identificazione di marcatori molecolari espressi a livello regionale nell'intestino fetale umano. (A) Geni noti per essere arricchiti nell'intestino di topo in via di sviluppo prossimale, incluso PDX1, GATA4, TM4SF4 e ONECUT2 sono stati esaminati in diverse regioni dell'intestino fetale umano (n=5 campioni biologici individuali prossimale, blu medio, rosso distale, verde). (B) I geni sanno di essere arricchiti nell'intestino distale di topo in via di sviluppo, incluso GUCA2A, OSR2, MUC2 e FZD10 sono stati esaminati in diverse regioni dell'intestino fetale umano (n=5 campioni biologici individuali prossimale, blu medio, rosso distale, verde). (C) Arricchimento della proteina PDX1 e GATA4 come valutato mediante immunofluorescenza e of ONECUT2 mRNA come valutato da sul posto l'ibridazione è stata confermata nella regione prossimale dell'intestino fetale, mentre GUCA2A L'mRNA e la proteina MUC2 sono stati arricchiti nell'intestino fetale distale quando valutati da sul posto ibridazione e immunofluorescenza, rispettivamente. Barre di scala: 200 μm.

Identificazione di marcatori molecolari espressi a livello regionale nell'intestino fetale umano. (A) Geni noti per essere arricchiti nell'intestino di topo in via di sviluppo prossimale, incluso PDX1, GATA4, TM4SF4 e ONECUT2 sono stati esaminati in diverse regioni dell'intestino fetale umano (n=5 campioni biologici individuali prossimali, blu medio, rosso distale, verde). (B) I geni sanno di essere arricchiti nell'intestino distale di topo in via di sviluppo, incluso GUCA2A, OSR2, MUC2 e FZD10 sono stati esaminati in diverse regioni dell'intestino fetale umano (n=5 campioni biologici individuali prossimali, blu medio, rosso distale, verde). (C) Arricchimento della proteina PDX1 e GATA4 come valutato mediante immunofluorescenza e of ONECUT2 mRNA come valutato da sul posto l'ibridazione è stata confermata nella regione prossimale dell'intestino fetale, mentre GUCA2A L'mRNA e la proteina MUC2 sono stati arricchiti nell'intestino fetale distale quando valutati da sul posto ibridazione e immunofluorescenza, rispettivamente. Barre di scala: 200 μm.

La segnalazione prolungata di WNT/FGF distalizza gli organoidi intestinali derivati ​​da hESC

Per esaminare gli effetti della segnalazione di WNT e FGF sullo sviluppo del tessuto intestinale umano, abbiamo sfruttato il sistema di coltura degli organoidi intestinali derivato da hESC (Spence et al., 2011). Le hESC sono state esposte all'activina A per 3 giorni per indurre l'endoderma, che è stato poi esposto a mezzi arricchiti con CHIR99021/FGF4 per indurre la formazione di sferoidi dell'intestino medio/hindgut, come descritto in precedenza (Finkbeiner et al., 2015a,b Xue et al., 2013 ). Gli sferoidi hanno iniziato a germogliare dalle colture monostrato dopo 4 giorni e hanno generato continuamente nuovi sferoidi per oltre 10 giorni, tuttavia, l'incubazione oltre i 10 giorni ha prodotto molti meno sferoidi (dati non mostrati). Gli sferoidi sono stati raccolti dalle colture dopo 5 giorni (d5), 7 giorni (d7) o 10 giorni (d10) e incorporati in matrigel (Fig. 2A). Gli sferoidi sono stati espansi in organoidi intestinali umani più grandi per 30-35 giorni in un mezzo di crescita intestinale contenente EGF, zucca e R-spondina 2 (Fig. 2A). qRT-PCR eseguita su tessuti raccolti a stadi progressivi di differenziazione degli organoidi, tra cui hESC indifferenziate, endoderma definitivo, tessuto dell'intestino posteriore dopo 4 giorni di CHIR99021/FGF4 e organoidi generati dopo d5, d7 e d10, ha mostrato l'espressione di pluripotenza prevista dell'mRNA specifico per lo stadio geni (OTTOBRE4), geni dell'endoderma (FOXA2, SOX17) e il gene della specificazione dell'intestino medio e intestinale CDX2 (Fig. 2B).

Gli organoidi intestinali umani sono modellati dalla segnalazione di FGF e WNT. (A) Schema del disegno sperimentale che mostra sferoidi generati in coltura per periodi di tempo crescenti. (B) Espressione di OTTOBRE4, FOXA2, SOX17 e CDX2 durante la differenziazione nelle hESC indifferenziate, nell'endoderma e nell'intestino posteriore (4 giorni dopo FGF4/CHIR99021) e negli organoidi derivati ​​da colture d5, d7 e d10 (d5, blu d7, rosso d10, verde). (C) Marcatori che si sono dimostrati arricchiti nel duodeno fetale umano (Fig. 1), incluso PDX1, GATA4, TM4SF4 e ONECUT2 sono stati esaminati negli organoidi d5, d7 e d10. (D) Marcatori che si sono dimostrati arricchiti nell'ileo fetale umano (Fig. 1), tra cui MUC2, OSR2, MUC2 e FZD10 sono stati esaminati negli organoidi d5, d7 e d10. (E) L'immunofluorescenza ha dimostrato che l'espressione della proteina PDX1 è stata arricchita negli organoidi d5, mentre l'espressione della proteina MUC2 è stata arricchita negli organoidi d7 e d10. Barre di scala: 200 μm.

Gli organoidi intestinali umani sono modellati dalla segnalazione di FGF e WNT. (A) Schema del disegno sperimentale che mostra sferoidi generati in coltura per periodi di tempo crescenti. (B) Espressione di OTTOBRE4, FOXA2, SOX17 e CDX2 durante la differenziazione nelle hESC indifferenziate, nell'endoderma e nell'intestino posteriore (4 giorni dopo FGF4/CHIR99021) e negli organoidi derivati ​​da colture d5, d7 e d10 (d5, blu d7, rosso d10, verde). (C) Marcatori che si sono dimostrati arricchiti nel duodeno fetale umano (Fig. 1), incluso PDX1, GATA4, TM4SF4 e ONECUT2 sono stati esaminati negli organoidi d5, d7 e d10. (D) Marcatori che si sono dimostrati arricchiti nell'ileo fetale umano (Fig. 1), tra cui MUC2, OSR2, MUC2 e FZD10 sono stati esaminati negli organoidi d5, d7 e d10. (E) L'immunofluorescenza ha dimostrato che l'espressione della proteina PDX1 è stata arricchita negli organoidi d5, mentre l'espressione della proteina MUC2 è stata arricchita negli organoidi d7 e d10. Barre di scala: 200 μm.

Successivamente abbiamo valutato gli effetti dell'esposizione del DE umano a CHIR99021 e FGF4 per diverse lunghezze di tempo ed esaminato l'espressione di marcatori specifici della regione dell'intestino umano in via di sviluppo identificato in Fig. 1. Simile all'intestino fetale umano, abbiamo scoperto che d5 organoidi umani avevano un'espressione significativamente più alta dei geni marcatori di identità prossimali PDX1, TM4SF4, GATA4 e ONECUT2 rispetto agli organoidi d7 e d10 (Fig. 2C). Al contrario, geni intestinali arricchiti distalmente GUCA2A, OSR2 e MUC2 sono stati espressi a livelli significativamente più alti negli organoidi d10 rispetto agli organoidi d5 e d7 (Fig. 2D). È interessante notare che FZD10 non era espresso a livello regionale nell'intestino fetale umano distale, era significativamente più alto negli organoidi d10 (Fig. 2D). Sebbene sia giustificata un'ulteriore esplorazione di questa osservazione, una possibile spiegazione per questa discrepanza è che gli organoidi possono rappresentare uno stadio di sviluppo precedente rispetto all'intestino fetale umano utilizzato in questo studio. L'immunocolorazione ha confermato che PDX1 era più abbondante negli organoidi d5 e che MUC2 era più abbondante negli organoidi d7 e d10 (Fig. 2E).

