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Modi creativi per disattivare l'alfa-amilasi prelevata dai funghi

Modi creativi per disattivare l'alfa-amilasi prelevata dai funghi


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Posso disattivare la $alpha$-amilasi in modi come i controlli della temperatura estrema, i controlli del pH della soluzione in cui rimane o l'aggiunta di sale alla soluzione.

Tuttavia, ci sono altri modi unici o elaborati per disattivare l'enzima? (forse l'ipotesi della serratura e della chiave funziona anche per gli enzimi E enzimi?)


Gli inibitori dell'amilasi hanno attirato molta attenzione a causa del loro potenziale nel trattamento del diabete di tipo 2.

È possibile inattivare la maggior parte degli enzimi utilizzando un inibitore specifico. Una classe di inibitori è costituita da molecole che assomigliano alle molecole del substrato ma non sono agite allo stesso modo. Questi si legheranno al sito attivo e impediranno al substrato di legarsi. Un inibitore di molte amilasi è l'acarbosio. Questo è un inibitore competitivo, il che significa che l'inibizione è superata da alte concentrazioni di substrato.

E se questo non è abbastanza per iniziare, ecco un'intera tesi sul tema degli inibitori dell'amilasi.

Se si desidera bloccare in modo permanente l'attività, il composto ideale sarebbe quello che si lega al sito attivo e lo modifica in modo covalente, distruggendo l'attività enzimatica. Questo sarebbe un inibitore irreversibile. Tuttavia, non sono riuscito a trovare un riferimento a un composto del genere.


Aeromonas

Amilasi

Le α-amilasi sono idrolasi dell'amido con diverse sequenze di amminoacidi che sono altamente conservate tra i membri della famiglia. amilasi di A. idrofila ceppi hanno una dimensione di circa 48-49 kDa, anche se un'amilasi maggiore (70 kDa) si trova in A. idrofila JMP636. L'αamilasi di UN. idrofila MCC-1 mostra la conservazione nei residui catalitici e leganti il ​​substrato. Inoltre, tre dei quattro residui leganti il ​​calcio (Asn100, Asp167, His201) ​​presenti in altre amilasi sono trattenuti in MCC-1, coerentemente con il fatto che questo enzima richiede calcio per l'attività.


2. Funzione pancreatica

Localizzazione, regolazione e carenza di amilasi

L'amilasi pancreatica è simile ad altre proteine ​​secretorie ed è sintetizzata nel reticolo endoplasmatico ruvido. Quindi si muove attraverso l'apparato di Golgi e viene immagazzinato in granuli secretori fino al momento in cui subisce una secrezione regolata. L'immunocolorazione rivela la sua concentrazione nei granuli (Figura 1). Come con altri enzimi pancreatici, la quantità di amilasi nel pancreas è regolata dalla quantità di substrato alimentare (8, 22, 55). I roditori che seguono una dieta ricca di carboidrati sintetizzano più amilasi, che è l'enzima digestivo pancreatico più abbondante in queste specie. Questo effetto si verifica a livello trascrizionale e l'effetto è mediato in gran parte dall'insulina. Con il diabete l'amilasi pancreatica diminuisce, ma può riprendersi dopo il trattamento insulinico (30, 61). Ciò è particolarmente evidente nei ratti, dove nel diabete sperimentale l'amilasi pancreatica scende solo a una piccola percentuale del normale. Un elemento insulino-reattivo di 30 paia di basi è stato identificato nel gene del topo Amy2-2 (28). Il fatto che i topi esprimano più di un gene Amy2 funzionale spiega perché l'amilasi pancreatica totale non cade tanto nel diabete quanto nei ratti (18).

Figura 1: Localizzazione immunofluorescente dell'amilasi nel pancreas di topo (verde). I nuclei sono colorati di blu con DAPI.

I volontari sani sono in grado di assorbire quasi il 100% di un carico di amido. Tuttavia, nella pancreatite cronica con perdita del tessuto pancreatico funzionante, solo il 90% circa viene digerito e assorbito con la completa inibizione dell'amilasi, che si riduce all'80-85% (31). In quest'ultimo caso fino al 20% dei carboidrati raggiunge l'ileo e viene bloccato l'aumento del GIP plasmatico e del peptide C dalla proinsulina. Sono stati segnalati pazienti con deficit isolato di amilasi con malassorbimento di carboidrati e relativi sintomi (37, 54). I pazienti valutati hanno mRNA intatto ma nessuna proteina amilasi. Questo è simile al deficit fisiologico di amilasi pancreatica alla nascita, dove la mancanza di sintomi è in parte dovuta al basso contenuto di amido alimentare che richiede amilasi e in parte all'azione dell'amilasi salivare. La carenza di amilasi può essere sottostimata a causa di sintomi lievi.

Recentemente, è stato dimostrato che la quantità di mRNA dell'amilasi pancreatica e l'attività dell'amilasi nel digiuno di ratti sensibili ai carboidrati è correlata all'ossidazione del glucosio nella dieta e all'accumulo di grasso viscerale (5)

Amilasi sierica come misura della funzione pancreatica nella pancreatite

La determinazione dell'amilasi sierica è stata a lungo un cardine nella diagnosi della pancreatite acuta (1, 26). L'amilasi sierica negli individui normali è per metà salivare e per metà pancreatica e ciascuna esiste in diverse isoforme che contribuiscono tutte all'amilasi totale. A causa dell'esistenza di dosaggi e standard diversi, il cutoff per la pancreatite acuta è solitamente espresso in relazione all'intervallo di normalità per il particolare laboratorio clinico. Livelli superiori a tre volte il limite superiore della norma (ULN) sono generalmente considerati indicativi di pancreatite. Tuttavia, la specificità diagnostica è solo del 70-90% a seconda della popolazione studiata e del gold standard utilizzato (13, 64). Una specificità più elevata si ottiene quando viene utilizzato un punto di cutoff più elevato, ad esempio 5 o anche 9 volte l'ULN, ma a scapito di una sensibilità inferiore. L'utilizzo di test per inibire l'amilasi salivare con l'inibitore del germe di grano o gli anticorpi monoclonali (59) o la sua rimozione con l'anticorpo monoclonale immobilizzato (40) aumenta leggermente la specificità e aiuta ad eliminare un contributo da tumori o altri organi che producono principalmente amilasi salivare, ma questi test non sono sempre disponibile. La combinazione di lipasi sierica con amilasi è generalmente disponibile e aiuta quando i livelli di amilasi sierica hanno già raggiunto il picco e sono diminuiti. Un aumento dell'amilasi sierica può anche essere dovuto alla macroamilassemia in cui l'amilasi è legata alle proteine ​​plasmatiche (di solito IgA o IgM), ma ciò si verifica solo nell'1-3% degli esseri umani normali. L'amilasi è elevata anche in una varietà di malattie chirurgiche, traumatiche e neoplastiche (13, 46, 64). La malattia renale può ridurre la filtrazione dell'amilasi e aumentare i livelli plasmatici, ma questo aumento è solitamente piccolo poiché la filtrazione glomerulare è solo una piccola parte della clearance dell'amilasi (46). Un aumento cronico di più enzimi pancreatici sierici inclusa l'amilasi in soggetti altrimenti sani senza malattia pancreatica è stato descritto da Gullo nel 1996 ed è ora definito iperenzimamia pancreatica benigna o sindrome di Gullo (23). Le tecniche di imaging avanzate possono scoprire un'anomalia pancreatica in alcuni di questi pazienti.

È anche importante essere consapevoli che la pancreatite può verificarsi senza aumento dell'amilasi sierica, specialmente con pancreatite alcolica o pancreatite cronica ricorrente (42). In alcuni di questi casi, la lipasi è elevata. Pertanto, sebbene l'amilasi sia ancora uno dei test più utili nella diagnosi della pancreatite acuta, dovrebbe essere eseguita insieme ad altri test (1) insieme alla comprensione del metabolismo dell'amilasi.

Secrezione di amilasi come misura della secrezione pancreatica o parotide regolata

La misurazione della secrezione di amilasi è diventata ampiamente adottata per misurare la secrezione proteica regolata da parte di pancreas o frammenti parotidei, fette o acini isolati. L'amilasi ha ricoperto questo ruolo perché è facile da misurare, sensibile e non richiede l'attivazione come le proteasi. Mentre per la misurazione dell'amilasi sierica nella pancreatite è desiderabile una quantità assoluta, la maggior parte delle misurazioni secretorie comportano l'analisi separata del prodotto secretorio, solitamente nel mezzo di incubazione, e del contenuto di tessuto e il calcolo del contenuto percentuale rilasciato in un tempo specificato. Mentre le prime misurazioni hanno analizzato i gruppi riducenti prodotti nel prodotto idrolitico, il più delle volte con acido dinitrosalicilico, gli studi negli ultimi 50 anni hanno utilizzato più comunemente i prodotti solubilizzati del substrato o un prodotto enzimatico colorato o fluorescente prodotto in una reazione accoppiata. Esempi di questo approccio sono l'amido blu Remazolbrilliant (48), l'amido marcato con Procion Yellow (27), l'antranilato di amilopectina (43) e l'amilosio F3GA Cibachronblue (29). Un substrato comunemente disponibile in commercio è il reagente Phadebas in cui un colorante blu non specificato è legato all'amido (12). Più comunemente questi studi di secrezione sono test endpoint in cui il tessuto viene incubato per un tempo standard e quindi aliquote del terreno vengono incubate con il substrato di amido per un tempo prestabilito, centrifugate e il prodotto letto in uno spettrofotometro o un fluorometro (39, 67). Alcuni di questi saggi sono stati adattati alla lettura continua con un sistema a flusso continuo (14, 34). Un secondo approccio utilizza substrati solubili incolori che possono essere incubati in un lettore di piastre con campioni del mezzo e portare a un prodotto colorato o fluorescente direttamente o attraverso una reazione accoppiata. Un substrato primario è l'etilidene-paranitrofenolo-G7. Questo può essere letto direttamente o il glucosio rilasciato determinato dalla glucosio ossidasi (65). Questo tipo di analisi è stato adattato anche alla tecnica dell'autoanalizzatore. Recentemente entrambi i tipi di test sono stati utilizzati per determinare l'amilasi duodenale umana con alta correlazione (19).

Inibitori dell'amilasi in medicina clinica

Gli inibitori dell'amilasi, in particolare l'acarbosio, uno pseudotetrasaccaride, sono stati utilizzati nel trattamento del diabete di tipo 2 dove hanno effetti moderati per ridurre il picco di glucosio postprandiale e l'emoglobina A1c. Normalmente, sono usati come farmaci di seconda linea spesso in combinazione con metformina (36). Esistono anche prove che l'acarbosio può ridurre la sindrome da dumping dopo la chirurgia bariatrica (11). Una serie di prodotti vegetali naturali con attività di inibitore dell'amilasi sono stati proposti o studiati come trattamento per il diabete, ma esistono poche prove conclusive per la loro efficacia.


Amilasi e un semplice esperimento enzimatico

Quando si tratta di digestione, la masticazione è l'ovvio punto di partenza. Meno evidenti invece sono tutti gli enzimi contenuti nella nostra saliva che aiutano anche la digestione. Gli enzimi, in parole povere, sono sostanze chimiche che aiutano la scomposizione delle sostanze o provocano una certa reazione chimica. Nel caso della saliva, un particolare enzima chiamato Amilasi aiuta la scomposizione o digestione dei carboidrati e dell'amido, trasformandoli in zuccheri. Parte della funzione della masticazione non è solo quella di rompere il nostro cibo in pezzi più piccoli, ma anche di mescolare accuratamente il cibo con l'amilasi in modo che il nostro cibo venga digerito in modo più efficiente. Potremmo aver sperimentato consapevolmente gli effetti dell'amilasi mangiando cibi ricchi di amido o carboidrati e notare che il cibo diventa leggermente più dolce dopo aver masticato un po'. Questo sapore dolce è il risultato dell'amilasi che scompone i carboidrati o l'amido in zuccheri dal sapore più dolce.

Abbiamo sviluppato un semplice esperimento di laboratorio che dimostra gli effetti dell'amilasi che chiunque può fare con alcune attrezzature di base. Questo è probabilmente un esperimento che altri hanno sviluppato, solo che non l'ho mai visto prima. Tutto ciò che serve è una provetta, acqua senza cloro, cracker salati, ioduro di potassio e spiedo. L'acqua del rubinetto può essere declorata lasciandola riposare per 24 ore e lo ioduro di potassio (IKI) e le provette possono essere acquistate on-line.

Ecco i passaggi per questo esperimento:
1. Schiacciare parte di un cracker salato in una polvere fine. Non ti serve molto, solo quanto basta per coprire il fondo di una provetta. (questo imita gli effetti della masticazione)
2. Metti il ​​cracker schiacciato sul fondo di una provetta, ne hai solo bisogno per coprire il fondo.
3. Aggiungere una quantità uguale di acqua declorata nella provetta e mescolare accuratamente.
4. Aggiungere una o due gocce di ioduro di potassio (IKI) alla miscela di cracker d'acqua e mescolare di nuovo accuratamente. A questo punto gran parte del cracker dovrebbe assumere un colore marrone. Questo è il risultato della colorazione degli amidi IKI nel cracker brown.
5. Raddoppia (o poco più) il volume totale nella provetta con la saliva. Sì, lascia che un po' di saliva si accumuli in bocca e poi sputa nella provetta.
6. Mescola e aspetta di vedere cosa succede.


Ricerca di facoltà

La nostra ricerca collega programmi accademici e laboratori esperienziali per coltivare una comunità attiva di ricerca orientata ai risultati.

La facoltà studia il cambiamento evolutivo utilizzando una varietà di tecniche sfruttando i recenti progressi nella metodologia genomica e l'evoluzione di virus, piante, pesci e umani.

I genetisti studiano i processi biologici esaminando le conseguenze fenotipiche dell'alterazione dei geni. La nostra facoltà studia come le informazioni codificate nel DNA vengono interpretate per produrre proteine ​​funzionali.

La facoltà di segnalazione studia la comunicazione cellulare e le vie intracellulari che regolano l'attività. Queste facoltà utilizzano un'ampia gamma di organismi modello e tecniche per esaminare una vasta gamma di vie di segnalazione coinvolte nella regolazione ormonale, nella trasduzione sensoriale e nella crescita e nel metabolismo cellulare.

Le facoltà cellulari e molecolari studiano la regolazione dell'espressione proteica, dalla trascrizione alla traduzione fino alla modifica post-traduzionale.

La nostra ricerca riguarda la biologia evolutiva delle piante, la filogenetica molecolare e la genomica delle popolazioni, la stabilità del genoma dell'espressione e della cromatina e la genetica degli invertebrati acquatici.

La nostra facoltà studia una varietà di sistemi modello utilizzando l'elettrofisiologia e le tecniche di imaging per comprendere la segnalazione sensoriale e i processi cellulari alla base di importanti disturbi neuronali.

La nostra facoltà studia la biologia cellulare e le vie di segnalazione utilizzate dai funghi filamentosi e dai lieviti in erba per adattarsi ai loro ambienti. La nostra ricerca utilizza il lievito come organismo modello per studiare i meccanismi dell'espressione genica.

La ricerca della facoltà si concentra sulla fotosintesi, sull'evoluzione delle piante, sulla genomica delle piante, sulla regolazione genica, sul risanamento ambientale e sull'ingegneria metabolica dei composti farmaceutici.


Musica della natura

Questo grafico mostra i livelli di alfa amilasi nelle donne che ascoltano musica rilassante (RM), acqua increspata (SW) o niente (R). Clicca per maggiori dettagli.

Questo grafico mostra i livelli di alfa amilasi nelle donne che ascoltano musica rilassante (RM), acqua increspata (SW) o niente (R). Clicca per maggiori dettagli.

Gli scienziati hanno testato come la musica classica e i suoni della natura influenzano i livelli di cortisolo e alfa-amilasi. I livelli di alfa-amilasi delle persone che hanno ascoltato musica classica sono tornati alla normalità più rapidamente rispetto alle persone che ascoltano i suoni della natura. Ciò suggerisce che la musica rilassante aiuta il corpo a tornare più rapidamente a uno stato di non stress.

Le persone che ascoltavano musica rilassante hanno mostrato una risposta allo stress più breve rispetto agli altri gruppi. La risposta più breve aiuta a prevenire l'usura del corpo. Ciò significa che l'ascolto di musica rilassante potrebbe aiutare a migliorare la risposta allo stress e la salute.

Inoltre, le donne che ascoltavano musica avevano livelli più alti di cortisolo dopo lo stress rispetto alle persone che non ascoltavano nulla. Erano le persone che ascoltavano i suoni della natura ad avere i livelli più bassi di cortisolo. Ciò significa che l'ascolto di musica durante lo stress potrebbe non ridurre effettivamente lo stress. Tuttavia, ascoltare i suoni della natura potrebbe fare al caso tuo.


Metodi

Flusso di lavoro dell'assemblaggio del genoma degli organelli utilizzando GetOrganelle

GetOrganelle v1.6.2 è costituito da due script principali ("get_organelle_from_reads.py" e "get_organelle_from_assembly.py") e 17 script minori (nella directory "Utilità" per l'elaborazione o la valutazione degli assembly di organelli) (Fig. 1), una serie di librerie (sotto la directory "GetOrganelleLib" incluso il database seed predefinito, il database delle etichette predefinito e le classi/funzioni Python) e le dipendenze (sotto la directory "GetOrganelleDep" inclusi Bowtie2, SPAdes, BLAST+). Lo script principale "get_organelle_from_reads.py" potrebbe convogliare tutti e 5 i passaggi descritti di seguito (vedere anche le frecce verdi solide in Fig. 1) insieme utilizzando un comando a riga singola per assemblare genomi di organelli da letture non elaborate. Lo script principale "get_organelle_from_assembly.py" potrebbe estrarre il genoma degli organelli dai grafici di assemblaggio generati utilizzando SPAdes [15] o Velvet [54] (i passaggi 4-5 vedono anche le frecce solide blu in Fig. 1).

Passaggio 1. Mappatura delle letture su seed e assemblaggio di letture mappate in seed per la stima dei parametri

La fase iniziale dell'assemblaggio del genoma o dei genomi dell'organello bersaglio dalle letture tramite GetOrganelle ("get_organelle_from_reads.py") utilizza Bowtie2 per mappare le letture alle sequenze di semi (cioè, il database di semi predefinito), che può includere il genoma di organello di riferimento completo ( s) o frammento(i) di organello (Fig. 1, freccia verde 1). Attualmente, il seme predefinito di GetOrganelle (nella directory "GetOrganelleLib/SeedDatabase") copre i plastomi embriofiti, i plastomi non embriofiti, i mitogenomi embriofiti, il DNA ribosomiale nucleare embriofato, i mitogenomi animali e i mitogenomi fungini (nell'opzione denominata "embplant_pt", rispettivamente "other_pt", "embplant_mt", "embplant_nr", "animal_mt", "fungus_mt"). Queste letture mappate sono qui chiamate letture mappate con semi (memorizzate in *.initial.fq).

Le letture mappate in semi verranno trattate come "esche" iniziali per reclutare più letture associate al bersaglio nella fase successiva. Nella modalità "auto" (vedere l'ultimo paragrafo del passaggio 2 di seguito), le letture mappate seme verranno anche assemblate grossolanamente in contig seme, che verranno utilizzati per la stima dei parametri nel passaggio 2.

Passaggio 2. Reclutare più letture associate al target attraverso l'estensione delle iterazioni

Dopo aver creato "esche", GetOrganelle ("get_organelle_from_reads.py") recluta nuove letture associate al bersaglio confrontando le letture candidate con "esche" e aggiornando le "esche" con nuove letture sovrapposte (Fig. 1, freccia verde 2). In questo processo di estensione, il metodo di confronto chiave per determinare le sovrapposizioni è il classico hashing delle sottostringhe. Le sottostringhe sono indicate come Parola(e) qui per distinguerle da K-mers, un concetto simile nel processo di assemblaggio. La lunghezza uniforme delle parole è quindi denominata dimensione della parola.

Prima delle iterazioni dell'estensione principale, "get_organelle_from_reads.py" crea un indice e assegna ID univoci per ogni set di letture duplicate per evitare calcoli ripetuti (informazioni memorizzate nel file "temp.indices.1"). Quelle letture con duplicati possono essere utilizzate anche per il "pre-raggruppamento" a valle. Il pre-raggruppamento è un algoritmo per accelerare il reclutamento di letture target.Questo algoritmo si basa sull'idea che sarebbe più efficiente confrontare prima le letture che hanno maggiori probabilità di essere associate al target. Dato che i genomi degli organelli di solito hanno più copie, e quindi una copertura di base più elevata rispetto alla maggior parte dei cromosomi non organelli, è più probabile che le letture duplicate siano associate agli organelli rispetto alle letture non duplicate. Lo script "get_organelle_from_reads.py" raggrupperà un certo numero di letture duplicate (dopo l'opzione "-P") in gruppi in base alla sovrapposizione di lettura utilizzando lo stesso metodo di hashing della sottostringa menzionato sopra. Tutti i gruppi, inclusi quelli con una sola lettura, avranno una tabella hash che memorizza le parole tagliate da tutte le letture di questo gruppo. Verranno uniti due gruppi che condividono almeno una singola parola nella loro tabella hash. Dopo il pre-raggruppamento, un gruppo assomiglia a un insieme di pseudo-contig collegati (informazioni memorizzate nel file "temp.indices.2"). Durante le successive iterazioni dell'estensione, una volta accettata una lettura come lettura associata alla destinazione, tutte le altre letture (id) nello stesso gruppo verranno contrassegnate come accettabili.

Lo script "get_organelle_from_reads.py" inizia le iterazioni dell'estensione principale con la costruzione di una tabella hash, tagliando le letture iniziali ("esche") in parole e aggiungendo quelle parole iniziali alla tabella hash (AW). Se una parola di una lettura candidata colpisce AW, tutte le parole di questa lettura vengono aggiunte anche ad AW e l'indice di questa lettura sarà contrassegnato come accettato (Accepted Index, AI). Come accennato in precedenza, tutti gli altri ID di lettura nello stesso gruppo verranno considerati accettati. Durante ogni iterazione (round), "get_organelle_from_reads.py" esamina tutte le letture candidate una per una per verificare se una lettura è accettabile. Dopo un numero di cicli specificato dall'utente o quando nessuna nuova lettura è stata accettata in un ciclo completo, "get_organelle_from_reads.py" interromperà il processo di estensione e restituirà tutte le letture accettate (memorizzate nel file "filtered_*.fq"). Per macchine con poca memoria o per scopi di test, le letture accettate per round possono essere emesse separatamente dopo ogni round (seguite dal flag "--out-per-round") insieme a AW svuotato dopo ogni round.

