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Qual è la differenza morfologica tra le cellule di Leydig nell'uomo e nei suini?

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Il maiale è solo un esempio, solo un animale. Le cellule di Leydig hanno inclusioni proteiche (cristalli di Reinke) che sono per lo più costituite da lipofuscina cristallizzata. Sono inclusioni secretorie cioè cellule formate in cellule secernenti.

Un esempio di cellula di Leydig nel testicolo di maiale:

Il mio insegnante mi ha detto che c'è una differenza nell'esistenza di alcune cellule tra umani e animali. Tuttavia, non riesco a trovare una tale differenza. Non mi è stata fornita una diapositiva di cellule di Leydig umane, quindi non sono stato in grado di confrontare.

Qual è la differenza morfologica tra le cellule di Leydig nell'uomo e nei suini?


Forse ciò che intendeva il tuo insegnante non era tanto una differenza nella morfologia delle cellule di Leydig, ma in morfologia del tessuto interstiziale, cioè. tessuto che occupa lo spazio tra i tubuli seminiferi. Le cellule di Leydig sono la sua componente più interessante, altre sono piccoli vasi sanguigni (molti), nervi e tessuto connettivo (principalmente fibroblasti, mastociti, linfociti e macrofagi). In specie diverse il tessuto interstiziale ha un aspetto diverso, ad esempio:

  • Le cellule di Leydig formano grumi attorno ai vasi sanguigni e sono circondate da fibroblasti (che li rende più difficili da isolare) nella cavia, ma non nei topi o nei ratti;
  • nell'uomo molto tessuto interstiziale è materia extracellulare, le cellule di Leydig non sono così frequenti, ma più attive;
  • e, ultimo ma non meno importante, nel maiale c'è poca materia extracellulare e molte cellule di Leydig che si isolano molto facilmente (e producono grandi quantità di estrogeni).

Ho trovato tutto questo in alcuni vecchi appunti delle lezioni; Tuttavia, non sono riuscito a trovare alcun riferimento sensato.


Ho studiato tutta la letteratura disponibile (tramite la biblioteca universitaria) sulle cellule di Leydig e penso che il tuo insegnante potrebbe avere in mente questo articolo che riassume gli studi morfologici sulle cellule di Leydig in diversi modelli animali.

Per dirla in chiaro, i modelli animali più comuni per lo studio delle cellule di Leydig sono ratti, topi e maiali.

È stato dimostrato che lo sviluppo delle cellule di Leydig nei ratti è bifasico: sviluppo della popolazione di cellule di Leydig nel feto e sua degradazione durante la trasformazione nelle cellule mature. Per molto tempo si è creduto che questo fosse vero anche per le cellule di Leydig umane. Tuttavia, alcuni studi condotti su maiali e scimmie hanno fornito prove di un'ulteriore fase di degradazione cellulare a volte tra i cambiamenti di sviluppo fetale e neonatale. Questi dati sono riassunti nella seguente Figura (tratta dal documento di riferimento):

Quindi, confrontando le cellule di Leydig di ratti e umani della stessa età fetale o poco dopo la nascita (periodo neonatale) potresti vedere la degradazione delle cellule di Leydig - diminuiscono di dimensioni e molte di esse alla fine muoiono - rispetto al normale stato di queste cellule nei ratti.


Studio morfologico e morfometrico dei primi cambiamenti nell'invecchiamento del testicolo del criceto dorato.

Le caratteristiche istologiche e morfometriche del testicolo del criceto dorato invecchiato sono state esaminate e confrontate con quelle degli animali adulti. Tre gruppi di età (6, 12 e 18 mesi) sono stati studiati al microscopio ottico e sono stati determinati i livelli di testosterone. Le osservazioni hanno mostrato una progressiva involuzione dei tubuli seminiferi, che inizia ad essere percepibile a 12 mesi con lieve ipospermatogenesi e desquamazione. Nei campioni di 18 mesi la degenerazione era più significativa e le lesioni istopatologiche potevano essere classificate su una scala a 6 punti, che andava da una leggera ipospermatogenesi all'assenza di cellule germinali. Questi cambiamenti involutivi non erano distribuiti in modo omogeneo nei tubuli colpiti dal testicolo vicino a quelli apparentemente normali. I risultati morfometrici indicano una progressiva diminuzione, nei 3 gruppi di età, degli spermatozoi del dotto deferente, degli spermatociti pachitene e delle cellule di Sertoli e Leydig (queste ultime significativamente diminuite solo nel gruppo di 18 mesi). Ai fini morfometrici è stata utilizzata una scala a 7 punti della degenerazione dei tubuli, che mostra un aumento significativo, con l'età, in presenza di stadi tubuli più degenerati. Sono state trovate diverse correlazioni tra le variabili morfometriche, delineando le relazioni esistenti tra l'età e la diminuzione associata di diversi tipi di cellule del testicolo e il diametro del lume. Non sono state riscontrate differenze significative tra i gruppi nei livelli sierici di testosterone. In conclusione, negli animali di 18 mesi sono evidenti alterazioni istologiche legate all'età, mentre a 12 mesi è rilevabile una diminuzione del numero di cellule germinali e della produzione di spermatozoi.


Sfondo

Nei topi, come nella maggior parte delle specie di mammiferi, durante il normale sviluppo dei testicoli si formano due generazioni di cellule di Leydig. Una popolazione "fetale" che compare poco dopo la differenziazione del testicolo in utero e una popolazione "adulta" che nasce dopo la nascita intorno al settimo giorno [1-3]. La maturazione morfologica e funzionale delle cellule di Leydig adulte dipende in modo critico dalla stimolazione dell'ormone luteinizzante (LH) e questo è chiaramente visibile nei topi privi di LH circolante o del recettore LH [4-7]. In questi animali il numero di cellule di Leydig non si sviluppa normalmente dopo la nascita e i livelli di androgeni circolanti sono bassi o non rilevabili [6-9]. Al contrario, i livelli di androgeni testicolari e il numero di cellule di Leydig sono normali durante lo sviluppo fetale in animali privi di gonadotropine [8,9], dimostrando che la popolazione fetale di cellule di Leydig non richiede gonadotropine durante questo periodo. Nonostante il chiaro ruolo dell'LH nella proliferazione e maturazione delle cellule di Leydig adulte nel testicolo postnatale, non è noto se questo ormone sia essenziale per l'inizio della differenziazione delle cellule di Leydig adulte. I primi studi hanno suggerito che l'LH è necessario per il processo di differenziazione [10-12] mentre studi immunoistochimici più recenti hanno riportato che specifici enzimi steroidogenici sono rilevabili nei precursori delle cellule di Leydig adulti di ratto prima che i recettori LH siano rilevabili [13]. Questa evidenza suggerirebbe che la differenziazione delle cellule di Leydig inizia in assenza di stimolazione dell'LH sebbene rimanga possibile che siano presenti livelli bassi e non rilevabili di recettore prima della differenziazione. Certamente, le cellule precursori delle cellule di Leydig esprimono il gene del recettore LH prima dell'apparente differenziazione, sebbene non sia chiaro se i trascritti siano tradotti o producano proteine ​​funzionali [14-16].

È stato precedentemente dimostrato che nelle specie di mRNA del topo codificanti 3β-idrossisteroide deidrogenasi tipo VI (3βHSD VI), 17β-idrossisteroide deidrogenasi tipo III (17βHSD III), prostaglandina (PG) D-sintetasi, l'estrogeno sulfotransferasi (EST) e la molecola di adesione cellulare vascolare 1 (VCAM 1) sono espresse solo nella popolazione di cellule di Leydig adulte e non nella popolazione fetale [1,17-20]. È quindi possibile utilizzare questi marcatori per esaminare il ruolo dell'LH nell'inizio della differenziazione delle cellule di Leydig adulte utilizzando topi privi di stimolazione delle gonadotropine. L'espressione di questi marcatori in topi privi di gonadotropine sarebbe una chiara dimostrazione che la differenziazione delle cellule di Leydig non richiede la stimolazione dell'LH. Si potrebbe prevedere, tuttavia, che anche se le cellule di Leydig adulte esistono in assenza di stimolazione con LH, l'espressione di questi marcatori specifici sarà molto bassa o inesistente poiché l'attività complessiva delle cellule di Leydig è determinata dall'LH [21]. Tuttavia, è probabile che il trattamento di topi con carenza di gonadotropine con hCG porti a un rapido aumento dell'espressione dei marcatori entro 24 ore se esistono già cellule di Leydig adulte. Se le cellule non si sono differenziate, è probabile che sia necessario un periodo di trattamento più prolungato per indurre la differenziazione delle cellule di Leydig e l'espressione dei marcatori. Per questi motivi l'espressione dei marcatori delle cellule di Leydig adulte è stata esaminata nell'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH) nullo (hpg) topo. Questo animale ha un vantaggio rispetto ai modelli carenti di recettori in quanto le gonadi rimangono sensibili al trattamento con ormoni esogeni.


Sviluppo di cellule di Leydig adulte da cellule staminali

Durante le prime 2-3 settimane postnatali nei ratti, le cellule di Leydig fetali vengono gradualmente sostituite da cellule di Leydig adulte [8, 21]. Era stato suggerito che lo sviluppo delle cellule di Leydig adulte fosse indipendente dalle cellule di Leydig fetali, ma piuttosto che le cellule provenissero da cellule staminali [18, 22, 23]. Il lavoro di Matthew Hardy e dei suoi colleghi ha mostrato che le cellule di Leydig di ratto adulto si sviluppano effettivamente dalle cellule staminali del testicolo del primo neonato (giorno 7) [24]. Questi ricercatori hanno dimostrato che ci sono cellule nel testicolo di ratto neonatale che sono 3β HSD-negative, LHR-negative e recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine α (PDGFRα)-positivo. A seconda delle condizioni in vitro a cui sono esposte, queste cellule hanno dimostrato di avere la capacità di proliferare indefinitamente (auto-rinnovarsi) o differenziarsi per diventare 3β-HSD positive e infine produrre testosterone. Inoltre, quando trapiantate nel compartimento interstiziale dei testicoli di ratto adulto ospite, le cellule si sono differenziate in vivo per diventare 3β-HSD positive.

