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Come calcolare quante volte un enzima taglierebbe un plasmide


Sono un po 'confuso su come capire la formula necessaria per capirlo.

Ho un plasmide di 7,3 Kb e mi è stato detto che è stato tagliato con un enzima di 4 bp. Per qualche ragione ho pensato che la formula necessaria per capirlo fosse:

(1/4)^4 x 7300

Ma mi dà un numero così basso che non credo sia giusto, quindi sono solo un po' confuso.


Ci sono 4 taglierini da $ 4^4 $, il che significa che dato un taglierino da 4, ti aspetti che tagli in media una volta ogni 256 basi. $ 7300/256 = 28,5 $, quindi ti aspetti 28 o 29 siti di taglio nel plasmide. Questo è identico a quello che hai calcolato.


Come calcolare quante volte un enzima taglierebbe un plasmide - Biologia

1.a. La frequenza di taglio in una sequenza casuale di DNA per un dato enzima di restrizione è una volta ogni 4 n , dove n è il numero di basi nella sequenza di riconoscimento degli enzimi di restrizione. Il "4" deriva dal fatto che ci sono quattro diversi possibili nucleotidi che possono essere inseriti in una qualsiasi posizione (G, A, T o C).

Eco RI e ciao dIII hanno un sito di riconoscimento a sei basi, quindi taglieranno una volta ogni 4 6 o 4096 basi.

ciao dII ha un sito di riconoscimento a cinque basi, quindi taglierà una volta ogni 4 5 o 1024 basi.

Hpa II ha un sito di riconoscimento a quattro basi, quindi taglierà una volta ogni 4 4 o 256 basi.

B. Per determinare il numero di siti, dividere il numero di basi nel DNA per la lunghezza media dei frammenti di restrizione risultanti dal dato enzima. La dimensione di l è 48.502 paia di basi, quindi il numero di siti previsti è:

2a. Taglio con ciao dIII produrrà frammenti di 1, 2 e 2,5 kilobasi. Taglio con Eco RI produrrà frammenti di 1,5, 2 e 3,5 kilobasi. Tagliare con entrambi ciao dIII e Pvu II produrrà frammenti di 1, 1,5 e 2 kilobasi.

B. Il cDNA in pBR322 consisterà solo dei due esoni, che sono affiancati alle estremità da EcoRI. Quando tagliato da EcoRI, il cDNA produrrà 0,5, 1,5 e 2 frammenti di kilobase. La digestione sia con EcoRI che con HindIII produrrà frammenti di 0,5, 1 e 1,5 kilobase.

C. La sonda radiomarcata da 1 kb proviene dal secondo esone nel cDNA. Se ibridato al DNA genomico che è stato digerito a EcoRI, si ibriderà al frammento di 3,5 kilobasi.

D. La sonda radiomarcata derivata dal cDNA wild-type sarà in grado di ibridarsi solo alla sezione di DNA genomico che contiene il primo esone. Quando il DNA genomico viene tagliato con HindIII, questo frammento è lungo 2,5 kilobasi.

e. Poiché la lunghezza del Pvu II frammento di restrizione nel mutante è lo stesso di quello del wild-type, non sembra esserci alcuna delezione tra i due PvuII siti. Pertanto, la mutazione non è la stessa di quella nella parte d. La mutazione qui è probabilmente una mutazione puntiforme.

B. C'è almeno un introne, perché il cDNA radiomarcato non si è ibridato con i frammenti 1,5 e 0,5, ma si è ibridato con i frammenti fiancheggianti. Altri introni possono risiedere nei frammenti 2,5 e 4,5.

C. Due metodi che possono essere utilizzati per marcare i cDNA sono l'estensione del primer e la traduzione del nick. L'estensione del primer utilizza un primer oligonucleotidico e un frammento di Klenow per sintetizzare un filamento di DNA marcato. Nella traduzione dei nick, una piccola quantità di DNasi viene utilizzata per creare nick nel dDNA. Gli oligonucleotidi marcati vengono quindi aggiunti con la DNA polimerasi I per riempire i nick.

4.a. Le "estremità appiccicose" risultanti dalla digestione con gli enzimi sono le stesse, ma i siti di restrizione effettivi sono diversi.

B. Dopo aver isolato il plasmide, digerirlo con entrambi gli enzimi, purificare il frammento da 4.5 kb, autolegare il frammento, trasformare il nuovo plasmide in batteri.