Per convalidare ulteriormente i nostri risultati, abbiamo condotto una serie di esperimenti aggiuntivi (Fig. S2). Abbiamo trattato l'endoderma per 5 giorni con FGF4 più CHIR99021 (500 ng/ml FGF4, 2 μM CHIR99021), e poi variato la concentrazione di CHIR99021 per i successivi 5 giorni, o in alternativa, rimosso CHIR99021 e aggiunto IWP2, un inibitore WNT, o il Inibitori di FGF ed ERK SU5402 o U0126, rispettivamente (Fig. S2). Gli sferoidi di tutte le condizioni sono stati incorporati in matrigel ed espansi in organoidi per 30 giorni, quindi sono stati confrontati per l'espressione genica regionale. Come previsto, gli organoidi d5 e d10 hanno dimostrato l'espressione genica regione-specifica quando cresciuti in condizioni standard (come in Fig. 2, 500 ng/ml FGF4+2μM CHIR99021). Tuttavia, quando le concentrazioni di CHIR99021 sono state ridotte, gli organoidi d10 hanno espresso livelli molto più elevati di marcatori prossimali, ma ciò non ha portato a una ridotta espressione genica del marcatore posteriore. È interessante notare che quando la segnalazione WNT è stata bloccata tra d5 e d10 (FGF4 + IWP2), l'espressione dei geni prossimali è stata migliorata e l'espressione genica distale è stata ridotta rispetto agli organoidi d5 e d10, rispettivamente. Questi dati suggeriscono che, durante la distalizzazione, uno dei ruoli di WNT/β-catenina potrebbe essere quello di reprimere i geni prossimali mentre induce i geni posteriori (Fig. S2). In totale, questi esperimenti mostrano che è necessaria un'esposizione prolungata ad alti livelli di CHIR99021 per l'espressione dei marcatori intestinali distali.

L'identità regionale si mantiene nel tempo in vitro

Non è chiaro se gli organoidi cambino nel tempo nella cultura, e non è nemmeno noto se l'identità regionale possa essere determinata anche dalla durata del tempo trascorso nella cultura. Per testare ciò, abbiamo generato organoidi d5, d7 e d10 e li abbiamo esaminati dopo 1 mese e dopo 90 giorni di coltura (confrontare la Fig. 2 con la Fig. S3). Sebbene alcuni singoli marcatori di identità regionale siano cambiati nel tempo nella cultura, le tendenze erano simili nei due diversi momenti: gli organoidi d5 avevano un'espressione del marcatore prossimale più abbondante con una bassa espressione del marcatore distale mentre gli organoidi d10 avevano una bassa espressione del marcatore prossimale con un'espressione del marcatore distale arricchita.

Il profilo dell'intero trascrittoma mediante il sequenziamento dell'RNA dimostra che gli organoidi sono modellati nell'intestino prossimale e distale

Poiché i modelli di espressione di diversi marcatori dell'identità intestinale prossimale-distale fetale umano hanno suggerito che gli organoidi d5 sono simili al duodeno umano e gli organoidi d10 sono simili all'ileo fetale umano (Figure 1 e 2), abbiamo quindi adottato un approccio imparziale per confermare questi risultati . Abbiamo condotto il sequenziamento dell'RNA (RNAseq) in diversi stadi di differenziazione, inclusi hESC indifferenziati (linea H9 hESC), DE e organoidi cresciuti per 30 giorni da ogni fase di formazione sferoide [organoidi a 5 giorni (OD5), organoidi a 7 giorni (OD7) e organoidi a 10 giorni (OD10)].

Come primo passo verso una valutazione imparziale dell'ipotesi che gli organoidi d5, d7 e d10 siano modellati nell'intestino prossimale o distale, abbiamo determinato modelli di espressione genica specifici dello stadio unici in ciascuno dei nostri set di dati RNAseq. Utilizzando la fattorizzazione della matrice non negativa (NNMF) (Brunet et al., 2004), abbiamo identificato programmi di espressione genica che erano altamente arricchiti in una fase tra le varie condizioni (Fig. 3A, Tabella S1). Ogni programma corrisponde a una coorte di geni che sono statisticamente arricchiti in un solo stadio. Al fine di determinare se i programmi di espressione genica d5 corrispondessero ai geni duodenali e i programmi di espressione genica d7/10 corrispondessero ai geni ileali, abbiamo condotto un test ipergeometrico per confrontare i programmi di espressione genica organoide (set di geni arricchiti) con i set di geni di identità regionale del topo fetale e intestino umano precedentemente identificato da microarray (Sherwood et al., 2009 Wang et al., 2015) (Fig. 3B). In questa analisi, era importante confrontare i programmi di espressione genica con i dati ottenuti dall'intestino fetale, rispetto a quello adulto, perché, come abbiamo recentemente dimostrato, gli organoidi assomigliano all'intestino fetale e non esprimono molti dei geni trovati nell'organo adulto ( Finkbeiner et al., 2015b). Questa analisi ha rivelato che i set di geni d5 avevano una sovrapposizione statisticamente significativa con i geni espressi nel duodeno del topo (Sherwood et al., 2009 "Sherwood duo") e dell'uomo (Wang et al., 2015 "Wang duo") (P<1.0×10 -18 per entrambi), mentre il set di geni d10 aveva una sovrapposizione statisticamente significativa con i geni espressi nell'ileo del topo (Sherwood et al., 2009 "Sherwood ileum" P<1.0×10 −18) e umano (Wang et al., 2015 ‘Wang ileum’ P<2.22×10 −16 ) (Fig. 3B, Tabella S2). È importante sottolineare che non siamo riusciti a stabilire se gli organoidi d7 sono simili al digiuno in base a Sherwood et al. e Wang et al., perché i set di geni espressi esclusivamente in questa regione erano molto piccoli e non ci hanno permesso di eseguire i confronti statistici con sicurezza. Pertanto, abbiamo limitato le nostre conclusioni agli organoidi d5 e d10. I geni sovrapposti identificati nei confronti degli organoidi duodeno/d5 e ileo/d10 organoidi (Fig. 3B) sono stati ulteriormente tracciati come mappa di calore (Fig. 3C). Come controllo, abbiamo anche confrontato i programmi di espressione genica d5 e d10 con i geni che sono arricchiti nel colon fetale umano (Wang et al., 2015). Qui, non abbiamo trovato alcuna sovrapposizione statisticamente significativa, aggiungendo sicurezza alla nostra conclusione che gli organoidi d5 e d10 sono più simili rispettivamente al duodeno e all'ileo umani (Fig. S4).

Identificazione bioinformatica di geni arricchiti di stadio e confronto con set di dati pubblicati. (A) La fattorizzazione della matrice non negativa è stata utilizzata per identificare i geni arricchiti di stadio. Una mappa di calore normalizzata e curata mostra geni rappresentativi (l'elenco completo è nella tabella S1). ES, cellule staminali embrionali umane DE, endoderma definitivo OD5, organoidi giorno 5 OD7, organoidi giorno 7 OD10, organoidi giorno 10. (B) I geni arricchiti negli organoidi d5, d7 e d10 sono stati confrontati con elenchi pubblicati di geni la cui espressione è limitata a livello regionale al duodeno o all'ileo. Un test ipergeometrico è stato utilizzato per determinare il livello di significatività dei set di geni sovrapposti. (C) La mappa termica dei geni rappresentativi trovati sovrapposti negli organoidi modellati e nei set di dati pubblicati mostra l'arricchimento per i geni ileali negli organoidi d10 e per i geni duodenali negli organoidi d5.

Identificazione bioinformatica di geni arricchiti di stadio e confronto con set di dati pubblicati. (A) La fattorizzazione della matrice non negativa è stata utilizzata per identificare i geni arricchiti di stadio. Una mappa di calore normalizzata e curata mostra geni rappresentativi (l'elenco completo è nella tabella S1). ES, cellule staminali embrionali umane DE, endoderma definitivo OD5, organoidi giorno 5 OD7, organoidi giorno 7 OD10, organoidi giorno 10. (B) I geni arricchiti negli organoidi d5, d7 e d10 sono stati confrontati con elenchi pubblicati di geni la cui espressione è limitata a livello regionale al duodeno o all'ileo. Un test ipergeometrico è stato utilizzato per determinare il livello di significatività dei set di geni sovrapposti. (C) La mappa termica dei geni rappresentativi trovati sovrapposti negli organoidi modellati e nei set di dati pubblicati mostra l'arricchimento per i geni ileali negli organoidi d10 e per i geni duodenali negli organoidi d5.