Dimensione della parola (seguita dal flag "-w"), come K-maggiore lunghezza nel montaggio, è cruciale per la fattibilità e l'efficienza di questo processo. La migliore dimensione della parola per l'estensione è influenzata dalla lunghezza della lettura, dalla qualità della lettura, dal numero totale di letture, dalla percentuale di letture del genoma dell'organello, dall'eterogeneità della copertura della base dell'organello e da altri fattori. Nella modalità "auto" quando non c'è un valore di dimensione Word assegnato dall'utente, "get_organelle_from_reads.py" stimerà automaticamente una corretta dimensione di Word con un insieme di funzioni empiricamente personalizzate, in base alle caratteristiche dei dati.

Passaggio 3. Esecuzione dell'assemblaggio de novo

Le letture associate al target reclutate verranno quindi assemblate automaticamente utilizzando SPAdes (Fig. 1, freccia verde 3). Verranno utilizzate letture accoppiate e non accoppiate. Le uscite di ciascuno K-mer of SPAdes include un grafico di assemblaggio (formato FASTG), che registra le connessioni di contigs come un grafico con un certo polimorfismo allelico e incertezza di assemblaggio. Altri assemblatori in grado di generare il grafico dell'assieme, come Velvet, possono essere utilizzati per completare questo passaggio, ma non sono ancora implementati in GetOrganelle. I risultati intermedi sono memorizzati nella sottocartella "filtered_spades".

Passaggio 4. Filtraggio approssimativo per contig simili a target

Poiché le sequenze sono spesso condivise tra plastomi, mitogenomi e genomi nucleari, le letture accettate dal passaggio 2 a volte includono inevitabilmente letture non target. Di conseguenza, il grafico dell'assembly di output potrebbe includere anche contig non di destinazione. Tuttavia, gli strumenti precedentemente segnalati non hanno tenuto conto o affrontato adeguatamente questa preoccupazione.

GetOrganelle ricerca i contig di tipo target dal file grafico dell'assieme originale utilizzando congiuntamente la tabella delle etichette contig, le connessioni contig e le coperture contig (Fig. 1, freccia verde 4 e freccia blu 1). Per creare la tabella delle etichette contig, GetOrganelle prende i contigs nel grafico dell'assieme come query, conduce la ricerca BLAST su un database di etichette locale (vedi paragrafo successivo), genera la tabella dei risultati BLAST e converte la tabella dei risultati BLAST generata nel contig label table, che registra le identità dei geni e i tipi di organelli di quelle corrispondenze BLAST. Eliminando in modo conservativo i contig non target, GetOrganelle emette un file grafico di assieme semplificato, insieme a un file in formato TAB cognominale che registra la tabella delle etichette contig (con l'estensione ".csv" per essere conforme a Bandage). Questo passaggio viene completato automaticamente dai due script principali o può essere eseguito indipendentemente utilizzando lo script "slim_fastg.py".

Per GetOrganelle, il database di etichette predefinito di un determinato organello è costituito dalle regioni codificanti del genoma di tale organello. Abbiamo creato sei database di etichette predefiniti che corrispondono ai sei tipi di genoma di organelli nei database di semi. Un contig che colpisce il database dell'organello bersaglio sarà etichettato con l'identità del gene nel file ".csv" e chiamato target-hit-contig qui. Qualsiasi contig che si connette direttamente o indirettamente a quel target-hit-contig è chiamato target-associato-contig. Qui, definiamo un gruppo di contig interconnessi come un componente connesso del grafico dell'assieme. GetOrganelle per impostazione predefinita conserva tutti i componenti connessi con target-hit-contig. Inoltre, nella modalità embplant_pt o embplant_mt, GetOrganelle per impostazione predefinita conserva i componenti connessi sia al plastoma che al mitogenoma per i contigs di clustering a valle per copertura. In genere, questo passaggio di filtraggio approssimativo è progettato per essere conservato ed evitare di rimuovere i contig di destinazione reali.

Passaggio 5. Identificazione dei contig di destinazione ed esportazione di tutte le configurazioni

GetOrganelle utilizza quindi il file grafico dell'assieme semplificato e la tabella delle etichette contig per (5a) identificare ulteriormente con precisione (restringere il campo a) i contig di organelli di destinazione, (5b) stimare le molteplicità (numero di copie) dei contig in un grafico di soli organelli e (5c ) esportare tutti i possibili percorsi distintivi [memorizzati come file FASTA] dal grafico di assemblaggio dell'organello (memorizzato come file in formato GFA cognominale) (Fig. 1, freccia verde 5 e freccia blu 2). Ogni percorso rappresenta una possibile configurazione del genoma dell'organello bersaglio. Questo passaggio viene eseguito dai due script principali o può essere eseguito separatamente utilizzando lo script "disentangle_organelle_assembly.py". In caso di genoma di organelli con un gran numero di ripetizioni, GetOrganelle imposta un'opzione per limitare il tempo di calcolo del districamento per evitare di generare combinazioni inesauribili. Quando gli script principali non sono riusciti a esportare sequenze circolari dal grafico dell'assieme per i motivi elencati di seguito nel passaggio 5′ o a causa del limite di tempo, eseguiranno una seconda esecuzione per esportare i contigs, che sarebbero principalmente l'obiettivo- hit-contig.

Occorre chiarire tre concetti:

Un "grafo sufficiente per gli organelli" è un grafico di assemblaggio con contigs che copre completamente un genoma completo di organelli.

Un "grafo di soli organelli" è un grafico di assemblaggio solo con veri contig di un genoma di organelli.

Un "grafo equivalente ad organelli" è sia un grafico sufficiente per organelli che un grafico solo organello.

GetOrganelle richiede tre presupposti per districare l'assieme e dichiarare il risultato come un organello circolare completo:

Assunzione 1: Tutte le configurazioni, se sono più di due, del genoma dell'organello bersaglio sono composizionalmente identiche. Questa ipotesi limita le molteplicità dei contigs per essere le stesse tra diverse configurazioni. In altre parole, i polimeri si trovano in vere molecole di DNA plastidi [55], mentre GetOrganelle può esportare solo la forma del monomero potenziali configurazioni sub-genomiche non sono attualmente implementate nella versione attuale. Se ci sono contig paralleli causati dal polimorfismo dei nucleotidi, tutti i sottografi composti da uno di questi polimorfismi verranno districati indipendentemente. Pertanto, tutte le configurazioni di ciascun sottografo saranno composizionalmente identiche.

Assunzione 2: La topologia di ogni genoma di organello sarà rappresentata come una singola molecola circolare. Questa ipotesi vale quando il vero genoma dell'organello è una molecola circolare o organizzata in polimeri (la maggior parte dei plastomi e i mitogenomi di tipo I e di tipo II) e il grafico di assemblaggio è un grafo sufficiente per gli organelli. Se questo presupposto viene violato, GetOrganelle esporta solo i contig di destinazione.

Assunzione 3: I valori di copertura dei contigs dello stesso genoma di organelli sono generalmente proporzionali alle loro molteplicità (numeri di copie). Pertanto, i valori di copertura dei contig con la stessa molteplicità dello stesso genoma di organelli sono generalmente coerenti.

5a. Ulteriore identificazione dei contig degli organelli bersaglio

L'utilizzo delle sole informazioni sul colpo BLAST per identificare i contig degli organelli bersaglio è rischioso. Alcuni contigs, compresi i contigs mitocondriali che hanno una breve sequenza di origine plastome o contigs contaminanti poco profondi simili a target, verrebbero etichettati erroneamente come contigs target-hit (falso positivo). D'altra parte, alcune sequenze potrebbero essere vere target contigs ma sono troppo corte o divergenti dalle sequenze nel database delle etichette per essere etichettate come target-hit-contigs (falso negativo). Pertanto, abbiamo utilizzato informazioni aggiuntive per migliorare l'identificazione dei contig di destinazione, come i caratteri del grafico di assemblaggio (Ipotesi 1 e 2) e i valori di copertura dei contig (Ipotesi 3). GetOrganelle utilizza una strategia integrata che utilizza in modo iterativo tutti o parte dei seguenti moduli per affrontare questa attività fino a quando non verranno più apportate modifiche al grafico dell'assieme.

Utilizzo delle informazioni sui colpi BLAST per raggruppare approssimativamente i contig con le etichette di destinazione. Nello specifico, GetOrganelle calcola prima un valore di peso dell'hit personalizzato (HW) per ogni record di hit BLAST (etichetta di identità del gene ripristinata dalla tabella delle etichette contig). Per i record che rappresentano lo stesso gene nel database BLAST locale, solo il record con il miglior HW viene mantenuto come unico record valido per quel gene. L'HW di un record di hit è semplicemente definito come il prodotto della lunghezza di hit della query (HL) e della copertura della query contig (QC) (HW = HL * QC). Data la nostra esperienza che i risultati falsi positivi generalmente corrispondono a contig di lunghezza e profondità inferiori, HW può essere un criterio per escludere i record di risultati falsi positivi. Ogni gene nel database BLAST è quindi allineato a non più di un contig nel grafico di assemblaggio. Quindi, GetOrganelle calcola un valore di peso contig personalizzato (CW) di un genoma di organelli target per ogni contig come CWobbiettivo = HWobbiettivo. Ad esempio, il CW del plastide per un contig è definito come la somma degli HW di tutti i record di hit di geni plastidi di quel contig, mentre il CW mitocondriale per lo stesso contig è definito come la somma degli HW di tutti i record di hit del gene mitocondriale di lo stesso contig. Per un contig, se il target CW è molto più grande (fattore predefinito: 3 volte) rispetto all'organello non target CW, questo contig verrebbe etichettato come contig target-ancora (molto probabilmente un vero contig target), e viceversa versa. Utilizzando HW e CW, GetOrganelle elimina grossolanamente la maggior parte dei contig non target con risultati BLAST falsi positivi.

Aggiunta di più etichette di destinazione ad alcuni contig di destinazione che non raggiungono il database di etichette in base ai caratteri del grafico di assieme. Sulla base del presupposto 2, qualsiasi configurazione del genoma dell'organello bersaglio è una singola molecola circolare. Di conseguenza, in un grafo sufficiente per organelli, entrambe le estremità di qualsiasi contig target vero dovrebbero essere collegate ad almeno un contig target vero. Se la coda di un vero contig target, Contig A (contrassegnato come Acoda) ha un solo arco che collega Acoda e la testata di un altro contig sconosciuto, Contig B (Btesta), allora Contig B dovrebbe essere un vero contig di destinazione. Tuttavia, in un grafico di assemblaggio reale con contig mancanti (genoma dell'organello incompleto), il contig B potrebbe mancare e il contig sconosciuto connesso ad Acoda potrebbe essere un contig non target. In considerazione di situazioni complicate come questa, solo quando Contig B si trova tra due contig target-ancora (Contig A e Contig C) con la sequenza (Acoda-Btesta-Bcoda-Ctesta), e quando Acoda si collega solo a Btesta e Ctesta si collega solo a Bcoda, GetOrganelle etichetta Contig B come contig di ancoraggio di destinazione con CW = 0.

Utilizzo dei valori di copertura dei contigs per rimuovere i contigs con un valore di copertura che si discosta in modo significativo dai contigs di ancoraggio di destinazione. In base al presupposto 3, GetOrganelle utilizza la distribuzione della miscela gaussiana per approssimare i valori di copertura di tutti i contig nel grafico dell'assieme semplificato, che è una combinazione di diversi contig di organelli e contigi nucleari. Nella maggior parte dei casi di dati empirici di scrematura del genoma vegetale, il plastoma ha una copertura significativamente più elevata rispetto al mitogenoma, la cui copertura a sua volta è superiore a quella del genoma nucleare ad eccezione delle regioni altamente ripetute. Pertanto, in un dataset WGS di impianto, i valori di copertura dei contigs plastidi e mitocondriali e nucleari dovrebbero essere classificati in diverse componenti gaussiane della distribuzione della miscela gaussiana. GetOrganelle potrebbe quindi eliminare i contigs con un valore di copertura lontano dalla distribuzione della copertura di destinazione. Nello specifico, GetOrganelle applica un algoritmo EM (Expectation-Maximization) con l'apprendimento semi-supervisionato e il modello di miscela gaussiana ponderata per raggruppare i valori di copertura di tutti i contig candidati. Qui, l'apprendimento semi-supervisionato significa che i valori di copertura dei contigs target-anchor (i dati etichettati) non vengono aggiornati durante le iterazioni EM. Il valore di copertura di un contig nel modello di miscela gaussiana è ponderato per la lunghezza del contig.

Rimozione di contig isolati dal componente principale connesso di destinazione che include i contig di ancoraggio di destinazione. In base al presupposto 2, i veri contig di destinazione in un grafico di assemblaggio sufficiente per organelli dovrebbero verificarsi in un componente connesso. Pertanto, per un vero grafico di assemblaggio sufficiente per organelli, GetOrganelle conserva il componente connesso con il maggior numero di contig di ancoraggio di destinazione ed elimina altri componenti connessi di questo tipo. In particolare, GetOrganelle calcola un valore di peso target (TW) personalizzato per ogni componente connesso del grafico dell'assieme. Il TW di un componente connesso è definito come la somma dei CW di destinazione di tutti i contigs in quel componente connesso. Supponendo la sufficienza degli organelli, GetOrganelle ordina i componenti connessi in base ai loro TW, trova il componente connesso con il TW significativamente più grande (100 volte più grande del secondo TW più grande per impostazione predefinita) e rimuove i contig di altri componenti connessi dal grafico dell'assieme. Se GetOrganelle non riesce a trovare un tale componente connesso, districare il grafico dell'assieme come un genoma di organello circolare fallisce e GetOrganelle torna alla "modalità lineare". In una "modalità lineare", quando GetOrganelle tenta di districare il grafico dell'assieme come contigs o scaffold, vengono mantenuti diversi componenti collegati con TW grandi e verranno rimossi solo i componenti collegati con TW 10.000 volte (per impostazione predefinita) inferiori al TW più grande .

Rimozione punta contig. Un contig tip è un contig con una o entrambe le estremità che non si collegano ad altri contig nel grafico dell'assieme né a se stesso come circolare. Sulla base dell'Assunzione 2, un grafico equivalente a un organello non conterrà alcun contig di punta, poiché qualsiasi sequenza parziale di una molecola di DNA circolare avrà sequenze sia a monte che a valle. GetOrganelle verificherà se un contig tip è un contig target-anchor prima di rimuoverlo. Se il contig punta è un contig bersaglio-ancora, è probabile che l'Assunzione 2 sia violata e, nella maggior parte dei casi, il grafico dell'assieme non è un grafico sufficiente per gli organelli ma piuttosto "un grafico degli organelli rotto".

5b. Stima delle molteplicità dei contigs in un grafo di soli organelli

Esistono fonti di risorse informative per la stima delle molteplicità per contigs in GetOrganelle. Uno è il valore di copertura contig (K-mer copertura in pratica, ma indicata come copertura in questo paragrafo). Secondo l'Assunzione 3, potremmo stimare approssimativamente la molteplicità di ciascun contig in base alla sua copertura. Dato che qualsiasi contig in un grafo di soli organelli avrebbe almeno una copia, GetOrganelle presuppone innanzitutto che tutti i contig abbiano la molteplicità di uno e stima un valore primario della copertura media del genoma bersaglio. Quindi, GetOrganelle ottimizza le molteplicità di tutti i contig dividendo il valore di copertura di un contig per la copertura media e arrotondando il risultato all'intero più vicino. GetOrganelle ottimizza iterativamente la copertura media del genoma target e le molteplicità dei contigs, con il vincolo che la copertura media del genoma non dovrebbe essere inferiore alla copertura minima di tutti i contigs secondo l'Assunzione 1. Qui, le molteplicità stabilizzate stimate sulla base di i valori di copertura dei contigs sono chiamati molteplicità osservate (OCio, insieme a Cio denotando il nome contig) (Fig. 2).

Un altro tipo di informazione proviene dalle caratteristiche del grafico, che offre un insieme di vincoli rigidi per le molteplicità dei contigs (MCio, insieme a Cio denotando il nome contig). Utilizzando la libreria Python Sympy, GetOrganelle crea un insieme di equazioni lineari per caratterizzare la relazione di molteplicità tra contig connessi. In dettaglio, ci sono principalmente quattro vincoli per costruire questo insieme di equazioni. Primo, la molteplicità di un contig self-loop non ha vincoli. Secondo, se Contig A non è un contig tip né un contig self-loop, Mcirca è uguale alla somma delle molteplicità dei contigs connessi ad Atesta e uguale alla somma delle molteplicità dei contigs connessi ad Acoda. Terzo, la molteplicità di un tip contig è arbitrariamente impostata su 1 per evitare una sovrastima, sebbene ciò rischi di fallire nella risoluzione delle equazioni. Infine, nel considerare la simmetria di grandi ripetizioni invertite (come IR nel plastome), la molteplicità di un contig di ripetizione sequenziale è vincolata ad essere un multiplo intero della molteplicità di uno dei suoi contig vicini, ad esempio, la molteplicità di una ripetizione sequenziale all'interno la regione IR di un grafico di assemblaggio del plastoma deve essere un numero pari e non inferiore a 4. Questo insieme di equazioni verrebbe quindi semplificato utilizzando Sympy.solve.I valori di molteplicità di tutti i contigs sarebbero rappresentati come espressione lineare di diverse variabili libere.

Riducendo al minimo la differenza delle molteplicità basate sui due tipi di informazione precedenti utilizzando i minimi quadrati, ovvero minimizzando ( _^>>_i>->_i> ight)>^2 ) , GetOrganelle ha ottenuto i valori di quelle variabili di libertà, quindi tutti i MCio (fig.2).

5c. Esportazione di tutti i possibili percorsi distintivi

GetOrganelle quindi cerca in modo esauriente tutti i possibili percorsi da questo grafico di soli organelli con molteplicità contig. Ogni combinazione di configurazione verrebbe salvata come file FASTA indipendente, con lo stesso stile del nome di sequenza per il completamento manuale utilizzando Bandage [30] (vedi sotto). Una sequenza circolare verrebbe anche contrassegnata con "(circolare)" nel nome della sequenza. Per i plastomi con ripetizioni all'interno dei grandi IR, ci sarebbero 6 percorsi, il che significa 6 potenziali isomeri (vedi Fig. 2 un altro esempio simile ma più complicato è SRR5602601 con 12 percorsi). Tuttavia, considerando la simmetria, solo quegli isomeri con IR grandi identici (percorso1 e amp 2 in Fig. 2) sono percorsi biologicamente possibili. In questi casi, GetOrganelle contrassegnerebbe questi risultati con IR identici come primo modello di ripetizione nel nome del file.

Passaggio 5′. Completamento manuale

Se GetOrganelle non riesce a esportare un genoma di organello circolare completo, a causa di un grafico di assemblaggio del target insufficiente, un tempo di esecuzione di districamento troppo breve, troppe sequenze di configurazione possibili o un'identificazione errata dei contig target, è necessario il completamento manuale per pulire il "rumoroso" e non target connessioni contig/impalcatura (Fig. 1, frecce grigie 4 e 5). Il grafico dell'assieme semplificato può essere visualizzato utilizzando Bandage [30]. Nel frattempo, il file "csv" di annotazione concomitante può essere importato in Bandage e aggiunto al grafico come etichette, il che aiuta a identificare manualmente contigs/scaffold simili a target. Il grafico dell'assieme pulito semi-manualmente può essere quindi finalizzato utilizzando un altro script principale "get_organelle_from_assembly.py" (Fig. 1) o essere esportato manualmente dal grafico dell'assieme pulito utilizzando Bandage.

Valutazione delle caratteristiche prestazionali di GetOrganelle

Per studiare le caratteristiche delle prestazioni di GetOrganelle, abbiamo variato i parametri rilevanti del programma: valori della dimensione delle parole (come la forma di WSR, ovvero 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0.85, 0.9), il numero di round (illimitati vs. minimo) e il pre-raggruppamento attivato (-P 2E5, ovvero utilizzando le prime 2E5 letture duplicate per condurre il pre-raggruppamento) o disattivato (-P 0). La modalità numero minimo di cicli è definita come il minor numero di cicli di iterazioni di estensione necessari per ottenere un plastoma completo o stabilizzare un plastoma incompleto.

Abbiamo usato queste varie impostazioni per assemblare il plastome delle specie di angiosperme Haberlea rodopensis Friv. (Gesneriaceae) da un dataset pubblicato ridotto (500 Mb, SRA: SRR4428742), con il plastoma completo di una specie di gimnosperme, Gnetum parvifolium (Warb.) W.C.Cheng (GBK: NC_011942.1) come seme. Usiamo inoltre solo il rbcL sequenza genica di Gnetum parvifolium (GBK: NC_011942.1) come seme e il WSR di 0,75 per assemblare lo stesso set di dati.

Per valutare le caratteristiche delle letture reclutate per round, è stata specificata l'opzione “--out-per-round” per lo script “get_organelle_from_reads.py”. Lo script "round_statistics.py" è stato utilizzato per valutare la crescente percentuale di copertura del genoma dell'organello utilizzando un approccio di mappatura di lettura. Usando Bowtie2, questo script mappa le letture di ogni round sui plastomi assemblati finali e calcola la percentuale di basi nel plastome che sono coperte da letture mappate oltre una certa soglia di copertura (i valori predefiniti erano 0 e 10). Il numero minimo di giri si verifica quando la percentuale di basi coperte raggiunge il 100% o rimane invariata e quando l'assemblaggio finale si stabilizza. Inoltre, se la libreria Python Matplotlib è disponibile, lo script "round_statistics.py" potrebbe generare la copertura di base attraverso il grafico del genoma dell'organello per ogni round di estensione per visualizzare il processo di estensione.

Assemblaggio de novo dei plastomi di 50 dataset di piante utilizzando GetOrganelle e NOVOPlasty

Per valutare l'efficienza lavorativa e il successo dell'assemblaggio, abbiamo selezionato 50 set di dati di piante vascolari con letture grezze dal GenBank Sequence Reads Archive (SRA) (file aggiuntivo 2: Tabella S1). Le 50 piante vascolari rappresentavano 42 specie di angiosperme (da otto cladi principali, 21 ordini e 29 famiglie), quattro specie di gimnosperme, tre specie di felci e una specie di licofite. In particolare, le letture grezze di questi 50 campioni sono associate a plastomi pubblicati [56,57,58,59], consentendo il confronto con plastomi appena riassemblati utilizzando GetOrganelle. Dal 2018, NOVOPlasty ha ricevuto più di 400 citazioni per l'assemblaggio del genoma del cloroplasto in Google Scholar (consultato il 31 dicembre 2019) ed è diventato uno degli strumenti più utilizzati per l'assemblaggio del plastoma. Abbiamo quindi riassemblato 50 campioni utilizzando NOVOplasty per i confronti.