È stato anche dimostrato che cellule staminali indistinguibili da quelle del testicolo neonatale circondano i tubuli seminiferi e i vasi sanguigni dei testicoli adulti [25]. Queste cellule sono state isolate e, come con le cellule staminali del testicolo neonatale, sono state trovate in grado di auto-rinnovarsi indefinitamente o di differenziarsi e infine produrre testosterone [25]. In uno studio recente, abbiamo riportato che le cellule staminali di Leydig ottenute dal ratto adulto possono transdifferenziare nell'epitelio uterino e prostatico, ma non nell'epidermide [26]. Anche gli studi sull'ablazione delle cellule di Leydig, utilizzando l'etano dimetano solfonato o approcci genetici per eliminare le cellule adulte, hanno contribuito alla nostra comprensione dell'origine delle cellule di Leydig adulte [27, 28]. Questi studi hanno dimostrato che, sebbene le cellule staminali adulte siano normalmente quiescenti, rigenereranno nuove cellule di Leydig dopo la perdita indotta sperimentalmente delle cellule adulte. Tuttavia, il ruolo normalmente svolto dalle cellule staminali del testicolo adulto non è noto.


Riproduzione comparativa

Determinazione del sesso somatico

L'identità sessuale somatica è determinata a valle del cariotipo del cromosoma sessuale ed è specificata durante l'embriogenesi precoce prima della gonadogenesi. XX femmine attivano l'espressione di Sxl, il gene regolatore del sesso principale, da un promotore embrionale precoce, Sxl-Pe, al ciclo nucleare 12, poco dopo la formazione di PGC. Questo è seguito da Sxl espressione di un promotore tardivo, Sxl-Pm, in entrambi i sessi al ciclo nucleare 14, dopo cellularizzazione somatica e piena attivazione della transizione da madre a zigote. La presenza della proteina Sxl nelle femmine XX potenzia un ciclo di autoregolazione in cui si lega a Sxl trascrizioni e provoca il salto di un esone contenente un codone di stop precoce, consentendo così la sintesi continua della proteina Sxl funzionale. Sxl le trascrizioni nei maschi XY contengono il codone di stop precoce e, quindi, non sono in grado di produrre proteine ​​funzionali. Una cascata di eventi di splicing alternativi che coinvolgono Tra/Tra2 a valle di Sxl alla fine produce un'isoforma specifica per la femmina del fattore di trascrizione Dsx F , mentre l'isoforma predefinita, Dsx M , è specifica per il maschio. Queste isoforme Dsx sesso-specifiche istruiscono la maggior parte della differenziazione sessuale somatica (Oliver, 2002).


Discussione

Gli studi iniziali che identificavano le cellule di Leydig fetali e adulte come appartenenti a diverse popolazioni cellulari si basavano sulle differenze morfologiche tra i due tipi cellulari [26, 27]. Queste differenze non sono tuttavia particolarmente adatte per differenziare tra cellule fetali e cellule adulte in condizioni di deprivazione ormonale o del fattore di crescita poiché la morfologia stessa sarà influenzata dallo stato di deprivazione. Questo è chiaramente visibile nel presente studio e in studi precedenti [4, 9, 28], che mostrano che le cellule di Leydig nei topi GnRH-null contengono numerose grandi goccioline lipidiche che sono diverse dalle normali cellule di Leydig fetali o adulte, ma sono simili alle Cellule di Leydig con livelli significativamente ridotti di steroidogenesi [29]. Vale la pena notare, tuttavia, che la distribuzione delle goccioline lipidiche nella cellula di Leydig adulta GnRH-null è simile a quella della normale cellula di Leydig adulta sebbene le goccioline lipidiche siano più grandi e più frequenti. La distribuzione delle goccioline lipidiche nei topi adulti GnRH-null è diversa dai caratteristici cluster osservati nelle cellule di Leydig fetali.

Sebbene i marcatori morfologici non siano chiaramente ideali per identificare le cellule di Leydig fetali e adulte, altri studi hanno ora dimostrato che esistono differenze fondamentali nell'espressione genica tra le due popolazioni di cellule di Leydig che potrebbero essere utilizzate per differenziare i tipi di cellule. Negli studi iniziali è stato dimostrato che l'11β-idrossisteroide deidrogenasi di tipo 1 (11βHSD1) è espressa nelle cellule di Leydig adulte del ratto ma che non vi è espressione nelle cellule fetali [30, 31]. Il nostro gruppo e altri lo hanno esteso per identificare quattro specie di mRNA (3βHSD VI, EST, PGD-sintetasi e 17βHSD III) che sono espresse nelle cellule di Leydig adulte, ma non nelle cellule di Leydig fetali, del topo [17-20]. Finora, le uniche differenze chiaramente identificate nell'espressione genica tra le due popolazioni riguardano i geni espressi nella popolazione di cellule adulte ma non nella popolazione fetale [1, 17-19]. I geni che sono altamente espressi nella popolazione fetale di cellule di Leydig, come quelli che codificano per la renina e la trombospondina 2, continuano ad essere espressi nel testicolo adulto, anche se a bassi livelli [19, 32, 33]. Ciò può essere dovuto al fatto che le cellule di Leydig adulte esprimono questi geni a bassi livelli o, più probabilmente, perché la popolazione di cellule di Leydig fetale persiste nel testicolo adulto [19, 34-36]. L'identificazione di geni specificamente espressi nella popolazione di cellule di Leydig adulte ma non nella popolazione di cellule di Leydig fetali, tuttavia, ci consente di determinare se le cellule di Leydig adulte si sviluppano in assenza di ormoni o fattori di crescita specifici.

La normale differenziazione della popolazione di cellule di Leydig adulte nel topo inizia intorno al settimo giorno postnatale [1–3]. È stato dimostrato in precedenza che in assenza di LH si verifica un fallimento della normale proliferazione di queste cellule e non si verifica lo sviluppo della normale funzione steroidogenica [8, 9]. Quindi, non c'è dubbio che una volta che la differenziazione è iniziata, le cellule di Leydig adulte richiedono la stimolazione con LH, ma il ruolo dell'LH all'inizio della fase di differenziazione iniziale è rimasto incerto. I risultati di questo studio ora mostrano, tuttavia, che le cellule di Leydig adulte si differenziano nei topi con carenza di LH circolante. Questa conclusione si basa principalmente sull'espressione misurata di specifici marcatori di cellule di Leydig adulte nei testicoli di topi GnRH-null non trattati. L'espressione di tutti e quattro i marcatori della differenziazione delle cellule di Leydig adulte era bassa ma chiaramente rilevabile mediante PCR in tempo reale nei topi GnRH-null adulti. Localizzazione, da sul posto l'ibridazione di due di questi marcatori ha confermato che l'espressione era presente nel testicolo di topo GnRH nullo non trattato ed era localizzata nel tessuto interstiziale. Affinché questi dati siano accettati come una chiara prova che le cellule di Leydig adulte si differenziano nonostante una carenza di LH, dipende dalla veridicità dei marcatori scelti per indicare lo sviluppo delle cellule di Leydig adulte. La prova che questi marcatori sono specifici per le cellule di Leydig adulte proviene da studi precedenti che hanno dimostrato che durante lo sviluppo in topi normali le specie di mRNA che codificano 3βHSD VI e EST non sono rilevabili dalla PCR in tempo reale [19] [e confermato da studi attuali], sul posto ibridazione [1], immunoistochimica [20] o Northern blotting [20] prima che avvenga la differenziazione delle cellule di Leydig adulte. Inoltre, mentre sia la PDG-sintetasi che la 17βHSD III sono espresse nel testicolo fetale/neonatale, questa espressione è solo nei tubuli seminiferi e si interrompe prima della pubertà, momento in cui l'espressione appare nella popolazione di cellule di Leydig adulte [17, 18]. L'espressione della PGD-sintetasi negli esperimenti in corso è stata confermata da sul posto ibridazione da localizzare al tessuto interstiziale del testicolo di topo adulto GnRH-null. Pertanto, per quanto è possibile determinare, i marcatori utilizzati sono specifici per la popolazione di cellule di Leydig adulte e indicano che queste cellule sono presenti nel testicolo GnRH nullo.

Anche il confronto dei modelli di espressione nei testicoli GnRH-null adulti con i normali testicoli neonatali è informativo. Se i testicoli GnRH-null adulti non contengono cellule di Leydig adulte e sono presenti solo cellule di Leydig di tipo fetale, ci si aspetterebbe che il pattern generale di espressione dell'mRNA sia quello di un testicolo neonatale privo di supporto gonadotropo. Infatti, con le eccezioni di P450scc e renina, i livelli di espressione sono simili o superiori nel testicolo GnRH nullo dell'adulto. Ciò è coerente, quindi, con la differenziazione di una popolazione adulta di cellule nel testicolo GnRH-null adulto.

Gli effetti del trattamento con hCG sull'espressione genica nel testicolo di topo GnRH-null adulto supporta anche l'ipotesi che in questo animale siano presenti cellule di Leydig adulte. L'espressione dei marcatori 3βHSD VI e 17βHSD III è aumentata significativamente dopo 2 iniezioni di hCG in un periodo di 12 ore. Durante il normale sviluppo testicolare c'è un intervallo di almeno quattro giorni tra la differenziazione iniziale delle cellule di Leydig [intorno al giorno 7 [2]] e la prima espressione di 3βHSD VI mRNA (intorno al giorno 11 [1]) e un intervallo più lungo prima del primo aumento significativo nei livelli di mRNA di 17βHSD III (dopo il giorno 20 [19]). Se nel testicolo GnRH-null fossero presenti solo cellule precursori indifferenziate, è probabile che sarebbe necessario un periodo più lungo di trattamento con hCG prima che si possa osservare un aumento dell'espressione di 3βHSD VI e 17βHSD III. In contrasto con 3βHSD VI e 17βHSD III, l'espressione delle specie di mRNA che codificano EST e PGD non è aumentata fino a dopo 48 ore di trattamento con hCG. Ciò è coerente con i dati precedenti che hanno dimostrato che questi due geni mostrano un pattern di espressione ritardato durante il normale sviluppo [19].

Nel topo GnRH-null la mancanza di stimolazione ipofisaria da parte del GnRH provoca una marcata riduzione della sintesi ipofisaria e del rilascio di gonadotropine [8]. Ciò significa che i livelli circolanti di LH e FSH sono molto bassi ma non necessariamente vengono aboliti.Pertanto, non si può escludere la possibilità che vi sia una stimolazione a basso livello delle gonadotropine dei precursori delle cellule di Leydig. Va notato, tuttavia, che i livelli di testosterone intratesticolare nei topi GnRH-null non sono rilevabili e sono inferiori rispetto ai topi LH-receptor nulli [6, 7]. Qualsiasi LH circolante deve, quindi, essere a un livello minimo e, come tale, è improbabile che influisca sullo sviluppo delle cellule di Leydig.