Somiglianze nei profili di espressione genica durante In vitro Invecchiamento dei fibroblasti primari del polmone umano embrionale e del prepuzio

La senescenza replicativa è di fondamentale importanza per il processo di invecchiamento cellulare, poiché è una proprietà della maggior parte delle nostre cellule somatiche. Qui, abbiamo chiarito questo processo confrontando i cambiamenti di espressione genica, misurati da RNA-seq, in fibroblasti provenienti da due diversi tessuti, polmone embrionale (MRC-5) e prepuzio (HFF), in cinque diversi momenti durante la loro transizione verso la senescenza. Sebbene i modelli di espressione di entrambe le linee cellulari di fibroblasti possano essere chiaramente distinti, è stato riscontrato che l'espressione differenziale simile di un insieme di geni correla bene con la loro transizione verso la senescenza, con solo una minoranza di geni specifici per linea cellulare. Gli approcci basati sul clustering hanno ulteriormente rivelato firme comuni tra le linee cellulari. L'indagine sui livelli di espressione dell'mRNA in vari momenti durante la durata della vita di uno dei fibroblasti ha portato a un numero di geni monotonicamente up e downregolati che hanno mostrato chiaramente un nuovo forte legame con i processi correlati all'invecchiamento e alla senescenza che potrebbero essere funzionali. In termini di profili di espressione di geni differenzialmente espressi con l'età, i geni comuni qui identificati hanno il potenziale per regolare la transizione alla senescenza dei fibroblasti embrionali del polmone e del prepuzio indipendentemente dalla loro diversa origine cellulare.

1. Introduzione

La senescenza cellulare è una fase terminale osservata verso la fine di una popolazione di cellule di fibroblasti umani primari dopo numerose divisioni cellulari ed è considerata il processo di invecchiamento cellulare. La senescenza cellulare si verifica naturalmente o indotta dallo stress, cioè le cellule smettono di dividersi dopo un numero finito di divisioni cellulari (denominate "senescenza replicativa"), raggiungendo lo stato di arresto del ciclo cellulare finale chiamato "limite di Hayflick" [1].Il processo di senescenza è associato a una serie di fenotipi in generale, l'integrità e la funzione dei tessuti diminuiscono, con il risultato che il corpo è suscettibile alle malattie associate all'età [2, 3]. I fattori chiave che guidano la senescenza cellulare sono l'aumento indotto degli inibitori della chinasi ciclina dipendenti (CDKI) [4], lo stress ossidativo [5] e il danno al DNA [6, 7]. Nella senescenza, nonostante la loro vitalità e metabolismo attivo, le cellule sono resistenti agli stimoli mitogeni o apoptotici [8, 9]. Da un lato, la senescenza cellulare determina un arresto irreversibile della crescita, limitando la proliferazione delle cellule danneggiate suscettibili di trasformazione neoplastica con conseguente diminuzione dell'incidenza del cancro. Tuttavia, d'altra parte, la senescenza provoca in vivo invecchiamento, indebolimento della funzione e rinnovamento delle cellule staminali [10]. I marcatori sono in grado di identificare la senescenza cellulare in vitro e in vivo: morfologia cellulare ingrandita, aumento della quantità di detriti cellulari, cambiamenti nella struttura della cromatina, aumento dell'espressione degli inibitori della chinasi ciclina dipendenti (CDKI), presenza di fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP) e ß-galattosidasi associata alla senescenza (SA ß-Gal) [11-13]. La risposta al danno del DNA e le vie p53-p21 e p16-pRb sono cruciali per l'induzione della senescenza [14], insieme a vie aggiuntive tra cui la rimozione dei telomeri, il danno al DNA (UV, radiazioni ionizzanti e sostanze chimiche), i geni del citoscheletro, la via dell'interferone, i nutrienti squilibri, attività oncogene e stress ossidativo [7, 15, 16]. Nei primati, la percentuale di fibroblasti cutanei senescenti aumenta con l'età in vivo [17]. Qui, abbiamo quindi utilizzato fibroblasti umani primari [9, 13, 18] come nostro sistema modello.

Recentemente, abbiamo identificato pattern di espressione genica individuali durante la senescenza replicativa tra cinque linee cellulari di fibroblasti di diversa origine cellulare [13]. In questo studio, abbiamo determinato i cambiamenti di espressione dell'mRNA durante le diverse fasi della loro vita in due linee cellulari di fibroblasti di diversa origine cellulare. Abbiamo analizzato il trascrittoma, determinato da RNA-seq, a cinque raddoppiamenti di popolazione separati (PD) tra fibroblasti di polmone embrionale giovane e senescente (MRC-5) e prepuzio (HFF). Utilizzando sia l'approccio di biologia molecolare che di sistema, abbiamo studiato in dettaglio il modello di crescita delle due linee cellulari di fibroblasti. Confrontando i fibroblasti di due diverse origini siamo stati in grado di determinare sia i cambiamenti dell'mRNA specifici per una delle linee cellulari, sia i modelli trascrittomici comuni che sono alla base del processo di senescenza replicativa.

2. Materiali e metodi

2.1. Linee cellulari

Fibroblasti umani primari (MRC-5, cellule primarie, maschio a 14 settimane di gestazione, fibroblasti da polmone normale, cariotipo diploide normale) sono stati ottenuti da ATCC (LGC Standards GmbH, Wesel, Germania). I fibroblasti umani del prepuzio (cellule primarie HFFs, fibroblasti dal prepuzio, cariotipo diploide normale) sono stati doni gentili di T. Stamminger (Università di Erlangen [19]).

2.2. Coltura cellulare

Cellule primarie di fibroblasti umani sono state coltivate in Dulbeccos Modified Eagle's Low Glucose Medium (DMEM) con L-glutammina (PAA Laboratories, Pasching, Austria), integrato con 10% di siero bovino fetale (FBS) (PAA Laboratories) in condizioni di aria normali in un 9,5 % CO2 atmosfera a 37°C. Le cellule sono state subcoltivate rimuovendo il terreno rimanente seguito da lavaggio in 1x PBS (pH 7,4) (PAA Laboratories) e distacco utilizzando tripsina/EDTA (PAA Laboratories). I fibroblasti primari sono stati subcoltivati ​​in un rapporto 1 : 4 (= 2 raddoppi di popolazione (PD)) o 1 : 2 (= 1 PD). Ai fini delle scorte, la crioconservazione delle linee cellulari a vari PD è stata effettuata in mezzo di crioconservazione (DMEM + 10% FBS + 5% DMSO). Le cellule sono state immediatamente congelate a -80°C e conservate per due o tre giorni. Successivamente, le cellule sono state trasferite in azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Il ricongelamento e il riscongelamento non sono stati eseguiti per evitare la senescenza prematura [20].

Una fiala di ciascuna delle due linee cellulari di fibroblasti (MRC-5 e HFF) è stata ottenuta e mantenuta in coltura da un PD precoce. Ottenuto uno stock sufficiente sulla crescita confluente dei fibroblasti in fiasche da 75 cm 2 , le cellule sono state subcoltivate in tre fiasche separate da 75 cm 2 e sono state fatte passare fino a quando non erano senescenti in coltura. In cinque diversi momenti dell'intervallo del fibroblasto in coltura (MRC-5 = PD 32, 42, 52, 62 e 72 e HFF = PD 16, 26, 46, 64 e 74), l'RNA totale è stato estratto e utilizzato per il sequenziamento ad alto rendimento.

2.3. Rilevazione della ß-galattosidasi associata alla senescenza (SA ß-Gal)

Il SA ?-Il saggio Gal è stato eseguito come descritto da [11] in ciascuno dei cinque PD sia in MRC-5 che in HFF. Studenti di tipo 2 accoppiati a due campioni

- sono stati eseguiti test assumendo uguali varianze per esaminare i valori ottenuti dal saggio SA ß-Gal per la significatività statistica [9].