C. Non ci sarà BamCIAO o BglII siti.

D. È possibile tagliare nuovamente con entrambi gli enzimi dopo la legatura: ciò assicurerebbe che solo un plasmide privo di entrambi i siti trasformi i batteri.

5. Cammina verso un clone che si sovrappone alla fine di una traslocazione o delezione (questo mostrerà la differenza nei Southern blot da organismi con e senza l'anomalia genetica). Utilizzare un clone da wild-type per raccogliere un frammento di giunzione nel ceppo mutante. Usa questo frammento per prelevare un clone all'altra estremità dell'anomalia cromosomica da una libreria selvaggia.

6.a. Una mappa di restrizione del frammento è mostrata di seguito:

B. Isolare mRNA e DNA genomico da un animale. Esegui l'mRNA su un gel e trasferiscilo su un blot (questo è chiamato Northern blotting). Usando l'estensione del primer o la traduzione del nick, etichetta il DNA genomico isolato e usalo come sonda per ibridare al blot. La sonda dovrebbe ibridarsi con il suo mRNA corrispondente e la posizione della sonda sul blot dovrebbe dirti la dimensione dell'mRNA.

C. Vedi sopra il cDNA mapperà le aree designate da |/////////|

7.a. Per isolare solo il DNA, utilizzare RNasi (o base). Per isolare l'RNA, usa Dnase.

B. Usa un enzima di restrizione, riesegui il gel e somma le dimensioni della banda se più di un DNA, dovrebbero sommarsi a una banda maggiore della banda originale.

C. Un metodo per isolare a D. melanogaster omologo del gene è creare una sonda marcata dal clonato C.elegans gene e ibridarlo in una libreria di D. melanogaster DNA. Un altro metodo consiste nel creare primer da sequenze nel gene di C. elegans e utilizzarlo per PCR l'omologo da D. melanogaster DNA genomico.

D. Eseguire l'mRNA su un gel, trasferire l'RNA su un blot e quindi ibridare il Northern blot con una sonda etichettata generata dal gene.

e. Lascia che la progenie di tipo selvatico si accoppi. Se la mutazione mostra penetranza incompleta, allora la progenie di tipo selvaggio dovrebbe produrre una progenie mutante.

8 . La trascrizione inversa viene utilizzata per produrre cDNA dall'mRNA e la PCR viene utilizzata per amplificarlo.

9 . un. io) Bam CIAO ii) ciao dIII iii) Eco RI (iv) ciao dIII e Eco Ri?

B. Solo il 4 e 5 kb Bam I frammenti HI (che contengono gli esoni) si ibrideranno sui Northern blot (ad un mRNA di 6 kb) e questo si troverà solo nel canale del fegato.

C. Solo una banda di 2 kb e 3 kb sarà trovata sul blot, questi risultano dalle regioni ibride DNA/RNA che non sono state digerite dalla nucleasi S1, che degrada gli acidi nucleici a singolo filamento.

D. Eliminando i 6 kb . iniziali ciaodIII, sono stati omessi gli elementi regolatori necessari per la trascrizione.

10. Falso, è vero il contrario.

11. Gli YAC (cromosomi artificiali di lievito) contengono elementi ARS di lievito (per la replicazione), segmenti di telomeri ed elementi CEN (segmenti di centromeri) possono contenere diverse centinaia di Kb di DNA. I cosmidi sono plasmidi modificati che hanno le cos (estremità coesive) del fago lambda e le sequenze plasmitiche (per la replicazione e la selezione dei farmaci) possono contenere 20-40 Kb di DNA.


Familiarizzare con il proprio plasmide di interesse

Iniziamo con un classico plasmide: pBR322 1 . È spesso usato come spina dorsale per i vettori derivati ​​perché ha tutte le caratteristiche necessarie per una clonazione di successo (Figura 1). Come vedete dal centro della mappa, la dimensione del plasmide linearizzato è 4361 paia di basi. Prima di iniziare a lavorare con qualsiasi plasmide, è consigliabile linearizzarlo tagliandolo con un enzima di restrizione unico per verificare che la dimensione pubblicizzata sia all'incirca la stessa prevista.

Le frecce nere indicano la direzione della trascrizione, essenziale per la clonazione. Se cloni il tuo gene di interesse in mezzo a un altro gene, assicurati che entrambi siano trascritti nella stessa direzione. Altrimenti, il promotore nativo può interferire con la tua espressione genica.