Se, come suggeriscono i dati qui descritti, le cellule di Leydig adulte si sviluppano senza stimolazione con LH, ciò fa sorgere la domanda su quale stato di differenziazione/sviluppo raggiungano le cellule. Lo sviluppo morfologico e funzionale della linea cellulare di Leydig adulta è stato recentemente rivisto da Mendis-Handagama e Ariyaratne [37]. Le cellule precursori di Leydig a forma di fuso si trovano nella regione peritubulare del tessuto interstiziale e si differenziano inizialmente in cellule progenitrici nella stessa regione. L'ulteriore sviluppo di cellule di Leydig adulte "neoformate" e "immature" è associato all'arrotondamento delle cellule e al movimento verso la regione interstiziale centrale [37]. L'espressione dei geni delle cellule di Leydig adulte nel testicolo non stimolato GnRH-null e la rapida risposta di alcuni di questi alla stimolazione dell'hCG suggerisce che le cellule hanno superato le fasi iniziali della differenziazione e possono rappresentare una forma di cellula adulta non stimolata e immatura. Un'ulteriore prova che le cellule si sono spostate oltre lo stadio progenitore è fornita dal 3βHSD VI sul posto studi di ibridazione che mostrano che il segnale di ibridazione è localizzato principalmente nell'area del tessuto interstiziale centrale piuttosto che nella regione peritubulare dove si trovano le cellule progenitrici. È anche interessante notare che il numero totale di cellule di Leydig morfologicamente riconoscibili (senza distinzione tra cellule fetali e cellule adulte) in realtà raddoppia durante il periodo puberale nell'animale GnRH-null [9]. Ciò sarebbe coerente con la differenziazione morfologica delle cellule di Leydig adulte durante questo periodo nei topi GnRH-null e si collega ai dati funzionali descritti sopra.

Nonostante l'apparente differenziazione delle cellule di Leydig adulte nei topi GnRH-null, il numero totale di cellule di Leydig in questi animali rimane notevolmente ridotto a circa il 10% del controllo [9]. È chiaro che lo sviluppo del numero finale di cellule di Leydig adulte è una combinazione di differenziazione dei precursori e proliferazione della cellula matura sebbene il contributo relativo dei due processi rimanga poco chiaro [37]. Se si accetta, dai dati qui presentati, che la differenziazione delle cellule di Leydig è in gran parte un evento LH-indipendente, la marcata riduzione del numero di cellule di Leydig nel topo GnRH-null sarebbe coerente con un ruolo ridotto per la differenziazione cellulare e un ruolo più importante per la proliferazione nella determinazione del numero finale di cellule. Un'ulteriore implicazione di questo modello sarebbe che mentre la differenziazione è un evento LH-indipendente, la proliferazione cellulare (inclusa la proliferazione di precursori/progenitori) è LH-dipendente. Ciò sarebbe coerente con studi precedenti che mostrano che l'LH indurrà la proliferazione delle cellule di Leydig nei topi GnRH-null [28].

I risultati di questo studio suggeriscono che la differenziazione delle cellule di Leydig adulte non richiede LH sebbene l'ormone sia necessario per lo sviluppo funzionale delle cellule e per stabilire il normale numero di cellule. Lo stimolo iniziale per la differenziazione delle cellule di Leydig adulte rimane sconosciuto sebbene sembri essere necessario l'ormone stimolante la tiroide [30, 38] insieme ai prodotti delle cellule del Sertoli Dhh e PDGF-A [35, 39]. Qualunque altro fattore o fattori siano coinvolti, sembra probabile che almeno alcuni siano di origine cellulare di Sertoli poiché queste cellule sono strettamente coinvolte nella regolazione delle cellule di Leydig e sono necessarie per la sopravvivenza e la funzione delle cellule di Leydig [40]

Studi di ibridazione in situ che mostrano l'espressione della 3β-idrossisteroide deidrogenasi (3βHSD) di tipo VI e della prostaglandina D (PGD)-sintetasi in topi GnRH-null di controllo adulti e topi GnRH-null dopo iniezione con hCG. L'ibridazione della sonda antisenso 3βHSD VI per controllare il testicolo GnRH-null è mostrata in A) e ad una potenza maggiore in B). In C) è mostrata l'ibridazione ai testicoli di topi GnRH-null dopo 4 iniezioni di hCG. L'ibridazione a una sonda 3βHSD VI di senso è mostrata in D). L'ibridazione di una sonda PGD-sintetasi antisenso al testicolo da topi di controllo GnRH-null è mostrata in E) mentre l'ibridazione di una sonda di senso è mostrata in F).


Identificazione di cellule staminali di Leydig derivate da interstizio testicolare di maiale.

Il testosterone non solo mantiene il processo di spermatogenesi, ma protegge anche la funzione dei tessuti androgeno-dipendenti [1, 2]. In quanto fonte primaria di sintesi e secrezione di testosterone nei testicoli dei mammiferi, le cellule di Leydig adulte (ALC) svolgono un ruolo essenziale nel mantenimento del movimento vitale [3]. Recentemente, è stato dimostrato che gli ALC derivano da cellule staminali di Leydig (SLC) [4]. Le SLC, che si trovano nel compartimento interstiziale vicino ai tubuli seminiferi nei testicoli dei mammiferi, sono uno dei più importanti tipi di cellule staminali somatiche [5, 6].

Gli SLC sono stati inizialmente identificati e arricchiti da testicoli di ratto neonatale da Ge et al. (2006) e ulteriori studi hanno dimostrato che i presunti SLC murini e umani avevano la capacità di differenziarsi in cellule che producono testosterone [4, 7, 8]. Secondo questi studi precedenti, sono state identificate alcune caratteristiche delle SLC [4, 9, 10]. In primo luogo, il numero di SLC di mammifero era abbastanza piccolo, ad esempio, una media di soli 8.500 SLC putativi sono stati ottenuti da un testicolo di ratto postnatale di 7 giorni [4]. In secondo luogo, gli SLC che risiedono sulla superficie esterna dei tubuli seminiferi nei testicoli di ratto erano in situ a forma di fuso [4, 10]. Inoltre, presunti SLC esprimevano il recettore LIF (LIFR), il recettore a del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFR[alfa]), Nestina, Thy-1 e alcuni marcatori di cellule staminali, tuttavia, erano 3[beta]-HSD- e luteinizzanti recettore ormonale- (LHR-) negativo [4, 8, 10, 11]. Sfortunatamente, non sono stati condotti studi SLC in altri animali mammiferi, tranne che in ratti, topi e umani.

Con l'aumentare dell'età, il numero di LC funzionali diminuisce e si riduce la capacità di produzione di testosterone, produzione di cAMP e l'attività degli enzimi steroidogenici [12, 13]. Pertanto, le malattie dell'infertilità maschile possono verificarsi nei maschi più anziani a causa della disfunzione dei LC o del disturbo del testosterone [14, 15]. Attualmente, la sostituzione degli androgeni era la terapia più efficiente per salvare la carenza di testosterone, tuttavia, richiedeva trattamenti successivi e comportava rischi intrinseci [16]. Gli SLC avevano la capacità di auto-rinnovarsi e differenziarsi in LC, fornendo quindi una nuova strategia per il trattamento di queste malattie mediante il trapianto di SLC [17].

Il maiale aveva svolto un ruolo cruciale come modello di mammifero negli studi sulle malattie umane [18, 19]. Il testicolo di maiale era stato suggerito come "l'organo produttore di steroidi più versatile conosciuto" e ha fornito materiale importante per la ricerca sulla fisiologia e la genetica della steroidogenesi umana [20]. Tuttavia, gli SLC suini dovevano ancora essere isolati e arricchiti. Inoltre, le distinzioni di specie hanno complicato gli studi sugli SLC suini, dal momento che non era stata ottenuta una mappatura completa dei marcatori e dei sistemi di coltura degli SLC di ratto e topo rispetto agli SLC suini. Data l'importanza degli SLC suini nelle applicazioni cliniche, l'obiettivo di questo studio era isolare, identificare e coltivare SLC da testicoli di suino neonatale.

2.1. Raccolta di testicoli suini. Lo studio è stato approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della Northwest A&F University in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health, Cina. Campioni di testicoli freschi di suini maschi di 7 giorni del gruppo dell'industria agricola Besun Co., Ltd. (Yangling, Shaanxi, Cina) sono stati trasportati al laboratorio in soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) integrata con 2% di penicillina-streptomicina ( P/S) soluzione (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) entro 1 h. Campioni di testicoli di suini maschi di 2 mesi sono stati raccolti da un allevamento di suini a Yangling, nella provincia dello Shaanxi, in Cina.

2.2. Isolamento di SLC suini. Un metodo di digestione enzimatica è stato utilizzato per ottenere SLC suini. I testicoli sono stati prima lavati e tritati dopo la rimozione dell'epididimo e della tunica albuginea. Quindi i frammenti testicolari sono stati sospesi in 0,75 mg/mL di collagenasi di tipo IV (Invitrogen) contenente il 5% (v/v) di siero fetale bovino (FBS, Gibco, UK) più DNasi I (100 [micro]g/mL Bio Basic, Markham , Canada) e incubate, con agitazione costante a 34[degrees]C per 90 min [21]. Le reti di nylon monofilamento da 160 e 59 [micro] m (Solarbio, Pechino, Cina) sono state quindi utilizzate per filtrare la sospensione cellulare [21]. Le cellule isolate sono state trattate con 1 mg/mL di ialuronidasi (Invitrogen) e centrifugate a 500 g per 5 minuti a 20[degrees]C. Dopo 5 min di quiete, il lato superiore delle sospensioni è stato coltivato in terreno per altri 15 min di quiete. Le cellule sul lato superiore delle sospensioni sono state quindi raccolte. Infine, le LC isolate sono state coltivate nel mezzo eagle modificato di Dulbecco: miscela di nutrienti F-12 (DMEM/F12, Invitrogen).