2.4. Western Blot

Il protocollo è stato eseguito come spiegato in [9, 21]. La concentrazione ottimale di tutti gli anticorpi primari è stata stimata nei fibroblasti umani primari. Gli anticorpi primari sono i seguenti: anticorpo di topo anti-p21 (OP64 Calbiochem diluizione 1 : 200), anticorpo di coniglio anti-p15 (4822 Cell Signaling Technology 1 : 250), anticorpo di topo anti-p16 (550834 BD Pharmingen 1 : 200), anti -p27 anticorpo di coniglio (sc-528 Santa Cruz 1 : 200), anticorpo di topo anti-ciclina B1 (CCNB1 ab72 Abcam 1 : 1000), anticorpo di coniglio anti-Eg5 (KIF11 ab61199 Abcam 1 : 500), anti-istone H1.2 anticorpo di coniglio (HIST1H1C ab17677 Abcam 1 : 1000), anticorpo di topo anti-ID3 (ab55269 Abcam 1 : 100), anticorpo di coniglio anti-catepsina K (CTSK ab19027 Abcam 1 : 50), anticorpo di capra anti-DKK3 (ab2459 Abcam 1 : 5000 ), anticorpo di coniglio anti-TMEM47 (SAB1104840 SIGMA-Aldrich 1 : 250), anticorpo di coniglio anti-IGFBP7 (ab74169 Abcam 1 : 500), anticorpo di coniglio anti-IGFBP2 (ab91404 Abcam 1 : 500), anticorpo di coniglio anti-MMP3 (ab53015 Abcam 1 : 200), anticorpo di coniglio anti-timosina beta 10 (TMSB10 ab14338 Abcam 1 : 10000), anticorpo di topo anti-Egr1 (ab55160 Abcam 1 : 100), anticorpo di topo anti-RPS23 (ab57644 Abcam 1 : 200), anticorpo di topo anti-LIF (SAB1406083 SIGMA-Aldrich 1 : 100), anticorpo di coniglio anti-FBL (SAB1101099 SIGMA-Aldrich 1 : 500), anticorpo di coniglio anti-Id1 (ab52998 Abcam 1 : 500), anti- Anticorpo di coniglio IL11 (ab76589 Abcam 1 : 500), anticorpo di coniglio anti-CLDN11 (HPA013166 SIGMA-Life Sciences 1 : 50), anticorpo di coniglio anti-NADH deidrogenasi subunità 6 (MT-ND6 ab81212 Abcam 1 : 1000), anti-MT- Anticorpo di coniglio ND5 (ab83985 Abcam 1 : 500), anticorpo di coniglio anti-Granulina (GRN ab108608 Abcam 1 : 1000), anticorpo di coniglio anti-ciclina D1 (CCND1 2922 Cell Signaling 1 : 500), anticorpo di topo anti-ciclina D2 (CCND2 ab3085 Abcam 1 : 500), anticorpo di coniglio anti-ciclina A2 (CCNA2 NBP1-31330 Novus Biologicals 1 : 1000), anticorpo di coniglio anti-Wnt16 (ab109437 Abcam 1 : 500), anticorpo di coniglio anti-cistatina C (CST3 ab109508 Abcam 1 : 10000 ), anticorpo di topo anti-MOXD1 (SAB1409086 SIGMA-Aldrich 1 : 200), anticorpo di coniglio anti-PERP (ab5986 Abcam 1 : 500) e anticorpo di topo anti-tubulina (T-9026 SIGMA-Aldrich 1 : 5000). Dopo lo sviluppo del film nella procedura Western Blot, l'intensità dei segnali è stata quantificata utilizzando il software Metamorph [22]. I valori di intensità del segnale sono stati esaminati per la significatività statistica utilizzando test di Student a due code a due campioni spaiati assumendo varianze disuguali.

2.5. Estrazione dell'RNA

L'RNA totale è stato isolato utilizzando Qiazol (Qiagen) secondo il protocollo del produttore, con modifiche come spiegato in [9].

2.6. PCR quantitativa in tempo reale

La PCR in tempo reale è stata eseguita utilizzando il termociclatore CFX384 Biorad e il sistema Quantitect PCR (Qiagen) come descritto in precedenza in [23]. Tre geni di riferimento (GAPDH, ACTB e RAB10) sono stati utilizzati per la normalizzazione dei valori CT. Poiché i nostri risultati di RNA-seq hanno rivelato un'espressione stabile di RAB10 per entrambe le linee cellulari attraverso i PD, è stato selezionato come gene di riferimento. Per l'esame della significatività statistica in base ai valori ΔCT è stato utilizzato un test di Student a due campioni a due code non appaiato, assumendo varianze disuguali.

2.7. Sequenziamento dell'RNA

Per il controllo di qualità, l'RNA totale è stato analizzato utilizzando Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) e RNA 6000 Nano Kit (Agilent) per garantire un'adeguata qualità dell'RNA in termini di degradazione. Il numero di integrità dell'RNA (RIN) varia tra 8 e 10 con una media di circa 9,65. L'RNA totale è stato utilizzato per la preparazione della libreria Illumina e il sequenziamento di nuova generazione [24]. Circa 2,5 μg di RNA totale è stato utilizzato per la preparazione della libreria indicizzata utilizzando il TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 di Illumina seguendo le istruzioni del produttore. Le librerie sono state raggruppate e sequenziate (4 campioni per corsia) utilizzando un HiSeq2000 (Illumina) in modalità di lettura singola con 50 cicli utilizzando la chimica di sequenziamento v3. Il sequenziamento ha prodotto circa 43 milioni di letture con una lunghezza di 50 bp (coppie di basi) per campione. Le letture sono state estratte in formato FASTQ utilizzando CASAVA v1.8.2 (Illumina).

2.8. Analisi dei dati RNA-seq

I dati di sequenziamento grezzi sono stati ricevuti in formato FASTQ. La mappatura della lettura è stata eseguita utilizzando Tophat 2.0.6 [25] e l'assembly di riferimenti del genoma umano GRCh37.66 (http://feb2012.archive.ensembl.org). I file di allineamento SAM risultanti sono stati elaborati utilizzando featureCounts v1.4.3-p1 [26] e la rispettiva annotazione del gene GTF, ottenuta dal database Ensembl [27]. I conteggi dei geni sono stati ulteriormente elaborati utilizzando il linguaggio di programmazione R [28] e normalizzati ai valori RPKM. I valori RPKM sono stati calcolati utilizzando le lunghezze degli esoni fornite da featureCounts e la somma di tutte le letture mappate per campione.

2.9. Clustering dei campioni e analisi della varianza

La correlazione di Spearman tra tutti i campioni è stata calcolata per esaminare la varianza e la relazione dell'espressione genica globale tra i campioni, utilizzando geni con conteggi grezzi maggiori di zero. I valori di correlazione sono stati visualizzati utilizzando una mappa di calore (Figura 1). Inoltre, è stata applicata l'analisi delle componenti principali (PCA) utilizzando i valori RPKM log 2 per i geni con conteggi grezzi maggiori di zero. I risultati sono stati visualizzati in un grafico a dispersione tridimensionale (Figura 2).

2.10. Rilevamento dell'espressione differenziale

I pacchetti Bioconductor DESeq 1.10.4 [29] e bordoR 3.4.2 [30] sono stati utilizzati per identificare i geni espressi in modo differenziale. Entrambi i pacchetti forniscono statistiche per la determinazione dell'espressione differenziale nei dati di espressione genica digitale utilizzando un modello basato sulla distribuzione binomiale negativa. I conteggi genici non normalizzati sono stati utilizzati qui, poiché entrambi i pacchetti includono procedure di normalizzazione interna. Il risultato

i valori sono stati aggiustati utilizzando l'approccio di Benjamini e Hochberg per il controllo del tasso di false scoperte (FDR) [31]. I geni con un valore corretto < 0,05 trovati da entrambi i pacchetti sono stati assegnati come espressi in modo differenziale. Poiché sono stati trovati grandi set di DEG, sono stati utilizzati cutoff di selezione più rigorosi: valore corretto < 0,01 (da entrambi i pacchetti) e log 2 volte-cambiamenti assoluti > 1. Vedere la tabella supplementare 1 nel materiale supplementare disponibile online all'indirizzo http://dx. doi.org/10.1155/2015/731938 per i risultati completi del test.

2.11. Confronto di RNA-seq con qRT-PCR e Protein Expression

L'analisi di correlazione è stata eseguita utilizzando tutti i 15 campioni (3 replicati per ciascuno dei 5 PD) per MRC-5 e HFF, rispettivamente. I coefficienti di correlazione di Spearman sono stati stimati utilizzando i valori RPKM (dati RNA-seq) e

valori (dati qRT-PCR). Per il confronto di RNA-seq con i dati Western Blot, sono stati utilizzati solo il primo e l'ultimo PD. I log 2 fold-change sono stati calcolati sulla base dei valori RPKM (dati RNA-seq),

rapporti (rRT-PCR) e rapporti di espressione proteica (Western Blot).

2.12. Clustering di profili di espressione

I geni sono stati raggruppati in base ai loro profili temporali utilizzando un fuzzy

-mezzi algoritmo. Abbiamo usato la funzione cmq dal pacchetto e1071 1.6-2 del linguaggio di programmazione R. I parametri sono stati definiti come

, iter.max = 500, d.obj.fun = 10 -8 . Il numero di prove per l'algoritmo fuzzy è stato impostato su 30. Il numero ottimale di cluster è stato determinato utilizzando una combinazione di diversi indici di convalida dei cluster come descritto da [32]. Vedere la tabella supplementare 2 per l'assegnazione dettagliata dei geni ai cluster.