Le risorse dati sono letture paired-end. La lunghezza della lettura variava da 100 a 300 bp (File aggiuntivo 2: Tabella S1). In tutti i test, se i dati testati includevano meno di 10.000.000 di letture per ciascuna estremità, abbiamo utilizzato tutte le letture se i dati includevano più di 10.000.000 di letture per ciascuna estremità, selezioniamo solo le prime 10.000.000 di letture per ciascuna estremità. Abbiamo impostato quattro gruppi di test, ovvero tre gruppi con valori di dimensione delle parole diversi (w = 0,6, 0,7, 0,8) (ad esempio, GetOrganelle-W0.6, GetOrganelle-W0.7, GetOrganelle-W0.8) e un'auto- gruppo di dimensioni stimate della parola (ad es. GetOrganelle-auto). I round di estensione di tutti i test sono stati impostati su 10. Tutte le altre opzioni, incluso il seme, sono state impostate sui valori predefiniti. Poiché gli assiemi incompleti non sono adatti per confrontare le qualità di mappatura nella parte successiva, abbiamo inoltre aggiunto esecuzioni extra per otto campioni, in cui GetOrganelle-auto non è stato in grado di ottenere plastomi completi, con opzioni personalizzate (personalizzazione di GetOrganelle) per il confronto della qualità di mappatura. Una registrazione dettagliata dei comandi, nonché i risultati finali e i file di registro che registrano l'utilizzo della memoria e il costo del tempo di tutti i test sono disponibili all'indirizzo https://github.com/Kinggerm/GetOrganelleComparison (versione 1.1.1).

Anche i plasmomi degli stessi 50 set di dati sono stati riassemblati da NOVOplasty utilizzando quattro K-mer, ovvero 23, 31, 39 e 47. Il file di configurazione di NOVOPlasty è stato scaricato dal repository GitHub di NOVOPlasty (https://github.com/ndierckx/NOVOPlasty/blob/master/config.txt), con " Digita" come "cloro", "Intervallo genoma" come 15.000-180.000, "Salva letture assemblate" come "sì", "Input seme" come lo stesso seme dell'esecuzione di GetOrganelle e "Lunghezza lettura" come lunghezza media di lettura di ciascuno campione (seed File aggiuntivo 2), con tutti gli altri parametri invariati.

Leggi la mappatura per valutare gli assemblaggi del plastome

Lo script "evaluate_assembly_using_mapping.py" è stato utilizzato per valutare assiemi circolari/non circolari (Fig. 1, freccia grigia 8). Utilizza Bowtie2 per mappare le letture su assiemi circolari/non circolari analizza il file SAM conta il numero di letture abbinate e non abbinate mappate conta le basi abbinate per ciascun sito (M), le basi non corrispondenti per ogni sito (X), gli inserimenti tra due siti qualsiasi (I), e le delezioni per ogni sito (D) e calcola la media e la deviazione standard della profondità abbinata (ΣM e var(M)), la media e la deviazione standard della profondità non corrispondente (ΣX e var(X)), la media e la standard deviazione delle inserzioni tra due siti di riferimento qualsiasi (ΣI e var(I)), e media e deviazione standard delle delezioni per sito di riferimento (ΣD e var(D)) per ogni contig e l'intero assieme. Se ΣM > 0, un tasso di errore personalizzato sarebbe anche calcolato come (ΣX + ΣI + ΣD)/ΣM con una deviazione personalizzata come (var(X) + var(I) + var(D))/ΣM. Se viene scelto "--draw", lo script "evaluate_assembly_using_mapping.py" genera il grafico di M/X/I/D in ogni sito/intervallo di sito attraverso l'intero assembly utilizzando la libreria Python Matplotlib. Per la riproducibilità quando si utilizza lo stesso seme casuale, una sequenza assemblata circolare è stata rilinearizzata per assicurarsi che biologicamente lo stesso plastoma circolare avesse inizio e fine identici dall'identica sequenza lineare. Per impostazione predefinita, Bowtie2 non supporta la mappatura delle letture su una sequenza circolare, lo script "evaluate_assembly_using_mapping.py" aggira questo problema aggiungendo un frammento extra della testa della sequenza originale alla coda e contando le statistiche di mappatura (M/X /I/D) dei siti nel frammento extra torna alle statistiche della parte principale della sequenza originale.

Lo script “evaluate_assembly_using_mapping.py” è stato utilizzato per valutare tutti i plastomi assemblati. I caratteri anomali, come "*" e "-" negli assembly in formato FASTA di NOVOplasty, sono stati sostituiti con "N". NOVOplasty produrrebbe anche più sequenze completamente diverse con lo stesso nome di sequenza negli assiemi, che verrebbero anche modificate con nomi diversi prima della valutazione. Per NOVOplasty, le statistiche di valutazione di ciascun campione si sono basate sul miglior risultato tra quelli che utilizzano differenti K-altri valori. Qui il miglior risultato è determinato a sua volta dall'essere vero circolarizzato, il maggior numero di letture abbinate mappate, il maggior numero di letture non abbinate mappate, la profondità abbinata più grande, il tasso di errore più piccolo, la deviazione più piccola della profondità abbinata e la deviazione più piccola di tasso di errore. Per GetOrganelle, ad eccezione di 8 campioni che sono stati generati utilizzando i parametri personalizzati, altre statistiche di valutazione sono state basate sugli assembly delle esecuzioni "GetOrganelle-auto".

Per ogni campione, quando si confrontano le statistiche di valutazione di diversi assembly, le letture mappate "migliori" (il segno di cappello nella tabella S3) sono definite come il numero maggiore di letture accoppiate mappate o il numero uguale di letture accoppiate mappate con il numero maggiore di letture non accoppiate mappate la profondità mappata "migliore" è definita come la profondità abbinata più grande o la profondità abbinata uguale più grande con la deviazione più piccola della profondità abbinata il tasso di errore "migliore" è definito come il tasso di errore più piccolo o il tasso di errore uguale più piccolo con la più piccola deviazione del tasso di errore.

Assemblaggio ex novo e valutazione dei mitogenomi utilizzando GetOrganelle e NOVOplasty

In totale, 56 animali (i campioni di prova di MitoZ [14], vedere File aggiuntivo 2: Tabella S3) e 50 campioni fungini (File aggiuntivo 2: Tabella S4) sono stati utilizzati per testare la capacità di GetOrganelle di assemblare i mitogenomi. I mitogenomi delle piante generalmente hanno un tasso di sostituzione nucleotidica relativamente lento [9, 60], pertanto, è possibile per GetOrganelle ottenere letture sufficienti per costruire il grafico di assemblaggio sufficiente per mitogenoma anche con un seme remoto correlato, a condizione che vi sia una copertura sufficiente. Tuttavia, ci sono due sfide principali per i dati di sequenziamento a lettura breve per confermare l'architettura del mitogenoma. In primo luogo, molte ripetizioni nel mitogenoma della pianta causano gli scomodi grovigli nel grafico di assemblaggio [47, 61, 62]. In secondo luogo, la maggior parte dei mitogenomi vegetali non sono un'unica struttura circolare, ma spesso sono costituiti da una grande molecola circolare e piccole molecole circolari simili a plasmidi (tipo III) o molecole lineari omogenee (tipo V) [63]. Ci sono anche frequenti trasferimenti orizzontali dal plastome al mitogenoma. In questo caso, quando la copertura del plastoma è molto superiore a quella del mitogenoma, la molteplicità dei contigs condivisi sarebbe difficile da stimare. Quando la copertura del plastoma è simile a quella del mitogenoma, i contig paralleli tra i contig condivisi sarebbero difficili da distinguere. Pertanto, non abbiamo incluso il test del mitogenoma vegetale a causa dell'impossibilità generale di assemblare il mitogenoma vegetale circolarizzato completo dai dati WGS.

Le risorse dati sono letture paired-end. La lunghezza della lettura variava da 92 a 301 bp (vedi File aggiuntivo 2: Tabella S3, Tabella S4). Nei test sugli animali, se i dati testati includevano meno di 75.000.000 di letture per ciascuna estremità, abbiamo utilizzato tutte le letture se i dati erano più di 75.000.000 di letture per ciascuna estremità, abbiamo utilizzato solo le prime 75.000.000 di letture per ciascuna estremità. Lo stesso numero massimo di letture per i funghi era di 15.000.000. Tutti i test GetOrganelle sono stati eseguiti con le impostazioni predefinite con il K-altri valori impostati su 21,43,65,87,127. Tutti i test NOVOplasty sono stati eseguiti con l'impostazione predefinita K-mer 39 (è stato anche il migliore K-mer nell'analisi del plastome). Comandi, risultati e file di registro di tutti i test sono disponibili su https://github.com/Kinggerm/GetOrganelleComparison (versione 1.1.1).

Lo script "slim_fastg.py" è stato utilizzato per valutare gli assemblaggi del mitogenoma generando la tabella degli hit genici. "slim_fastg.py" potrebbe condurre una ricerca BLAST nel database delle etichette e generare un file formattato TAB cognominale concomitante che registra molte informazioni sui contigs. Riassumendo i geni hit di ogni contig, abbiamo calcolato il numero di geni hit per ogni assembly.

Risorse del computer per i test

Tutti gli assemblaggi sono stati eseguiti su una macchina con CPU Intel Xeon contenente 144 core da 2,40 GHz, per un totale di 3 TB di RAM (64 GB di RAM sono sufficienti per tutti i test, mentre i 3 TB di RAM consentono di eseguire diversi test contemporaneamente), e configurato con Linux (versione Linux 3.10.0-514.el7.x86 (Red Hat 4.8.5-11)). L'ambiente di test include anche Python v3.6.5, Perl v5.16.3, GetOrganelle v1.6.2, Bowtie2 v2.3.5.1, SPAdes v3.13.0, BLAST 2.2.30+, Numpy v1.13.3, Scipy v0.19.1, Sympy v1 .1.1, Matplotlib v3.0.2, Psutil v5.4.7 e NOVOPlasty 2.7.2 [23]. GetOrganelle è in grado di eseguire più elaborazioni nel processo di mappatura e assemblaggio, che è stato disabilitato in questo test per essere paragonabile a NOVOplasty. I test possono essere riprodotti accedendo a zenodo (doi: https://doi.org/10.5281/zenodo.3943877) o Github (https://github.org/Kinggerm/GetOrganelleComparison versione 1.1.1).


Vaccino inattivato

Un vaccino inattivato (o vaccino ucciso) è un vaccino costituito da particelle virali, batteri o altri agenti patogeni che sono stati coltivati ​​in coltura e poi uccisi per distruggere la capacità di produrre malattie. Al contrario, i vaccini vivi utilizzano agenti patogeni ancora vivi (ma sono quasi sempre attenuati, cioè indeboliti). Gli agenti patogeni per i vaccini inattivati ​​vengono coltivati ​​in condizioni controllate e vengono uccisi come mezzo per ridurre l'infettività e quindi prevenire l'infezione dal vaccino. [1] Il virus viene ucciso usando un metodo come il calore o la formaldeide. Oltre ai metodi chimici e fisici utilizzati per inattivare virus, batteri e funghi possono essere inattivati ​​utilizzando metodi delicati per produrre vaccini fantasma. I fantasmi batterici sono involucri di cellule batteriche intatte che vengono svuotate del loro contenuto con metodi biologici o chimici delicati. Le tecniche fantasma aumentano la sicurezza dei vaccini uccisi, pur mantenendo la loro antigenicità grazie a procedure di preparazione blande. Inoltre, le piattaforme fantasma possono esprimere e/o trasportare diversi antigeni o DNA plasmidico che codifica per epitopi proteici. In base al modello di risposta immunitaria che suscitano, i vaccini fantasma sono considerati come una fase intermedia tra i vaccini inattivati ​​e attenuati. [2]

I vaccini inattivati ​​sono ulteriormente classificati a seconda del metodo utilizzato per inattivare il virus. [3] Vaccini a virus intero utilizzare l'intera particella virale, completamente distrutta mediante calore, sostanze chimiche o radiazioni. [4] Vaccini a virus split sono prodotti utilizzando un detergente per distruggere il virus. [3] Vaccini a subunità sono prodotti purificando gli antigeni che stimolano meglio il sistema immunitario a montare una risposta al virus, rimuovendo altri componenti necessari per la replicazione o la sopravvivenza del virus o che possono causare reazioni avverse. [3] [4]

Poiché i virus inattivati ​​tendono a produrre una risposta più debole da parte del sistema immunitario rispetto ai virus vivi, possono essere necessari adiuvanti immunologici e iniezioni multiple di "richiamo" per fornire una risposta immunitaria efficace contro l'agente patogeno. [1] [3] [4] I vaccini attenuati sono spesso preferibili per le persone generalmente sane perché una singola dose è spesso sicura e molto efficace. Tuttavia, alcune persone non possono assumere vaccini attenuati perché l'agente patogeno rappresenta per loro troppi rischi (ad esempio, persone anziane o persone con immunodeficienza). Per quei pazienti, un vaccino inattivato può fornire protezione.

Le particelle patogene vengono distrutte e non possono dividersi, ma i patogeni mantengono parte della loro integrità per essere riconosciuti dal sistema immunitario ed evocare una risposta immunitaria adattativa. Se prodotto correttamente, il vaccino non è infettivo, ma un'inattivazione impropria può provocare particelle intatte e infettive.


Contenuti

L'RNAi è un processo di silenziamento genico dipendente dall'RNA che è controllato dal complesso di silenziamento indotto dall'RNA (RISC) ed è avviato da brevi molecole di RNA a doppio filamento nel citoplasma di una cellula, dove interagiscono con il componente catalitico RISC argonaute. [5] Quando il dsRNA è esogeno (proveniente dall'infezione da un virus con un genoma di RNA o manipolazioni di laboratorio), l'RNA viene importato direttamente nel citoplasma e tagliato in brevi frammenti da Dicer. Il dsRNA di inizio può anche essere endogeno (proveniente dalla cellula), come nei pre-microRNA espressi dai geni codificanti RNA nel genoma. I trascritti primari di tali geni vengono prima elaborati per formare la caratteristica struttura ad anello del pre-miRNA nel nucleo, quindi esportati nel citoplasma. Pertanto, le due vie del dsRNA, esogena ed endogena, convergono al RISC. [6]

Il dsRNA esogeno avvia l'RNAi attivando la proteina ribonucleasi Dicer, [7] che lega e scinde gli RNA a doppio filamento (dsRNA) nelle piante, o gli RNA a forcina corta (shRNA) negli esseri umani, per produrre frammenti a doppio filamento di 20-25 paia di basi con una sporgenza di 2 nucleotidi all'estremità 3'. [8] Gli studi di bioinformatica sui genomi di più organismi suggeriscono che questa lunghezza massimizza la specificità del gene bersaglio e riduce al minimo gli effetti non specifici. [9] Questi brevi frammenti a doppio filamento sono chiamati piccoli RNA interferenti (siRNA). Questi siRNA vengono quindi separati in singoli filamenti e integrati in un RISC attivo, dal RISC-Loading Complex (RLC).RLC include Dicer-2 e R2D2, ed è fondamentale per unire Ago2 e RISC. [10] Il fattore 11 associato alla proteina legante TATA (TAF11) assembla l'RLC facilitando la tetramerizzazione di Dcr-2-R2D2, che aumenta l'affinità di legame al siRNA di 10 volte. L'associazione con TAF11 converte il complesso R2-D2-Initiator (RDI) in RLC. [11] R2D2 trasporta domini leganti l'RNA a doppio filamento in tandem per riconoscere il capolinea termodinamicamente stabile dei duplex di siRNA, mentre Dicer-2 l'altra estremità meno stabile. Il caricamento è asimmetrico: il dominio MID di Ago2 riconosce l'estremità termodinamicamente stabile del siRNA. Pertanto, il filamento "passeggero" (senso) la cui estremità 5' è scartata da MID viene espulso, mentre il filamento "guida" salvato (antisenso) coopera con AGO per formare il RISC. [10]

Dopo l'integrazione nel RISC, la coppia di basi di siRNA al loro mRNA bersaglio e lo scinde, impedendo così che venga utilizzato come modello di traduzione. [12] Diversamente da siRNA, un complesso RISC caricato con miRNA scansiona gli mRNA citoplasmatici per potenziali complementarità. Invece della scissione distruttiva (da Ago2), i miRNA colpiscono piuttosto le regioni della regione non tradotta 3' (UTR) degli mRNA dove si legano tipicamente con complementarità imperfetta, bloccando così l'accesso dei ribosomi per la traduzione. [13]

Il dsRNA esogeno viene rilevato e legato da una proteina effettrice, nota come RDE-4 in C. elegans e R2D2 in Drosophila, che stimola l'attività di cubettatrice. [14] Il meccanismo che produce questa specificità di lunghezza è sconosciuto e questa proteina si lega solo a dsRNA lunghi. [14]

In C. elegans questa risposta di iniziazione viene amplificata attraverso la sintesi di una popolazione di siRNA 'secondari' durante la quale gli siRNA inizianti o 'primari' prodotti dal dacer vengono utilizzati come modelli. [15] Questi siRNA "secondari" sono strutturalmente distinti dagli siRNA prodotti da dicer e sembrano essere prodotti da una RNA polimerasi RNA-dipendente (RdRP). [16] [17]

MicroRNA Modifica

I microRNA (miRNA) sono RNA non codificanti codificati genomicamente che aiutano a regolare l'espressione genica, in particolare durante lo sviluppo. [18] Il fenomeno dell'interferenza dell'RNA, ampiamente definito, include gli effetti di silenziamento genico dei miRNA indotti in modo endogeno e il silenziamento innescato da dsRNA estraneo. I miRNA maturi sono strutturalmente simili agli siRNA prodotti da dsRNA esogeno, ma prima di raggiungere la maturità, i miRNA devono prima subire un'ampia modifica post-trascrizionale. Un miRNA è espresso da un gene codificante RNA molto più lungo come trascritto primario noto come a pri-miRNA che viene processato, nel nucleo cellulare, in una struttura ad anello staminale di 70 nucleotidi chiamata a pre-miRNA dal complesso del microprocessore. Questo complesso è costituito da un enzima RNasi III chiamato Drosha e da una proteina legante il dsRNA DGCR8. La porzione dsRNA di questo pre-miRNA è legata e scissa da Dicer per produrre la molecola di miRNA matura che può essere integrata nel complesso RISC, quindi miRNA e siRNA condividono lo stesso macchinario cellulare a valle. [19] In primo luogo, il miRNA codificato dal virus è stato descritto nel virus di Epstein-Barr (EBV). [20] Successivamente, un numero crescente di microRNA è stato descritto nei virus. VIRmiRNA è un catalogo completo che copre i microRNA virali, i loro bersagli e i miRNA antivirali [21] (vedi anche la risorsa VIRmiRNA: http://crdd.osdd.net/servers/virmirna/).

siRNA derivati ​​da lunghi precursori di dsRNA differiscono dai miRNA in quanto i miRNA, specialmente quelli negli animali, hanno tipicamente un accoppiamento di basi incompleto a un bersaglio e inibiscono la traduzione di molti mRNA diversi con sequenze simili. Al contrario, gli siRNA tipicamente si accoppiano perfettamente e inducono la scissione dell'mRNA solo in un singolo bersaglio specifico. [22] In Drosophila e C. elegans, miRNA e siRNA sono processati da distinte proteine ​​argonaute ed enzimi cubettatori. [23] [24]

Tre regioni prime non tradotte e microRNA Modifica

Tre regioni principali non tradotte (3'UTR) di RNA messaggeri (mRNA) contengono spesso sequenze regolatorie che causano interferenza con l'RNA post-trascrizionale. Tali 3'-UTR contengono spesso sia siti di legame per microRNA (miRNA) che per proteine ​​regolatorie. Legandosi a siti specifici all'interno del 3'-UTR, i miRNA possono ridurre l'espressione genica di vari mRNA inibendo la traduzione o causando direttamente la degradazione della trascrizione. Il 3'-UTR può anche avere regioni silenziatori che legano proteine ​​repressive che inibiscono l'espressione di un mRNA.

Il 3'-UTR contiene spesso elementi di risposta di microRNA (MRE). Gli MRE sono sequenze a cui si legano i miRNA. Questi sono motivi prevalenti all'interno di 3'-UTR. Tra tutti i motivi normativi all'interno dei 3'-UTR (ad esempio, comprese le regioni del silenziatore), gli MRE costituiscono circa la metà dei motivi.

A partire dal 2014, il sito web miRBase, [25] un archivio di sequenze e annotazioni di miRNA, elencava 28.645 voci in 233 specie biologiche. Di questi, 1.881 miRNA erano in loci di miRNA umani annotati. Si prevedeva che i miRNA avessero una media di circa quattrocento mRNA bersaglio (che influenzano l'espressione di diverse centinaia di geni). [26] Friedman et al. [26] stimano che >45.000 siti bersaglio di miRNA all'interno di mRNA 3'UTR umani sono conservati al di sopra dei livelli di fondo e >60% dei geni codificanti proteine ​​umane sono stati sottoposti a pressioni selettive per mantenere l'accoppiamento ai miRNA.

Esperimenti diretti mostrano che un singolo miRNA può ridurre la stabilità di centinaia di mRNA unici. [27] Altri esperimenti mostrano che un singolo miRNA può reprimere la produzione di centinaia di proteine, ma che questa repressione è spesso relativamente lieve (meno di 2 volte). [28] [29]

Gli effetti della disregolazione dei miRNA dell'espressione genica sembrano essere importanti nel cancro. [30] Ad esempio, nei tumori gastrointestinali, nove miRNA sono stati identificati come epigeneticamente alterati ed efficaci nella riduzione degli enzimi di riparazione del DNA. [31]

Gli effetti della disregolazione dei miRNA dell'espressione genica sembrano essere importanti anche nei disturbi neuropsichiatrici, come la schizofrenia, il disturbo bipolare, la depressione maggiore, il morbo di Parkinson, il morbo di Alzheimer e i disturbi dello spettro autistico. [32] [33] [34]

Attivazione e catalisi RISC Modifica

Il dsRNA esogeno viene rilevato e legato da una proteina effettrice, nota come RDE-4 in C. elegans e R2D2 in Drosophila, che stimola l'attività di cubettatrice. [14] Questa proteina si lega solo a dsRNA lunghi, ma il meccanismo che produce questa specificità di lunghezza è sconosciuto. [14] Questa proteina legante l'RNA facilita quindi il trasferimento degli siRNA scissi al complesso RISC. [35]

In C. elegans questa risposta di iniziazione è amplificata attraverso la sintesi di una popolazione di siRNA 'secondari' durante la quale gli siRNA di inizio o 'primari' prodotti dal dacer sono usati come modelli. [15] Questi siRNA "secondari" sono strutturalmente distinti dagli siRNA prodotti da dicer e sembrano essere prodotti da una RNA polimerasi RNA-dipendente (RdRP). [16] [17]

Pre-RNA a forcina 60-70nt. Questo pre-miRNA viene trasportato attraverso il complesso dei pori nucleari (NPC) nel citoplasma, dove Dicer lo riduce ulteriormente a un

20nt miRNA duplex (anche i pre-siRNA entrano nel percorso in questo passaggio). Questo duplex viene quindi caricato in Ago per formare il "pre-RISC (complesso di silenziamento indotto dall'RNA)" e il filamento passeggero viene rilasciato per formare RISC attivo.