1. Perché era importante trovare un enzima che tagliasse il plasmide in un solo sito? Cosa potrebbe accadere se il plasmide fosse tagliato in più di un sito? Vuoi semplicemente aprire il DNA circolare in modo che il DNA umano possa essere inserito nel cerchio. Se gli enzimi tagliano in più punti, otterresti più frammenti.

2. Quale enzima di restrizione hai usato? __ diversi sono possibili __ Chiedi ad altri gruppi cosa hanno usato e confronta i plasmidi transgenici finali. Perché potrebbero esserci alcune lunghezze diverse? dipende da dove l'enzima ha tagliato il DNA umano, avrebbe potuto fare un pezzo più lungo

3. Perché era importante scartare gli enzimi che tagliano il plasmide nel sito di replicazione? se vuoi che il tuo DNA venga copiato, allora hai bisogno dei batteri per potersi riprodurre, il sito di replicazione è necessario

4. Perché è importante tagliare il plasmide e il DNA umano con lo stesso enzima di restrizione? le estremità devono combaciare in modo da poterle unire insieme

5. Gli enzimi di restrizione esistono naturalmente negli organismi? Se sì, qual è il loro scopo? attaccano e distruggono gli invasori, come i virus

6. Perché gli enzimi di restrizione che hanno creato estremità "smussate" non sarebbero utili nella ricombinazione come quelli che creano estremità appiccicose? le estremità smussate non si attaccheranno ad altro DNA

7. Nell'attività, hai simulato la creazione di un organismo batterico ricombinante. Per ciascuno dei seguenti materiali, indicare cosa rappresentano?
Forbici ______ enzima di restrizione_ ___
Nastro ______ ligasi _________


Usi tradizionali della clonazione del DNA

La clonazione del DNA tradizionale mediante endonucleasi restrittiva ha molteplici usi. Il DNA ricombinante espresso (sequenze di DNA che codificano per la sintesi proteica), quando inserito nell'informazione genetica dei batteri, stimola i batteri a produrre la proteina bersaglio.

Questo è il metodo con cui gli ingegneri genetici nelle aziende farmaceutiche producono insulina umana, albumina umana, alcuni vaccini, anticorpi monoclonali e ormone della crescita umano a un costo molto inferiore rispetto all'estrazione di questi prodotti da organismi multicellulari. Il DNA ricombinante viene anche utilizzato per diagnosticare malattie ereditarie e produrre antibiotici su vasta scala.

L'analisi genica è un vasto settore in cui gli ingegneri genetici inseriscono sequenze di DNA ricombinante scisse (rDNA) per aiutarci a capire cosa fanno i geni specifici. Comprendendo i geni, abbiamo quindi i dati di cui abbiamo bisogno per apportare modifiche che possono potenzialmente sradicare la malattia.

Le colture geneticamente modificate sono il risultato delle tradizionali tecniche di clonazione molecolare in cui la resistenza a insetti ed erbicidi e una maggiore produzione per ettaro quadrato sono gli obiettivi principali. Questo metodo migliora anche la fissazione dell'azoto nelle piante e nelle colture.

L'industria della ristorazione utilizza il DNA ricombinante nei processi di fermentazione e caseificazione, nonché per rilevare la presenza di batteri e funghi patogeni sulle superfici utilizzate per la preparazione degli alimenti.

Tuttavia, per produrre risultati che possano migliorare la nostra salute o le fonti di cibo, è essenziale la nostra conoscenza della funzione di ogni gene. Solo una volta scoperta la funzione di una sequenza di DNA è possibile utilizzarla correttamente. La clonazione tradizionale del DNA è stata la prima tecnica utilizzata nel campo della mappatura del genoma che, per molti anni, ci ha insegnato come vengono espressi i geni. Con i nuovi enzimi di restrizione artificiale, ci si può aspettare che l'ingegneria genetica avanzi solo nei prossimi decenni.


Recensione

Termini e concetti

  • linearizzare
  • Indicatore di peso molecolare
  • Enzima di restrizione
  • Sito di restrizione
  • DNA superavvolto e DNA lineare

Rivedere le domande

  1. Perché è importante se il DNA su un gel è superavvolto?
  2. Perché è importante aggiungere l'enzima per ultimo quando si imposta un digest di restrizione?
  3. In un quiz, preparati a calcolare le quantità di tutti gli ingredienti in un digest di restrizione, come mostrato in questa pagina.