2.13. Analisi di arricchimento funzionale

L'analisi dell'arricchimento del set di geni singolari è stata eseguita utilizzando FungiFun2 [33] per insiemi selezionati di geni in base ai risultati del clustering. Sebbene FungiFun2 sia principalmente adatto per l'analisi dell'arricchimento genico fungino, è inclusa anche l'annotazione per i geni umani, che è stata recentemente aggiornata. Sono stati utilizzati parametri predefiniti mentre termini significativi di Gene Ontology (GO) e percorsi KEGG sono stati selezionati in base ai valori corretti FDR < 0,05. Gli elenchi completi dei termini GO e dei percorsi KEGG sono disponibili nella tabella supplementare 3. L'elenco dei termini GO è stato ulteriormente riassunto utilizzando TreeMaps dello strumento online REVIGO [34]. Come input sono stati utilizzati i parametri predefiniti e il termine GO con i valori modificati.

2.14. Geni espressi in modo monotono

Per identificare i geni che cambiano i loro livelli di espressione in modo monotono con l'età, abbiamo calcolato il coefficiente di correlazione di Spearman

del profilo temporale di ciascun gene con la curva crescente linearmente

. Per incorporare le repliche in ogni momento, abbiamo ripetuto i calcoli campionando casualmente le repliche in ogni momento e calcolando successivamente un coefficiente di correlazione medio dalle curve ricampionate. i valori sono stati calcolati utilizzando la funzione di base R cor.test. Abbiamo utilizzato il coefficiente di correlazione calcolato del gene con la curva crescente lineare come criterio per dividere i geni nei seguenti tre gruppi: se

, abbiamo considerato un gene che aumentava monotonicamente con l'età, se e , il gene era considerato decrescente in modo monotono con l'età e se , l'espressione del gene corrispondente era considerata non uniforme [35]. Vedere la tabella supplementare 4 per i risultati dei test dettagliati.

2.15. Reti di associazioni funzionali

I simboli genetici sono stati utilizzati come input per la creazione di reti di associazioni funzionali utilizzando il database STRING [36], Cognoscente [37] e gli strumenti online GeneMANIA [38]. Per STRING abbiamo utilizzato l'input "nomi multipli" e selezionato "Homo sapiens" come organismo. In Cognoscente abbiamo selezionato "Umano" e "Raggio = 0 con intermedi" come parametri di input oltre all'elenco dei geni. La rete GeneMANIA è stata creata utilizzando le impostazioni predefinite. Le reti risultanti sono mostrate nella Figura 9 e nella Figura 6 supplementare.

3. Risultati e discussioni

Abbiamo studiato la crescita di due linee cellulari primarie di fibroblasti umani, MRC-5 e HFF, durante tutto il loro intervallo in coltura da un PD precoce fino a quando non hanno raggiunto la senescenza a PD tardivi. Analisi del loro comportamento di crescita (Supplementale Figura 1A) e del loro ingresso nella senescenza (Supplementale Figura 1B), misurato dall'induzione di SA ?-Gal, ha rivelato una transizione specifica della linea cellulare nella senescenza di questi due fibroblasti (MRC-5 derivato dal polmone embrionale e HFFs derivato dal prepuzio umano). La crescita specifica della linea cellulare di fibroblasti è stata da noi osservata in precedenza [13, 39]. L'RNA totale è stato estratto in cinque diversi punti temporali dell'intervallo dei fibroblasti in coltura ed è stato sottoposto a sequenziamento dell'RNA ad alto rendimento (RNA-seq).

3.1. Cluster di profili di espressione globali in base alla linea cellulare e all'età

Complessivamente, i dati RNA-seq di questo studio comprendono 30 campioni: 15 campioni per ogni linea cellulare (HFF e MRC-5), costituiti da cinque diversi PD, ciascuno con tre repliche biologiche. Per ogni campione, la mappatura e il conteggio hanno prodotto 56.299 valori di espressione del conteggio dei geni grezzi (utilizzando l'annotazione del gene Ensembl). Il gruppo più numeroso di questi geni (21.226) appartiene al gruppo dei geni codificanti proteine. Per tutti i 30 campioni, 19.237 geni hanno un numero di geni grezzi maggiore di zero, questi geni sono stati considerati per ulteriori analisi.

In primo luogo, abbiamo studiato il clustering primario dell'espressione genica globale. Abbiamo quindi creato una mappa di calore che mostra la correlazione di Spearman per tutti i 30 campioni utilizzando i geni diversi da zero (Figura 1). In questa mappa di calore, entrambe le linee cellulari erano chiaramente separate. In otto casi su dieci, i tre valori delle repliche sono stati raggruppati insieme, mostrando la buona qualità dei dati e il basso rumore tra le repliche. Successivamente, abbiamo applicato l'analisi dei componenti principali (PCA) per studiare ulteriormente l'effetto dell'invecchiamento nelle singole linee cellulari. La figura 2 mostra i primi tre componenti principali che spiegano

97% delle varianze in un grafico tridimensionale. MRC-5 e HFF di nuovo erano chiaramente separati (da PC2) e l'effetto dell'invecchiamento era coperto da PC1 e PC3, con una maggiore separazione tra HFF giovane e vecchio rispetto a MRC-5. Già a questo livello globale, la somiglianza tra le due linee cellulari è percepibile, poiché i campioni giovani e senescenti sono raggruppati in modo concorde.

3.2. MRC-5 e HFF condividono geni comuni espressi in modo differenziale regolati dall'invecchiamento

I geni differenzialmente espressi (DEG) sono stati identificati confrontando tutti i PD consecutivi e il primo con l'ultimo PD nelle cellule MRC-5 e HFF (10 confronti Tabella 1). Le figure 3(a) e 3(c) mostrano il numero assoluto di DEG trovati nonché l'intersezione di insiemi di DEG (indicati dal colore). Nel complesso, considerando tutti e cinque i confronti in ciascuna linea cellulare, abbiamo identificato più DEG in HFF (14.511) rispetto a MRC-5 (10.517). A causa del forte effetto dell'invecchiamento sull'espressione genica e del gran numero di DEG rilevati, sono stati utilizzati cutoff di selezione più rigorosi (e |log 2 fold-change| > 1) oltre la soglia del valore standard di 0,05 (Figure 3(b) e 3(d)). La Figura 3 rivela che i DEG non erano specifici per un certo confronto di PD ma si ripresentavano quando venivano confrontati PD successivi. MRC-5 e HFF condividevano una grande frazione di DEG solo una frazione minore di DEG è stata identificata in modo univoco in una delle linee cellulari (barre a destra nella Figura 3). Ciò indica processi comuni che si verificano durante l'invecchiamento in entrambe le linee cellulari piuttosto che cambiamenti specifici della linea cellulare. La maggior parte dei DEG è stata trovata confrontando il primo con l'ultimo PD, portando a nuovi DEG che non erano stati precedentemente rilevati tra PD consecutivi (barre colorate arancioni e turchesi nella Figura 3). Entrambe le linee cellulari differivano tra il numero assoluto di DEG e la percentuale aumentata di DEG per le prime due transizioni nell'HFF (da PD 16 a PD 26 da PD 26 a PD 46). In MRC-5, la maggior parte dei cambiamenti sembrava verificarsi a PD tardivi, mentre le cellule HFF indicavano cambiamenti più grandi già dopo i PD precoci. Questo effetto è percepibile anche dalle distanze nel grafico PCA (Figura 2).

3.3. Alta correlazione di RNA-seq con qRT-PCR per DEG . selezionati

Per la convalida dei dati RNA-seq, è stata applicata la qRT-PCR. Qui sono stati misurati i triplicati per tutti e cinque i PD. La selezione dei geni si basava sul confronto del primo con l'ultimo PD, utilizzando i rigorosi criteri DEG ( e |log 2 fold-change| > 1), risultando in 2.117° per MRC-5 e 4.651° per HFF (5° e 10a barra nelle figure 3(b) e 3(d)). Abbiamo ulteriormente filtrato l'intersezione di questi due set di geni (1.139) in base alle differenze comuni in entrambe le linee cellulari. La maggior parte (917) di questi DEG erano comunemente regolati, sia verso l'alto (385) che verso il basso (532), mostrando ancora una volta la somiglianza dei cambiamenti di espressione genica in entrambe le linee cellulari. Complessivamente sono stati selezionati 12 DEG che hanno mostrato una forte espressione nei dati RNA-seq (geni RPKM > 50: EGR1, CCND1, CTSK, DKK3, IGFBP7, e TMEM47) o hanno dimostrato di avere un ruolo consolidato nel ciclo cellulare e nelle vie della senescenza (CCNA2, CCNB1, ID3, IGFBP2, MMP3, e WNT16). Il criterio RPKM minimo è stato applicato per garantire un segnale di espressione forte in almeno una condizione per un insieme di geni. I profili di espressione di entrambe le tecniche di misurazione sono stati quindi confrontati utilizzando la correlazione di rango di Spearman in ogni singola linea cellulare.I risultati hanno mostrato elevati coefficienti di correlazione che indicano una buona sovrapposizione di entrambe le tecniche di misurazione e la qualità dell'analisi dell'espressione genica ad alto rendimento (Figura 4). In 17 casi su 24, la correlazione è risultata maggiore del 50% (correlazione media del 63%), mentre solo una volta è stata riscontrata una correlazione negativa (EGR1 in MRC-5).

