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Regolazione della struttura della cromatina

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Recentemente, ho rivisto i diversi livelli di struttura della cromatina. Il livello primario sono i nucleosomi, dove il DNA è legato agli istoni e ha una somiglianza strutturale con "perline su un filo". Il livello secondario è una fibra da 30 nm e il livello terziario è formato avvolgendo radialmente le fibre.

Ho anche imparato a conoscere il codice dell'istone e come le diverse modifiche agli istoni centrali si riferiscono alla regolazione trascrizionale. Queste modifiche sono il meccanismo di regolazione primario per la struttura della cromatina? In altre parole, la cromatina assume la struttura più compatta possibile fino a quando non vengono apportate modifiche istoniche per consentire la trascrizione? Oppure sono stati scoperti e caratterizzati altri meccanismi regolatori non correlati alla trascrizione?


"Sono queste modifiche il meccanismo di regolazione primario per la struttura della cromatina?"

Dipende da come si definisce il primario, attualmente potremmo pensare alle modificazioni degli istoni come primarie perché altri meccanismi regolatori non sono stati ancora ben studiati. Un'altra cosa a cui puoi pensare sono le varie proteine ​​​​regolatrici che interagiscono con i segni dell'istone per modificare la cromatina.

Non penso che dovresti immaginare che la cromatina assuma "la struttura più compatta possibile fino a quando non vengono apportate modifiche istoniche per consentire la trascrizione" ma piuttosto che le modifiche istoniche sono un processo dinamico con vari fattori di trascrizione (una classe di proteine) che entrano e aggiungono / rimuovono segni di istoni e "rimodellamento della cromatina" (aggiunta/rimozione di nucleosomi)

Come nota a margine, non credo si sappia molto sullo stadio terziario che hai menzionato inizialmente, quindi forse potrebbe svolgere un ruolo enorme nei meccanismi di regolazione della struttura della cromatina, ma non è stato ben esplorato.


Regolazione della struttura della cromatina e dell'espressione genica

L'obiettivo a lungo termine del mio laboratorio è acquisire una comprensione molecolare dei processi epigenetici che regolano la struttura della cromatina e l'espressione genica. A tal fine abbiamo identificato una nuova chinasi tandem in Drosophila, JIL-1, che si localizza specificamente nelle regioni interbande geniche dei cromosomi politenici larvali, fosforila l'istone H3S10 e si arricchisce quasi del doppio sulla larva maschio trascrizionalmente iperattiva cromosoma X del politene. Negli ipomorfi JIL-1 le regioni interbande ordinate dei cromosomi politenici sono interrotte e i bracci cromosomici sono altamente condensati. La variegatura dell'effetto di posizione (PEV) in Drosophila è servita come un importante paradigma per l'identificazione e l'analisi genetica dei determinanti evolutivamente conservati della regolazione epigenetica della struttura della cromatina e del silenziamento genico e forniamo prove che gli alleli con perdita di funzione dell'istone JIL-1 La chinasi H3S10 può agire sia come soppressore che come potenziatore della PEV a seconda dell'ambiente della cromatina del locus reporter. Questi effetti sulla PEV sono stati correlati con la diffusione dei principali marcatori di eterocromatina dmH3K9 e HP1 in sedi ectopiche sui bracci del cromosoma con la sovraregolazione più pronunciata riscontrata sui cromosomi X maschili e femminili. Sulla base di questi risultati proponiamo un modello in cui l'attività della chinasi JIL-1 e la fosforilazione dell'istone H3S10 in corrispondenza dell'interfase funzionano per antagonizzare l'eterocromatizzazione regolando un equilibrio dinamico tra fattori che promuovono la repressione e l'attivazione dell'espressione genica.

Il silenziamento genico è un processo di sviluppo critico rilevante per molti problemi di salute umana che includono il cancro. Inoltre, JIL-1 è l'omologo della Drosophila della chinasi MSK1 dei mammiferi che funziona anche come regolatore della struttura della cromatina fosforilando il residuo dell'istone H3S10. Attualmente gli studi sui mammiferi sono stati diretti all'analisi della fosforilazione degli istoni nel contesto della trascrizione genica immediata e precoce. Tuttavia, i nostri risultati suggeriscono che il concetto di fosforilazione dell'istone dovrebbe essere ampliato per essere considerato anche nel contesto della regolazione del silenziamento genico. Pertanto, i nostri studi serviranno a fornire approfondimenti generali sui meccanismi molecolari di come l'attività della chinasi modula la struttura della cromatina e la regolazione genica che sono direttamente rilevanti per l'uomo.