Sequenziamento

Questa sezione spiega come comporre il vettore e inserire il DNA in modo generale.

Procedura¶

Questo richiede almeno quattro giorni per estrarre il DNA plasmidico ligato.

Preparare campioni (diverse ore)

Vedere Amplificazione PCR sezione per i dettagli. Dopo l'amplificazione, è necessario purificare il DNA prodotto perché esistono polimerasi/endonucleasi e queste proteine ​​possono influenzare le fasi a valle.

Se si desidera utilizzare il DNA estratto dal plasmide, assicurarsi che la concentrazione del campione sia sufficiente.

Stima della concentrazione del campione (1 ora)

Utilizzare la seguente formula per calcolare la massa richiesta per la digestione

Messaggio di sistema: ERROR/3 (/home/docs/sites/readthedocs.org/checkouts/readthedocs.org/user_builds/molecular-biology-protocols/checkouts/latest/DNA.rst, riga 562)

Comando LaTeX sconosciuto: punti

Digerire la massa appropriata di DNA campione. Regolare il volume della soluzione di digestione con |ddH2O| . Vedere Restrizione digest sezione per i dettagli. La sezione ha assunto la stessa condizione di questa procedura.

Dopo essere stato digerito, precipitare a 10 |ul| di Precipitazione di etanolo

Vedere Legatura del DNA sezione per i dettagli. La sezione ha assunto la stessa condizione di questa procedura.

Trasformazione (durante la notte)

Vedere Protocolli per |E.coli| protocolli per i dettagli. Incubare a 37 |C| durante la notte

Vedere Protocolli per |E.coli| protocolli per i dettagli. Il più delle volte sono sufficienti 5 colonie per ogni campione da raccogliere (dipende dalla difficoltà di legatura)

Isolamento di una singola colonia (durante la notte)

Trasferire la colonia isolata nel terreno (durante la notte)

Per estrarre il DNA plasmidico, scegli una colonia e diluiscila a 2 |ml| di SOC e incubare a 37 |C| durante la notte


Metodo di clonazione basato su enzimi di restrizione

La clonazione basata su enzimi di restrizione dipende da due cose: in primo luogo, dipende dalla capacità degli enzimi di restrizione di "tagliare" entrambi i frammenti di DNA, ovvero il frammento e il vettore. In secondo luogo, la clonazione basata su enzimi di restrizione richiede che l'enzima, la DNA ligasi, "incolli" il frammento di DNA nel vettore. Questo metodo è relativamente più economico rispetto ad altri metodi di clonazione.

Clonazione del DNA basata su enzimi di restrizione. 1. Brevi sequenze contenenti siti di restrizione vengono aggiunte alle estremità 5' dei primer durante l'amplificazione del DNA mediante PCR. 2. Sia il vettore che il frammento di DNA vengono digeriti con enzimi di restrizione per creare estremità coesive. 3. Il vettore e il frammento di DNA sono legati. 4. Il DNA ricombinante entra nella cellula ospite durante la trasformazione.


Analisi di laboratorio pGLO

I plasmidi sono pezzi di DNA circolare che si trovano nei batteri che possono codificare per geni che possono far sì che i batteri abbiano "caratteristiche" extra. Con il plasmide pGLO questa "caratteristica" extra fa brillare i batteri (dalla proteina fluorescente verde che è stata inserita) e ha anche resistenza all'ampicillina (dalla proteina beta-lattamasi). Aggiungendo il plasmide pGLO i batteri E.coli potranno crescere su agar con zucchero arabinosio e ampicillina. La ragione principale per fare questo laboratorio è capire meglio come i geni controllano i tratti, il modo migliore per farlo è fare la mutagenesi. Esistono diversi modi per preformare la mutagenesi e in questo laboratorio viene eseguita aggiungendo un trasposone al plasmide pGLO e quindi osservando come il trasposone influenza l'aspetto e la crescita del batterio. Osservando il modo in cui i batteri crescono e l'aspetto, possiamo determinare dove è stato inserito il trasposone, questo ci aiuta a capire meglio come i geni controllano i tratti. Nel campione che abbiamo lavorato con i batteri mutagenizzati non brillavano di verde sotto la luce UV, il che ci dice che il trasposone si è inserito nel gene araC ed è confermato nel gel dell'elettroforesi.