I componenti attivi di un complesso di silenziamento indotto da RNA (RISC) sono endonucleasi chiamate proteine ​​argonaute, che scindono il filamento di mRNA bersaglio in modo complementare al loro siRNA legato. [5] Poiché i frammenti prodotti da dicer sono a doppio filamento, potrebbero in teoria produrre ciascuno un siRNA funzionale. Tuttavia, solo uno dei due filamenti, noto come filo guida, lega la proteina argonauta e dirige il silenziamento genico. L'altro filo anti-guida o filo del passeggero viene degradato durante l'attivazione del RISC. [36] Sebbene inizialmente si credesse che un'elicasi ATP-dipendente separasse questi due filamenti, [37] il processo si è dimostrato indipendente dall'ATP ed eseguito direttamente dai componenti proteici di RISC. [38] [39] Tuttavia, an in vitro l'analisi cinetica dell'RNAi in presenza e assenza di ATP ha mostrato che l'ATP può essere necessario per svolgere e rimuovere il filamento di mRNA tagliato dal complesso RISC dopo la catalisi. [40] Il filamento guida tende ad essere quello la cui estremità 5' è accoppiata meno stabilmente al suo complemento, [41] ma la selezione del filamento non è influenzata dalla direzione in cui il dicer taglia il dsRNA prima dell'incorporazione del RISC. [42] Invece, la proteina R2D2 può servire come fattore di differenziazione legando l'estremità 5' più stabile del filamento passeggero. [43]

La base strutturale per il legame dell'RNA alla proteina argonauta è stata esaminata mediante cristallografia a raggi X del dominio di legame di una proteina argonauta legata all'RNA. Qui, l'estremità 5' fosforilata del filamento di RNA entra in una tasca superficiale di base conservata e stabilisce contatti attraverso un catione bivalente (un atomo con due cariche positive) come il magnesio e mediante impilamento aromatico (un processo che consente a più di un atomo di condividere un elettrone facendolo passare avanti e indietro) tra il nucleotide 5' nel siRNA e un residuo di tirosina conservato. Si pensa che questo sito formi un sito di nucleazione per il legame del siRNA al suo mRNA bersaglio. [44] L'analisi dell'effetto inibitorio dei disallineamenti nell'estremità 5' o 3' del filamento guida ha dimostrato che l'estremità 5' del filamento guida è probabilmente responsabile dell'abbinamento e del legame dell'mRNA bersaglio, mentre l'estremità 3' è responsabile dell'organizzazione fisica dell'mRNA bersaglio in una regione RISC favorevole alla scissione. [40]

Non è chiaro come il complesso RISC attivato localizzi mRNA complementari all'interno della cellula. Sebbene sia stato proposto che il processo di scissione sia collegato alla traduzione, la traduzione del bersaglio dell'mRNA non è essenziale per la degradazione mediata da RNAi. [45] In effetti, l'RNAi può essere più efficace contro bersagli di mRNA che non sono tradotti. [46] Le proteine ​​Argonaute sono localizzate in regioni specifiche nel citoplasma chiamate corpi P (anche corpi citoplasmatici o corpi GW), che sono regioni con alti tassi di decadimento dell'mRNA. [47] L'attività dei miRNA è anche raggruppata in corpi P. [48] ​​L'interruzione dei corpi P riduce l'efficienza dell'interferenza dell'RNA, suggerendo che sono un sito critico nel processo RNAi. [49]

Silenziamento trascrizionale Modifica

I componenti della via RNAi sono utilizzati in molti eucarioti per il mantenimento dell'organizzazione e della struttura dei loro genomi. La modificazione degli istoni e l'induzione associata della formazione di eterocromatina serve a sottoregolare i geni pre-trascrizionalmente [51] questo processo è indicato come silenziamento trascrizionale indotto da RNA (RITS) ed è effettuato da un complesso di proteine ​​chiamato complesso RITS. Nel lievito di fissione questo complesso contiene argonaute, una proteina del cromodominio Chp1 e una proteina chiamata Tas3 di funzione sconosciuta. [52] Di conseguenza, l'induzione e la diffusione delle regioni eterocromatiche richiede l'argonauta e le proteine ​​RdRP. [53] Infatti, la delezione di questi geni nel lievito di fissione S. pombe interrompe la metilazione dell'istone e la formazione del centromero, [54] causando un'anafase lenta o in stallo durante la divisione cellulare. [55] In alcuni casi, sono stati osservati processi simili associati alla modificazione dell'istone per sovraregolare trascrizionalmente i geni. [56]

Il meccanismo con cui il complesso RITS induce la formazione e l'organizzazione dell'eterocromatina non è ben compreso. La maggior parte degli studi si è concentrata sulla regione del tipo di accoppiamento nel lievito di fissione, che potrebbe non essere rappresentativa delle attività in altre regioni/organismi genomici. Nel mantenimento delle regioni di eterocromatina esistenti, RITS forma un complesso con siRNA complementari ai geni locali e lega stabilmente gli istoni metilati locali, agendo in modo co-trascrizionale per degradare qualsiasi trascritto pre-mRNA nascente che viene avviato dalla RNA polimerasi. La formazione di tale regione eterocromatina, sebbene non il suo mantenimento, è dipendente dal dicer, presumibilmente perché il dicer è necessario per generare il complemento iniziale di siRNA che prendono di mira le trascrizioni successive. [57] È stato suggerito che il mantenimento dell'eterocromatina funzioni come un circuito di feedback auto-rinforzante, poiché nuovi siRNA si formano dalle trascrizioni nascenti occasionali di RdRP per l'incorporazione nei complessi RITS locali. [58] La rilevanza delle osservazioni dalle regioni del tipo di accoppiamento del lievito di fissione e dai centromeri per i mammiferi non è chiara, poiché il mantenimento dell'eterocromatina nelle cellule di mammifero può essere indipendente dai componenti della via dell'RNAi. [59]

Crosstalk con modifica dell'RNA Modifica

Il tipo di editing dell'RNA che è più diffuso negli eucarioti superiori converte i nucleotidi dell'adenosina in inosina nei dsRNA tramite l'enzima adenosina deaminasi (ADAR). [60] È stato originariamente proposto nel 2000 che le vie di modifica dell'RNAi e dell'RNA A→I potrebbero competere per un substrato di dsRNA comune. [61] Alcuni pre-miRNA subiscono l'editing dell'RNA A→I [62] [63] e questo meccanismo può regolare l'elaborazione e l'espressione dei miRNA maturi. [63] Inoltre, almeno un ADAR di mammifero può sequestrare siRNA dai componenti della via RNAi. [64] Ulteriore supporto a questo modello viene dagli studi su ADAR-null C. elegans ceppi che indicano che l'editing dell'RNA A→I può contrastare il silenziamento dell'RNAi di geni e transgeni endogeni. [65]

Variazione tra organismi Modifica

Gli organismi variano nella loro capacità di assorbire dsRNA estraneo e di utilizzarlo nella via dell'RNAi. Gli effetti dell'interferenza dell'RNA possono essere sia sistemici che ereditari nelle piante e C. elegans, anche se non in Drosophila o mammiferi. Nelle piante, si pensa che l'RNAi si propaghi attraverso il trasferimento di siRNA tra le cellule attraverso i plasmodesmi (canali nelle pareti cellulari che consentono la comunicazione e il trasporto). [37] L'ereditarietà deriva dalla metilazione dei promotori presi di mira dall'RNAi, il nuovo modello di metilazione viene copiato in ogni nuova generazione della cellula. [67] Un'ampia distinzione generale tra piante e animali risiede nel targeting dei miRNA prodotti endogenamente nelle piante, i miRNA sono solitamente perfettamente o quasi perfettamente complementari ai loro geni bersaglio e inducono la scissione diretta dell'mRNA da parte del RISC, mentre i miRNA degli animali tendono ad essere più divergenti in sequenza e inducono la rimozione traslazionale. [66] Questo effetto traslazionale può essere prodotto inibendo le interazioni dei fattori di inizio della traduzione con la coda di poliadenina dell'RNA messaggero. [68]

Alcuni protozoi eucarioti come Leishmania maggiore e Tripanosoma cruzi mancano completamente della via RNAi. [69] [70] La maggior parte o tutti i componenti mancano anche in alcuni funghi, in particolare nell'organismo modello Saccharomyces cerevisiae. [71] La presenza di RNAi in altre specie di lievito in erba come Saccharomyces castellii e candida albicans, dimostra ulteriormente che l'induzione di due proteine ​​correlate all'RNAi da S. castellii facilita l'RNAi in S. cerevisiae. [72] Il fatto che alcuni ascomiceti e basidiomiceti siano privi di percorsi di interferenza dell'RNA indica che le proteine ​​necessarie per il silenziamento dell'RNA sono state perse indipendentemente da molti lignaggi fungini, probabilmente a causa dell'evoluzione di un nuovo percorso con funzione simile, o alla mancanza di vantaggio selettivo in determinate nicchie. [73]

Sistemi procariotici correlati Modifica

L'espressione genica nei procarioti è influenzata da un sistema basato sull'RNA simile per alcuni aspetti all'RNAi. Qui, i geni che codificano per l'RNA controllano l'abbondanza o la traduzione dell'mRNA producendo un RNA complementare che si accoppia a un mRNA. Tuttavia, questi RNA regolatori non sono generalmente considerati analoghi ai miRNA perché l'enzima dicer non è coinvolto. [74] È stato suggerito che i sistemi di interferenza CRISPR nei procarioti siano analoghi ai sistemi di interferenza dell'RNA eucariotico, sebbene nessuno dei componenti proteici sia ortologhi. [75]

Immunità Modifica

L'interferenza dell'RNA è una parte vitale della risposta immunitaria a virus e altro materiale genetico estraneo, specialmente nelle piante dove può anche impedire l'autopropagazione dei trasposoni. [76] Piante come Arabidopsis thaliana esprimono più omologhi cubettatori che sono specializzati a reagire in modo diverso quando la pianta è esposta a virus diversi. [77] Anche prima che il percorso dell'RNAi fosse completamente compreso, era noto che il silenziamento genico indotto nelle piante poteva diffondersi in tutta la pianta in un effetto sistemico e poteva essere trasferito da piante di ceppo a piante rampicanti tramite innesto. [78] Da allora questo fenomeno è stato riconosciuto come una caratteristica del sistema immunitario adattativo della pianta e consente all'intera pianta di rispondere a un virus dopo un primo incontro localizzato. [79] In risposta, molti virus delle piante hanno sviluppato meccanismi elaborati per sopprimere la risposta dell'RNAi. [80] Questi includono proteine ​​virali che legano brevi frammenti di RNA a doppio filamento con estremità sporgenti a filamento singolo, come quelli prodotti da dicer. [81] Alcuni genomi vegetali esprimono anche siRNA endogeni in risposta all'infezione da parte di specifici tipi di batteri. [82] Questi effetti possono essere parte di una risposta generalizzata ai patogeni che sottoregola qualsiasi processo metabolico nell'ospite che aiuta il processo di infezione. [83]

Sebbene gli animali esprimano generalmente meno varianti dell'enzima dicer rispetto alle piante, l'RNAi in alcuni animali produce una risposta antivirale. Sia nel giovane che nell'adulto Drosophila, l'interferenza dell'RNA è importante nell'immunità innata antivirale ed è attiva contro gli agenti patogeni come il virus Drosophila X. [84] [85] Un ruolo simile nell'immunità può operare in C. elegans, poiché le proteine ​​argonaute sono sovraregolate in risposta a virus e vermi che sovraesprimono componenti della via RNAi sono resistenti all'infezione virale. [86] [87]

Il ruolo dell'interferenza dell'RNA nell'immunità innata dei mammiferi è poco compreso e sono disponibili relativamente pochi dati. Tuttavia, l'esistenza di virus che codificano geni in grado di sopprimere la risposta RNAi nelle cellule di mammifero può essere una prova a favore di una risposta immunitaria dei mammiferi RNAi-dipendente, [88] [89] sebbene questa ipotesi sia stata contestata in quanto scarsamente motivata. [90] Sono state presentate prove dell'esistenza di un percorso funzionale dell'RNAi antivirale nelle cellule di mammifero. [91] [92]

Esistono anche altre funzioni per l'RNAi nei virus dei mammiferi, come i miRNA espressi dal virus dell'herpes che possono agire come inneschi dell'organizzazione dell'eterocromatina per mediare la latenza virale. [93]

Downregolazione dei geni Modifica

I miRNA espressi in modo endogeno, compresi i miRNA intronici e intergenici, sono più importanti nella repressione traslazionale [66] e nella regolazione dello sviluppo, in particolare sui tempi della morfogenesi e sul mantenimento di tipi cellulari indifferenziati o incompletamente differenziati come le cellule staminali. [94] Il ruolo del miRNA espresso in modo endogeno nella sottoregolazione dell'espressione genica è stato descritto per la prima volta in C. elegans nel 1993. [95] Nelle piante questa funzione è stata scoperta quando il "JAW microRNA" di Arabidopsis ha dimostrato di essere coinvolto nella regolazione di diversi geni che controllano la forma delle piante. [96] Nelle piante, la maggior parte dei geni regolati dai miRNA sono fattori di trascrizione [97] quindi l'attività dei miRNA è particolarmente ampia e regola intere reti di geni durante lo sviluppo modulando l'espressione di geni regolatori chiave, inclusi fattori di trascrizione e F -box proteine. [98] In molti organismi, compreso l'uomo, i miRNA sono collegati alla formazione di tumori e alla disregolazione del ciclo cellulare. Qui, i miRNA possono funzionare sia come oncogeni che come soppressori tumorali. [99]

Sulla base dell'analisi filogenetica basata sulla parsimonia, il più recente antenato comune di tutti gli eucarioti molto probabilmente possedeva già una via di interferenza dell'RNA precoce, si pensa che l'assenza della via in alcuni eucarioti sia una caratteristica derivata. [100] Questo sistema RNAi ancestrale probabilmente conteneva almeno una proteina dicer-like, un argonaute, una proteina PIWI e una RNA polimerasi RNA-dipendente che potrebbe aver svolto anche altri ruoli cellulari. Allo stesso modo, uno studio comparativo di genomica su larga scala indica che il gruppo della corona eucariotica possedeva già questi componenti, che potrebbero quindi aver avuto associazioni funzionali più strette con sistemi di degradazione dell'RNA generalizzati come l'esosoma. [101] Questo studio suggerisce anche che la famiglia della proteina argonauta legante l'RNA, che è condivisa tra gli eucarioti, la maggior parte degli archaea e almeno alcuni batteri (come Aquifex aeolicus), è omologa e originariamente si è evoluta dai componenti del sistema di iniziazione della traduzione.

Atterramento genetico Modifica

La via dell'interferenza dell'RNA è spesso sfruttata in biologia sperimentale per studiare la funzione dei geni nella coltura cellulare e in vivo negli organismi modello. [5] L'RNA a doppio filamento viene sintetizzato con una sequenza complementare a un gene di interesse e introdotto in una cellula o organismo, dove viene riconosciuto come materiale genetico esogeno e attiva la via dell'RNAi. Utilizzando questo meccanismo, i ricercatori possono causare una drastica diminuzione dell'espressione di un gene mirato. Studiare gli effetti di questa diminuzione può mostrare il ruolo fisiologico del prodotto genico. Poiché l'RNAi potrebbe non abolire completamente l'espressione del gene, questa tecnica viene talvolta definita "knockdown", per distinguerla dalle procedure "knockout" in cui l'espressione di un gene è completamente eliminata. [102] In un recente studio la convalida dell'efficienza del silenziamento dell'RNAi utilizzando dati di array di geni ha mostrato un tasso di fallimento del 18,5% in 429 esperimenti indipendenti. [103]

Grandi sforzi nella biologia computazionale sono stati diretti verso la progettazione di reagenti dsRNA di successo che massimizzano il knockdown genico ma riducono al minimo gli effetti "fuori bersaglio". Gli effetti fuori bersaglio si verificano quando un RNA introdotto ha una sequenza di basi che può accoppiarsi e quindi ridurre l'espressione di più geni. Tali problemi si verificano più frequentemente quando il dsRNA contiene sequenze ripetitive. È stato stimato dallo studio dei genomi degli esseri umani, C. elegans e S. pombe che circa il 10% dei possibili siRNA ha effetti sostanziali fuori bersaglio. [9] Una moltitudine di strumenti software sono stati sviluppati implementando algoritmi per la progettazione di siRNA generici [104] [105] specifici per i mammiferi, [106] e specifici per virus [107] che vengono automaticamente controllati per la possibile reattività crociata.

A seconda dell'organismo e del sistema sperimentale, l'RNA esogeno può essere un lungo filamento progettato per essere tagliato dal dicer, o brevi RNA progettati per fungere da substrati di siRNA. Nella maggior parte delle cellule di mammifero, vengono utilizzati RNA più corti perché le lunghe molecole di RNA a doppio filamento inducono la risposta all'interferone dei mammiferi, una forma di immunità innata che reagisce in modo non specifico al materiale genetico estraneo. [108] Gli ovociti di topo e le cellule dei primi embrioni di topo mancano di questa reazione al dsRNA esogeno e sono quindi un sistema modello comune per studiare gli effetti di knockdown genico dei mammiferi. [109] Sono state sviluppate anche tecniche di laboratorio specializzate per migliorare l'utilità dell'RNAi nei sistemi dei mammiferi evitando l'introduzione diretta di siRNA, ad esempio, mediante trasfezione stabile con un plasmide che codifica la sequenza appropriata da cui possono essere trascritti siRNA, [110] o da sistemi di vettori lentivirali più elaborati che consentono l'attivazione o la disattivazione inducibile della trascrizione, noti come RNAi condizionale. [111] [112]

Genomica funzionale Modifica


Gli approcci alla progettazione di librerie di RNAi a livello di genoma possono richiedere più sofisticatezza rispetto alla progettazione di un singolo siRNA per un insieme definito di condizioni sperimentali. Le reti neurali artificiali sono spesso utilizzate per progettare librerie di siRNA [113] e per prevedere la loro probabile efficienza al knockdown del gene. [114] Lo screening genomico di massa è ampiamente considerato un metodo promettente per l'annotazione del genoma e ha innescato lo sviluppo di metodi di screening ad alto rendimento basati su microarray. [115] [116] Tuttavia, l'utilità di questi schermi e la capacità delle tecniche sviluppate su organismi modello di generalizzare anche a specie strettamente correlate è stata messa in dubbio, ad esempio da C. elegans ai nematodi parassiti correlati. [117] [118]

Medicina Modifica

Storia dell'uso dell'RNAi in medicina

Il primo caso di silenziamento dell'RNA negli animali è stato documentato nel 1996, quando Guo e Kemphues osservarono che, introducendo RNA senso e antisenso nel par-1 mRNA in Caenorhabditis elegans causato il degrado del messaggio par-1. [119] Si pensava che questa degradazione fosse innescata da RNA a singolo filamento (ssRNA), ma due anni dopo, nel 1998, Fire e Mello scoprirono che questa capacità di silenziare l'espressione genica par-1 era in realtà innescata da RNA a doppio filamento RNA (dsRNA). [119] Alla fine avrebbero condiviso il Premio Nobel per la Fisiologia o la Medicina per questa scoperta. [120] Subito dopo la scoperta pionieristica di Fire e Mello, Elbashir et al. scoperto, utilizzando piccoli RNA interferenti sintetici (siRNA), era possibile mirare al silenziamento di sequenze specifiche in un gene, piuttosto che silenziare l'intero gene. [121] Solo un anno dopo, McCaffrey e colleghi hanno dimostrato che questo silenziamento specifico per sequenza aveva applicazioni terapeutiche prendendo di mira una sequenza del virus dell'epatite C in topi transgenici. [122] Da allora, diversi ricercatori hanno tentato di espandere le applicazioni terapeutiche dell'RNAi, cercando in particolare di colpire i geni che causano vari tipi di cancro. [123] [124] Entro il 2006, le prime applicazioni a raggiungere gli studi clinici riguardavano il trattamento della degenerazione maculare e del virus respiratorio sinciziale. [125] Quattro anni dopo è stato avviato il primo studio clinico di fase I sull'uomo, utilizzando un sistema di consegna di nanoparticelle per colpire i tumori solidi. [126] Sebbene la maggior parte della ricerca stia attualmente esaminando le applicazioni dell'RNAi nel trattamento del cancro, l'elenco delle possibili applicazioni è ampio. L'RNAi potrebbe essere potenzialmente usato per trattare virus, [127] malattie batteriche, [128] parassiti, [129] mutazioni genetiche disadattive, [130] controllare il consumo di droghe, [131] fornire sollievo dal dolore, [132] e persino modulare il sonno. [133]

Applicazioni terapeutiche Modifica

Infezione virale Modifica

Il trattamento antivirale è una delle prime applicazioni mediche proposte basate sull'RNAi e ne sono stati sviluppati due diversi tipi. Il primo tipo è quello di indirizzare gli RNA virali. Molti studi hanno dimostrato che prendere di mira gli RNA virali può sopprimere la replicazione di numerosi virus, tra cui HIV, [134] HPV, [135] epatite A, [136] epatite B, [137] virus dell'influenza, [138] [139] [140 ] [141] virus respiratorio sinciziale (RSV), [141] SARS coronavirus (SARS-CoV), [141] adenovirus [141] e virus del morbillo. [142] L'altra strategia consiste nel bloccare le entrate virali iniziali prendendo di mira i geni delle cellule ospiti. [143] Ad esempio, la soppressione dei recettori delle chemochine (CXCR4 e CCR5) sulle cellule ospiti può impedire l'ingresso del virus HIV. [144]

Cancro Modifica

Mentre la chemioterapia tradizionale può uccidere efficacemente le cellule tumorali, la mancanza di specificità per discriminare le cellule normali e le cellule tumorali in questi trattamenti di solito causa gravi effetti collaterali. Numerosi studi hanno dimostrato che l'RNAi può fornire un approccio più specifico per inibire la crescita del tumore prendendo di mira i geni correlati al cancro (cioè l'oncogene). [145] È stato anche proposto che l'RNAi possa aumentare la sensibilità delle cellule tumorali agli agenti chemioterapici, fornendo un approccio terapeutico combinatorio con la chemioterapia. [146] Un altro potenziale trattamento a base di RNAi è quello di inibire l'invasione e la migrazione delle cellule. [147]