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Principi del legame metabolico con l'epigenetica

Nonostante le difficoltà nella comprensione completa dei ruoli dipendenti dal contesto dell'asse epigenetico del metabolismo e della complessità delle vie metaboliche e delle modificazioni della cromatina da esse regolate, ci sono diversi principi universali alla base di questo dialogo incrociato, che dimostrano l'emergere evolutivo di specifici meccanismi molecolari che facilitano le dinamiche epigenomiche sotto alterazioni metaboliche.

La capacità delle modificazioni epigenetiche di rispondere alle fluttuazioni delle attività metaboliche è una conseguenza dei parametri termodinamici e cinetici intrinseci degli enzimi che modificano la cromatina (Box 1). L'aggiunta e la rimozione della maggior parte di queste modifiche sono catalizzate da enzimi (cioè ‘writers’ e 𠆎rasers’) che utilizzano metaboliti come substrati o cofattori (cioè metaboliti che modificano la cromatina (Figura 1)). Enzimi modificatori della cromatina che utilizzano substrati metaboliti le cui concentrazioni fisiologiche sono vicine o inferiori a quelle degli enzimi’ K intrinsecom e KD valori [G] sono più suscettibili alle alterazioni delle vie metaboliche rispetto a quelli i cui substrati sono presenti in quantità eccessive 13 . Questa proprietà consente quindi alle fluttuazioni metaboliche di influenzare le attività di alcuni enzimi modificatori della cromatina e di modulare i livelli di specifiche modificazioni epigenetiche, e la differenza nelle disponibilità di substrato e nei valori di Km può determinare la sensibilità relativa delle modificazioni epigenetiche alle alterazioni metaboliche 24,25 (Box 1 ). D'altra parte, possono essere aggiunte anche modificazioni della cromatina non enzimatiche, le cui proprietà cinetiche e termodinamiche dettagliate sono meno ben caratterizzate ma sono influenzate in una certa misura dalla legge dell'azione di massa.

L'abbondanza di metaboliti che modificano la cromatina è regolata a livello intracellulare da diversi meccanismi. I metaboliti assorbiti dalle cellule possono diffondersi passivamente o attivamente attraverso il plasma e la membrana nucleare per modificare la cromatina. In alternativa, i metaboliti possono essere processati internamente dall'attività di enzimi metabolici che li convertono in substrati o cofattori per enzimi di rimodellamento della cromatina. Questi enzimi possono anche traslocare nel nucleo dove possono produrre localmente substrati per la modificazione della cromatina. La conseguenza risultante dell'abbondanza di metaboliti sulla velocità di modificazione della cromatina dipende dai parametri cinetici e termodinamici dell'enzima. Gli enzimi con rapporti iniziali [S]/Km sulla parte lineare evidenziata della curva visualizzata sono più suscettibili alle perturbazioni delle concentrazioni di substrato — questi includono metiltransferasi e acetiltransferasi, tra gli altri. Infine, una volta che le modifiche sono state depositate, le proteine ​​effettrici possono riconoscerle e legarle utilizzando specifici moduli di legame proteico, sui quali determinano una varietà di destini intracellulari tra cui la regolazione dell'omeostasi, lo sviluppo, la regolazione immunitaria e la tumorigenesi.

Casella 1:

Proprietà cinetiche e termodinamiche degli enzimi modificanti la cromatina

Le velocità delle reazioni enzimatiche dipendono da molti fattori inclusi parametri enzimatici intrinseci come il numero di turnover e la costante di Michaelis–Menten (Km) valori, abbondanza di enzimi, substrati, cofattori e attivatori o inibitori allosterici e altri fattori ambientali come pH, temperatura e viscosità locale. Queste variabili insieme determinano la velocità complessiva della reazione attraverso una relazione quantitativa che dipende dal meccanismo molecolare della reazione enzimatica 236 . Gli studi che descrivono la biochimica e la biologia strutturale degli enzimi che modificano la cromatina hanno fornito informazioni cruciali sui loro meccanismi catalitici e regolatori. I meccanismi cinetici degli enzimi coinvolti nella metilazione del DNA, nell'acetilazione dell'istone e nella metilazione dell'istone sono stati ampiamente studiati in particolare quando si tratta di problemi relativi allo sviluppo di farmaci, dimostrando che l'esatto meccanismo catalitico per ciascun enzima modificante la cromatina è diverso e in gran parte dipendente dal contesto (vedere la figura ). Ad esempio, le acetiltransferasi dell'istone PCAF e GCN5 mostrano un meccanismo catalitico ternario ordinato in cui l'acetil-CoA si lega all'enzima prima del peptide dell'istone, che è seguito dal rilascio dell'istone acetilato e, infine, dalla molecola di CoA 237�. Al contrario, p300 e HAT8 funzionano attraverso un meccanismo ping-pong che inizia con il legame dell'acetil-CoA e termina con il rilascio dell'istone acetilato 240.241. Infine, è stata osservata una cinetica ternaria casuale nell'istone acetiltransferasi Rtt109 242 di lievito.