2.3. Preparazione del liquido testicolare dei suinetti (pTF). Il pTF e le LC primarie sono state derivate dalla stessa fonte. I testicoli di suini di 7 giorni sono stati tagliati in frammenti il ​​più piccoli possibile e il pTF è stato estratto mediante omogeneizzazione dei tessuti a 20[degrees]C [22]. Infine, il pTF è stato filtrato attraverso un colino da 0,22 [micro] m per degerminarlo.

2.4. Coltura di LC suini isolati. I precipitati di LC isolati sono stati risospesi in due mezzi: un mezzo di base e l'altro mezzo pTF (mezzo di base più 30% (v/v) pTF) [22]. Il terreno di base era costituito da DMEM/F12, 10% (v/v) FBS, 1% (v/v) P/S e 1% (v/v) di vitamine. Le LC sono state quindi incubate in un'atmosfera di 95% aria-5% C[O.sub.2] a 34[degrees]C e coltivate per almeno 2 settimane. I mezzi di coltura venivano cambiati giornalmente.

2.5. Trattamento Etano Dimetansolfonato (EDS). L'EDS è stato fornito dal professor Yuanqiang Zhang (Dipartimento di anatomia umana, istologia ed embriologia, quarta università medica militare, Cina). Secondo i metodi precedenti, l'EDS è stato sciolto in dimetilsolfossido (DMSO)/acqua sterile (1: 3, v/v) [23-25]. Successivamente, gli SLC primari isolati sono stati seminati in una piastra da 6 pozzetti e sono stati aggiunti rispettivamente 0, 0,5, 0,75 e 1,0 mg/mL di EDS (concentrazione finale) alla soluzione di coltura [24, 25]. L'analisi quantitativa della PCR in tempo reale (qRT-PCR) e dell'immunofluorescenza è stata eseguita 24 ore dopo il trattamento con EDS.

2.6. Colorazione ematossilina ed eosina (H&E) e analisi immunoistochimica. Campioni di testicolo di suini maschi di 7 giorni e 2 mesi sono stati fissati, disidratati e inclusi in paraffina. I tessuti inclusi in paraffina sono stati quindi sezionati a 5 [micro] m utilizzando procedure standard e fatti aderire a vetrini prerivestiti. Successivamente, è stata condotta la colorazione H&E delle sezioni incluse in paraffina per osservare l'istologia [26].

Per l'immunoistochimica, è stata determinata l'espressione di PDGFR[alfa] nelle cellule interstiziali di testicoli suini di 7 giorni e il tipo di queste cellule positive alla proteina. In dettaglio, le sezioni in paraffina sono state deparaffinate, reidratate e risciacquate in PBS. Quindi il recupero dell'antigene ha comportato l'ebollizione dei campioni in una soluzione di acido tris-etilendiamminotetraacetico 0,01 M (Tris-EDTA pH = 9,0) per 10 min. Le sezioni sono state incubate con siero d'asino al 10% per 2 ore a 37[degrees]C, seguita da incubazione con anticorpi primari (anti-PDGFR[alpha], 1:200, Abcam, Cambridge, UK) durante la notte a 4[degrees]C e successiva incubazione con anticorpi biotinilati secondari (ZSGB-BIO, Cina) per 1 ora a 37[degrees]C [27, 28]. Successivamente, la 3,3'-diaminobenzidina (DAB, ComWin Biotech, Cina) è stata utilizzata come cromogeno per rilevare l'espressione proteica.

Le caratteristiche delle cellule isolate sono state rilevate mediante colorazione con immunofluorescenza. Innanzitutto, le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% e permeabilizzate con Triton X-100 allo 0,05% per 15 minuti. Le cellule sono state quindi incubate con anticorpi primari a 4[degrees]C durante la notte, e poi per 2 h con appropriati anticorpi secondari coniugati con Alexa Fluor 594 (1 : 400, Invitrogen, USA) a 37[degrees]C. Infine, le cellule sono state etichettate con 4,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 1: 1000 Beyotime, Cina). Gli anticorpi primari utilizzati erano anti-PDGFR[alfa] di coniglio (1:200, Abcam) e anti-CYP17A1 di topo (1: 100, Santa Cruz, USA).

Tutte le immagini di tutte le colorazioni sono state acquisite utilizzando una fotocamera per microscopio a fluorescenza Nikon Eclipse 80i (Tokyo, Giappone).

2.7. Analisi qRT-PCR. L'RNA totale è stato estratto dalle cellule e dai tessuti dei testicoli suini utilizzando il reagente RNAiso Plus (TaKaRa, Dalian, Cina) secondo il protocollo raccomandato. Il cDNA è stato quindi sintetizzato per la PCR a trascrizione inversa (RT-PCR) utilizzando il kit di reagenti PrimeSript[TM] RT (TaKaRa). Per caratterizzare le cellule isolate sono stati utilizzati primer specifici (Tabella 1). Il sistema di reazione qRT-PCR aveva un volume di 20 [micro]L: 10 [micro]L SYBR[R] Premix Ex Taq II (2x) (TaKaRa), 0,8 [micro]L cDNA, 0,5 [micro]L PCR Forward Primer (10 [micro]mol/L), 0,5 [micro]L PCR Reverse Primer (10 [micro]mol/L) e aggiunta di acqua sterile al volume totale di 20 [micro]L. Le condizioni della reazione PCR erano le seguenti: denaturazione a 95[degrees]C per 3 min, seguita da 40 cicli di (95[degrees]C per 15s, 60[degrees]C per 30s e 72[degrees]C per 30s ).

2.8. Colorazione olio rosso O. Per la visualizzazione delle goccioline lipidiche, la LC è stata fissata in formaldeide al 4% (preparata di fresco da paraformaldeide) per 15 minuti, colorata in una soluzione colorante Oil Red O (soluzione allo 0,3% di Oil Red O) per 10 minuti e quindi lavata con PBS 2

3 volte. Le cellule sono state quindi catturate utilizzando una fotocamera per microscopio a fluorescenza Nikon Eclipse 80i.

2.9. Analisi statistiche. Le espressioni di mRNA rilevate mediante qRT-PCR sono state calcolate utilizzando il metodo [2.sup.-[DELTA][DELTA]CT] e normalizzate mediante l'espressione di [beta]-actina [29]. La variazione dell'espressione dell'mRNA tra diversi campioni è stata calcolata utilizzando SPSS (versione 18.0) (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Le differenze statistiche dei geni nei diversi gruppi sono state determinate mediante ANOVA e i dati sono stati presentati come deviazione standard media [+ o -] dei duplicati.

3.1. SLC erano presenti nei testicoli suini neonatali. Un certo numero di cellule a forma di fuso sono state trovate nell'interstizio testicolare nei testicoli suini postnatali di 7 giorni e 2 mesi di età mediante colorazione H&E (Figura 1 (a)). Inoltre, le analisi immunochimiche hanno mostrato che PDGFR[alfa] era principalmente espresso nell'interstizio testicolare nei suini di 7 giorni dopo la nascita, mentre l'espressione di PDGFR[alfa] era bassa nell'interstizio testicolare suino di 2 mesi (Figura 1( B)). Inoltre, l'espressione di Nestin nei testicoli suini di 7 giorni era significativamente superiore a quella nei testicoli di 2 mesi (P < 0,5) (Figura 1 (c)). Sulla base di questi risultati, abbiamo scelto di raccogliere SLC da suini di 7 giorni anziché suini di 2 mesi.

3.2. I LC isolati da interstizio testicolare suino hanno espresso marcatori di SLC. I LC primari sono stati ottenuti con il metodo di digestione (Figura 2 (a)). RT-PCR e analisi immunofluorescente sono state quindi utilizzate per caratterizzare queste cellule. Come mostrato nella Figura 2 (b), i risultati della RT-PCR hanno mostrato che i LC isolati esprimevano SLC o marcatori di cellule staminali pluripotenza (Nestin, PDGFR [alpha], GATA-4, Oct4 e LIFR) (Figura 2 (b)). Inoltre, non sono stati rilevati marcatori di cellule di Sertoli (SOX9) e cellule staminali spermatogoniali (PLZF) (Figura 2 (b)), indicando l'assenza di contaminazione con queste cellule in questi LC. I risultati hanno dimostrato che questo metodo di digestione era utile per rimuovere i tubuli seminiferi. Inoltre, i risultati della qRT-PCR hanno mostrato che le espressioni di LIFR e PDGFR[alfa] nei LC erano significativamente più alte di quelle nei testicoli suini (P < 0,5) (Figure 2(c) e 2(d)), indicando che questo metodo è stato in grado di arricchire SLC da testicoli suini. In sintesi, i LC primari isolati, che esprimono marcatori SLC (Nestin, PDGFR [alfa], GATA-4, Oct4 e LIFR), erano SLC putativi.

L'EDS è stato utilizzato per eliminare specificamente le LC differenziate nei testicoli di ratto e topo [4, 8]. Secondo i risultati del trattamento EDS, la percentuale di LC differenziati suini era di circa il 23% nei LC isolati primari e la purezza degli SLC suini primari isolati era superiore al 77% (Figure S1, S2, nel materiale supplementare disponibile online su https: //doi.org/10.1155/2017/2740272). Inoltre, i risultati della qRT-PCR delle espressioni di Nestin, PDGFR[alpha], CYP17A1 e l'analisi immunofluorescente di CYP17A1 hanno ulteriormente confermato che l'EDS potrebbe eliminare specificamente le LC differenziate nel suino (Figure S3, S4), il che era coerente con i risultati di tassi di sopravvivenza cellulare dopo il trattamento con EDS (Figura S2).

3.3. Questi SLC isolati hanno mostrato un alto potenziale clonogenico. Anche se gli SLC primari erano isolati, il loro sistema di coltura doveva ancora essere determinato. Nello studio attuale, il pTF è stato utilizzato come componente principale del mezzo. Sette giorni dopo, si sono formati un numero di cloni, che sono cresciuti dopo 2 settimane di coltura (Figura 3 (a)). L'analisi immunofluorescente ha mostrato che i cloni erano PDGFR [alfa] positivi (Figura 3 (b)). Le espressioni sia di Nestina che di LIFR erano più elevate negli SLC suini coltivati ​​con terreno pTF rispetto agli SLC senza coltura (P < 0,5) (Figura 5), ​​indicando che il pTF era in grado di sostenere il potenziale delle cellule staminali degli SLC.