Malattie neurologiche Modifica

Le strategie RNAi mostrano anche il potenziale per il trattamento delle malattie neurodegenerative. Studi nelle cellule e nel topo hanno dimostrato che mirare specificamente ai geni produttori di amiloide-beta (ad esempio BACE1 e APP) da parte dell'RNAi può ridurre significativamente la quantità di peptide Aβ che è correlato con la causa della malattia di Alzheimer. [148] [149] [150] Inoltre, questi approcci basati sul silenziamento forniscono anche risultati promettenti nel trattamento del morbo di Parkinson e della malattia da poliglutamine. [151] [152] [153]

Difficoltà nell'applicazione terapeutica Modifica

Per ottenere il potenziale clinico dell'RNAi, il siRNA deve essere trasportato in modo efficiente alle cellule dei tessuti bersaglio. Tuttavia, ci sono vari ostacoli che devono essere fissati prima che possa essere utilizzato clinicamente. Ad esempio, il siRNA "nudo" è suscettibile di diversi ostacoli che ne riducono l'efficacia terapeutica. [154] Inoltre, una volta che il siRNA è entrato nel flusso sanguigno, l'RNA nudo può essere degradato dalle nucleasi sieriche e può stimolare il sistema immunitario innato. [154] A causa delle sue dimensioni e della natura altamente polianionica (contenente cariche negative in diversi siti), le molecole di siRNA non modificate non possono entrare facilmente nelle cellule attraverso la membrana cellulare. Pertanto, devono essere utilizzati siRNA artificiali o incapsulati con nanoparticelle. Tuttavia, il trasporto di siRNA attraverso la membrana cellulare presenta ancora le sue sfide uniche. Se siRNA viene trasferito attraverso la membrana cellulare, possono verificarsi tossicità indesiderate se le dosi terapeutiche non sono ottimizzate e gli siRNA possono mostrare effetti fuori bersaglio (ad esempio downregulation non intenzionale di geni con complementarità di sequenza parziale). [155] Anche dopo essere entrati nelle cellule, è necessario un dosaggio ripetuto poiché i loro effetti sono diluiti ad ogni divisione cellulare. Come descritto in precedenza, anche parti del vettore che trasporta il dsRNA possono avere effetti regolatori. Pertanto, gli effetti collaterali non specifici dovrebbero essere considerati e controllati. [156]

Trattamento del cancro Modifica

Rispetto alla chemioterapia o ad altri farmaci antitumorali, ci sono molti vantaggi del farmaco siRNA. [157] Il siRNA agisce sulla fase post-trascrizionale dell'espressione genica, quindi non modifica o cambia il DNA con un effetto deleterio. [157] SiRNA può anche essere utilizzato per produrre una risposta specifica in un certo tipo di modo, ad esempio declassando la soppressione dell'espressione genica. [157] In una singola cellula cancerosa, il siRNA può causare una drammatica soppressione dell'espressione genica con solo diverse copie. [157] Ciò avviene silenziando i geni che promuovono il cancro con RNAi, oltre a prendere di mira una sequenza di mRNA. [157]

I farmaci RNAi trattano il cancro silenziando alcuni geni che promuovono il cancro. [157] Questo viene fatto integrando i geni del cancro con l'RNAi, ad esempio mantenendo le sequenze di mRNA in accordo con il farmaco RNAi. [157] Idealmente, l'RNAi dovrebbe essere iniettato e/o modificato chimicamente in modo che l'RNAi possa raggiungere le cellule cancerose in modo più efficiente. [157] L'assorbimento e la regolazione dell'RNAi sono monitorati dai reni. [157]

Stimolazione della risposta immunitaria Modifica

Il sistema immunitario umano è diviso in due rami separati: il sistema immunitario innato e il sistema immunitario adattativo. [158] Il sistema immunitario innato è la prima difesa contro le infezioni e risponde agli agenti patogeni in modo generico. [158] D'altra parte, il sistema immunitario adattativo, un sistema che si è evoluto più tardi di quello innato, è composto principalmente da cellule B e T altamente specializzate che sono addestrate a reagire a porzioni specifiche di molecole patogene. [158]

La sfida tra vecchi e nuovi agenti patogeni ha contribuito a creare un sistema di cellule e particelle protette che sono chiamate quadro sicuro. [158] Questa struttura ha fornito agli umani un esercito di sistemi che cercano e distruggono le particelle invasori, come agenti patogeni, organismi microscopici, parassiti e infezioni. [158] La struttura sicura per i mammiferi si è sviluppata per incorporare siRNA come strumento per indicare la contaminazione virale, che ha consentito a siRNA di creare un'intensa risposta immunitaria innata. [158]

siRNA è controllato dal sistema immunitario innato, che può essere suddiviso in risposte infiammatorie acute e risposte antivirali. [158] La risposta infiammatoria viene creata con segnali provenienti da piccole molecole di segnalazione o citochine. [158] Questi includono l'interleuchina-1 (IL-1), l'interleuchina-6 (IL-6), l'interleuchina-12 (IL-12) e il fattore di necrosi tumorale α (TNF-α). [158] Il sistema immunitario innato genera infiammazione e risposte antivirali, che causano i recettori di riconoscimento del modello di rilascio (PRR). [158] Questi recettori aiutano a identificare quali agenti patogeni sono virus, funghi o batteri. [158] Inoltre, l'importanza di siRNA e del sistema immunitario innato è di includere più PRR per aiutare a riconoscere diverse strutture di RNA. [158] Ciò rende più probabile che il siRNA causi una risposta immunostimolante nel caso dell'agente patogeno. [158]

Prospettive come tecnica terapeutica Modifica

Gli studi clinici di Fase I e II sulle terapie con siRNA condotti tra il 2015 e il 2017 hanno dimostrato un potente e duraturo knockdown genico nel fegato, con alcuni segni di miglioramento clinico e senza tossicità inaccettabile. [155] Sono in corso due studi di Fase III per il trattamento delle sindromi neurodegenerative e cardiache familiari causate da mutazioni della transtiretina (TTR). [155] Numerose pubblicazioni hanno dimostrato che i sistemi di somministrazione in vivo sono molto promettenti e hanno caratteristiche diverse, consentendo numerose applicazioni. Il sistema di somministrazione delle nanoparticelle è il più promettente, ma questo metodo presenta ulteriori sfide nell'ampliamento del processo di produzione, come la necessità di processi di miscelazione strettamente controllati per ottenere una qualità costante del prodotto farmaceutico. [154]

La tabella seguente mostra diversi farmaci che utilizzano l'interferenza dell'RNA e quali erano le loro fasi e il loro stato negli studi clinici a partire dal 2013. [154]

Droga Obbiettivo Sistema di consegna Malattia Fase Stato Società Identificatore
ALN–VSP02 KSP e VEGF LNP Tumori solidi io Completato Alnylam Pharmaceuticals NCT01158079
siRNA–EphA2–DOPC EphA2 LNP Tumori avanzati io reclutamento MD Anderson Cancer Center NCT01591356
Atu027 PKN3 LNP Tumori solidi io Completato Terapia del silenzio NCT00938574
TKM-080301 PLK1 LNP Cancro io reclutamento Tekmira Pharmaceutical NCT01262235
TKM–100201 VP24, VP35, Zaire Ebola L-polimerasi LNP Infezione da virus Ebola io reclutamento Tekmira farmaceutica NCT01518881
ALN–RSV01 nucleocapside RSV siRNA nudo Infezioni respiratorie da virus sinciziale II Completato Alnylam Pharmaceuticals NCT00658086
PRO-040201 ApoB LNP Ipercolesterolemia io Terminato Tekmira Pharmaceutical NCT00927459
ALN–PCS02 PCSK9 LNP Ipercolesterolemia io Completato Alnylam prodotti farmaceutici NCT01437059
ALN–TTR02 TTR LNP Amiloidosi mediata da transtiretina II reclutamento Alnylam prodotti farmaceutici NCT01617967
CALAA-01 RRM2 Ciclodestrina NP Tumori solidi io Attivo Calando Pharmaceuticals NCT00689065
TD101 K6a (mutazione N171K) siRNA nudo Pachionichia congenita io Completato Progetto Pachyonychia Congenita NCT00716014
AGN211745 VEGFR1 siRNA nudo Degenerazione maculare senile, neovascolarizzazione coroideale II Terminato Allergan NCT00395057
QPI-1007 CASP2 siRNA nudo Atrofia ottica, neuropatia ottica ischemica anteriore non arteritica io Completato Prodotti farmaceutici di Quark NCT01064505
I5NP p53 siRNA nudo Danno renale, insufficienza renale acuta io Completato Prodotti farmaceutici di Quark NCT00554359
Funzione ritardata dell'innesto, complicanze del trapianto di rene io, II reclutamento Prodotti farmaceutici di Quark NCT00802347
PF-655 (PF-04523655) RTP801 (bersaglio proprietario) siRNA nudo Neovascolarizzazione coroideale, retinopatia diabetica, edema maculare diabetico II Attivo Prodotti farmaceutici di Quark NCT01445899
siG12D LODER KRAS polimero LODER Il cancro del pancreas II reclutamento Silenzioso NCT01676259
Bevasiranib VEGF siRNA nudo Edema maculare diabetico, degenerazione maculare II Completato Opko Health NCT00306904
SYL1001 TRPV1 siRNA nudo Dolore oculare, sindrome dell'occhio secco io, II reclutamento Sylentis NCT01776658
SYL040012 ADRB2 siRNA nudo Ipertensione oculare, glaucoma ad angolo aperto II reclutamento Sylentis NCT01739244
CEQ508 CTNNB1 ShRNA . portatore di Escherichia coli Poliposi adenomatosa familiare io, II reclutamento Marina Biotech Sconosciuto
RXi-109 CTGF Composto di RNAi a rilascio automatico Cicatrice prevenzione cicatrice io reclutamento Prodotti farmaceutici RXi NCT01780077
ALN–TTRsc TTR siRNA-GalNAc coniugato Amiloidosi mediata da transtiretina io reclutamento Alnylam prodotti farmaceutici NCT01814839
ARC-520 Regioni conservate di HBV DPC HBV io reclutamento Ricerca sulla punta di freccia NCT01872065

Biotecnologia Modifica

L'interferenza dell'RNA è stata utilizzata per applicazioni in biotecnologia e si sta avvicinando alla commercializzazione in altri campi. L'RNAi ha portato all'invenzione di nuove colture come tabacco senza nicotina, caffè decaffeinato, vegetazione fortificata con nutrienti e colture ipoallergeniche. Le mele artiche geneticamente modificate hanno ricevuto l'approvazione della FDA nel 2015. [159] Le mele sono state prodotte dalla soppressione RNAi del gene PPO (polifenolo ossidasi), rendendo le varietà di mele che non subiranno l'imbrunimento dopo essere state affettate. Le mele silenziate con PPO non sono in grado di convertire l'acido clorogenico nel prodotto standard del chinone. [1]

Ci sono diverse opportunità per le applicazioni dell'RNAi nella scienza delle colture per il suo miglioramento, come la tolleranza allo stress e il miglioramento del livello nutrizionale. L'RNAi dimostrerà il suo potenziale di inibizione della fotorespirazione per migliorare la produttività delle piante C3. Questa tecnologia di abbattimento può essere utile per indurre la fioritura precoce, la maturazione ritardata, la senescenza ritardata, l'interruzione della dormienza, le piante senza stress, il superamento dell'autosterilità, ecc. [1]

Cibi Modifica

L'RNAi è stato utilizzato per ingegnerizzare geneticamente le piante per produrre livelli più bassi di tossine vegetali naturali. Tali tecniche sfruttano il fenotipo RNAi stabile ed ereditabile nei ceppi vegetali. I semi di cotone sono ricchi di proteine ​​alimentari, ma contengono naturalmente il prodotto tossico terpenoide gossipolo, che li rende inadatti al consumo umano. L'RNAi è stato utilizzato per produrre ceppi di cotone i cui semi contengono livelli ridotti di delta-cadinene sintasi, un enzima chiave nella produzione del gossipolo, senza influenzare la produzione dell'enzima in altre parti della pianta, dove il gossipolo è di per sé importante nella prevenzione dei danni da parassiti delle piante. [160] Sforzi simili sono stati diretti verso la riduzione del prodotto naturale cianogeno linamarina nelle piante di manioca. [161]

Nessun prodotto vegetale che utilizzi l'ingegneria genetica basata sull'RNAi è ancora uscito dalla fase sperimentale. Gli sforzi di sviluppo hanno ridotto con successo i livelli di allergeni nelle piante di pomodoro [162] e la fortificazione di piante come i pomodori con antiossidanti alimentari. [163] I prodotti commerciali precedenti, tra cui il pomodoro Flavr Savr e due cultivar di papaia resistente agli anelli, sono stati originariamente sviluppati utilizzando la tecnologia antisenso, ma probabilmente sfruttavano la via dell'RNAi. [164] [165] Il silenziamento dell'RNAi dell'alfa-amilasi è stato utilizzato anche per ridurre la crescita del fungo Aspergillus flavus nel mais che altrimenti avrebbe contaminato i chicchi con pericolose aflatossine. [166] Il silenziamento del fattore lacrimogeno sintasi nelle cipolle ha prodotto cipolle senza lacrime e l'RNAi è stato utilizzato nei geni BP1 nei semi di colza per migliorare la fotosintesi. [167] I geni SBEIIa e SBEIIb nel frumento sono stati presi di mira nel frumento al fine di produrre livelli più elevati di amilosio al fine di migliorare la funzione intestinale. [168]

Altre colture Modifica

Un altro sforzo ha ridotto i precursori di probabili agenti cancerogeni nelle piante di tabacco. [169] Altre caratteristiche delle piante che sono state ingegnerizzate in laboratorio includono la produzione di prodotti naturali non narcotici da parte del papavero da oppio [170] e la resistenza ai comuni virus delle piante. [171]

Insetticida Modifica

L'RNAi è in fase di sviluppo come insetticida, utilizzando molteplici approcci, tra cui l'ingegneria genetica e l'applicazione topica. [3] Le cellule dell'intestino medio di alcuni insetti assorbono le molecole di dsRNA nel processo denominato RNAi ambientale. [172] In alcuni insetti l'effetto è sistemico poiché il segnale si diffonde in tutto il corpo dell'insetto (denominato RNAi sistemico). [173]

Gli animali esposti all'RNAi a dosi milioni di volte superiori ai livelli di esposizione umana previsti non mostrano effetti negativi. [174]

L'RNAi ha effetti variabili in diverse specie di lepidotteri (farfalle e falene). [175] Forse perché la loro saliva e il loro succo intestinale sono più bravi a scomporre l'RNA, il verme del cotone, il verme della barbabietola e la piralide del riso asiatico non si sono dimostrati suscettibili all'RNAi alimentandosi. [3]

Prove recenti suggeriscono che la resistenza all'RNAi potrebbe essere ad ampio spettro, il che significa che la resistenza a una sequenza potrebbe conferire resistenza ad altre sequenze di dsRNA. In una popolazione di laboratorio di diabrotica del mais occidentale, la resistenza si è verificata per mancanza di assorbimento di DvSnf7 dsRNA attraverso l'intestino. [176] Quando altre sequenze di dsRNA sono state testate contro DvSnf7, le altre sequenze non erano più efficaci, il che suggerisce che la gestione della resistenza sarebbe stata più difficile della semplice sostituzione delle sequenze di dsRNA. Combinando più strategie, come l'ingegnerizzazione della proteina Cry, derivata da un batterio chiamato Bacillus thuringiensis (Bt) e RNAi in una pianta ritardano l'insorgenza della resistenza. [3] [177]

Piante transgeniche Modifica

Sono state realizzate colture transgeniche per esprimere il dsRNA, scelto con cura per silenziare geni cruciali nei parassiti bersaglio. Questi dsRNA sono progettati per influenzare solo gli insetti che esprimono sequenze geniche specifiche. Come prova di principio, nel 2009 uno studio ha mostrato che gli RNA potrebbero uccidere una qualsiasi delle quattro specie di moscerini della frutta senza danneggiare le altre tre. [3]

Nel 2012 Syngenta ha acquistato la società belga RNAi Devgen per $ 522 milioni e Monsanto ha pagato $ 29,2 milioni per i diritti esclusivi sulla proprietà intellettuale di Alnylam Pharmaceuticals. L'International Potato Center di Lima, in Perù, è alla ricerca di geni da colpire nel tonchio della patata dolce, uno scarabeo le cui larve devastano le patate dolci in tutto il mondo. Altri ricercatori stanno cercando di mettere a tacere i geni di formiche, bruchi e scarabei pollinici. La Monsanto sarà probabilmente la prima a commercializzare, con un seme di mais transgenico che esprime il dsRNA basato sul gene Snf7 della diabrotica del mais occidentale, un coleottero le cui larve causano ogni anno un miliardo di dollari di danni nei soli Stati Uniti. Un documento del 2012 ha mostrato che il silenziamento di Snf7 blocca la crescita delle larve, uccidendole in pochi giorni. Nel 2013 lo stesso team ha dimostrato che l'RNA colpisce pochissime altre specie. [3]

Modifica topica

In alternativa, il dsRNA può essere fornito senza ingegneria genetica. Un approccio è aggiungerli all'acqua di irrigazione. Le molecole vengono assorbite nel sistema vascolare delle piante e avvelenano gli insetti che si nutrono di esse. Un altro approccio prevede la spruzzatura di dsRNA come un pesticida convenzionale. Ciò consentirebbe un adattamento più rapido alla resistenza. Tali approcci richiederebbero fonti di dsRNA a basso costo che attualmente non esistono. [3]

Screening su scala genomica Modifica

La ricerca RNAi su scala genomica si basa sulla tecnologia di screening ad alto rendimento (HTS). La tecnologia RNAi HTS consente lo screening della perdita di funzione dell'intero genoma ed è ampiamente utilizzata nell'identificazione di geni associati a fenotipi specifici. Questa tecnologia è stata salutata come una potenziale seconda ondata di genomica, dopo la prima ondata di genomica di microarray di espressione genica e piattaforme di scoperta del polimorfismo a singolo nucleotide. [178] Uno dei principali vantaggi dello screening RNAi su scala genomica è la sua capacità di interrogare simultaneamente migliaia di geni. Con la capacità di generare una grande quantità di dati per esperimento, lo screening RNAi su scala genomica ha portato a un'esplosione dei tassi di generazione dei dati. Lo sfruttamento di insiemi di dati così grandi è una sfida fondamentale, che richiede metodi statistici/bioinformatici adeguati. Il processo di base dello screening RNAi cellulare include la scelta di una libreria RNAi, tipi cellulari robusti e stabili, trasfezione con agenti RNAi, trattamento/incubazione, rilevamento del segnale, analisi e identificazione di geni importanti o bersagli terapeutici. [179]

Il processo di RNAi è stato indicato come "co-soppressione" e "quelling" quando osservato prima della conoscenza di un meccanismo correlato all'RNA. La scoperta dell'RNAi è stata preceduta prima da osservazioni di inibizione trascrizionale da parte dell'RNA antisenso espresso in piante transgeniche, [181] e più direttamente da segnalazioni di risultati inaspettati in esperimenti condotti da scienziati vegetali negli Stati Uniti e nei Paesi Bassi nei primi anni '90. [182] Nel tentativo di alterare i colori dei fiori nelle petunie, i ricercatori hanno introdotto copie aggiuntive di un gene che codifica la calcone sintasi, un enzima chiave per la pigmentazione dei fiori nelle piante di petunia dal colore dei fiori normalmente rosa o viola. Ci si aspettava che il gene sovraespresso portasse a fiori più scuri, ma invece faceva sì che alcuni fiori avessero pigmento viola meno visibile, a volte in modelli variegati, indicando che l'attività della calcone sintasi era stata sostanzialmente ridotta o era stata soppressa in un modo specifico del contesto. Ciò sarebbe in seguito spiegato come il risultato dell'inserimento del transgene adiacente ai promotori nella direzione opposta in varie posizioni in tutto il genoma di alcuni trasformanti, portando così all'espressione di trascritti antisenso e silenziamento genico quando questi promotori sono attivi. Un'altra prima osservazione dell'RNAi è venuta da uno studio sul fungo Neurospora crassa, [183] ​​sebbene non sia stato immediatamente riconosciuto come correlato. Ulteriori indagini sul fenomeno nelle piante hanno indicato che la downregulation era dovuta all'inibizione post-trascrizionale dell'espressione genica attraverso un aumento del tasso di degradazione dell'mRNA. [184] Questo fenomeno fu chiamato co-soppressione dell'espressione genica, ma il meccanismo molecolare è rimasto sconosciuto. [185]

Non molto tempo dopo, i virologi delle piante che lavoravano per migliorare la resistenza delle piante alle malattie virali hanno osservato un fenomeno inaspettato simile. Sebbene fosse noto che le piante che esprimono proteine ​​specifiche del virus mostrassero una maggiore tolleranza o resistenza all'infezione virale, non ci si aspettava che le piante che trasportavano solo brevi regioni non codificanti di sequenze di RNA virale mostrassero livelli di protezione simili. I ricercatori ritenevano che anche l'RNA virale prodotto dai transgeni potesse inibire la replicazione virale. [186] L'esperimento inverso, in cui brevi sequenze di geni vegetali sono state introdotte nei virus, ha mostrato che il gene mirato è stato soppresso in una pianta infetta. [187] Questo fenomeno è stato etichettato come "silenziamento genico indotto da virus" (VIGS), e l'insieme di tali fenomeni è stato chiamato collettivamente silenziamento genico post-trascrizionale. [188]

Dopo queste prime osservazioni nelle piante, i laboratori hanno cercato questo fenomeno in altri organismi. [189] [190] 1998 di Craig C. Mello e Andrew Fire Natura carta ha riportato un potente effetto di silenziamento genico dopo l'iniezione di RNA a doppio filamento in C. elegans. [191] Nello studio della regolazione della produzione di proteine ​​muscolari, hanno osservato che né le iniezioni di mRNA né di RNA antisenso hanno avuto un effetto sulla produzione di proteine, ma l'RNA a doppio filamento ha silenziato con successo il gene mirato. Come risultato di questo lavoro, hanno coniato il termine RNAi. Questa scoperta ha rappresentato la prima identificazione dell'agente eziologico del fenomeno. Fire e Mello hanno ricevuto nel 2006 il Premio Nobel per la Fisiologia o la Medicina. [5]