I plasmidi sono stati studiati nella ricerca genetica da quando sono stati scoperti nel 1952 da Joshua Lederberg. Sono stati usati per capire come alcuni batteri reagiscono a diversi tipi di antibiotici e per cambiare il modo in cui funzionano i batteri aggiungendo cose nei plasmidi. In questo laboratorio il plasmide su cui ci siamo concentrati era il plasmide pGLO. Questo plasmide ha tre principali regioni codificanti che esamineremo. La prima regione del gene è la regione che codifica per l'enzima beta-lattamasi (bla). “La proteina beta-lattamasi è prodotta e secreta dai batteri che contengono il plasmide. La beta-lattamasi inattiva l'ampicillina presente nell'agar nutriente LB, consentendo la crescita batterica. Solo i batteri trasformati che contengono il plasmide ed esprimono la beta-lattamasi possono sopravvivere su piastre che contengono ampicillina. (Leatherman 2011). La Green Fluoresce Protein (GFP) è un codice genetico che viene inserito nel plasmide pGLO per farlo brillare di verde sotto la luce UV con l'aiuto del gene araC. Il gene araC codifica per una proteina che si lega all'arabinosio e alla regione del promotore anche in presenza di arabinosio, quando legato alla regione del promotore del gene GFP traduce la proteina che farà brillare i batteri.

La mutagenesi non si verifica molto spesso in natura, ma può essere utilizzata regolarmente nei laboratori di genetica per aiutare a studiare diverse funzioni di batteri e plasmidi. Facendo mutagenesi sui batteri possiamo capire meglio come i batteri traducono i geni e come reagiscono al loro ambiente quando qualcosa cambia. Ci sono un paio di modi per preformare la mutagenesi come l'uso di sostanze chimiche o raggi X. In questo esperimento la mutagenesi viene eseguita inserendo un trasposone nel plasmide pGLO. Il trasposone Tn5 sarà inserito nel gene pGLO il trasposone Tn5 codifica per una proteina che porta alla resistenza della kanamicina, che ci aiuterà a vedere se il trasposone è stato inserito correttamente.

Dopo che il trasposone è stato inserito nel plasmide pGLO, sarà assorbito dai batteri E.coli per trasformazione. La trasformazione avviene quando i batteri assorbono il DNA libero dall'ambiente circostante. Una volta che i plasmidi sono stati assorbiti, i batteri sono stati coltivati ​​su agar nutritivi con diverse combinazioni di ampicillina, kanamicina e arabinosio insieme a gruppi di controllo per vedere come i batteri mutanti sono stati influenzati dal trasposone.

I batteri usano gli enzimi di restrizione da soli per sbarazzarsi dei batteriofagi tagliando le proteine ​​che producono o tagliando direttamente il fago (Aude). Siamo in grado di utilizzare questi enzimi di restrizione per digerire l'enzima di restrizione per tagliare i plasmidi che sono stati inseriti nei batteri. “Gli enzimi di restrizione sono comunemente usati per tagliare il DNA in particolari sequenze nucleotidiche. Spesso si tratta di creare un nuovo "pezzo ricombinante di DNA, seguito dalla legatura di due pezzi". (Leatherman 2011). I plasmidi sono stati tagliati in posizioni note del plasmide con enzimi Nde 1 ed EcoR1. Conoscendo la quantità di coppie di basi che sono nel plasmide (5.400 bp) e dove tagliano gli enzimi di restrizione possiamo esaminare i diversi pezzi del plasmide tagliato per scoprire dove si è inserito il trasposone.

Utilizzare il kit di inserimento Tn5 per inserire il trasposone Tn5 nel plasmide pGLO. Il primo passo è stato mescolare 6,4 microlitri di acqua, 1 microlitro di tampone di reazione EZ Tn5 10X, 1 microlitro di 0,2 microgrammi/microlitro di plasmide pGLO, 0,6 microlitri di trasposone Tn5 e 1 microlitro di trasposasi EZ-Tn5 (aiuta l'inserimento del trasposone ) in questo ordine e mescolare vortexando, quindi centrifugare. Incubare la provetta a 37 gradi Celsius per 50 minuti, quindi estrarre la provetta e farla girare di nuovo e riportare la provetta nell'incubatrice per altri 50 minuti. Girare ancora una volta e aggiungere 1 microlitro di soluzione di arresto alla provetta, mescolare bene e far girare nuovamente il liquido sul fondo della provetta. Scaldare il tubo a 70 gradi per 10 minuti conservare in freezer per la prossima volta.