3.4. Gli SLC isolati hanno mostrato la capacità di differenziazione spontanea in LC quando coltivati ​​in vitro. Le cellule isolate coltivate con un terreno di base non hanno formato cloni dopo 2 settimane (Figura 4 (a)) ed hanno espresso CYP17A1, un marcatore di LC differenziate di maiale (Figura 4 (b)). Inoltre, le espressioni sia di Nestin che di LIFR erano significativamente inferiori negli SLC suini coltivati ​​con il terreno di base per 2 settimane rispetto agli SLC senza coltura (P < 0,5) (Figura 5). L'espressione di CYP17A1 era significativamente più alta negli SLC suini coltivati ​​con il terreno di base per 2 settimane rispetto a quella degli SLC senza coltura (P < 0,5) (Figura 5). La colorazione Oil Red O ha mostrato che le cellule in coltura secernono goccioline lipidiche, che erano anche un marker di LC differenziati (Figura 6). Questi risultati hanno dimostrato che gli SLC primari isolati erano in grado di differenziarsi in linee LC quando coltivati ​​con il terreno di base, indicando che i presunti SLC avevano la capacità di differenziarsi spontaneamente in LC.

Diversi tipi di cellule erano essenziali per la spermatogenesi nel testicolo: cellule germinali, cellule di Sertoli, cellule mioidi peritubulari e ALC [30]. Gli ALC erano la principale fonte di secrezione di testosterone nei mammiferi, tuttavia, non erano in grado di proliferare. Il testosterone potrebbe diffondersi nelle cellule del Sertoli in modo da regolare indirettamente la spermatogenesi. Quando i processi di sintesi del testosterone erano disturbati, gli spermatidi postmeiotici erano significativamente ridotti o assenti [30]. Gli SLC erano quindi ideali per salvare l'infertilità causata dalla disfunzione dei LC. Inoltre, è stato dimostrato che gli SLC erano in grado di differenziarsi in ALC in vivo trapiantando il tessuto interstiziale incapsulato in alginato nel tessuto extra testicolare di ratto [31]. Pertanto, gli SLC dei mammiferi erano molto promettenti per la ricerca e l'uso clinico nell'infertilità maschile.

Recentemente, gli SLC sono stati isolati con successo da ratti, topi e umani, ma non dai maiali. Precedenti studi avevano dimostrato che diverse proteine ​​sono state rilevate in presunti SLC nell'interstizio testicolare di ratto, come Nestin, LIFR, PDGFR [alfa], CD90 e CD51 [11, 32]. Tuttavia, la maggior parte di questi sono stati espressi anche in altre cellule testicolari e hanno reso utili marcatori di SLC, poiché sono stati espressi in modo specifico per tempo e/o stadio. Ad esempio, Ge e i suoi colleghi hanno dimostrato che le cellule PDGFR[alfa]-positive e 3[beta]-HSD-negative nei ratti postnatali di 7 giorni erano presunte SLC [4]. Hanno quindi concluso che PDGFR[alfa] era un marker di SLC di ratto nella fase neonatale. In questo studio, sono stati identificati SLC e PDGFR [alfa] ha dimostrato di essere espresso negli SLC utilizzando la colorazione H&E e l'immunochimica. Inoltre, i risultati dell'immunochimica e dell'analisi qRT-PCR hanno mostrato che le espressioni sia di PDGFR[alfa] che di Nestina erano significativamente più alte nei suini postnatali di 7 giorni rispetto a quelli di 2 mesi (P < 0,5). Questi risultati hanno predetto che PDGFR [alfa] potrebbe essere utilizzato anche come marker di SLC suini neonatali e il punto di campionamento di 7 giorni era più adatto per isolare SLC rispetto ai 2 mesi di età nei suini.

Tuttavia, nessuno studio ha riportato l'isolamento di SLC suini. Nel ratto, le tecnologie di purificazione e immunoselezione Percoll sono state utilizzate per ottenere SLC da Ge et al. (2006) [4] e diversi studi hanno utilizzato topi transgenici per ottenere SLC murini [8, 9]. Nel presente studio, la digestione con collagenasi e ialuronidasi è stata utilizzata per isolare le cellule interstiziali del testicolo di maiale dai testicoli di maiale. Inoltre, la ialuronidasi potrebbe isolare singole cellule dalla superficie esterna dei tubuli seminiferi. Pertanto, il metodo utilizzato nel presente studio era più semplice e veloce rispetto ai metodi utilizzati nei topi e nei ratti.

Come altre cellule staminali, anche la proliferazione e la differenziazione delle SLC sono state regolate dal microambiente, che ha fornito fattori cellulari e proteine ​​vitali. Nei testicoli, alcuni tipi di cellule, come le cellule di Sertoli e le cellule mioidi peritubulari, secernono fattori nel liquido testicolare per regolare le attività delle SLC [33-35]. Poiché il sistema di coltura degli SLC suini non era stato sviluppato, tutti i fattori di interi testicoli sono stati estratti come pTF. Inizialmente, abbiamo ipotizzato che il pTF potesse mantenere il potenziale delle cellule staminali degli SLC suini quando aggiunto al terreno di coltura. I risultati di questo lavoro hanno mostrato che il pTF potrebbe effettivamente supportare il potenziale delle cellule staminali delle SLC per 2 settimane in vitro. Il pTF è stato in grado di mantenere le proprietà di autorinnovamento degli SLC, poiché l'origine del pTF era coerente con i presunti SLC. Inoltre, il pTF conteneva abbondanti ormoni, fattori di crescita, citochine e una grande quantità di proteine, che potrebbero fornire la base materiale necessaria per la proliferazione delle SLC [22, 36]. L'analisi immunofluorescente di PDGFR[alfa] ha anche dimostrato che le cellule che erano state coltivate per 2 settimane erano presunte SLC. Presi insieme, i risultati hanno indicato che il pTF potrebbe contribuire al mantenimento delle proprietà di autorinnovamento dei presunti SLC. Pertanto, la nostra ricerca futura sarà diretta a rivelare i componenti vitali per mantenere l'auto-rinnovamento degli SLC nel pTF.

C'erano due aree di innovazione del presente studio. Innanzitutto, ha fornito un metodo più semplice e veloce per ottenere gli SLC suini, che potrebbe fornire un serbatoio per la differenziazione del lignaggio LC. In secondo luogo, ha sviluppato un nuovo sistema di coltura a breve termine per SLC suini. Inoltre, come modello umano ideale, alcune indagini sulla tossicità dei farmaci umani di malattie sterili potrebbero essere valutate nel maiale in primo luogo, prima delle sperimentazioni sull'uomo, il che potrebbe ridurre la spesa delle indagini su nuovi farmaci.

Per riassumere, abbiamo isolato gli SLC suini e identificato alcune delle loro caratteristiche di base. Inoltre, il pTF potrebbe mantenere le caratteristiche degli SLC suini quando aggiunto al sistema di coltura. Questo lavoro potrebbe aiutarci a comprendere i meccanismi regolatori della proliferazione e differenziazione degli SLC e promette ulteriori studi relativi agli SLC suini.

L'attuale indirizzo di Chuanying Pan è College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, No. 22 Xinong Road, Yangling, Shaanxi 712100, Cina.

Gli autori dichiarano che non ci sono interessi in competizione per quanto riguarda la pubblicazione di questo documento.

Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto finanziato dalla China Postdoctoral Science Foundation (n. 2014M560809), dai Fundamental Research Funds for the Central Universities (NWSUAF, n. 2452015145) e dal National Basic Research Program of China (programma 973 n. 2014CB943100). Un ringraziamento speciale è dovuto al professor Yuan-Qiang Zhang (The Fourth Military Medical University, Cina) per la sua generosa donazione di EDS.

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Shuai Yu, Pengfei Zhang, Wuzi Dong, Wenxian Zeng e Chuanying Pan

College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi 712100, Cina

La corrispondenza deve essere indirizzata a Chuanying Pan [email protected]

Ricevuto il 26 agosto 2016 Accettato il 19 dicembre 2016 Pubblicato il 24 gennaio 2017

Redattore accademico: James Adjaye

Didascalia: FIGURA 1: Identificazione delle cellule staminali di Leydig (SLC) in situ. (a) Colorazione H&E di testicoli suini di 7 giorni e 2 mesi di età (bar = 50 [micro] m). (b) Analisi immunoistochimica di PDGFR[alfa] di testicoli suini di 7 giorni e 2 mesi di età (bar = 50 [micro]m) le punte di freccia nere indicavano le cellule PDGFR[alfa]-positive nell'interstizio testicolare. (c) espressione dell'mRNA di Nestina in testicoli di suino di 7 giorni e 2 mesi. Lettere diverse (A, B) indicano una differenza significativa (P < 0,05).

Didascalia: FIGURA 2: Identificazione di SLC suini. (a) Gli SLC primari isolati da testicoli suini di 7 giorni con l'aiuto di collagenasi di tipo IV (bar = 50 [micro] m). (b) Risultati RT-PCR di geni coinvolti nelle SLC del potenziale delle cellule staminali e della spermatogenesi, SLC primarie isolate di suino +, controllo positivo (testicoli suini di 7 giorni) -, controllo negativo (acqua sterile). (c e d) Espressioni di LIFR e PDGFR[alfa] in testicoli di maiale, cellule di Sertoli di maiale, cellule staminali di Spermatogonia di maiale e SLC primarie di maiale isolate come cambiamento di piega rispetto alla beta-actina Spermatogonia, cellule staminali di Spermatogonia. Lettere diverse (A, B) indicano una differenza significativa (P < 0,05).

Didascalia: FIGURA 3: Sviluppo morfologico e analisi di immunofluorescenza PDGFR[alfa] di SLC suini coltivate in terreno pTF (bar = 50 [micro]m). (a) Sviluppo morfologico di SLC suini coltivati ​​0 d, 1 w e 2 w in terreno pTF. (b) Immunofluorescenza PDGFR [alfa] di SLC suini coltivate in terreno pTF per 2 w.

Didascalia: FIGURA 4: Sviluppo morfologico e immunofluorescenza CYP17A1 di SLC suini coltivate in terreno basico. (a) Sviluppo morfologico di SLC suini coltivati ​​0 d, 1 w e 2 w in terreno di base. (b) Immunofluorescenza CYP17A1 di SLC suini coltivate in terreno basico per 2 settimane.