  1. ^ unBC Saurabh S, Vidyarthi AS, Prasad D (marzo 2014). "Interferenza dell'RNA: dal concetto alla realtà nel miglioramento delle colture". Plantare. 239 (3): 543-64. doi: 10.1007/s00425-013-2019-5 . PMID24402564.
  2. ^
  3. Weiss B, Davidkova G, Zhou LW (marzo 1999). "Terapia genica dell'RNA antisenso per lo studio e la modulazione dei processi biologici". Scienze della vita cellulare e molecolare. 55 (3): 334–58. doi:10.1007/s000180050296. PMID10228554. S2CID9448271.
  4. ^ unBCDeFG
  5. Kupferschmidt, K. (2013). "Una dose letale di RNA". Scienza. 341 (6147): 732–3. Bibcode:2013Sci. 341.732K. doi:10.1126/science.341.6147.732. PMID23950525.
  6. ^
  7. Macrae IJ, Zhou K, Li F, Repic A, Brooks AN, Cande WZ, Adams PD, Doudna JA (gennaio 2006). "Base strutturale per l'elaborazione di RNA a doppio filamento da Dicer". Scienza. 311 (5758): 195-8. Bibcode:2006Sci. 311..195M. doi:10.1126/science.1121638. PMID16410517. S2CID23785494.
  8. ^ unBCD
  9. Daneholt B. "Informazioni avanzate: interferenza dell'RNA". Il Premio Nobel per la Fisiologia o la Medicina 2006. Archiviato dall'originale il 20 gennaio 2007 . Estratto il 25 gennaio 2007.
  10. ^
  11. Bagasra O, Prilliman KR (agosto 2004). "Interferenza dell'RNA: il sistema immunitario molecolare". Giornale di Istologia Molecolare. 35 (6): 545–53. CiteSeerX10.1.1.456.1701 . doi:10.1007/s10735-004-2192-8. PMID15614608. S2CID2966105.
  12. ^
  13. Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ (gennaio 2001). "Ruolo per una ribonucleasi bidentata nella fase di iniziazione dell'interferenza dell'RNA". Natura. 409 (6818): 363–6. Bibcode:2001Natur.409..363B. doi:10.1038/35053110. PMID11201747. S2CID4371481.
  14. ^
  15. Siomi H, Siomi MC (gennaio 2009). "Sulla strada per leggere il codice di interferenza RNA". Natura. 457 (7228): 396-404. Bibcode:2009Natur.457..396S. doi:10.1038/nature07754. PMID19158785. S2CID205215974.
  16. Zamore PD, Tuschl T, Sharp PA, Bartel DP (marzo 2000). "RNAi: RNA a doppio filamento dirige la scissione ATP-dipendente dell'mRNA a intervalli di 21-23 nucleotidi". Cellula. 101 (1): 25–33. doi: 10.1016/S0092-8674(00)80620-0 . PMID10778853.
  17. Vermeulen A, Behlen L, Reynolds A, Wolfson A, Marshall WS, Karpilow J, Khvorova A (maggio 2005). "I contributi della struttura del dsRNA alla specificità e all'efficienza di Dicer". RNA. 11 (5): 674-82. doi:10.1261/rna.7272305. PMC1370754. PMID15811921.
  18. Castanotto D, Rossi JJ (gennaio 2009). "Le promesse e le insidie ​​delle terapie basate sull'interferenza dell'RNA". Natura. 457 (7228): 426-33. Bibcode:2009Natur.457..426C. doi:10.1038/nature07758. PMC2702667. PMID19158789.
  19. ^ unB
  20. Qiu S, Adema CM, Lane T (2005). "Uno studio computazionale degli effetti fuori bersaglio dell'interferenza dell'RNA". Ricerca sugli acidi nucleici. 33 (6): 1834-1847. doi:10.1093/nar/gki324. PMC1072799. PMID15800213.
  21. ^ unB
  22. Nakanishi K (settembre 2016). "Anatomia del RISC: come i piccoli RNA e chaperon attivano le proteine ​​Argonaute?". Recensioni interdisciplinari Wiley: RNA. 7 (5): 637–60. doi:10.1002/wrna.1356. PMC5084781. PMID27184117.
  23. ^
  24. Liang C, Wang Y, Murota Y, Liu X, Smith D, Siomi MC, Liu Q (settembre 2015). "TAF11 assembla il complesso di caricamento RISC per migliorare l'efficienza di RNAi". Cellula molecolare. 59 (5): 807-18. doi:10.1016/j.molcel.2015.07.006. PMC4560963. PMID26257286.
  25. ^
  26. Ahlquist P (2002). "RNA polimerasi RNA-dipendente, virus e silenziamento dell'RNA". Scienza. 296 (5571): 1270–3. Bibcode:2002Sci. 296.1270A. doi:10.1126/science.1069132. PMID12016304. S2CID42526536.
  27. ^
  28. Roberts, TC (2015). "Il macchinario microRNA". MicroRNA: Scienze di base. Progressi nella medicina sperimentale e nella biologia. 887. pp. 15-30. doi:10.1007/978-3-319-22380-3_2. ISBN978-3-319-22379-7. PMID26662984.
  29. ^ unBCD
  30. Parker G, Eckert D, Basso B (2006). "RDE-4 si lega preferenzialmente dsRNA lungo e la sua dimerizzazione è necessaria per la scissione del dsRNA in siRNA". RNA. 12 (5): 807-18. doi:10.1261/rna.2338706. PMC1440910. PMID16603715.
  31. ^ unB
  32. Baulcombe DC (gennaio 2007). "Biologia molecolare. Silenziamento amplificato". Scienza. 315 (5809): 199-200. doi:10.1126/science.1138030. PMID17218517. S2CID46285020.
  33. ^ unB
  34. Pak J, Fire A (gennaio 2007). "Popolazioni distinte di effettori primari e secondari durante RNAi in C. elegans". Scienza. 315 (5809): 241-4. Bibcode:2007Sci. 315..241P. doi:10.1126/science.1132839. PMID17124291. S2CID46620298.
  35. ^ unB
  36. Sijen T, Steiner FA, Thijssen KL, Plasterk RH (gennaio 2007). "SiRNA secondari derivano dalla sintesi di RNA non innescato e formano una classe distinta". Scienza. 315 (5809): 244-7. Bibcode:2007Sci. 315..244S. doi:10.1126/science.1136699. PMID17158288. S2CID9483460.
  37. ^
  38. Wang QL, Li ZH (maggio 2007). "Le funzioni dei microRNA nelle piante". Frontiere nelle bioscienze. 12: 3975-82. doi:10.2741/2364. PMC2851543. PMID17485351. S2CID23014413.
  39. Zhao Y, Srivastava D (aprile 2007). "Una visione evolutiva della funzione dei microRNA". Tendenze nelle scienze biochimiche. 32 (4): 189-97. doi:10.1016/j.tibs.2007.02.006. PMID17350266.
  40. ^
  41. Gregory RI, Chendrimada TP, Shiekhattar R (2006). "Biogenesi dei microRNA: isolamento e caratterizzazione del complesso microprocessore". Protocolli MicroRNA. Metodi in biologia molecolare. 342. pp. 33-47. doi:10.1385/1-59745-123-1:33. ISBN978-1-59745-123-9. PMID16957365.
  42. ^
  43. Pfeffer S, Zavolan M, Grässer FA, Chien M, Russo JJ, Ju J, John B, Enright AJ, Marks D, Sander C, Tuschl T (aprile 2004). "Identificazione di microRNA codificati da virus". Scienza. 304 (5671): 734–6. Bibcode:2004Sci. 304.734P. doi:10.1126/science.1096781. PMID15118162. S2CID25287167.
  44. ^
  45. Qureshi A, Thakur N, Monga I, Thakur A, Kumar M (1 gennaio 2014). "VIRmiRNA: una risorsa completa per i miRNA virali convalidati sperimentalmente e i loro bersagli". Banca dati. 2014: ba103. doi:10.1093/database/bau103. PMC4224276. PMID25380780.
  46. ^
  47. Pillai RS, Bhattacharyya SN, Filipowicz W (2007). "Repressione della sintesi proteica da parte dei miRNA: quanti meccanismi?". Trends Cell Biol. 17 (3): 118-26. doi:10.1016/j.tcb.2006.12.007. PMID17197185.
  48. ^
  49. Okamura K, Ishizuka A, Siomi H, Siomi M (2004). "Ruoli distinti per le proteine ​​Argonaute in piccoli percorsi di scissione dell'RNA diretti da RNA". Sviluppo dei geni. 18 (14): 1655–66. doi:10.1101/gad.1210204. PMC478188. PMID15231716.
  50. ^
  51. Lee Y, Nakahara K, Pham J, Kim K, He Z, Sontheimer E, Carthew R (2004). "Ruoli distinti per Drosophila Dicer-1 e Dicer-2 nei percorsi di silenziamento siRNA/miRNA". Cellula. 117 (1): 69–81. doi: 10.1016/S0092-8674(04)00261-2 . PMID15066283.
  52. ^ miRBase.org
  53. ^ unB
  54. Friedman RC, Farh KK, Burge CB, Bartel DP (2009). "La maggior parte degli mRNA dei mammiferi sono bersagli conservati di microRNA". Risoluzione del genoma. 19 (1): 92-105. doi:10.1101/gr.082701.108. PMC2612969. PMID18955434.
  55. ^
  56. Lim LP, Lau NC, Garrett-Engele P, Grimson A, Schelter JM, Castle J, Bartel DP, Linsley PS, Johnson JM (febbraio 2005). "L'analisi dei microarray mostra che alcuni microRNA sottoregolano un gran numero di mRNA bersaglio". Natura. 433 (7027): 769-73. Bibcode:2005Natur.433..769L. doi:10.1038/nature03315. PMID15685193. S2CID4430576.
  57. ^
  58. Selbach M, Schwanhäusser B, Thierfelder N, Fang Z, Khanin R, Rajewsky N (settembre 2008). "Cambiamenti diffusi nella sintesi proteica indotta da microRNA". Natura. 455 (7209): 58-63. Bibcode:2008Natur.455. 58S.doi:10.1038/nature07228. PMID18668040. S2CID4429008.
  59. ^
  60. Baek D, Villén J, Shin C, Camargo FD, Gygi SP, Bartel DP (settembre 2008). "L'impatto dei microRNA sulla produzione di proteine". Natura. 455 (7209): 64-71. Bibcode:2008Natur.455. 64B. doi:10.1038/nature07242. PMC2745094. PMID18668037.
  61. ^
  62. Palmero EI, de Campos SG, Campos M, de Souza NC, Guerreiro ID, Carvalho AL, Marques MM (luglio 2011). "Meccanismi e ruolo della deregolamentazione dei microRNA nell'insorgenza e nella progressione del cancro". Genetica e Biologia Molecolare. 34 (3): 363–70. doi:10.1590/S1415-47572011000300001. PMC3168173. PMID21931505.
  63. ^
  64. Bernstein C, Bernstein H (maggio 2015). "Riduzione epigenetica della riparazione del DNA in progressione al cancro gastrointestinale". World Journal of Gastrointestinal Oncology. 7 (5): 30–46. doi:10.4251/wjgo.v7.i5.30. PMC4434036. PMID25987950.
  65. ^
  66. Maffioletti E, Tardito D, Gennarelli M, Bocchio-Chiavetto L (2014). "Micro spie dal cervello alla periferia: nuovi indizi dagli studi sui microRNA nei disturbi neuropsichiatrici". Frontiere nelle neuroscienze cellulari. 8: 75. doi:10.3389/fncel.2014.00075. PMC3949217. PMID24653674.
  67. ^
  68. Mellios N, Sur M (2012). "Il ruolo emergente dei microRNA nella schizofrenia e nei disturbi dello spettro autistico". Frontiere in psichiatria. 3: 39. doi:10.3389/fpsyt.2012.00039. PMC3336189. PMID22539927.
  69. ^
  70. Geaghan M, Cairns MJ (agosto 2015). "MicroRNA e disregolazione post-trascrizionale in psichiatria". Psichiatria Biologica. 78 (4): 231-9. doi: 10.1016/j.biopsych.2014.12.009 . PMID25636176.
  71. ^
  72. Liu Q, Rand TA, Kalidas S, Du F, Kim HE, Smith DP, Wang X (settembre 2003). "R2D2, un ponte tra le fasi di iniziazione ed effettore della via della Drosophila RNAi". Scienza. 301 (5641): 1921–5. Bibcode:2003Sci. 301.1921L. doi:10.1126/science.1088710. PMID14512631. S2CID41436233.
  73. ^
  74. Gregory RI, Chendrimada TP, Cooch N, Shiekhattar R (novembre 2005). "Risc umano coppie biogenesi microRNA e silenziamento genico post-trascrizionale". Cellula. 123 (4): 631–40. doi: 10.1016/j.cell.2005.10.022 . PMID16271387.
  75. ^ unB
  76. Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser CA, Krieger M, Scott MP, Zipurksy SL, Darnell J (2004). Biologia cellulare molecolare (5a ed.). WH Freeman: New York, NY. ISBN978-0-7167-4366-8.
  77. ^
  78. Matranga C, Tomari Y, Shin C, Bartel DP, Zamore PD (novembre 2005). "La scissione del filamento del passeggero facilita l'assemblaggio di siRNA in complessi enzimatici RNAi contenenti Ago2". Cellula. 123 (4): 607-20. doi: 10.1016/j.cell.2005.08.044 . PMID16271386.
  79. ^
  80. Leuschner PJ, Ameres SL, Kueng S, Martinez J (marzo 2006). "Clivaggio del filamento passeggero siRNA durante l'assemblaggio RISC nelle cellule umane". Rapporti EMBO. 7 (3): 314–20. doi:10.1038/sj.embor.7400637. PMC1456892. PMID16439995.
  81. ^ unB
  82. Haley B, Zamore PD (luglio 2004). "Analisi cinetica del complesso enzimatico RNAi". Natura strutturale e biologia molecolare. 11 (7): 599–606. doi:10.1038/nsmb780. PMID15170178. S2CID12400060.
  83. ^
  84. Schwarz DS, Hutvágner G, Du T, Xu Z, Aronin N, Zamore PD (ottobre 2003). "Asimmetria nell'assemblaggio del complesso enzimatico RNAi". Cellula. 115 (2): 199-208. doi: 10.1016/S0092-8674(03)00759-1 . PMID14567917.
  85. ^
  86. Preall JB, He Z, Gorra JM, Sontheimer EJ (marzo 2006). "Breve selezione del filamento di RNA interferente è indipendente dalla polarità di elaborazione dsRNA durante RNAi in Drosophila". Biologia attuale. 16 (5): 530-5. doi: 10.1016/j.cub.2006.01.061 . PMID16527750.
  87. ^
  88. Tomari Y, Matranga C, Haley B, Martinez N, Zamore PD (novembre 2004). "Un sensore di proteine ​​per l'asimmetria siRNA". Scienza. 306 (5700): 1377–80. Bibcode:2004Sci. 306.1377T. doi:10.1126/science.1102755. PMID15550672. S2CID31558409.
  89. ^
  90. Ma JB, Yuan YR, Meister G, Pei Y, Tuschl T, Patel DJ (marzo 2005). "Base strutturale per il riconoscimento specifico all'estremità 5' dell'RNA guida da parte della proteina A. fulgidus Piwi". Natura. 434 (7033): 666–70. Bibcode:2005Natur.434..666M. doi:10.1038/nature03514. PMC4694588. PMID15800629.
  91. ^
  92. Sen G, Wehrman T, Blau H (2005). "La traduzione dell'mRNA non è un prerequisito per la piccola scissione dell'mRNA mediata da RNA interferente". Differenziazione. 73 (6): 287–93. doi:10.1111/j.1432-0436.2005.00029.x. PMID16138829. S2CID41117614.
  93. ^
  94. Gu S, Rossi J (2005). "Disaccoppiamento di RNAi dalla traduzione attiva nelle cellule di mammifero". RNA. 11 (1): 38–44. doi:10.1261/rna.7158605. PMC1370689. PMID15574516.
  95. ^
  96. Sen G, Blau H (2005). "Argonaute 2/RISC risiede in siti di decadimento dell'mRNA dei mammiferi noti come corpi citoplasmatici". Nat Cell Biol. 7 (6): 633–6. doi:10.1038/ncb1265. PMID15908945. S2CID6085169.
  97. ^
  98. Lian S, Jakymiw A, Eystathioy T, Hamel J, Fritzler M, Chan E (2006). "Corpi GW, microRNA e ciclo cellulare". Ciclo cellulare. 5 (3): 242–5. doi: 10.4161/cc.5.3.2410 . PMID16418578.
  99. ^
  100. Jakymiw A, Lian S, Eystathioy T, Li S, Satoh M, Hamel J, Fritzler M, Chan E (2005). "La rottura dei corpi P altera l'interferenza dell'RNA dei mammiferi". Nat Cell Biol. 7 (12): 1267–74. doi:10.1038/ncb1334. PMID16284622. S2CID36630239.
  101. ^
  102. Hammond S, Bernstein E, Beach D, Hannon G (2000). "Una nucleasi RNA-diretta media il silenziamento genico post-trascrizionale nelle cellule di Drosophila". Natura. 404 (6775): 293–6. Bibcode:2000Natur.404..293H. doi:10.1038/35005107. PMID10749213. S2CID9091863.
  103. ^
  104. Holmquist GP, Ashley T (2006). "Organizzazione dei cromosomi e modificazione della cromatina: influenza sulla funzione e l'evoluzione del genoma". Ricerca citogenetica e genomica. 114 (2): 96–125. doi:10.1159/000093326. PMID16825762. S2CID29910065.
  105. ^
  106. Verdel A, Jia S, Gerber S, Sugiyama T, Gygi S, Grewal SI, Moazed D (gennaio 2004). "Targeting mediato da RNAi di eterocromatina dal complesso RITS". Scienza. 303 (5658): 672–6. Bibcode:2004Sci. 303.672V. doi:10.1126/science.1093686. PMC3244756. PMID14704433.
  107. ^
  108. Irvine DV, Zaratiegui M, Tolia NH, Goto DB, Chitwood DH, Vaughn MW, Joshua-Tor L, Martienssen RA (agosto 2006). "L'affettatura dell'Argonaute è necessaria per il silenziamento e la diffusione eterocromatica". Scienza. 313 (5790): 1134-7. Bibcode:2006Sci. 313.1134I. doi:10.1126/science.1128813. PMID16931764. S2CID42997104.
  109. ^
  110. Volpe TA, Kidner C, Hall IM, Teng G, Grewal SI, Martienssen RA (settembre 2002). "Regolamento del silenziamento eterocromatico e metilazione dell'istone H3 lisina-9 da parte di RNAi". Scienza. 297 (5588): 1833-7. Bibcode:2002Sci. 297.1833V. doi:10.1126/science.1074973. PMID12193640. S2CID2613813.
  111. ^
  112. Volpe T, Schramke V, Hamilton GL, White SA, Teng G, Martienssen RA, Allshire RC (2003). "L'interferenza dell'RNA è necessaria per la normale funzione del centromero nel lievito di fissione". Ricerca sui cromosomi. 11 (2): 137-46. doi:10.1023/A:1022815931524. PMID12733640. S2CID23813417.
  113. ^
  114. Li LC, Okino ST, Zhao H, Pookot D, Place RF, Urakami S, Enokida H, Dahiya R (novembre 2006). "Piccoli dsRNA inducono l'attivazione trascrizionale nelle cellule umane". Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. 103 (46): 17337-42. Bibcode:2006PNAS..10317337L. doi:10.1073/pnas.0607011503. PMC1859931. PMID17085592.
  115. ^
  116. Noma K, Sugiyama T, Cam H, Verdel A, Zofall M, Jia S, Moazed D, Grewal SI (novembre 2004). "RITS agisce in cis per promuovere il silenziamento trascrizionale e post-trascrizionale mediato dall'interferenza dell'RNA". Genetica della natura. 36 (11): 1174–80. doi: 10.1038/ng1452. PMID15475954.
  117. ^
  118. Sugiyama T, Cam H, Verdel A, Moazed D, Grewal SI (gennaio 2005). "L'RNA polimerasi RNA-dipendente è un componente essenziale di un assemblaggio eterocromatina di accoppiamento ad anello auto-forzante per la produzione di siRNA". Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. 102 (1): 152-7. Bibcode:2005PNAS..102..152S. doi:10.1073/pnas.0407641102. PMC544066. PMID15615848.
  119. ^
  120. Wang F, Koyama N, Nishida H, Haraguchi T, Reith W, Tsukamoto T (giugno 2006). "L'assemblaggio e il mantenimento dell'eterocromatina avviati dalle ripetizioni del transgene sono indipendenti dalla via di interferenza dell'RNA nelle cellule di mammifero". Biologia molecolare e cellulare. 26 (11): 4028-40. doi:10.1128/MCB.02189-05. PMC1489094. PMID16705157.
  121. ^
  122. Basso BL (2002). "Modifica dell'RNA da parte dell'adenosina deaminasi che agisce sull'RNA". Revisione annuale della biochimica. 71: 817-46. doi:10.1146/annurev.biochem.71.110601.135501. PMC1823043. PMID12045112.
  123. ^
  124. Basso BL (aprile 2000). "RNA a doppio filamento come modello per il silenziamento genico". Cellula. 101 (3): 235-8. doi: 10.1016/S0092-8674(02)71133-1 . PMID10847677.
  125. ^
  126. Luciano DJ, Mirsky H, Vendetti NJ, Maas S (agosto 2004). "Modifica dell'RNA di un precursore di miRNA". RNA. 10 (8): 1174-7. doi:10.1261/rna.7350304. PMC1370607. PMID15272117.
  127. ^ unB
  128. Yang W, Chendrimada TP, Wang Q, Higuchi M, Seeburg PH, Shiekhattar R, Nishikura K (gennaio 2006). "Modulazione dell'elaborazione e dell'espressione dei microRNA attraverso l'editing dell'RNA da parte delle deaminasi ADAR". Natura strutturale e biologia molecolare. 13 (1): 13-21. doi:10.1038/nsmb1041. PMC2950615. PMID16369484.
  129. ^
  130. Yang W, Wang Q, Howell KL, Lee JT, Cho DS, Murray JM, Nishikura K (febbraio 2005). "ADAR1 RNA deaminasi limita l'efficacia dell'RNA interferente breve nelle cellule di mammifero". Il Giornale di Chimica Biologica. 280 (5): 3946–53. doi:10.1074/jbc.M407876200. PMC2947832 . PMID15556947.
  131. ^
  132. Nishikura K (dicembre 2006). "L'editor incontra il silenziatore: diafonia tra l'editing dell'RNA e l'interferenza dell'RNA". Recensioni sulla natura Biologia cellulare molecolare. 7 (12): 919-31. doi:10.1038/nrm2061. PMC2953463. PMID17139332.
  133. ^ unBC
  134. Saumet A, Lecellier CH (2006). "Silenziamento dell'RNA antivirale: sembriamo piante?". retrovirologia. 3 (1): 3. doi:10.1186/1742-4690-3-3. PMC1363733. PMID16409629.
  135. ^
  136. Jones L, Ratcliff F, Baulcombe DC (maggio 2001). "Il silenziamento genico trascrizionale diretto dall'RNA nelle piante può essere ereditato indipendentemente dall'innesco dell'RNA e richiede Met1 per la manutenzione". Biologia attuale. 11 (10): 747–57. doi:10.1016/S0960-9822(01)00226-3. PMID11378384. S2CID16789197.
  137. ^
  138. Humphreys DT, Westman BJ, Martin DI, Preiss T (novembre 2005). "I microRNA controllano l'inizio della traduzione inibendo il fattore di iniziazione eucariotico 4E/cap e la funzione della coda poli(A)". Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. 102 (47): 16961-6. Bibcode:2005PNAS..10216961H. doi:10.1073/pnas.0506482102. PMC1287990. PMID16287976.
  139. ^
  140. DaRocha WD, Otsu K, Teixeira SM, Donelson JE (febbraio 2004). "Test di interferenza dell'RNA citoplasmatica (RNAi) e costruzione di un sistema promotore T7 inducibile dalla tetraciclina in Trypanosoma cruzi". Parassitologia molecolare e biochimica. 133 (2): 175-86. doi:10.1016/j.molbiopara.2003.10.005. PMID14698430.
  141. ^
  142. Robinson KA, Beverly SM (maggio 2003). "Miglioramenti nell'efficienza di trasfezione e test di interferenza dell'RNA (RNAi) approcci nel parassita protozoo Leishmania". Parassitologia molecolare e biochimica. 128 (2): 217-28. doi:10.1016/S0166-6851(03)00079-3. PMID12742588.
  143. ^
  144. Aravind L, Watanabe H, Lipman DJ, Koonin EV (ottobre 2000). "Perdita specifica del lignaggio e divergenza dei geni funzionalmente collegati negli eucarioti". Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. 97 (21): 11319-24. Bibcode:2000PNAS. 9711319A. doi:10.1073/pnas.200346997. PMC17198. PMID11016957.
  145. ^
  146. Drinnenberg IA, Weinberg DE, Xie KT, Mower JP, Wolfe KH, Fink GR, Bartel DP (ottobre 2009). "RNAi nel lievito in erba". Scienza. 326 (5952): 544-550. Bibcode:2009Sci. 326.544D. doi:10.1126/science.1176945. PMC3786161. PMID19745116.
  147. ^
  148. Nakayashiki H, Kadotani N, Mayama S (luglio 2006). "Evoluzione e diversificazione delle proteine ​​di silenziamento dell'RNA nei funghi" (PDF) . Journal of Molecular Evolution. 63 (1): 127-35. Bibcode:2006JMolE..63..127N. doi:10.1007/s00239-005-0257-2. PMID16786437. S2CID22639035.
  149. ^
  150. Morita T, Mochizuki Y, Aiba H (marzo 2006). "La repressione traslazionale è sufficiente per il silenziamento genico da parte di piccoli RNA non codificanti batterici in assenza di distruzione dell'mRNA". Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. 103 (13): 4858-63. Bibcode:2006PNAS..103.4858M. doi:10.1073/pnas.0509638103. PMC1458760. PMID16549791.
  151. ^
  152. Makarova KS, Grishin NV, Shabalina SA, Wolf YI, Koonin EV (marzo 2006). "Un putativo sistema immunitario basato sull'interferenza dell'RNA nei procarioti: analisi computazionale del macchinario enzimatico previsto, analogie funzionali con l'RNAi eucariotico e ipotetici meccanismi d'azione". Biologia diretta. 1: 7. doi:10.1186/1745-6150-1-7. PMC1462988. PMID16545108.
  153. ^
  154. Stram Y, Kuzntzova L (giugno 2006). "Inibizione dei virus mediante interferenza dell'RNA". Geni del virus. 32 (3): 299-306. doi:10.1007/s11262-005-6914-0. PMC7088519. PMID16732482.
  155. ^
  156. Blevins T, Rajeswaran R, Shivaprasad PV, Beknazarians D, Si-Ammour A, Park HS, Vazquez F, Robertson D, Meins F, Hohn T, Pooggin MM (2006). "Quattro Dicer vegetali mediano la biogenesi del piccolo RNA virale e il silenziamento indotto dal virus del DNA". Ricerca sugli acidi nucleici. 34 (21): 6233-46. doi:10.1093/nar/gkl886. PMC1669714. PMID17090584.
  157. ^
  158. Palauqui JC, Elmayan T, Pollien JM, Vaucheret H (agosto 1997). "Silenziamento sistemico acquisito: il silenziamento post-trascrizionale specifico del transgene viene trasmesso mediante innesto da ceppi silenziati a rampolli non silenziati". Il diario EMBO. 16 (15): 4738-45. doi:10.1093/emboj/16.15.4738. PMC1170100. PMID9303318.
  159. ^
  160. Voinnet O (agosto 2001). "Silenziamento dell'RNA come sistema immunitario delle piante contro i virus". Tendenze in genetica. 17 (8): 449–59. doi:10.1016/S0168-9525(01)02367-8. PMID11485817.
  161. ^
  162. Lucy AP, Guo HS, Li WX, Ding SW (aprile 2000). "Soppressione del silenziamento genico post-trascrizionale da parte di una proteina virale vegetale localizzata nel nucleo". Il diario EMBO. 19 (7): 1672-1680. doi:10.1093/emboj/19.7.1672. PMC310235. PMID10747034.
  163. ^
  164. Mérai Z, Kerényi Z, Kertész S, Magna M, Lakatos L, Silhavy D (giugno 2006). "Il legame dell'RNA a doppio filamento può essere una strategia virale generale dell'RNA vegetale per sopprimere il silenziamento dell'RNA". Giornale di virologia. 80 (12): 5747-56. doi:10.1128/JVI.01963-05. PMC1472586. PMID16731914.
  165. ^
  166. Katiyar-Agarwal S, Morgan R, Dahlbeck D, Borsani O, Villegas A, Zhu JK, Staskawicz BJ, Jin H (novembre 2006). "Un siRNA endogeno inducibile dai patogeni nell'immunità delle piante". Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. 103 (47): 18002-7. Bibcode:2006PNAS..10318002K. doi:10.1073/pnas.0608258103. PMC1693862 . PMID17071740.
  167. ^
  168. Fritz JH, Girardin SE, Philpott DJ (giugno 2006). "Difesa immunitaria innata attraverso l'interferenza dell'RNA". STKE . della scienza. 2006 (339): pe27. doi:10.1126/stke.3392006pe27. PMID16772641. S2CID33972766.
  169. ^
  170. Zambon RA, Vakharia VN, Wu LP (maggio 2006). "RNAi è una risposta immunitaria antivirale contro un virus dsRNA in Drosophila melanogaster". Microbiologia cellulare. 8 (5): 880-9. doi: 10.1111/j.1462-5822.2006.00688.x . PMID16611236. S2CID32439482.
  171. ^
  172. Wang XH, Aliyari R, Li WX, Li HW, Kim K, Carthew R, Atkinson P, Ding SW (aprile 2006). "L'interferenza dell'RNA dirige l'immunità innata contro i virus nella drosofila adulta". Scienza. 312 (5772): 452-4. Bibcode:2006Sci. 312.452W. doi:10.1126/science.1125694. PMC1509097. PMID16556799.
  173. ^
  174. Lu R, Maduro M, Li F, Li HW, Broitman-Maduro G, Li WX, Ding SW (agosto 2005). "Replicazione del virus animale e silenziamento antivirale mediato da RNAi in Caenorhabditis elegans". Natura. 436 (7053): 1040-1043. Bibcode:2005Natur.436.1040L. doi:10.1038/nature03870. PMC1388260. PMID16107851.
  175. ^
  176. Wilkins C, Dishongh R, Moore SC, Whitt MA, Chow M, Machaca K (agosto 2005). "L'interferenza dell'RNA è un meccanismo di difesa antivirale in Caenorhabditis elegans". Natura. 436 (7053): 1044-7. Bibcode:2005Natur.436.1044W. doi:10.1038/nature03957. PMID16107852. S2CID4431035.
  177. ^
  178. Berkhout B, Haasnoot J (maggio 2006). "L'interazione tra l'infezione da virus e il macchinario di interferenza dell'RNA cellulare". Lettere FEBS. 580 (12): 2896–902. doi:10.1016/j.febslet.2006.02.070. PMC7094296. PMID16563388.
  179. ^
  180. Schütz S, Sarnow P (gennaio 2006). "Interazione dei virus con la via di interferenza dell'RNA dei mammiferi". Virologia. 344 (1): 151-7. doi: 10.1016/j.virol.2005.09.034 . PMID16364746.
  181. ^
  182. Cullen BR (giugno 2006). "L'interferenza dell'RNA è coinvolta nell'immunità antivirale intrinseca nei mammiferi?". Immunologia della natura. 7 (6): 563-7. doi:10.1038/ni1352. PMID16715068. S2CID23467688.
  183. ^
  184. Maillard PV, Ciaudo C, Marchais A, Li Y, Jay F, Ding SW, Voinnet O (ottobre 2013). "Interferenza dell'RNA antivirale nelle cellule di mammifero". Scienza. 342 (6155): 235-8. Bibcode:2013Sci. 342..235 M. doi:10.1126/science.1241930. PMC3853215. PMID24115438.
  185. ^
  186. Li Y, Lu J, Han Y, Fan X, Ding SW (ottobre 2013). "Funzioni di interferenza dell'RNA come meccanismo di immunità antivirale nei mammiferi". Scienza. 342 (6155): 231-4. Bibcode:2013Sci. 342..231L. doi:10.1126/science.1241911. PMC3875315. PMID24115437.
  187. ^
  188. Li HW, Ding SW (ottobre 2005). "Silenziamento antivirale negli animali". Lettere FEBS. 579 (26): 5965-73. doi:10.1016/j.febslet.2005.08.034. PMC1350842. PMID16154568.
  189. ^
  190. Carrington JC, Ambros V (luglio 2003). "Ruolo dei microRNA nello sviluppo di piante e animali". Scienza. 301 (5631): 336-8. Bibcode:2003Sci. 301..336C. doi:10.1126/science.1085242. PMID12869753. S2CID43395657.
  191. ^
  192. Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V (dicembre 1993). "Il gene eterocronico lin-4 di C. elegans codifica per piccoli RNA con complementarità antisenso a lin-14". Cellula. 75 (5): 843–54. doi: 10.1016/0092-8674(93)90529-Y . PMID8252621.
  193. ^
  194. Palatnik JF, Allen E, Wu X, Schommer C, Schwab R, Carrington JC, Weigel D (settembre 2003). "Controllo della morfogenesi fogliare da parte dei microRNA". Natura. 425 (6955): 257-63. Bibcode:2003Natur.425..257P. doi:10.1038/nature01958. PMID12931144. S2CID992057.
  195. ^
  196. Zhang B, Pan X, Cobb GP, Anderson TA (gennaio 2006). "MicroRNA vegetale: una piccola molecola regolatrice con un grande impatto". Biologia dello sviluppo. 289 (1): 3-16. doi: 10.1016/j.ydbio.2005.10.036 . PMID16325172.
  197. ^
  198. Jones-Rhoades MW, Bartel DP, Bartel B (2006). "MicroRNAS e loro ruoli regolatori nelle piante". Revisione annuale della biologia vegetale. 57: 19-53. doi:10.1146/annurev.arplant.57.032905.105218. PMID16669754. S2CID13010154.