Data la diversità dei meccanismi catalitici degli enzimi che modificano la cromatina e la variabilità dei parametri cinetici enzimatici specifici, è probabile che le modificazioni epigenetiche mostrino specificità a causa di questi diversi meccanismi. Le proprietà termodinamiche e cinetiche delle modificazioni epigenetiche dipendono dal tipo di modificazione, dal corrispondente enzima modificante la cromatina, dal locus genomico specifico e dall'abbondanza di regolatori e cofattori allosterici. Questa variabilità si traduce in dinamiche distinte di deposizione e turnover in risposta alle perturbazioni del metabolismo. Mirare direttamente a queste modificazioni epigenetiche ha dimostrato che la dinamica dell'acetilazione dell'istone è in generale più veloce dei cambiamenti in quella del DNA e della metilazione dell'istone 243 e che l'acetilazione e la deacetilazione avvengono nell'arco di pochi minuti. in vivo 244.245. La metilazione dell'istone e del DNA, invece, sono più stabili rispetto all'acetilazione, che potrebbe costituire un tipo di memoria epigenetica in risposta a perturbazioni più forti ma transitorie 243 . Un ulteriore livello di complessità deriva dall'affinità eterogenea e dall'attività dei modificatori della cromatina verso diverse modificazioni della cromatina 246 e diversi loci genomici 247.248. Variazione nell'abbondanza dei metaboliti che modificano la cromatina e K . apparentem valori in cellule e tessuti diversi potrebbero quindi portare a eterogeneità nella sensibilità dei segni epigenetici alle alterazioni metaboliche in contesti diversi.

Esistono diversi meccanismi aggiuntivi che consentono la regolazione efficiente e precisa delle modificazioni della cromatina catalizzate da enzimi dall'attività metabolica. Enzimi metabolici coinvolti nella sintesi di metaboliti che modificano la cromatina, come acetil-CoA e S-adenosilmetionina (SAM), può essere in grado di localizzarsi nel nucleo e interagire con i nucleosomi e gli enzimi che modificano la cromatina per produrre in modo efficiente metaboliti in specifici loci genomici 26� . I livelli di metaboliti che modificano la cromatina, come il SAM, sono controllati da molteplici meccanismi, inclusi entrambi gli input ambientali come la disponibilità di nutrienti e i pozzi intracellulari di gruppi metilici [G] che consumano SAM 33� . I sink di gruppo metilico sono mediati da enzimi che metabolizzano il SAM, consentendo loro di deviare i gruppi metilici lontano da enzimi come l'istone metiltransferasi, influenzando così la loro attività. Questi meccanismi forniscono vie per il controllo dei livelli dei metaboliti e quindi per la cromatina per rilevare lo stato metabolico intracellulare.