Didascalia: FIGURA 5: Espressioni di Nestina, LIFR e CYP17A1 di SLC suini coltivate in terreni diversi per 2 settimane. Nota: cellule primarie, gli SLC suini primari isolati. Lettere diverse (A, B, C) indicano una differenza significativa (P < 0,05).

Didascalia: FIGURA 6: Colorazione Oil Red O di LC di maiale dopo 7 giorni di coltura nel terreno di base (bar = 50 [micro] m).


Identificazione di cellule staminali di Leydig derivate da interstizio testicolare di maiale

Le cellule staminali di Leydig (SLC), situate nel compartimento interstiziale testicolare nei testicoli dei mammiferi, sono in grado di differenziarsi in cellule di Leydig (LC) che sintetizzano il testosterone, fornendo così una nuova strategia per il trattamento della carenza di testosterone. Tuttavia, nessun rapporto precedente ha identificato e coltivato SLC derivati ​​dal maiale. Lo scopo del presente studio era isolare, identificare e coltivare SLC dai suini. La colorazione con ematossilina ed eosina e l'analisi immunochimica hanno mostrato che erano presenti SLC e che PDGFRα è stato espresso principalmente nell'interstizio testicolare del maiale, indicando che PDGFRα era un marker per SLC nel suino neonatale. Inoltre, i risultati della PCR di trascrizione inversa hanno mostrato che i marcatori SLC erano espressi in LC primari isolati, indicando che erano SLC putativi. I presunti SLC sono stati successivamente coltivati ​​con un fluido testicolare di suinetti (pTF). I cloni si sono formati dopo 7 giorni e le cellule hanno espresso PDGFRα. Tuttavia, nessun clone è cresciuto in assenza di pTF, ma le cellule hanno espresso CYP17A1, indicando che il pTF potrebbe sostenere le caratteristiche degli SLC suini. Per riassumere, abbiamo isolato gli SLC suini e identificato le loro caratteristiche di base. Presi insieme, questi risultati possono aiutare a gettare le basi per la ricerca nell'applicazione clinica degli SLC suini.

1. Introduzione

Il testosterone non solo mantiene il processo di spermatogenesi, ma protegge anche la funzione dei tessuti androgeno-dipendenti [1, 2]. In quanto fonte primaria di sintesi e secrezione di testosterone nei testicoli dei mammiferi, le cellule di Leydig adulte (ALC) svolgono un ruolo essenziale nel mantenimento del movimento vitale [3]. Recentemente, è stato dimostrato che gli ALC derivano da cellule staminali di Leydig (SLC) [4]. Le SLC, che si trovano nel compartimento interstiziale vicino ai tubuli seminiferi nei testicoli dei mammiferi, sono uno dei più importanti tipi di cellule staminali somatiche [5, 6].

Gli SLC sono stati inizialmente identificati e arricchiti da testicoli di ratto neonatale da Ge et al.(2006) e ulteriori studi hanno dimostrato che i presunti SLC murini e umani avevano la capacità di differenziarsi in cellule che producono testosterone [4, 7, 8]. Secondo questi studi precedenti, sono state identificate alcune caratteristiche delle SLC [4, 9, 10]. In primo luogo, il numero di SLC di mammifero era abbastanza piccolo, ad esempio, una media di soli 8.500 SLC putativi sono stati ottenuti da un testicolo di ratto postnatale di 7 giorni [4]. In secondo luogo, gli SLC che risiedono sulla superficie esterna dei tubuli seminiferi nei testicoli di ratto erano in situ a forma di fuso [4, 10]. Inoltre, presunti SLC esprimevano il recettore LIF (LIFR), recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine α (PDGFRα), Nestin, Thy-1 e alcuni marcatori di cellule staminali, tuttavia, erano 3?-HSD- e recettore dell'ormone luteinizzante- (LHR-) negativo [4, 8, 10, 11]. Sfortunatamente, non sono stati condotti studi SLC in altri animali mammiferi, tranne che in ratti, topi e umani.

Con l'aumentare dell'età, il numero di LC funzionali diminuisce e si riduce la capacità di produzione di testosterone, produzione di cAMP e l'attività degli enzimi steroidogenici [12, 13]. Pertanto, le malattie dell'infertilità maschile possono verificarsi nei maschi più anziani a causa della disfunzione dei LC o del disturbo del testosterone [14, 15]. Attualmente, la sostituzione degli androgeni era la terapia più efficiente per salvare la carenza di testosterone, tuttavia, richiedeva trattamenti successivi e comportava rischi intrinseci [16]. Gli SLC avevano la capacità di auto-rinnovarsi e differenziarsi in LC, fornendo quindi una nuova strategia per il trattamento di queste malattie mediante il trapianto di SLC [17].

Il maiale aveva svolto un ruolo cruciale come modello di mammifero negli studi sulle malattie umane [18, 19]. Il testicolo di maiale era stato suggerito come "l'organo produttore di steroidi più versatile conosciuto" e ha fornito materiale importante per la ricerca sulla fisiologia e la genetica della steroidogenesi umana [20]. Tuttavia, gli SLC suini dovevano ancora essere isolati e arricchiti. Inoltre, le distinzioni di specie hanno complicato gli studi sugli SLC suini, dal momento che non era stata ottenuta una mappatura completa dei marcatori e dei sistemi di coltura degli SLC di ratto e topo rispetto agli SLC suini. Data l'importanza degli SLC suini nelle applicazioni cliniche, l'obiettivo di questo studio era isolare, identificare e coltivare SLC da testicoli di suino neonatale.

2. Materiali e metodi

2.1. Raccolta di testicoli suini

Lo studio è stato approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della Northwest A&F University in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health, Cina. Campioni di testicoli freschi di suini maschi di 7 giorni del gruppo dell'industria agricola Besun Co., Ltd. (Yangling, Shaanxi, Cina) sono stati trasportati al laboratorio in soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) integrata con 2% di penicillina-streptomicina ( P/S) soluzione (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) entro 1 h. Campioni di testicoli di suini maschi di 2 mesi sono stati raccolti da un allevamento di suini a Yangling, nella provincia dello Shaanxi, in Cina.

2.2. Isolamento di SLC suini

Un metodo di digestione enzimatica è stato utilizzato per ottenere SLC suini. I testicoli sono stati prima lavati e tritati dopo la rimozione dell'epididimo e della tunica albuginea. Quindi i frammenti testicolari sono stati sospesi in 0,75 mg/mL di collagenasi di tipo IV (Invitrogen) contenente il 5% (v/v) di siero fetale bovino (FBS, Gibco, UK) più DNasi I (100 μg/mL Bio Basic, Markham, Canada) e incubate, con agitazione costante a 34°C per 90 min [21]. Il 160 e il 59 μm reti di nylon monofilamento (Solarbio, Pechino, Cina) sono state quindi utilizzate per filtrare la sospensione cellulare [21]. Le cellule isolate sono state trattate con 1 mg/mL di ialuronidasi (Invitrogen) e centrifugate a 500

per 5 min a 20°C. Dopo 5 min di quiete, il lato superiore delle sospensioni è stato coltivato in terreno per altri 15 min di quiete. Le cellule sul lato superiore delle sospensioni sono state quindi raccolte. Infine, le LC isolate sono state coltivate nel mezzo eagle modificato di Dulbecco: miscela di nutrienti F-12 (DMEM/F12, Invitrogen).

2.3. Preparazione del liquido testicolare dei suinetti (pTF)

Il pTF e le LC primarie sono state derivate dalla stessa fonte. I testicoli di suini di 7 giorni sono stati tagliati in frammenti il ​​più piccoli possibile e il pTF è stato estratto mediante omogeneizzazione dei tessuti a 20°C [22]. Infine, il pTF è stato filtrato attraverso un 0.22 μm colino per degerminare.

2.4. Coltura di LC suini isolati

I precipitati di LC isolati sono stati risospesi in due mezzi: un mezzo di base e l'altro mezzo pTF (mezzo di base più 30% (v/v) pTF) [22]. Il terreno di base era costituito da DMEM/F12, 10% (v/v) FBS, 1% (v/v) P/S e 1% (v/v) di vitamine. Le LC sono state quindi incubate in un'atmosfera di 95% aria-5% CO2 a 34°C e coltivato per almeno 2 settimane. I mezzi di coltura venivano cambiati giornalmente.

2.5. Trattamento di etano dimetansolfonato (EDS)

L'EDS è stato fornito dal professor Yuanqiang Zhang (Dipartimento di anatomia umana, istologia ed embriologia, quarta università medica militare, Cina). Secondo i metodi precedenti, l'EDS è stato sciolto in dimetilsolfossido (DMSO)/acqua sterile (1 : 3, v/v) [23-25]. Successivamente, gli SLC primari isolati sono stati seminati in una piastra da 6 pozzetti e sono stati aggiunti rispettivamente 0, 0,5, 0,75 e 1,0 mg/mL di EDS (concentrazione finale) alla soluzione di coltura [24, 25]. L'analisi quantitativa della PCR in tempo reale (qRT-PCR) e dell'immunofluorescenza è stata eseguita 24 ore dopo il trattamento con EDS.

2.6. Colorazione ematossilina ed eosina (H&E) e analisi immunoistochimica

Campioni di testicolo di suini maschi di 7 giorni e 2 mesi sono stati fissati, disidratati e inclusi in paraffina. I tessuti inclusi in paraffina sono stati quindi sezionati a 5' μm utilizzando procedure standard e aderito a vetrini pre-rivestiti. Successivamente, è stata condotta la colorazione H&E delle sezioni incluse in paraffina per osservare l'istologia [26].

Per immunoistochimica, PDGFRα è stata determinata l'espressione nelle cellule interstiziali di testicoli suini di 7 giorni ed è stato determinato il tipo di queste cellule positive alla proteina. In dettaglio, le sezioni in paraffina sono state deparaffinate, reidratate e risciacquate in PBS. Quindi il recupero dell'antigene ha comportato l'ebollizione dei campioni in una soluzione di acido tris-etilendiamminotetraacetico 0,01 M (Tris-EDTA pH = 9,0) per 10 min. Le sezioni sono state incubate con siero d'asino 10% per 2 ore a 37°C, seguita da incubazione con anticorpi primari (anti-PDGFRα, 1 : 200, Abcam, Cambridge, UK) per una notte a 4°C e successiva incubazione con anticorpi biotinilati secondari (ZSGB-BIO, Cina) per 1 h a 37°C [27, 28]. Successivamente, è stata utilizzata la 3,3′-diaminobenzidina (DAB, ComWin Biotech, Cina) come cromogeno per rilevare l'espressione proteica.