Trasferire 1,5 mL di E.coli in tre provette per microcentrifuga e mettere in ghiaccio per 10 minuti. Centrifugare le provette per 1 minuto ed eliminare tutto il surnatante. Aggiungere 300 microlitri di CaCl . ghiacciato2 a tutte e tre le provette sciogliere completamente il pellet pipettando e posizionare le provette in ghiaccio per 2 minuti. Centrifugare le provette per 1 minuto ed eliminare il surnatante. Aggiungere 60 microlitri di CaCL2 a ciascuna provetta e risospendere delicatamente il pellet e mettere in ghiaccio per 10 minuti. Etichetta le tre provette, No DNA, pGLO wt e pGLO mutant. Non aggiungere nulla, 1 microlitro di pGLO DNA e 1 microlitro di reazione pGLO di mutagenesi Tn5 rispettivamente a ciascuna provetta. Mescolare delicatamente le provette picchiettandole e porre in ghiaccio per 15 minuti. Riscaldare le provette a 42 gradi per esattamente 90 secondi e tornare immediatamente al ghiaccio per 2 minuti. Aggiungere 1 ml di brodo LB alle provette, quindi trasferire il contenuto di ciascuna provetta in una provetta e incubare a 37 gradi per 30 minuti agitando. Ottenere ed etichettare 5 diverse piastre di agar come mostrato nella tabella 1 ed etichettarle. Trasferire i batteri in nuove provette per microcentrifuga e farli girare per 1 minuto e rimuovere 500 microlitri di surnatante, risospendere i batteri nel brodo. Aggiungere 200 microlitri di ciascuna reazione alle rispettive piastre di agar e diffondere i batteri sulle piastre di agar. Incubare le piastre a 37 gradi nella sala di preparazione per un giorno.

Tabella 1. DNA aggiunto alle diverse piastre e previsioni.

Preparare due provette di coltura sterili con 5 mL di brodo LB, uno con ampicillina e uno con kanamicina, etichetta che è. Esaminare le piastre e scegliere una colonia di tipo selvatico e mettere la colonia nel brodo LB con ampicillina. Guarda la piastra con il mutante pGLO e guarda se qualcuna delle colonie si illumina di verde sotto la luce UV. La colonia scelta per questo esperimento era bianca. Prendi la colonia e metti in brodo LB con kanamicina. Mettere le provette nell'incubatrice a 37 gradi e incubare durante la notte. Guarda tutti i piatti e confronta i risultati con le tue previsioni. Ottenere le colture dall'incubatrice e trasferirle in una provetta da 15 ml per centrifugare. Spin in centrifuga refrigerata a 3000 rpm per 5 minuti e scartare il surnatante. Aggiungere 250 microlitri di tampone P1 (rimuove l'RNA) a ciascun pellet di batteri e risospendere il pellet e trasferire immediatamente nella provetta per microcentrifuga. Aggiungere 250 microlitri di tampone P2 (lisi delle cellule) e mescolare capovolgendo per non più di 5 minuti. Aggiungere 350 microlitri di tampone N3 (pH ideale per il legame della colonna) e mescolare immediatamente capovolgendo la provetta. Girare per 10 minuti fino a quando non si forma una pallina bianca. Pipettare il surnatante in colonne spin separate e far girare per 30 secondi, quindi scartare il flusso continuo. Aggiungere 750 microlitri di tampone PE (lava il DNA) alla colonna e far girare per 30 secondi e scartare il flusso continuo. Collocare la colonna in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 ml, aggiungere 50 microlitri di acqua (eluizione del DNA) alla colonna di rotazione e lasciarla riposare per 1 minuto. Spin per 1 minuto, quindi scartare la colonna di rotazione e mantenere il flusso continuo. Misurare le concentrazioni dei due campioni di DNA, quindi mettere in freezer per la prossima settimana. La concentrazione del DNA wild-type era di 68,2 nano grammi/microlitro con una purezza di 1,84 e il DNA mutante aveva una concentrazione di 81,9 nano grammi/microlitro con una purezza di 1,64 che non era così pura

Utilizzare la mappa di restrizione per determinare il numero di bande nei plasmidi wild-type tagliati in luoghi diversi.