  199. ^
  200. Zhang B, Pan X, Cobb GP, Anderson TA (febbraio 2007)."microRNA come oncogeni e oncosoppressori". Biologia dello sviluppo. 302 (1): 1-12. doi: 10.1016/j.ydbio.2006.08.028 . PMID16989803.
  201. ^
  202. Cerutti H, Casas-Mollano JA (agosto 2006). "Sull'origine e le funzioni del silenziamento mediato da RNA: dai protisti all'uomo". Genetica attuale. 50 (2): 81-99. doi:10.1007/s00294-006-0078-x. PMC2583075. PMID16691418.
  203. ^
  204. Anantharaman V, Koonin EV, Aravind L (aprile 2002). "Genomica comparata ed evoluzione delle proteine ​​coinvolte nel metabolismo dell'RNA". Ricerca sugli acidi nucleici. 30 (7): 1427–64. doi:10.1093/nar/30.7.1427. PMC101826. PMID11917006.
  205. ^
  206. Voorhoeve PM, Agami R (gennaio 2003). "Knockdown si alza". Tendenze nelle biotecnologie. 21 (1): 2-4. doi:10.1016/S0167-7799(02)00002-1. PMID12480342.
  207. ^
  208. Munkácsy G, Sztupinszki Z, Herman P, Bán B, Pénzváltó Z, Szarvas N, Győrffy B (settembre 2016). "La convalida dell'efficienza di silenziamento dell'RNAi utilizzando i dati di array di geni mostra un tasso di fallimento del 18,5% in 429 esperimenti indipendenti". Terapia Molecolare. Acidi nucleici. 5 (9): e366. doi:10.1038/mtna.2016.66. PMC5056990. PMID27673562.
  209. ^
  210. Naito Y, Yamada T, Matsumiya T, Ui-Tei K, Saigo K, Morishita S (luglio 2005). "dsCheck: software di ricerca fuori bersaglio altamente sensibile per interferenza RNA mediata da RNA a doppio filamento". Ricerca sugli acidi nucleici. 33 (problema del server Web): W589–91. doi:10.1093/nar/gki419. PMC1160180. PMID15980542.
  211. ^
  212. Henschel A, Buchholz F, Habermann B (luglio 2004). "DEQOR: uno strumento web-based per la progettazione e il controllo della qualità di siRNA". Ricerca sugli acidi nucleici. 32 (problema del server Web): W113–20. doi:10.1093/nar/gkh408. PMC441546. PMID15215362.
  213. ^
  214. Naito Y, Yamada T, Ui-Tei K, Morishita S, Saigo K (luglio 2004). "siDirect: software di progettazione siRNA mirato e altamente efficace per l'interferenza dell'RNA dei mammiferi". Ricerca sugli acidi nucleici. 32 (problema del server Web): W124–9. doi:10.1093/nar/gkh442. PMC441580. PMID15215364.
  215. ^
  216. Naito Y, Ui-Tei K, Nishikawa T, Takebe Y, Saigo K (luglio 2006). "siVirus: software di progettazione siRNA antivirale basato sul web per sequenze virali altamente divergenti". Ricerca sugli acidi nucleici. 34 (problema del server Web): W448–50. doi:10.1093/nar/gkl214. PMC1538817. PMID16845046.
  217. ^
  218. Reynolds A, Anderson EM, Vermeulen A, Fedorov Y, Robinson K, Leake D, Karpilow J, Marshall WS, Khvorova A (giugno 2006). "L'induzione della risposta dell'interferone da parte del siRNA è dipendente dal tipo di cellula e dalla lunghezza del duplex". RNA. 12 (6): 988-93. doi:10.1261/rna.2340906. PMC1464853. PMID16611941.
  219. ^
  220. Stein P, Zeng F, Pan H, Schultz RM (ottobre 2005). "Assenza di effetti non specifici dell'interferenza dell'RNA innescata da RNA a doppio filamento lungo negli ovociti di topo". Biologia dello sviluppo. 286 (2): 464–71. doi: 10.1016/j.ydbio.2005.08.015 . PMID16154556.
  221. ^
  222. Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R (aprile 2002). "Un sistema per l'espressione stabile di brevi RNA interferenti nelle cellule di mammifero". Scienza. 296 (5567): 550-3. Bibcode:2002Sci. 296..550B. doi:10.1126/science.1068999. hdl: 1874/15573 . PMID11910072. S2CID18460980.
  223. ^
  224. Tiscornia G, Tergaonkar V, Galimi F, Verma IM (maggio 2004). "CRE interferenza RNA inducibile dalla ricombinasi mediata da vettori lentivirali". Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. 101 (19): 7347-51. Bibcode:2004PNAS..101.7347T. doi:10.1073/pnas.0402107101. PMC409921. PMID15123829.
  225. ^
  226. Ventura A, Meissner A, Dillon CP, McManus M, Sharp PA, Van Parijs L, Jaenisch R, Jacks T (luglio 2004). "Interferenza dell'RNA condizionale regolata da Cre-lox dai transgeni". Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. 101 (28): 10380-5. Bibcode:2004PNAS..10110380V. doi:10.1073/pnas.0403954101. PMC478580. PMID15240889.
  227. ^
  228. Huesken D, Lange J, Mickanin C, Weiler J, Asselbergs F, Warner J, Meloon B, Engel S, Rosenberg A, Cohen D, Labow M, Reinhardt M, Natt F, Hall J (agosto 2005). "Progettazione di una libreria di siRNA a livello di genoma utilizzando una rete neurale artificiale". Biotecnologie naturali. 23 (8): 995–1001. doi:10.1038/nbt1118. PMID16025102. S2CID11030533.
  229. ^
  230. Ge G, Wong GW, Luo B (ottobre 2005). "Previsione dell'efficienza atterramento siRNA utilizzando modelli di rete neurale artificiale". Comunicazioni di ricerca biochimica e biofisica. 336 (2): 723-8. doi:10.1016/j.bbrc.2005.08.147. PMID16153609.
  231. ^
  232. Janitz M, Vanhecke D, Lehrach H (2006). "Interferenza dell'RNA ad alta produttività nella genomica funzionale". RNA verso la medicina. Manuale di farmacologia sperimentale. 173. pp. 97-104. doi:10.1007/3-540-27262-3_5. ISBN978-3-540-27261-8. PMID16594612.
  233. ^
  234. Vanhecke D, Janitz M (febbraio 2005). "Genomica funzionale utilizzando l'interferenza dell'RNA ad alto rendimento". La scoperta della droga oggi. 10 (3): 205-12. doi:10.1016/S1359-6446(04)03352-5. hdl: 11858/00-001M-0000-0010-86E7-8 . PMID15708535.
  235. ^
  236. Geldhof P, Murray L, Couthier A, Gilleard JS, McLauchlan G, Knox DP, Britton C (giugno 2006). "Testare l'efficacia dell'interferenza dell'RNA in Haemonchus contortus". Rivista internazionale di parassitologia. 36 (7): 801-10. doi:10.1016/j.ijpara.2005.12.004. PMID16469321.
  237. ^
  238. Geldhof P, Visser A, Clark D, Saunders G, Britton C, Gilleard J, Berriman M, Knox D (maggio 2007). "Interferenza dell'RNA negli elminti parassiti: situazione attuale, potenziali insidie ​​e prospettive future". Parassitologia. 134 (Pt 5): 609-19. doi:10.1017/S0031182006002071. PMID17201997. S2CID27296716.
  239. ^ unB
  240. Sen GL, Blau HM (luglio 2006). "Una breve storia di RNAi: il silenzio dei geni". Diario FASEB. 20 (9): 1293–9. doi:10.1096/fj.06-6014rev. PMID16816104. S2CID12917676.
  241. ^
  242. Daneholt B (2 ottobre 2006). "Il Premio Nobel per la Fisiologia o la Medicina 2006". premionobel.org . Estratto il 30 ottobre 2017.
  243. ^
  244. Elbashir S, Harbourth J, Lendeckel W, et al. (2001). "Duplex di RNA a 21 nucleotidi mediano l'interferenza dell'RNA in cellule di mammifero coltivate". Natura. 411 (6836): 494-498. Bibcode:2001Natur.411..494E. doi:10.1038/35078107. PMID11373684. S2CID710341.
  245. ^
  246. McCaffrey AP, Meuse L, Pham TT, Conklin DS, Hannon GJ, Kay MA (luglio 2002). "Interferenza dell'RNA nei topi adulti". Natura. 418 (6893): 38–9. Bibcode:2002Natur.418. 38M. doi:10.1038/418038a. PMID12097900. S2CID4361399.
  247. ^
  248. Devi GR (settembre 2006). "Approcci basati su siRNA nella terapia del cancro". Terapia genica del cancro. 13 (9): 819–29. doi: 10.1038/sj.cgt.7700931 . PMID16424918.
  249. ^
  250. Wall NR, Shi Y (ottobre 2003). "Piccolo RNA: l'interferenza dell'RNA può essere sfruttata per la terapia?". Lancetta. 362 (9393): 1401–3. doi:10.1016/s0140-6736(03)14637-5. PMID14585643. S2CID25034627.
  251. ^
  252. Sah D (2006). "Potenziale terapeutico dell'interferenza dell'RNA per i disturbi neurologici". fantascienza. 79 (19): 1773-1780. doi:10.1016/j.lfs.2006.06.011. PMID16815477.
  253. ^
  254. Davis ME, Zuckerman JE, Choi CH, Seligson D, Tolcher A, Alabi CA, Yen Y, Heidel JD, Ribas A (aprile 2010). "Prove di RNAi nell'uomo da siRNA somministrato per via sistemica tramite nanoparticelle mirate". Natura. 464 (7291): 1067–70. Bibcode:2010Natur.464.1067D. doi:10.1038/nature08956. PMC2855406. PMID20305636.
  255. ^
  256. Escobar MA, Civerolo EL, Summerfelt KR, Dandekar AM (novembre 2001). "Il silenziamento dell'oncogene mediato da RNAi conferisce resistenza alla tumorigenesi della galla della corona". Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. 98 (23): 13437-42. Bibcode:2001PNAS. 9813437E. doi:10.1073/pnas.241276898. PMC60889. PMID11687652.
  257. ^
  258. Pereira TC, Pascoal VD, Marchesini RB, Maia IG, Magalhães LA, Zanotti-Magalhães EM, Lopes-Cendes I (aprile 2008). "Schistosoma mansoni: valutazione di un trattamento a base di RNAi mirato al gene HGPRTase". Parassitologia Sperimentale. 118 (4): 619-23. doi:10.1016/j.exppara.2007.11.017. PMID18237732.
  259. ^
  260. Raoul C, Abbas-Terki T, Bensadoun JC, Guillot S, Haase G, Szulc J, Henderson CE, Aebischer P (aprile 2005). "Il silenziamento lentivirale-mediato di SOD1 attraverso l'interferenza dell'RNA ritarda l'insorgenza e la progressione della malattia in un modello murino di SLA". Medicina della natura. 11 (4): 423-8. doi:10.1038/nm1207. PMID15768028. S2CID25445264.
  261. ^
  262. Ptasznik A, Nakata Y, Kalota A, Emerson SG, Gewirtz AM (novembre 2004). "Breve RNA interferente (siRNA) che prende di mira la chinasi Lyn induce l'apoptosi nelle cellule leucemiche primarie e resistenti ai farmaci, BCR-ABL1 (+)". Medicina della natura. 10 (11): 1187-9. doi:10.1038/nm1127. PMID15502840. S2CID21770360.
  263. ^
  264. Kim SJ, Lee WI, Lee YS, Kim DH, Chang JW, Kim SW, Lee H (novembre 2009). "Efficace sollievo dal dolore neuropatico mediante l'espressione mediata da virus adeno-associata di un piccolo RNA a forcina contro GTP cicloidrolasi 1". Dolore molecolare. 5: 1744–8069–5–67. doi:10.1186/1744-8069-5-67. PMC2785765. PMID19922668.
  265. ^
  266. Chen L, McKenna JT, Bolortuya Y, Winston S, Thakkar MM, Basheer R, Brown RE, McCarley RW (novembre 2010). "L'atterramento del recettore dell'orexina di tipo 1 nel locus coeruleus del ratto aumenta il sonno REM durante il periodo buio". Il Giornale Europeo di Neuroscienze. 32 (9): 1528-1536. doi:10.1111/j.1460-9568.2010.07401.x. PMC3058252. PMID21089218.
  267. ^
  268. Vargason JM, Szittya G, Burgyán J, Hall TM (dicembre 2003). "Riconoscimento selettivo delle dimensioni di siRNA da parte di un soppressore del silenziamento dell'RNA". Cellula. 115 (7): 799-811. doi: 10.1016/s0092-8674(03)00984-x . PMID14697199.
  269. ^
  270. Berkhout B (aprile 2004). "Interferenza dell'RNA come approccio antivirale: prendere di mira l'HIV-1". Opinione attuale in terapia molecolare. 6 (2): 141-5. PMID15195925.
  271. ^
  272. Jiang M, Milner J (settembre 2002). "Silenziamento selettivo dell'espressione genica virale in cellule di carcinoma cervicale umano HPV-positive trattate con siRNA, un primer di interferenza dell'RNA". oncogene. 21 (39): 6041-8. doi: 10.1038/sj.onc.1205878 . PMID12203116.
  273. ^
  274. Kusov Y, Kanda T, Palmenberg A, Sgro JY, Gauss-Müller V (giugno 2006). "Silenziamento dell'infezione da virus dell'epatite A da piccoli RNA interferenti". Giornale di virologia. 80 (11): 5599-610. doi:10.1128/jvi.01773-05. PMC1472172. PMID16699041.
  275. ^
  276. Jia F, Zhang YZ, Liu CM (ottobre 2006). "Un sistema basato su retrovirus per silenziare stabilmente i geni del virus dell'epatite B mediante interferenza dell'RNA". Lettere di biotecnologia. 28 (20): 1679–85. doi:10.1007/s10529-006-9138-z. PMID16900331. S2CID34511611.
  277. ^
  278. Li YC, Kong LH, Cheng BZ, Li KS (dicembre 2005). "Costruzione di vettori di espressione di siRNA del virus dell'influenza e loro effetti inibitori sulla moltiplicazione del virus dell'influenza". Malattie aviarie. 49 (4): 562–73. doi:10.1637/7365-041205R2.1. PMID16405000. S2CID86214047.
  279. ^
  280. Khanna M, Saxena L, Rajput R, Kumar B, Prasad R (2015). "Silenziamento genico: un approccio terapeutico per combattere le infezioni da virus dell'influenza". Microbiologia del futuro. 10 (1): 131–40. doi:10.2217/fmb.14.94. PMID25598342.
  281. ^
  282. Rajput R, Khanna M, Kumar P, Kumar B, Sharma S, Gupta N, Saxena L (dicembre 2012). "Piccolo RNA interferente mirato alla trascrizione del gene 1 non strutturale inibisce la replicazione del virus dell'influenza A nei topi sperimentali". Acidi nucleici terapeutici. 22 (6): 414–22. doi:10.189/nat.2012.0359. PMID23062009.
  283. ^ unBCD
  284. Asha K, Kumar P, Sanicas M, Meseko CA, Khanna M, Kumar B (dicembre 2018). "I progressi nella terapia a base di acido nucleico contro le infezioni virali respiratorie". Giornale di Medicina Clinica. 8 (1): 6. doi:10.3390/jcm8010006. PMC6351902 . PMID30577479.
  285. ^
  286. Hu L, Wang Z, Hu C, Liu X, Yao L, Li W, Qi Y (2005). "Inibizione della moltiplicazione del virus del morbillo in coltura cellulare per interferenza dell'RNA". Acta Virologica. 49 (4): 227-34. PMID16402679.
  287. ^
  288. Qureshi A, Thakur N, Monga I, Thakur A, Kumar M (2014). "VIRmiRNA: una risorsa completa per i miRNA virali convalidati sperimentalmente e i loro bersagli". Banca dati. 2014. doi:10.1093/database/bau103. PMC4224276. PMID25380780.
  289. ^
  290. Crowe S (2003). "La soppressione dell'espressione del recettore delle chemochine mediante interferenza dell'RNA consente l'inibizione della replicazione dell'HIV-1, di Martínez et al". Aids. 17 Supplemento 4: S103–5. PMID15080188.
  291. ^
  292. Fuchs U, Damm-Welk C, Borkhardt A (agosto 2004). "Silenziamento dei geni correlati alla malattia da piccoli RNA interferenti". Medicina molecolare attuale. 4 (5): 507-17. doi:10.2174/1566524043360492. PMID15267222.
  293. ^
  294. Cioca DP, Aoki Y, Kiyosawa K (febbraio 2003). "L'interferenza dell'RNA è una via funzionale con potenziale terapeutico nelle linee cellulari di leucemia mieloide umana". Terapia genica del cancro. 10 (2): 125-33. doi: 10.1038/sj.cgt.7700544 . PMID12536201.
  295. ^
  296. Lapteva N, Yang AG, Sanders DE, Strube RW, Chen SY (gennaio 2005). "CXCR4 atterramento da piccolo RNA interferente annulla la crescita del tumore al seno in vivo". Terapia genica del cancro. 12 (1): 84–9. doi: 10.1038/sj.cgt.7700770 . PMID15472715.
  297. ^
  298. Singer O, Marr RA, Rockenstein E, Crews L, Coufal NG, Gage FH, Verma IM, Masliah E (ottobre 2005). "Targeting BACE1 con siRNA migliora la neuropatologia della malattia di Alzheimer in un modello transgenico". Neuroscienze della natura. 8 (10): 1343–9. doi:10.1038/nn1531. PMID16136043. S2CID6978101.
  299. ^
  300. Rodríguez-Lebrón E, Gouvion CM, Moore SA, Davidson BL, Paulson HL (settembre 2009). "L'RNAi allele-specifico attenua la progressione fenotipica in un modello transgenico della malattia di Alzheimer". Terapia Molecolare. 17 (9): 1563–73. doi:10.1038/mt.2009.123. PMC2835271. PMID19532137.
  301. ^
  302. Piedrahita D, Hernández I, López-Tobón A, Fedorov D, Obara B, Manjunath BS, Boudreau RL, Davidson B, Laferla F, Gallego-Gómez JC, Kosik KS, Cardona-Gómez GP (ottobre 2010). "Il silenziamento di CDK5 riduce i grovigli neurofibrillari nei topi transgenici di Alzheimer". Il Giornale delle Neuroscienze. 30 (42): 13966-76. doi:10.1523/jneurosci.3637-10.2010. PMC3003593. PMID20962218.
  303. ^
  304. Raoul C, Barker SD, Aebischer P (marzo 2006). "Modellazione virale e correzione delle malattie neurodegenerative mediante interferenza dell'RNA". Terapia genetica. 13 (6): 487–95. doi: 10.1038/sj.gt.3302690 . PMID16319945.
  305. ^
  306. Harper SQ, Staber PD, He X, Eliason SL, Martins IH, Mao Q, Yang L, Kotin RM, Paulson HL, Davidson BL (aprile 2005). "L'interferenza dell'RNA migliora le anomalie motorie e neuropatologiche nel modello murino della malattia di Huntington". Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. 102 (16): 5820-5. Bibcode:2005PNAS..102.5820H. doi:10.1073/pnas.0501507102. PMC556303. PMID15811941.
  307. ^
  308. Boudreau RL, Rodríguez-Lebrón E, Davidson BL (aprile 2011). "Medicina RNAi per il cervello: progressi e sfide". Genetica Molecolare Umana. 20 (R1): R21-7. doi:10.1093/hmg/ddr137. PMC3095054. PMID21459775.
  309. ^ unBCD
  310. Kanasty R, Dorkin JR, Vegas A, Anderson D (novembre 2013). "Materiali di consegna per terapie siRNA". Materiali della natura. 12 (11): 967–77. Bibcode:2013NatMa.12.967K. doi:10.1038/nmat3765. PMID24150415.
  311. ^ unBC
  312. Wittrup A, Lieberman J (settembre 2015). "Abbattere la malattia: un rapporto sui progressi sulle terapie siRNA". Recensioni sulla natura Genetica. 16 (9): 543–52. doi:10.1038/nrg3978. PMC4756474. PMID26281785.
  313. ^
  314. De-Souza EA, Camara H, Salgueiro WG, Moro RP, Knittel TL, Tonon G, et al. (maggio 2019). "L'interferenza dell'RNA può provocare fenotipi inaspettati in Caenorhabditis elegans". Ricerca sugli acidi nucleici. 47 (8): 3957-3969. doi:10.1093/nar/gkz154. PMC6486631 . PMID30838421.
  315. ^ unBCDeFGhio
  316. Xu C, Wang J (1 febbraio 2015). "Sistemi di consegna per lo sviluppo di farmaci siRNA nella terapia del cancro". Giornale asiatico di scienze farmaceutiche. 10 (1): 1-12. doi: 10.1016/j.ajps.2014.08.011 .
  317. ^ unBCDeFGhioJKiom
  318. Whitehead KA, Dahlman JE, Langer RS, Anderson DG (2011). "Silenziamento o stimolazione? consegna di siRNA e il sistema immunitario". Revisione annuale dell'ingegneria chimica e biomolecolare. 2: 77-96. doi:10.1146/annurev-chembioeng-061010-114133. PMID22432611. S2CID28803811.
  319. ^
  320. "La FDA conclude che le mele artiche e le patate innate sono sicure per il consumo". Estratto il 29 settembre 2017 .
  321. ^
  322. Sunilkumar G, Campbell LM, Puckhaber L, Stipanovic RD, Rathore KS (novembre 2006). "Ingegneria di semi di cotone per l'uso nell'alimentazione umana mediante riduzione tessuto-specifica del gossipolo tossico". Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. 103 (48): 18054-9. doi:10.1073/pnas.0605389103. PMC1838705. PMID17110445.
  323. ^
  324. Siritunga D, Sayre RT (luglio 2003). "Generazione di manioca transgenica senza cianogeno". Plantare. 217 (3): 367–73. doi:10.1007/s00425-003-1005-8. PMID14520563. S2CID13561249.
  325. ^
  326. Le LQ, Lorenz Y, Scheurer S, Fötisch K, Enrique E, Bartra J, Biemelt S, Vieths S, Sonnewald U (marzo 2006). "Progettazione di frutti di pomodoro con ridotta allergenicità mediante inibizione mediata da dsRNAi dell'espressione di ns-LTP (Lyc e 3)". Giornale di biotecnologia vegetale. 4 (2): 231-42. doi:10.1111/j.1467-7652.2005.00175.x. PMID17177799.
  327. ^
  328. Niggeweg R, Michael AJ, Martin C (giugno 2004). "Impianti di ingegneria con livelli aumentati di acido clorogenico antiossidante". Biotecnologie naturali. 22 (6): 746–54. doi:10.1038/nbt966. PMID15107863. S2CID21588259.
  329. ^
  330. Sanders RA, Hiatt W (marzo 2005). "Struttura del transgene pomodoro e silenziamento". Biotecnologie naturali. 23 (3): 287-9. doi:10.1038/nbt0305-287b. PMID15765076. S2CID21191589.
  331. ^
  332. Chiang CH, Wang JJ, Jan FJ, Yeh SD, Gonsalves D (novembre 2001). "Reazioni comparative di virus ricombinanti papaya ringspot con geni della proteina di rivestimento chimerico (CP) e virus di tipo selvatico su papaia transgenica CP". Il Giornale di Virologia Generale. 82 (Pt 11): 2827-36. doi: 10.1099/0022-1317-82-11-2827 . PMID11602796. S2CID25659570.
  333. ^
  334. Gilbert MK, Majumdar R, Rajasekaran K, Chen ZY, Wei Q, Sickler CM, Lebar MD, Cary JW, Frame BR, Wang K (giugno 2018). "Il silenziamento basato sull'interferenza dell'RNA del gene dell'alfa-amilasi (amy1) in Aspergillus flavus riduce la crescita fungina e la produzione di aflatossine nei chicchi di mais". Plantare. 247 (6): 1465–1473. doi:10.1007/s00425-018-2875-0. PMID29541880. S2CID3918937.
  335. ^
  336. Katoch R, Thakur N (marzo 2013). "Interferenza dell'RNA: una tecnica promettente per il miglioramento delle colture tradizionali". Rivista internazionale di scienze alimentari e nutrizione. 64 (2): 248-59. doi:10.3109/09637486.2012.713918. PMID22861122. S2CID45212581.
  337. ^
  338. Katoch R, Thakur N (marzo 2013). "I progressi nella tecnologia di interferenza dell'RNA e il suo impatto sul miglioramento nutrizionale, sulle malattie e sul controllo degli insetti nelle piante". Biochimica applicata e biotecnologia. 169 (5): 1579–605. doi:10.1007/s12010-012-0046-5.PMID23322250. S2CID23733295.
  339. ^
  340. Gavilano LB, Coleman NP, Burnley LE, Bowman ML, Kalengamaliro NE, Hayes A, Bush L, Siminszky B (novembre 2006). "Ingegneria genetica di Nicotiana tabacum per ridotto contenuto di nornicotina". Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (24): 9071-8. doi:10.1021/jf0610458. PMID17117792.
  341. ^
  342. Allen RS, Millgate AG, Chitty JA, Thisleton J, Miller JA, Fist AJ, Gerlach WL, Larkin PJ (dicembre 2004). "Sostituzione mediata da RNAi della morfina con l'alcaloide non narcotico reticulina nel papavero da oppio". Biotecnologie naturali. 22 (12): 1559-66. doi:10.1038/nbt1033. PMID15543134. S2CID8290821.
  343. ^
  344. Zadeh AH, Foster GD (2004). "Resistenza transgenica al virus del ring spot del tabacco". Acta Virologica. 48 (3): 145–52. PMID15595207.
  345. ^
  346. Ivashuta S, Zhang Y, Wiggins BE, Ramaseshadri P, Segers GC, Johnson S, Meyer SE, Kerstetter RA, McNulty BC, Bolognesi R, Heck GR (maggio 2015). "RNAi ambientale negli insetti erbivori". RNA. 21 (5): 840-50. doi:10.1261/rna.048116.114. PMC4408792. PMID25802407.
  347. ^
  348. Miller SC, Miyata K, Brown SJ, Tomoyasu Y (2012). "La dissezione dell'interferenza dell'RNA sistemica nel coleottero della farina rossa Tribolium castaneum: parametri che influenzano l'efficienza di RNAi". PLOS UNO. 7 (10): e47431. Bibcode:2012PLoSO. 747431M. doi:10.1371/journal.pone.0047431. PMC3484993 . PMID23133513.
  349. ^
  350. Petrick JS, Friedrich GE, Carleton SM, Kessenich CR, Silvanovich A, Zhang Y, Koch MS (novembre 2016). "DvSnf7 RNA antidiarroico attivo: ripetere la valutazione tossicologica orale della dose a sostegno della sicurezza umana e dei mammiferi". Tossicologia Regolatoria e Farmacologia. 81: 57-68. doi: 10.1016/j.yrtph.2016.07.009 . PMID27436086.
  351. ^
  352. Terenius O, Papanicolaou A, Garbutt JS, Eleftherianos I, Huvenne H, Kanginakudru S, et al. (febbraio 2011). "Interferenza dell'RNA nei lepidotteri: una panoramica di studi e implicazioni di successo e insuccesso per la progettazione sperimentale". Journal of Insect Physiology. 57 (2): 231-45. doi:10.1016/j.jinsphys.2010.11.006. hdl: 1854/LU-1101411 . PMID21078327.
  353. ^
  354. Khajuria C, Ivashuta S, Wiggins E, Flagel L, Moar W, Pleau M, et al. (14 maggio 2018). "Sviluppo e caratterizzazione della prima popolazione di insetti resistente al dsRNA da diabrotica del mais occidentale, Diabrotica virgifera virgifera LeConte". PLOS UNO. 13 (5): e0197059. Bibcode:2018PLoSO..1397059K. doi:10.1371/journal.pone.0197059. PMC5951553. PMID29758046.
  355. ^
  356. Zhang, Sarah (23 giugno 2017). "L'EPA ha approvato silenziosamente la nuova tecnologia di ingegneria genetica della Monsanto: è la prima volta che l'interferenza dell'RNA verrà utilizzata per uccidere gli insetti nocivi". L'Atlantico.
  357. ^
  358. Matson RS (2005). Applicazione della tecnologia dei microarray genomici e proteomici nella scoperta di farmaci . CRC Press. P. 6. ISBN978-0-8493-1469-8.
  359. ^
  360. Zhang XHD (2011). Screening ottimale ad alta produttività: progettazione sperimentale pratica e analisi dei dati per la ricerca RNAi su scala genomica. Cambridge University Press. pp. ix-xiii. ISBN978-0-521-73444-8.
  361. ^
  362. Matzke MA, Matzke AJ (2004). "Piantare i semi di un nuovo paradigma". PLOS Bio. 2 (5): e133. doi:10.1371/journal.pbio.0020133. PMC406394. PMID15138502.
  363. ^
  364. Ecker JR, Davis RW (agosto 1986). "Inibizione dell'espressione genica nelle cellule vegetali mediante espressione di RNA antisenso". Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. 83 (15): 5372–6. Bibcode:1986PNAS. 83.5372E. doi:10.1073/pnas.83.15.5372. PMC386288 . PMID16593734.
  365. ^
  366. Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R (aprile 1990). "L'introduzione di un gene chimerico calcone sintasi in risultati petunia in reversibile co-soppressione di geni omologhi in trans". La cellula vegetale. 2 (4): 279-289. doi:10.1105/tpc.2.4.279. PMC159885. PMID12354959.
  367. ^
  368. Romano N, Macino G (novembre 1992). "Quelling: inattivazione transitoria dell'espressione genica in Neurospora crassa mediante trasformazione con sequenze omologhe". Microbiologia Molecolare. 6 (22): 3343-53. doi:10.1111/j.1365-2958.1992.tb02202.x. PMID1484489. S2CID31234985.
  369. ^
  370. Van Blokland R, Van der Geest N, Mol JN, Kooter JM (1994). "Soppressione mediata dal transgene dell'espressione della calcone sintasi in Petunia ibrida deriva da un aumento del turnover dell'RNA". Pianta J. 6 (6): 861–77. doi:10.1046/j.1365-313X.1994.6060861.x.
  371. ^
  372. Mol JN, van der Krol AR (1991). Acidi nucleici antisenso e proteine: fondamenti e applicazioni. M. Dekker. pp. 4, 136. ISBN978-0-8247-8516-1.
  373. ^
  374. Covey S, Al-Kaff N, Langara A, Turner D (1997). "Le piante combattono l'infezione mediante il silenziamento genico". Natura. 385 (6619): 781-2. Bibcode:1997Natur.385..781C. doi:10.1038/385781a0. S2CID43229760.
  375. ^
  376. Kumagai MH, Donson J, della-Cioppa G, Harvey D, Hanley K, Grill LK (febbraio 1995). "Inibizione citoplasmatica della biosintesi dei carotenoidi con RNA derivato da virus". Atti della National Academy of Sciences degli Stati Uniti d'America. 92 (5): 1679–83. Bibcode: 1995PNAS. 92.1679K. doi:10.1073/pnas.92.5.1679. PMC42583. PMID7878039.
  377. ^
  378. Ratcliff F, Harrison BD, Baulcombe DC (giugno 1997). "Una somiglianza tra difesa virale e silenziamento genico nelle piante". Scienza. 276 (5318): 1558–60. doi:10.1126/science.276.5318.1558. PMID18610513.
  379. ^
  380. Guo S, Kemphues KJ (maggio 1995). "par-1, un gene necessario per stabilire la polarità negli embrioni di C. elegans, codifica per una presunta chinasi Ser/Thr che è distribuita in modo asimmetrico". Cellula. 81 (4): 611-20. doi: 10.1016/0092-8674(95)90082-9 . PMID7758115.
  381. ^
  382. Pal-Bhadra M, Bhadra U, Birchler JA (agosto 1997). "Cosoppressione in Drosophila: silenziamento genico di alcol deidrogenasi da transgeni bianco-Adh è Polycomb dipendente". Cellula. 90 (3): 479–90. doi: 10.1016/S0092-8674(00)80508-5 . PMID9267028.
  383. ^
  384. Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC (febbraio 1998). "Interferenza genetica potente e specifica di RNA a doppio filamento in Caenorhabditis elegans". Natura. 391 (6669): 806–11. Bibcode:1998Natur.391..806F. doi:10.1038/35888. PMID9486653. S2CID4355692.
    , a partire dal Gli scienziati nudi dell'Università di Cambridge , a partire dal Natura – Un video di 15 minuti del Nova trasmissione in onda su PBS, 26 luglio 2005 esperimenti di interferenza RNA (RNAi) e bioinformatica in C. elegans per l'istruzione. Dal Dolan DNA Learning Center del Cold Spring Harbor Laboratory. , a partire dal New York Times , una raccolta di articoli gratuiti sull'RNAi come strategia terapeutica. : un database di fenotipi da esperimenti di screening dell'interferenza dell'RNA in Drosophila melanogaster e Homo sapians Strumenti di interferenza dell'RNA pre-progettati e personalizzati