Le caratteristiche delle cellule isolate sono state rilevate mediante colorazione con immunofluorescenza. Innanzitutto, le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% e permeabilizzate con Triton X-100 allo 0,05% per 15 minuti. Le cellule sono state quindi incubate con anticorpi primari a 4°C durante la notte, e poi per 2 ore con appropriati anticorpi secondari coniugati con Alexa Fluor 594 (1 : 400, Invitrogen, USA) a 37°C. Infine, le cellule sono state etichettate con 4,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 1 : 1000 Beyotime, Cina). Gli anticorpi primari utilizzati erano anti-PDGFR . di coniglioα (1 : 200, Abcam) e anti-CYP17A1 di topo (1 : 100, Santa Cruz, USA).

Tutte le immagini di tutte le colorazioni sono state acquisite utilizzando una fotocamera per microscopio a fluorescenza Nikon Eclipse 80i (Tokyo, Giappone).

2.7. Analisi qRT-PCR

L'RNA totale è stato estratto dalle cellule e dai tessuti dei testicoli suini utilizzando il reagente RNAiso Plus (TaKaRa, Dalian, Cina) secondo il protocollo raccomandato. Il cDNA è stato quindi sintetizzato per la PCR a trascrizione inversa (RT-PCR) utilizzando il kit di reagenti PrimeSript™ RT (TaKaRa). Per caratterizzare le cellule isolate sono stati utilizzati primer specifici (Tabella 1). Il sistema di reazione qRT-PCR era 20 μL in volume: 10 μL SYBR® Premiscela Ex Taq II (2x) (TaKaRa), 0.8 μLcDNA, 0,5 μL PCR Forward Primer (10 μmol/L), 0,5 μL PCR Reverse Primer (10 μmol/L) e ha aggiunto acqua sterile a un volume totale di 20 μLe condizioni della reazione di L. PCR erano le seguenti: denaturazione a 95°C per 3 min, seguita da 40 cicli di (95°C per 15 s, 60°C per 30 s e 72°C per 30 s).

2.8. Colorazione olio rosso O

Per la visualizzazione delle goccioline lipidiche, la LC è stata fissata in formaldeide al 4% (preparata di fresco da paraformaldeide) per 15 minuti, colorata in una soluzione colorante Oil Red O (soluzione allo 0,3% di Oil Red O) per 10 minuti e quindi lavata con PBS 2

3 volte. Le cellule sono state quindi catturate utilizzando una fotocamera per microscopio a fluorescenza Nikon Eclipse 80i.

2.9. Analisi statistiche

Le espressioni di mRNA rilevate mediante qRT-PCR sono state calcolate utilizzando il

metodo e normalizzato dall'espressione di?-actina [29]. La variazione dell'espressione dell'mRNA tra diversi campioni è stata calcolata utilizzando SPSS (versione 18.0) (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Le differenze statistiche dei geni nei diversi gruppi sono state determinate da ANOVA e i dati sono stati presentati come media ± deviazione standard dei duplicati.

3. Risultati

3.1. Gli SLC erano presenti nei testicoli suini neonatali

Un certo numero di cellule a forma di fuso sono state trovate nell'interstizio testicolare nei testicoli suini postnatali di 7 giorni e 2 mesi di età mediante colorazione H&E (Figura 1 (a)). Inoltre, analisi immunochimiche hanno mostrato che PDGFRα è stata espressa principalmente nell'interstizio testicolare nei suini postnatali di 7 giorni, mentre l'espressione di PDGFRα era basso nell'interstizio testicolare suino di 2 mesi (Figura 1 (b)). Inoltre, l'espressione di Nestin nei testicoli suini di 7 giorni era significativamente superiore a quello dei testicoli di 2 mesi (

) (Figura 1(c)). Sulla base di questi risultati, abbiamo scelto di raccogliere SLC da suini di 7 giorni anziché suini di 2 mesi.

3.2. I LC isolati dai marcatori espressi nell'interstizio testicolare suino di SLC

I LC primari sono stati ottenuti con il metodo di digestione (Figura 2 (a)). RT-PCR e analisi immunofluorescente sono state quindi utilizzate per caratterizzare queste cellule. Come mostrato nella Figura 2 (b), i risultati della RT-PCR hanno mostrato che i LC isolati esprimevano SLC o marcatori di cellule staminali pluripotenza (Nestin, PDGFRα, GATA-4, Oct4 e LIFR) (Figura 2(b)). Inoltre, non sono stati rilevati marcatori di cellule di Sertoli (SOX9) e cellule staminali spermatogoniali (PLZF) (Figura 2 (b)), indicando l'assenza di contaminazione con queste cellule in questi LC. I risultati hanno dimostrato che questo metodo di digestione era utile per rimuovere i tubuli seminiferi. Inoltre, i risultati della qRT-PCR hanno mostrato che le espressioni di LIFR e PDGFRα nei LC erano significativamente più alti di quelli nei testicoli suini ( ) (Figure 2(c) e 2(d)), indicando che questo metodo era in grado di arricchire gli SLC dai testicoli suini. In sintesi, i LC primari isolati, che esprimono marcatori SLC (Nestin, PDGFRα, GATA-4, Oct4 e LIFR), erano presunti SLC.

L'EDS è stato utilizzato per eliminare specificamente le LC differenziate nei testicoli di ratto e topo [4, 8]. Secondo i risultati del trattamento EDS, la percentuale di LC differenziati suini era di circa il 23% nei LC isolati primari e la purezza degli SLC suini isolati primari era superiore al 77% (Figure

, , in Materiale Supplementare disponibile online all'indirizzo https://doi.org/10.1155/2017/2740272). Inoltre, i risultati della qRT-PCR di Nestin, PDGFRα, CYP17A1 espressioni e l'analisi immunofluorescente del CYP17A1 ha ulteriormente confermato che l'EDS potrebbe eliminare specificamente le LC differenziate nel suino (Figure

), che era coerente con i risultati dei tassi di sopravvivenza cellulare dopo il trattamento con EDS (Figura ).

3.3. Questi SLC isolati hanno mostrato un alto potenziale clonogenico

Anche se gli SLC primari erano isolati, il loro sistema di coltura doveva ancora essere determinato. Nello studio attuale, il pTF è stato utilizzato come componente principale del mezzo. Sette giorni dopo, si sono formati un numero di cloni, che sono cresciuti dopo 2 settimane di coltura (Figura 3 (a)). L'analisi immunofluorescente ha mostrato che i cloni erano PDGFRα positivo (Figura 3(b)). Le espressioni di entrambi Nestin e LIFR erano più alti negli SLC suini coltivati ​​con terreno pTF rispetto agli SLC senza coltura ( ) (Figura 5), ​​indicando che il pTF era in grado di sostenere il potenziale delle cellule staminali degli SLC.

3.4. Gli SLC isolati hanno mostrato la capacità di differenziazione spontanea in LC quando coltivati ​​in vitro

Le cellule isolate coltivate con un terreno di base non hanno formato cloni dopo 2 settimane (Figura 4 (a)) ed hanno espresso CYP17A1, un marcatore di LC differenziate di maiale (Figura 4 (b)). Inoltre, le espressioni di entrambi Nestin e LIFR erano significativamente inferiori negli SLC suini coltivati ​​con il terreno di base per 2 settimane rispetto agli SLC senza coltura ( ) (Figura 5). L'espressione di CYP17A1 era significativamente più alto negli SLC suini coltivati ​​con il terreno di base per 2 settimane rispetto a quello degli SLC senza coltura ( ) (Figura 5). La colorazione Oil Red O ha mostrato che le cellule in coltura secernono goccioline lipidiche, che erano anche un marker di LC differenziati (Figura 6). Questi risultati hanno dimostrato che gli SLC primari isolati erano in grado di differenziarsi in linee LC quando coltivati ​​con il terreno di base, indicando che i presunti SLC avevano la capacità di differenziarsi spontaneamente in LC.

4. Discussione

Diversi tipi di cellule erano essenziali per la spermatogenesi nel testicolo: cellule germinali, cellule di Sertoli, cellule mioidi peritubulari e ALC [30]. Gli ALC erano la principale fonte di secrezione di testosterone nei mammiferi, tuttavia, non erano in grado di proliferare. Il testosterone potrebbe diffondersi nelle cellule del Sertoli in modo da regolare indirettamente la spermatogenesi. Quando i processi di sintesi del testosterone erano disturbati, gli spermatidi postmeiotici erano significativamente ridotti o assenti [30]. Gli SLC erano quindi ideali per salvare l'infertilità causata dalla disfunzione dei LC. Inoltre, è stato dimostrato che gli SLC erano in grado di differenziarsi in ALC in vivo trapiantando il tessuto interstiziale incapsulato in alginato nel tessuto extra testicolare di ratto [31]. Pertanto, gli SLC dei mammiferi erano molto promettenti per la ricerca e l'uso clinico nell'infertilità maschile.

Recentemente, gli SLC sono stati isolati con successo da ratti, topi e umani, ma non dai maiali. Precedenti studi avevano dimostrato che diverse proteine ​​sono state rilevate in presunti SLC nell'interstizio testicolare di ratto, come Nestin, LIFR, PDGFRα, CD90 e CD51 [11, 32]. Tuttavia, la maggior parte di questi sono stati espressi anche in altre cellule testicolari e hanno reso utili marcatori di SLC, poiché sono stati espressi in modo specifico per tempo e/o stadio. Ad esempio, Ge e i suoi colleghi hanno dimostrato che il PDGFRα-positivo e 3?-Le cellule HSD-negative nei ratti postnatali di 7 giorni erano presunte SLC [4]. Hanno poi concluso che PDGFRα era un marker di SLC di ratto nella fase neonatale. In questo studio, sono stati identificati SLC e PDGFRα ha dimostrato di essere espresso negli SLC utilizzando la colorazione H&E e l'immunochimica. Inoltre, i risultati dell'immunochimica e dell'analisi qRT-PCR hanno mostrato che le espressioni di entrambi PDGFRα e Nestin erano significativamente più alti nei suini di 7 giorni dopo la nascita rispetto a quelli di 2 mesi ( ). Questi risultati hanno predetto che PDGFRα potrebbe anche essere usato come marker di SLC suini neonatali e il punto di campionamento di 7 giorni era più adatto per isolare SLC rispetto ai 2 mesi di età nei suini.