Tabella 2. Dimensioni delle bande di plasmidi wild-type con tagli diversi.

Mescolare ogni soluzione in base a ciò di cui ha bisogno ogni provetta. Utilizzare la concentrazione di DNA per determinare quanto DNA deve essere aggiunto a ciascuna provetta (500/concentrazione=quanto DNA è necessario).

Peso non tagliato mutante non tagliato Nde1 peso mutante Nde1 EcoR1 peso mutante EcoR1 Nde1 + EcoR1 peso Nde1 + mutante EcoR1
Acqua 12.67 13.9 10.17 11.4 10.17 11.4 10.12 11.4
Buffer 10X Nessuno Nessuno 2Buffer 4 2Buffer 4 2 tampone EcoR1 2 tampone EcoR1 2 tampone EcoR1 2 tampone EcoR1
DNA: 5 milligrammi 7.33 6.1 7.33 6.1 7.33 6.1 7.33 6.1
Enzima Nde1 (20 unità/microlitro) Nessuno Nessuno .5 .5 Nessuno Nessuno .5 .5
Enzima EcoR1 (20 unità/microlitro) Nessuno Nessuno Nessuno Nessuno .5 .5 .5 .5

Tabella 3. Miscele di ciascuna provetta. (tutto in microlitri)

Mettere le otto provette nell'incubatore a 37 gradi per 1,5 ore affinché la reazione proceda, una volta trascorse 1,5 ore mettere le provette nel congelatore per la prossima volta.

Diluire il tampone 50X in tampone 1X aggiungere 20 ml di tampone 1X TAE in un cilindro graduato e quindi aggiungere 980 ml di acqua nel cilindro. Preparare un gel di agarosio all'1,2% pesare 0,6 grammi di agarosio in polvere e svuotarlo in un pallone, quindi prendere 50 mL di tampone TAE 50X e aggiungerlo al pallone. Mescolare l'agarosio e il tampone quindi metterlo in un microonde per circa un minuto o fino a quando la soluzione diventa limpida. Lascia raffreddare la fiaschetta finché non puoi toccarla senza scottarti. Metti il ​​vassoio nella scatola da corsa con entrambi i lati rivolti verso l'alto e il pettine in posizione e versa la soluzione di agarosio nel vassoio. Lascia riposare l'agarosi finché non diventa di un colore bianco latte e si indurisce. Durante l'attesa caricare 2 microlitri di colorante di caricamento 10X in ciascuna provetta e miscelare pipettando. Abbassare i lati del vassoio e quindi riempire la scatola in esecuzione con il tampone TAE fino a coprire la parte superiore del gel. Caricare la scala da 1 kb all'estremità sinistra con 10 microlitri di scala da 1 kb. Prendere le reazioni di PCR della settimana precedente e riempire nell'ordine gli 8 spazi successivi nel gel con 20 microlitri delle reazioni di digestione di restrizione. Dopo che il gel è stato caricato, far funzionare il gel per circa 45 minuti a 100 volt, controllare periodicamente per vedere se i coloranti si stanno spostando lungo il gel. Una volta che il colorante è uscito circa a metà del gel, estrailo dalla scatola da corsa e metti il ​​gel in una scatola per colorazione. Versare il verde SYBR nella scatola di colorazione fino a quando il verde SYBR non copre la parte superiore del gel, agitare la scatola ogni 5 minuti. Il verde SYBR si lega al DNA e ci permette di guardare il DNA sotto una luce UV. Dopo 15 minuti estrarre il gel dalla confezione e versare nuovamente il SYBR green nel flacone. Prendi il tuo gel e mettilo in una scatola UV e scatta una foto del tuo gel per vedere i risultati della tua PCR.

Quando i batteri sono stati esaminati per la prima volta, i batteri mutagenizzati non hanno brillato in verde quando sono stati sottoposti a luce UV, il che significa che il trasposone potrebbe essersi inserito nel gene araC o nel gene GFP.

Tabella 4. Risultati delle piastre di agar.

Quando si miscelavano gli enzimi di restrizione, l'enzima di restrizione veniva scambiato per tampone quando veniva aggiunto ai tubi mutanti, il che rendeva illeggibili sul gel i tubi mutanti.