3.4. Cambiamenti consistenti dell'mRNA e dell'espressione proteica

Sebbene si consideri generalmente che i cambiamenti di espressione dell'mRNA conducano di conseguenza a corrispondenti cambiamenti nei livelli di proteine, la correlazione tra entrambi può essere di appena il 40%, come osservato in esperimenti di profilazione del proteoma e del trascrittoma su larga scala [40]. Abbiamo quindi chiesto se i cambiamenti rilevati di DEG fortemente alterati fossero correlati con i corrispondenti livelli di espressione proteica. Per il confronto sono stati selezionati triplicati del primo e dell'ultimo PD. La selezione genica è stata eseguita come descritto sopra, sia per forte espressione in RNA-seq (RPKM > 35) sia per relazione funzionale con il ciclo cellulare e le vie di senescenza. Complessivamente, sono stati selezionati 28 DEG (16 DEG down e 12 DEG sovraregolati) (i geni sopra menzionati, convalidati da qRT-PCR, sono stati inclusi in questo set). I risultati di questo confronto hanno mostrato cambiamenti coerenti, in termini di direzione di regolazione, tra l'espressione dell'mRNA, misurata mediante RNA-seq, e l'espressione proteica, misurata mediante Western Blot, per tutti i geni selezionati (Figure 5 e 6). 44 dei 56 cambiamenti di piega proteica hanno mostrato differenze significative tra PD giovani e vecchi.

) sono indicati con un asterisco:

, , e . (c) I blot mostrano i livelli di espressione proteica nelle cellule MRC-5 e HFF giovani rispetto ai vecchi PD. La up- o downregulation era indicata dalla presenza o assenza di bande nei Western Blot.

3.5. Geni comuni che regolano la transizione alla senescenza in MRC-5 e HFF

Quindi, abbiamo chiesto se i comuni marcatori cellulari sono coinvolti nella transizione verso la senescenza. Abbiamo quindi studiato i geni più differenzialmente espressi con l'età comunemente nei fibroblasti MRC-5 e HFF. Abbiamo notato che un gran numero di geni tra i geni più differenzialmente espressi apparteneva al fenotipo secretorio (Figura 8 (a), come spiegato nella Sezione 3.7). L'elenco dei geni inclusi CTSK, normalmente stimolato da citochine infiammatorie rilasciate dopo un danno tissutale [41], GRN, un gene precedentemente convalidato dal punto di vista funzionale responsabile della guarigione delle ferite [42], CST3, associata a sarcopenia [43], e PERP, un effettore dell'apoptosi p53, il cui livello di espressione di mRNA è sovraregolato nelle cellule staminali mesenchimali umane [44]. Abbiamo rilevato una significativa sovraregolazione di IGFBP2 che è stato trovato sovraregolato con la senescenza nelle cellule epiteliali del pigmento retinico [45, 46] e nei fibroblasti BJ [47]. ID1, ID3, CCNA2, e CCNB1 ha mostrato una significativa downregulation con l'età nel nostro studio per entrambi i fibroblasti umani. Downregulation di ID1 e ID3 l'espressione con senescenza è stata rilevata nel prepuzio BJ, nella pelle fetale WS1 e nei fibroblasti umani polmonari LF1 [48] e di CCNA2 in IMR-90 e WI-38 [49]. Targeting CCNB1 l'espressione inibisce la proliferazione delle cellule del cancro al seno [50]. Include anche l'elenco dei geni più espressi in modo differenziale IGFBP7 e MMP3 che codificano per i recettori proteici situati prevalentemente sulla superficie cellulare. Entrambi IGFBP7 e MMP3 sono sovraregolati con la senescenza nei melanociti umani [51-54]. Recentemente abbiamo scoperto che la sovraespressione delle proteine ​​ricombinanti IGFBP7 induce una senescenza prematura nei fibroblasti MRC-5 precoci [13].

Tra i geni significativamente sovraregolati con l'età sia in MRC-5 che in HFF abbiamo identificato DKK3, avendo un ruolo nella segnalazione di Wnt [55-57]. DKK3 ha attività oncosoppressore nelle pazienti con carcinoma mammario [58] e nel carcinoma papillare della tiroide [57]. Tuttavia, non siamo riusciti a dimostrare un'induzione della senescenza prematura nei primi HFF del PD sulla sovraespressione delle proteine ​​DKK3 ricombinanti [13]. Sebbene non si esprimesse in modo significativamente differenziale con l'età nei fibroblasti MRC-5, uno dei geni che erano più significativamente sovraregolati con l'età negli HFF era il SFRP4 gene, un antagonista della segnalazione Wnt [59]. SFRP4 agisce come soppressore del tumore nel carcinoma gastrico [60] e nelle linee cellulari di cancro ovarico epiteliale [61]. In uno studio separato, abbiamo validato funzionalmente l'espressione di SFRP4 nei fibroblasti precoci di PD HFF e MRC-5 trattandoli separatamente con la proteina SFRP4 ricombinante umana. Questo trattamento ha provocato un'induzione prematura della senescenza negli HFF ma non nei fibroblasti MRC-5 precoci [13]. Qui, l'induzione dell'espressione dell'mRNA di SFRP4 non è stata rilevata da RNA-seq, spiegando la mancanza di induzione della senescenza prematura nei fibroblasti precoci di PD MRC-5. L'espressione di SFRP4 ha quindi mostrato differenze specifiche della linea cellulare.

3.6. Il raggruppamento dei profili di espressione mostra un modello simile in entrambe le linee cellulari

Abbiamo trovato molti geni differenzialmente espressi comunemente regolati sia in MRC-5 che in HFF. Successivamente, abbiamo chiesto se entrambe le linee cellulari mostrano profili di espressione temporale comuni piuttosto che mostrare effetti diversi per lo stesso set di geni. Pertanto, abbiamo applicato il raggruppamento di mezzi fuzzy confrontando i profili di espressione di entrambe le linee cellulari. Abbiamo utilizzato 1.803 geni che risultano essere regolati in modo differenziale tra i quattro PD consecutivi e tra il primo e l'ultimo PD in entrambe le linee cellulari, secondo i rigorosi cutoff mostrati nelle Figure 3(b) e 3(d) (FDR < 0.01 | log 2 piega-cambia| > 1). Utilizzando diversi indici di convalida dei cluster, è stato stimato un numero ottimale di cinque cluster e ciascun DEG selezionato è stato assegnato a uno di questi cinque gruppi (Figura 7). La maggior parte di DEG mostra profili di espressione temporale simili in MRC-5 e HFF. 811°C sono stati sovraregolati (gruppi 3 e 5) e 722 sono stati sottoregolati (gruppi 2 e 4). Differenze più forti tra entrambe le linee cellulari sono state trovate per i geni raggruppati nei cluster 1 e 4. È interessante notare che la maggior parte dei geni segue un profilo monotono (su o giù) mentre solo pochi geni mostrano una forma parabolica. I cluster 1 e 3 mostrano importanti cambiamenti in MRC-5 tra il penultimo e l'ultimo PD, mentre il cluster 4 raggruppa geni con grandi differenze tra il primo e il secondo PD nell'HFF. Questo effetto è stato già osservato quando si confrontavano DEG tra i PD consecutivi (vedere la sezione DEG sopra). La Figura 7 riassume i profili di espressione genica mostrando solo la media scalata e centrata e la deviazione standard del cluster DEG. Nella maggior parte dei casi, i valori di espressione assoluta erano diversi tra entrambe le linee cellulari (indicati dalle linee orizzontali tratteggiate) ma le tendenze dei cambiamenti effettivi tra i cinque PD erano simili. Ad esempio, il cluster 3 contiene geni che mostrano valori di espressione media più grandi per MRC-5 ma sono sovraregolati con l'aumento di PD in entrambe le linee cellulari (vice versa nel gruppo 2).