Tuttavia, nessuno studio ha riportato l'isolamento di SLC suini. Nel ratto, le tecnologie di purificazione e immunoselezione Percoll sono state utilizzate per ottenere SLC da Ge et al. (2006) [4] e diversi studi hanno utilizzato topi transgenici per ottenere SLC murini [8, 9]. Nel presente studio, la digestione con collagenasi e ialuronidasi è stata utilizzata per isolare le cellule interstiziali del testicolo di maiale dai testicoli di maiale. Inoltre, la ialuronidasi potrebbe isolare singole cellule dalla superficie esterna dei tubuli seminiferi. Pertanto, il metodo utilizzato nel presente studio era più semplice e veloce rispetto ai metodi utilizzati nei topi e nei ratti.

Come altre cellule staminali, anche la proliferazione e la differenziazione delle SLC sono state regolate dal microambiente, che ha fornito fattori cellulari e proteine ​​vitali. Nei testicoli, alcuni tipi di cellule, come le cellule di Sertoli e le cellule mioidi peritubulari, secernono fattori nel liquido testicolare per regolare le attività degli SLC [33-35]. Poiché il sistema di coltura degli SLC suini non era stato sviluppato, tutti i fattori di interi testicoli sono stati estratti come pTF. Inizialmente, abbiamo ipotizzato che il pTF potesse mantenere il potenziale delle cellule staminali degli SLC suini quando aggiunto al terreno di coltura. I risultati di questo lavoro hanno mostrato che il pTF potrebbe effettivamente supportare il potenziale delle cellule staminali delle SLC per 2 settimane in vitro. Il pTF è stato in grado di mantenere le proprietà di autorinnovamento degli SLC, poiché l'origine del pTF era coerente con i presunti SLC. Inoltre, il pTF conteneva abbondanti ormoni, fattori di crescita, citochine e una grande quantità di proteine, che potrebbero fornire la base materiale necessaria per la proliferazione delle SLC [22, 36]. L'analisi immunofluorescente del PDGFRα ha anche dimostrato che le cellule che erano state coltivate per 2 settimane erano presunte SLC. Presi insieme, i risultati hanno indicato che il pTF potrebbe contribuire al mantenimento delle proprietà di autorinnovamento dei presunti SLC. Pertanto, la nostra ricerca futura sarà diretta a rivelare i componenti vitali per mantenere l'auto-rinnovamento degli SLC nel pTF.

C'erano due aree di innovazione del presente studio. Innanzitutto, ha fornito un metodo più semplice e veloce per ottenere gli SLC suini, che potrebbe fornire un serbatoio per la differenziazione del lignaggio LC. In secondo luogo, ha sviluppato un nuovo sistema di coltura a breve termine per SLC suini. Inoltre, come modello umano ideale, alcune indagini sulla tossicità dei farmaci umani di malattie sterili potrebbero essere valutate nel maiale in primo luogo, prima delle sperimentazioni sull'uomo, il che potrebbe ridurre la spesa delle indagini su nuovi farmaci.

5. Conclusioni

Per riassumere, abbiamo isolato gli SLC suini e identificato alcune delle loro caratteristiche di base. Inoltre, il pTF potrebbe mantenere le caratteristiche degli SLC suini quando aggiunto al sistema di coltura.Questo lavoro potrebbe aiutarci a comprendere i meccanismi regolatori della proliferazione e differenziazione degli SLC e promette ulteriori studi relativi agli SLC suini.

Divulgazione

L'attuale indirizzo di Chuanying Pan è College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, No. 22 Xinong Road, Yangling, Shaanxi 712100, Cina.

Interessi conflittuali

Gli autori dichiarano che non ci sono interessi in competizione per quanto riguarda la pubblicazione di questo documento.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto finanziato dalla China Postdoctoral Science Foundation (n. 2014M560809), dai Fundamental Research Funds for the Central Universities (NWSUAF, n. 2452015145) e dal National Basic Research Program of China (programma 973 n. 2014CB943100). Un ringraziamento speciale è dovuto al professor Yuan-Qiang Zhang (The Fourth Military Medical University, Cina) per la sua generosa donazione di EDS.

Materiali supplementari

L'EDS è stato utilizzato per eliminare le LC differenziate nelle cellule primarie isolate in questo studio. Come mostrato nella Figura S1, una parte delle cellule primarie morte quando incubate con diverse concentrazioni di EDS (0, 0,5, 0,75 e 1,0 mg/mL). La percentuale di cellule morte era di circa il 23%, il che ha mostrato che la percentuale di LC differenziati era di circa il 23% e la purezza degli SLC suini primari isolati era superiore al 77% (Figura S1, S2). Quindi i risultati della qRT-PCR hanno mostrato che le espressioni di Nestin e CYP17A1 erano statisticamente significativi nel gruppo trattato con EDS 1,0 mg/mL rispetto al gruppo di controllo, che prevedeva che 1,0 mg/mL fosse la migliore concentrazione di trattamento di EDS in questo studio (Figura S3). Alla base di questo risultato, è stata utilizzata l'analisi immunofluorescente per rilevare l'espressione di CYP17A1 nelle cellule primarie prima e dopo il trattamento con EDS. Come mostrato nella Figura S4, la percentuale di cellule positive al CYP17A1 era di circa il 25% prima del trattamento con EDS, il che era coerente con la percentuale di cellule morte. Nel frattempo, le strutture di membrana delle cellule positive al CYP17A1 sono state rotte dopo il trattamento con EDS, prevedendo che l'EDS potrebbe eliminare le LC differenziate suini in questo studio (Figura S4).

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Diritto d'autore

Copyright © 2017 Shuai Yu et al. Questo è un articolo ad accesso aperto distribuito sotto la Creative Commons Attribution License, che consente l'uso, la distribuzione e la riproduzione senza restrizioni con qualsiasi mezzo, a condizione che l'opera originale sia adeguatamente citata.


Qual è la differenza morfologica tra le cellule di Leydig nell'uomo e nei suini? - Biologia

Astratto

Lo scopo del nostro studio è stato quello di dimostrare se le cellule isolate dai testicoli di pazienti sottoposti a orchiectomia bilaterale per carcinoma prostatico sono in grado di crescere in vitro e, in tal caso, sono funzionalmente attive. L'immunochimica è stata eseguita per mostrare lo stato funzionale delle cellule umane in coltura. In dettaglio, è stata dimostrata l'immunolocalizzazione dei recettori dell'ormone luteinizzante (LHR), dei mitocondri e degli elementi del citoscheletro. Inoltre, è stato utilizzato un test radioimmunologico per misurare la secrezione di testosterone da parte delle cellule di Leydig coltivate. Utilizzando il contrasto di interferenza Nomarski e l'analisi di immunofluorescenza fine, l'immunocolorazione positiva per LHR è stata osservata in quasi tutte le cellule di Leydig, tuttavia era di varia intensità nelle singole cellule. La misurazione del testosterone ha rivelato una differenza significativa tra la secrezione di testosterone da parte delle cellule di Leydig stimolate con hCG e non stimolate (p<0.05). Inoltre, i livelli di testosterone erano significativamente più alti nelle colture di 24 e 48 ore rispetto a quelle di 72 ore (p<0.05). L'analisi morfologica delle cellule di Leydig in coltura ha rivelato la presenza di cellule mononucleate e multinucleate. Queste ultime cellule si sono verificate sia in colture stimolate con hCG che non stimolate. Nelle cellule di Leydig marcate con un marcatore molecolare MitoTtracker, è stata osservata un'abbondanza di mitocondri e una distribuzione tipica di microtubuli e microfilamenti indipendentemente dal numero di nuclei all'interno della cellula, suggerendo che non ci sono differenze funzionali tra cellule di Leydig umane mono e multinucleate in vitro. Poiché la percentuale di cellule multinucleate era simile sia nelle colture stimolate con hCG che in quelle non stimolate (23,70% e 22,80%), rispettivamente, l'aspetto di queste popolazioni cellulari sembra essere indipendente dalla stimolazione ormonale

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Ipoplasia delle cellule di Leydig

Ipoplasia delle cellule di Leydig (LCH) è un disturbo che compromette lo sviluppo sessuale maschile. Provoca lo sviluppo incompleto delle cellule di Leydig, che sono cellule nei testicoli ( testicoli ) che secernono ormoni sessuali maschili (androgeni). Questi ormoni sono necessari per il normale sviluppo sessuale maschile durante la formazione degli organi riproduttivi (prima della nascita) e durante la pubertà. Un maschio genetico con LCH ha i tipici cromosomi maschili (46, XY), ma a causa dei bassi livelli di androgeni, può avere una serie di differenze genitali. [1] [2] [3]

In un maschio genetico con LCH, i genitali esterni potrebbero non sembrare chiaramente maschili o femminili (genitali ambigui). Le caratteristiche specifiche della LCH possono includere un pene piccolo (micropene), un'apertura dell'uretra (foro) sul lato inferiore del pene piuttosto che sulla punta (ipospadia) e uno scroto diviso in due metà (scroto bifido). Una persona con una forma grave di LCH può avere solo genitali esterni femminili e piccoli testicoli ritenuti (localizzati nella pelvi, nell'addome o nell'inguine). [1] [3] I maschi con LCH grave possono non sviluppare caratteristiche sessuali secondarie durante la pubertà, come l'aumento dei peli sul corpo, i peli del viso e una voce più profonda. [2]

LCH è causato da mutazioni nel LHCGR gene e l'ereditarietà è autosomica recessiva. [1] [2] Non esiste un trattamento standard per LCH. Il trattamento dipende dalle caratteristiche e dalla gravità di ogni persona e può includere un intervento chirurgico di terapia ormonale per i testicoli ritenuti, la rimozione dei testicoli o per correggere le differenze genitali e la tecnologia di riproduzione assistita per l'infertilità. [3] [4] Un team di specialisti spesso lavora insieme per identificare le opzioni di trattamento per una persona con LCH.

Di nota: Anche le femmine genetiche (46, XX) possono ereditare le mutazioni che causano LCH nei maschi. Le femmine genetiche con queste mutazioni hanno genitali esterni femminili normali e sviluppo femminile normale durante la pubertà, ma possono avere amenorrea (periodi assenti) e infertilità. [5]


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