Figura 2. La riga 1 è la scala 1kb. 2 plasmide non tagliato di tipo selvatico. 3 taglio nde di tipo selvatico. 4 taglio ecologico di tipo selvatico. 5 taglio eco/nde wild type. 6 mutante non tagliato. 7 mutante nde tagliato. 8 mutanti eco taglio. 9 mutante eco/nde cut

Da questo gel possiamo vedere che il non tagliato wild-type e il taglio EcoR1 sono gli stessi che è quello che ci si aspettava. Ci sono quattro bande sul taglio naturale EcoR1/Nde1 nelle regioni 300 e 500 e nelle aree 1000 e 2000. E tre bande sulla Nde1 tagliano nelle aree 300, 1000 e 2000. Quindi tutti i campioni di tipo selvatico erano dove erano previsti. Sfortunatamente i campioni mutanti non sono leggibili.

Figura 3. La riga 1 è la scala 1kb. 2 plasmide non tagliato di tipo selvatico. 3 taglio nde di tipo selvatico. 4 taglio ecologico di tipo selvatico. 5 taglio eco/nde wild type. 6 mutante non tagliato. 7 mutante nde tagliato. 8 mutanti eco taglio. 9 mutante eco/nde cut.

In questa figura puoi vedere che nella riga 6 non ha viaggiato fino al wild-type non tagliato nella riga 2, dicendoci che il trasposone è nel campione. Guardando le righe 7 e 9 c'è una barra mancante a circa 1.800 coppie di basi come nelle righe 3 e 5. Qui è dove il trasposone viene inserito nel gene araC che si trova in uno dei tagli Nde1 che ha circa 1.800 basi -coppie. Nel gel l'aggiunta del trasposone a questa regione fa sì che la barra da 1.800 rimanga indietro dove si trova la barra da 2.800 coppie di basi e la fa sembrare solo una barra sul gel.

Il trasposone è stato trovato nel gene araC del plasmide pGLO dai risultati del gel. Essendo il trasposone nel gene araC, non produce la proteina che si lega alla regione del promotore del gene GFP che ha portato i batteri mutagenizzati a non brillare di verde sotto la luce UV. L'inserimento del trasposone nel gene araC potrebbe anche spiegare perché c'era così poca crescita mutante sulla piastra su cui è stato posizionato il batterio mutante. Il problema con il gel originale era che ai tubi veniva aggiunto più enzima che rendeva illeggibili i campioni mutanti sul gel.

Aude A Bourniquel, Thomas A Bickle, Enzimi di restrizione complessi: motori molecolari guidati da NTP, Biochimie, Volume 84, Numero 11, 1 novembre 2002, pagine 1047-1059, ISSN 0300-9084, 10.1016/S0300-9084(02)00020- 2.

Leatherman J. 2011 Manuale di laboratorio di genetica. Università del Colorado settentrionale


Come si calcola il peso molecolare del DNA?

Se hai una grande molecola di DNA, probabilmente la taglierai in frammenti più piccoli usando un cosiddetto enzima di restrizione del DNA.

Passo 2. Elettroforesi su gel

Quindi posizionerai campioni adeguatamente preparati della soluzione di acido nucleico nei pozzetti di un sistema di elettroforesi su gel di agarosio e applicherai una tensione per un periodo di tempo specificato.

In uno dei pozzetti, metti anche una "scala del DNA": un campione che contiene frammenti di DNA con un numero noto di coppie di basi.


(Da www.slideshare.net)

Il gel finito potrebbe assomigliare a questo:

Le corsie su ciascuna estremità sono le scale. Le distanze percorse sono proporzionali alle masse molari dei frammenti.

Passaggio 3. Calcola il numero di coppie di basi nei tuoi frammenti

Crea una curva standard dalle tue scale tracciando log (coppie di basi) (bp) rispetto alla distanza percorsa (d).

Otterresti un grafico come questo:

Se uno dei tuoi frammenti fosse migrato di 1,80 cm, avresti calcolato

#log("bp")= "-0,4637×1,80 + 4,3366" = 3.501#

Passaggio 4. Calcola la massa molare del frammento.

La massa media di una coppia di basi è 650 u.

Quindi, la massa del frammento è

#3176 color(rosso)(cancel(color(black)("bp"))) × "650 u"/(1 color(red)(cancel(color(black)("bp")))) = 2,06 × 10^6colore(bianco)(l) "u"#