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Editore di numeri speciali

Tutti gli organismi viventi sono costantemente in contatto con xenobiotici, ad esempio farmaci, coloranti e additivi alimentari, preparati cosmetici e contaminanti ambientali. Ogni xenobiotico, assunto intenzionalmente o meno, rappresenta un potenziale onere e pericolo per il consumatore. Pertanto, gli organismi hanno sistemi attraverso i quali metabolizzano, disattivano ed espellono gli xenobiotici, nonché i cosiddetti enzimi che metabolizzano i farmaci. Gli xenobiotici e i loro metaboliti differiscono per struttura, proprietà fisico-chimiche, attività biologica e comportamenti negli organismi. L'identificazione dei metaboliti emergenti è essenziale per la formazione della farmacocinetica, della tossicocinetica e per la determinazione della tossicità di ciascun xenobiotico nei test sui farmaci, nonché negli studi tossicologici e ambientali. Recentemente, il rapido sviluppo di metodi analitici ha permesso di scoprire metaboliti precedentemente non rilevabili.

Questo numero speciale di IJMS tratterà una selezione di recenti temi di ricerca e articoli di rassegna in corso nel campo dell'identificazione e quantificazione dei metaboliti xenobiotici in vari organismi (uomo, animali, invertebrati, piante, ecc.). I ricercatori sono cordialmente invitati a presentare lavori pertinenti a questi argomenti.

Prof. Dr. Barbora Szotáková
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