3.7. Identificazione di categorie funzionali significativamente arricchite per geni con profili di espressione comuni

Successivamente, abbiamo dedotto i principali processi biologici guidati dai set di geni differenzialmente espressi ottenuti dall'analisi dei cluster. Utilizzando l'analisi dell'arricchimento del set di geni, per ciascuno dei cinque cluster è stato possibile identificare categorie GO significative e percorsi KEGG. I risultati hanno indicato una forte connessione dei geni sovraregolati (raggruppati nei cluster 3 e 5) ai componenti dello "spazio extracellulare" (GO: 0005615) e della "membrana" (GO:0016020) (Figura 8 (a)). I percorsi KEGG corrispondenti, trovati per questi geni, erano ad esempio "interazione recettore-ECM" (hsa04512) e "trasportatori ABC" (hsa02010 vedere la tabella supplementare 3). Le proteine ​​ABC trasportano varie molecole attraverso le membrane extra e intracellulari e sono coinvolte nell'invecchiamento e nelle malattie legate all'età [62]. Il cluster 3 mostra una sovraregolazione più forte alla fine della PD per le cellule MRC-5 mentre le cellule HFF sono sovraregolate più chiaramente nel cluster 5 (vedi sopra). Confrontando i termini GO trovati per questi singoli cluster, abbiamo trovato collegamenti della sovraregolazione più forte in MRC-5 con "componente integrale della membrana plasmatica" (GO:0005887) e "apparato di Golgi" (GO:0005794), mentre "sarcolemma " (GO:0042383) e "nucleosoma" (GO:0000786) erano più specifici per la sovraregolazione nell'HFF (Figura supplementare 2). La struttura della secrezione che regola il complesso di Golgi è alterata nelle cellule senescenti [63]. Mentre i nostri risultati indicano differenze specifiche della linea cellulare durante la senescenza replicativa, il confronto del termine GO ha rivelato che in entrambe le linee cellulari molti geni erano sovraregolati in modo simile. Un ampio set di termini GO associati a geni sovraregolati era correlato al fenotipo secretorio associato alla senescenza [64].

I geni sottoregolati (raggruppati nei cluster 2 e 4) sono stati associati a processi GO fortemente arricchiti relativi, ad esempio, a "ciclo cellulare" (GO:0007049), "divisione cellulare" (GO:051301) e "replicazione del DNA" (GO: 0006260) (Figura 8(b)). Qui, le differenze tra entrambe le linee cellulari sono più evidenti. Dopo un leggero guadagno iniziale, l'espressione nelle cellule MRC-5 è fortemente diminuita tra PD 46 e PD 64. Negli HFF, un forte declino è già iniziato dopo PD32 senza cambiamenti maggiori per PD tardivo (Figura 7 cluster 4). La maggior parte di questi geni correlati al ciclo cellulare, che rappresentano i profili sopra menzionati, sono correlati al componente cellulare "nucleoplasma" (GO:0005654). I termini GO associati per il cluster 2, che descrive una moderata downregulation, erano processi più diffusi e coperti come "regolazione positiva del processo biosintetico dell'ossido nitrico" (GO:0045429), "formazione dell'endoderma" (GO:0001706) e "risposta al cAMP ” (GO:0051591 Figura supplementare 3).

Il cluster 1 ha mostrato le maggiori differenze tra entrambe le linee cellulari. Mentre, in MRC-5, i geni sono fortemente downregolati nell'ultimo PD, non si osserva alcuna chiara up o downregulation per l'HFF. I termini GO significativamente arricchiti associati a questi geni erano, ad esempio, "vasculogenesi" (GO:0001570), "risposta al lipopolisaccaride" (GO:0032496) e "adesione cellulare" (GO:0007155) (Figura supplementare 4).

3.8. I geni regolati monotonicamente in MRC-5 e HFF sono collegati in reti di associazioni funzionali

Poiché la senescenza è un processo cellulare continuo, si può ipotizzare che i geni che possiedono una rilevanza chiave per la senescenza cambino i loro valori di espressione in modo monotono nel tempo, mentre i geni con modelli di espressione temporale irregolari potrebbero essere associati alla risposta alle condizioni ambientali, al ritmo circadiano o ad altri processi .

Tra l'altro, l'analisi di clustering ha rilevato profili in continuo aumento e diminuzione. Oltre a questo approccio imparziale, intendevamo identificare i geni con un forte comportamento monotono tra i PD qui studiati. Abbiamo calcolato il coefficiente di correlazione di Spearman del profilo temporale di ciascun gene con una sequenza linearmente crescente. I replicati per ogni PD sono stati incorporati mediante un approccio di campionamento casuale. Successivamente, abbiamo classificato i geni in tre classi in base al loro comportamento con l'età: (a) geni monotonicamente sovraregolati, (b) geni monotonicamente sottoregolati e (c) geni regolati non uniformemente (Tabella 2).

per i risultati completi del test.

Sono stati trovati geni più monotonicamente up e downregolati per gli HFF rispetto a MRC-5 (888 contro 179). Solo un piccolo sottoinsieme di questi geni era comunemente regolato in entrambe le linee cellulari (9 su e 14 giù), ma ancora meno geni mostravano profili di espressione monotonici opposti (8 vedere la Figura 5 supplementare e la Tabella 4 supplementare). I 23 geni comunemente monotonicamente up o downregolati sono stati studiati in modo più dettagliato. Poiché in entrambe le linee cellulari la regolazione di questi geni è fortemente correlata con un aumento della senescenza, potrebbero svolgere un ruolo essenziale nell'invecchiamento cellulare e governare il comune processo di regolazione. Abbiamo utilizzato diverse risorse online per trovare interazioni potenziali o convalidate tra questi geni. Il database STRING [36] fornisce solo le interazioni tra quattro di tutti i 23 geni (Figura 6A supplementare). Utilizzando Cognoscente [37], 17 su 23 geni sono stati collegati all'interno di un grafico di interazione (Figura 6B supplementare). Ulteriori interazioni potrebbero essere trovate utilizzando GeneMANIA [38], portando a una rete ampiamente connessa da coespressione e percorsi comuni come, ad esempio, "proliferazione delle cellule epiteliali" e "organizzazione della matrice extracellulare" (Figura 9). Entrambi questi ultimi strumenti integrano geni intermedi che non erano nell'elenco di input. Geni hub in queste reti inclusi ATF7, MAF, UBC, e ELAVL che sono interessanti candidati per ulteriori studi. Tutti e quattro questi geni erano funzionalmente associati alla tumorigenesi. I membri della famiglia dell'ubiquitina, compreso l'UBC, sono stati associati alla progressione del tumore [65]. In termini di ATF7, la famiglia del fattore di trascrizione attivante è associata alla proliferazione cellulare e all'oncogenesi [66]. Sia MAF che ELAV1 sono stati associati all'oncogenesi e alla progressione del tumore [67, 68]. Quindi tutti e quattro i geni avevano un'associazione con la proliferazione cellulare. Quindi, abbiamo studiato la rilevanza biologica dei geni monotonicamente up e downregolati in entrambe le linee cellulari di fibroblasti. L'elenco dei geni monotonicamente downregolati include NLE1, AMMECR1, FIBCD1, ENPP2, TMTC4, ANPEP, IL MIO C, EFNB3, HCLS1, FERMT1, FABP5, SPHK1, GOS2, e RPL36A. I geni monotonicamente sovraregolati inclusi LRP10, TMCO3, CAV2, ADAMTS5, C5orf15, SDC2, ANKH, PCDHB16, e TGFB2. Un certo numero di geni nell'elenco di cui sopra sono stati funzionalmente associati alla proliferazione.

3.8.1. Geni monotonicamente downregolati

NLE svolge un ruolo nella regolazione dell'attività di Notch ed è coinvolto nello sviluppo embrionale nei mammiferi influenzando le vie CDKN1A e Wnt [69]. L'espressione forzata di miR-26 inibisce la crescita delle cellule del cancro al seno stimolate e del tumore nei modelli di xenotrapianto riducendo i livelli di espressione dell'mRNA di AMMECR1 e di altri geni [70]. AMMECR1 è associato a sindrome di Alport, ritardo mentale, ipoplasia della faccia mediana ed ellissocitosi [71]. FIBCD1 (dominio del fibrinogeno C contenente 1) si lega alla chitina dei parassiti invasori [72]. FIBCD1 è principalmente presente nel tratto gastrointestinale degli esseri umani, tuttavia, la loro presenza nella pelle è stata molto dibattuta [73, 74]. ENPP2 facilita la motilità cellulare e la progressione ed è correlata all'invasione dei carcinomi duttali della mammella [75]. TMTC4 è un gene che contribuisce allo sviluppo del cervello embrionale interagisce con Wntless, un regolatore integrale di Wnt [76]. EFNB3, un membro della famiglia del gene dell'efrina, è associato allo sviluppo neurale [77]. L'ANPEP è un marcatore ben noto per la leucemia mieloide acuta e l'invasione del tumore, ha un ruolo regolatore nell'angiogenesi [78, 79]. FERMT1 è sovraespresso nei carcinomi del colon e del polmone [80]. Il IL MIO C l'oncogene è associato alla regolazione della crescita cellulare guidando la proliferazione attraverso la sovraregolazione delle cicline e la sottoregolazione di p21 [81, 82]. HCLS1 Il gene che è monotonicamente downregolato con l'età è associato alla segnalazione del recettore dell'antigene e all'espansione clonale, nonché alla delezione delle cellule linfoidi [83]. Il FABP5 codifica per la proteina legante gli acidi grassi nelle cellule epidermiche ed è sovraregolato nei tessuti psoriasici [84]. SPHK1 è stato precedentemente associato alla progressione del melanoma e all'angiogenesi [85, 86]. Il GOS2 Il gene promuove l'apoptosi legandosi a BCL2, quindi prevenendo la formazione di BCL2-BAX protettivo, i suoi livelli di mRNA e proteine ​​sono downregolati nei pazienti diabetici di tipo 2 [87, 88]. Pertanto, quasi tutti i geni, monotonicamente downregolati con l'età in entrambe le linee cellulari di fibroblasti, sono associati alla proliferazione e alla sopravvivenza cellulare.

3.8.2. Geni monotonicamente sovraregolati

LRP10, un regolatore negativo della segnalazione di Wnt, è stato trovato monotonicamente sovraregolato con l'età [89]. CAV2 è una proteina dell'impalcatura all'interno della membrana caveolare che modula la progressione del cancro [90]. ADAMTS5 consente la distruzione di aggrecan in pazienti con malattia artritica che è prevalente con l'invecchiamento [91]. Il ANKH Il gene, associato alla regolazione della calcificazione dei tessuti e, a sua volta, alla suscettibilità all'artrite, è anche monotonicamente sovraregolato con l'età in entrambe le linee cellulari di fibroblasti [92]. La proteina Syndecan-2 (SDC2) è sovraregolata nei tessuti cutanei e polmonari di pazienti affetti da sclerosi sistemica e fibrosi (associate all'età) [93, 94]. L'espressione dell'mRNA di PCDHB16 è sovraregolata nei pazienti con malattia di Alzheimer (associata all'età) [95]. TGFB2, anche monotonicamente sovraregolato con l'età nei fibroblasti, ha effetti soppressivi sulla proliferazione delle cellule T dipendenti dall'interleuchina-2 e mostra funzioni effettrici [96].

In sintesi, i geni, che abbiamo trovato qui monotonicamente up e downregolati con l'età in entrambe le linee cellulari di fibroblasti, sono stati studiati in precedenza. In questo studio, mostriamo esplicitamente per la prima volta la regolazione associata all'età di questi geni in cellule primarie di fibroblasti umani di due diverse origini. In uno studio successivo determineremo l'espressione proteica di tutti i geni legati all'età e convalideremo funzionalmente l'espressione di questi geni.

4. Conclusione

Abbiamo studiato gli aspetti molecolari dell'invecchiamento cellulare determinando l'espressione differenziale dei geni durante l'invecchiamento di due fibroblasti umani primari, MRC-5 e HFF. L'analisi dei dati RNA-seq comprendeva diversi livelli, a partire dall'insieme completo di geni annotati ed espressi, procedendo a diversi sottoinsiemi di geni e categorie funzionali. La maggior parte dei cambiamenti rilevati è risultata comune in entrambe le linee cellulari, come indicato dal gran numero di DEG sovrapposti e dai profili di espressione comuni identificati dal raggruppamento. Abbiamo convalidato i modelli di espressione per i geni selezionati, dimostrando un'associazione di quasi tutti i geni espressi in modo differenziale con la proliferazione o l'arresto del ciclo cellulare, coerente con i precedenti studi sulla senescenza. Indagare i cambiamenti di espressione in cinque PD consecutivi e confrontare le cellule giovani con quelle senescenti ci ha permesso di identificare sia i geni monotonicamente up- e down-regolati, sia i geni espressi in modo più differenziale. Entrambi i gruppi di geni hanno fortemente contribuito alla transizione verso la senescenza cellulare. Pertanto, descriviamo quantitativamente le somiglianze nei profili di espressione genica durante l'invecchiamento di due linee cellulari di fibroblasti di diversa origine.

Deposizione dei dati

I dati RNA-seq discussi in questa pubblicazione sono stati depositati in Gene Expression Omnibus di NCBI e sono accessibili tramite il numero di accesso alla serie GEO GSE63577.

Conflitto d'interessi

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse per quanto riguarda la pubblicazione di questo documento.

Contributo degli autori

Shiva Marthandan e Steffen Priebe hanno contribuito in egual modo a questo lavoro.

Ringraziamenti

Il lavoro qui descritto fa parte del programma di ricerca del Jena Center for Systems Biology of Aging (JenAge). Gli autori riconoscono il finanziamento di JenAge da parte del Ministero tedesco per l'istruzione e la ricerca (codice di supporto Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF): 0315581). Gli autori desiderano ringraziare Sabine Ohndorf e Sabine Gallert per l'eccellente assistenza tecnica.

Materiali supplementari

suppl. Figura 1: (A) Curva di crescita dei fibroblasti MRC-5 e HFF derivati ​​da una singola fiala e mantenuti in coltura in triplicato da un PD precoce fino alla senescenza a PD tardivo.Vengono visualizzati i punti dati di tutte le misurazioni (non la media). I PD specificati nel grafico indicano i punti temporali in cui l'RNA totale è stato raccolto e sottoposto a RNA-seq. La linea nera indica MRC-5 e il verde indica HFF (B) Percentuale di cellule positive SA-β Gal in diversi momenti della loro crescita in coltura nei fibroblasti MRC-5 e HFF. Ogni curva viene misurata in triplicato, il valore medio viene visualizzato con barra di errore (± S.E). La linea rossa indica MRC-5 e il nero indica HFF.

suppl. Figura 2: TreeMaps prodotte utilizzando REVIGO (http://revigo.irb.hr) che riassume: (A) 12 termini GO cellular component (CC) trovati per il cluster 3. (B) 21 termini GO CC trovati per il cluster 5. Entrambi i cluster contengono geni up-regolati ma mostrano differenze tra MRC-5 e HFF.

suppl. Figura 3: TreeMaps prodotte utilizzando REVIGO (http://revigo.irb.hr) che riassume: (A) 59 termini GO biologici (BP) trovati per il cluster 2. (B) 162 termini GO BP trovati per il cluster 4. Entrambi i cluster contengono geni down-regolati.

suppl. Figura 4: TreeMaps prodotte utilizzando REVIGO (http://revigo.irb.hr) che riassume 24 termini GO BP trovati per il cluster 1.

suppl. Figura 5: grafici di Venn che mostrano il numero di pattern di espressione significativamente monotonicamente rilevati. (A, B): up/down-regolato sia in MRC-5 che in HFF. (C) up-regolato in MRC-5 e down-regolato in HFF. (D): viceversa di (C).

suppl. Figura 6: Reti di associazione funzionale generate utilizzando (A) STRING DB e (B) Cognoscente inclusi 23 geni trovati monotonicamente espressi nei cinque PD. (A) Sono state trovate solo connessioni tra quattro geni utilizzando STRING DB. I diversi colori delle linee rappresentano i tipi di evidenza per l'associazione, spiegati a destra. (B) I nodi delineati in rosso sono i 23 geni di input. Non sono state trovate interazioni per PCDHB16. 19 intermedi sono stati inclusi dallo strumento. I colori dei bordi indicano il tipo di interazione, come spiegato nella legenda in alto.

Colonna 1-4: annotazione del gene.

Colonna 5-10: valori RPKM per ogni singolo campione.

Colonna 11-13: valori RPKM medi e log2 fold-change.

Colonna 14-15: valori p aggiustati (FDR) da DESeq e edgeR.

Colonna 1-4: annotazione del gene.

Colonna 5-14: valori RPKM medi di MRC-5 e HFF e tutti e cinque i PD.

Colonna 15: numero di appartenenza al cluster [1-5].

Tabella supplementare 3: tabella Excel con analisi dell'arricchimento funzionale (FungiFun). Il file contiene 9 fogli: un foglio per ogni singolo cluster utilizzato per l'analisi di arricchimento GO due fogli con risultati GO per cluster combinati e due fogli con risultati KEGG per cluster combinati. Ogni foglio contiene gli ID del percorso/termine, i nomi corrispondenti, i livelli superiori, i valori p esatti, i valori p corretti, il numero di geni per percorso/termine e per elenco di input.

Colonna 1-3: annotazione del gene.

Colonna 4-5: valori di correlazione di Spearman e p-value (cor.test) per MRC-5.

Colonna 6-7: valori di correlazione di Spearman e p-value (cor.test) per HFF.

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