Le modificazioni epigenetiche influenzano i programmi trascrizionali attraverso vari meccanismi (Box 2). Tutti questi risultati possono essere potenzialmente influenzati dalla regolazione metabolica dell'epigenoma. Inoltre, studi recenti hanno scoperto che i compartimenti della cromatina con diversa attività trascrizionale possono segregarsi in organelli privi di membrana attraverso la separazione della fase liquida. [G] in risposta alle modificazioni della cromatina, stabilendo domini cromatinici distinti con modelli di regolazione distinti. L'eterocromatina trascrizionalmente inattiva può formare goccioline liquide separate in fase interagendo con la proteina eterocromatina 1 (HP1) che riconosce e si lega alla modifica dell'istone H3K9me, consentendo alla cromatina di condensarsi stabilmente all'interno di queste goccioline 36� . D'altra parte, le regioni della cromatina attiva, come quelle che contengono acetilazione dell'istone, potenziatori [G] e super-potenziatori [G] , sono anche in grado di separarsi in fase interagendo con proteine ​​leganti come il bromodomain [G] -contenenti proteine ​​39� . Si è scoperto che effetti simili che promuovono la separazione di fase sono mediati dall'interazione tra n 6-metiladenosina (m 6 A) nell'mRNA e nelle proteine ​​YTHDF che legano m 6 A 42 . Sebbene sia una questione aperta se la separazione di fase della cromatina sia regolata dal metabolismo, questi risultati suggeriscono che la capacità della cromatina di separarsi in fase all'interno delle cellule può essere regolata da modificazioni epigenetiche derivate da metaboliti e potrebbe essere sensibile al metabolismo cellulare. Inoltre, è stato dimostrato che la separazione di fase di altre biomolecole concentra le molecole in una certa fase per attivare i processi di segnalazione biochimica 43 . Non è noto se la separazione di fase della cromatina determini anche la localizzazione dei metaboliti e l'attivazione o l'inibizione delle reazioni di modificazione della cromatina in una fase specifica, ma potenzialmente funge da meccanismo aggiuntivo per il controllo preciso dei livelli di metaboliti locali e delle modifiche della cromatina.

Riquadro 2:

Influenze delle modificazioni epigenetiche sulla struttura della cromatina e sull'espressione genica

I primi indizi che suggeriscono le conseguenze funzionali di particolari modificazioni epigenetiche sono il loro arricchimento locus-specifico e l'associazione con i livelli di espressione genica e la regolazione genica. Sebbene non implichino in modo conclusivo la causalità, questi risultati sono stati utilizzati per teorizzare l'esistenza di un 𠆌odice istonico’, che postula che la presenza e la combinazione di specifiche modificazioni del DNA e dell'istone si leghino alla regolazione dei programmi trascrizionali e degli eventi di espressione genica 249 . Gli studi negli ultimi decenni hanno rivelato due modi principali per le modifiche epigenetiche di regolare l'espressione genica: modificando la struttura della cromatina locale o influenzando il reclutamento di effettori proteici non istonici nella cromatina250. La cromatina può essere approssimativamente classificata in due categorie in base alle loro proprietà strutturali e biochimiche: eterocromatina condensata, trascrizionalmente silenziata ed eucromatina decondensata e trascritta attivamente. La formazione di eterocromatina ed eucromatina dipende dall'esistenza di modificazioni epigenetiche. L'acetilazione dell'istone, tipicamente arricchita in eucromatina, è in grado di neutralizzare la carica positiva del residuo di lisina modificata, interrompendo così l'interazione tra istone e DNA e determinando una struttura della cromatina aperta che facilita la trascrizione attiva. L'eterocromatina è tipicamente arricchita dalla trimetilazione dell'istone 3 lisina 9 (H3K9me3), che è legata alla proteina eterocromatina 1 (HP1) che promuove la compattazione e la diffusione dell'eterocromatina 251 e innesca la separazione della fase liquida formando oligomeri 38 .

Le affinità di legame della cromatina di una pletora di proteine, inclusi fattori di trascrizione, rimodellatori della cromatina e componenti del meccanismo di trascrizione, possono essere modulate da queste modifiche. Ciò è meglio dimostrato dalla presenza di moduli leganti la cromatina ‘reader’ in queste proteine, come i cromodomini e le dita PHD che riconoscono e si legano agli istoni metilati, e i bromodomini e i domini YEATS che si legano agli istoni acetilati 252,253. È stato ipotizzato che l'associazione tra H3K4me3 e la trascrizione attiva sia largamente mediata dal legame di H3K4me3 da parte del dito PHD della subunità TAF3 di TFIID, un componente del complesso di pre-inizio della RNA polimerasi 254 . È stato recentemente dimostrato che la metilazione del DNA riduce l'affinità di legame della maggior parte dei fattori di trascrizione mentre promuove il legame delle proteine ​​contenenti PHD attraverso interazioni idrofobiche con la citosina metilata 255. Recentemente sono stati identificati anche lettori di alcune delle modificazioni istoniche emergenti non canoniche, come la succinilazione 116 e la crotonilazione 256,257 258.


Cromatina

Cellule germinali in profase della meiosi I da un him-8 ermafrodita. I cromosomi X non sinapsi sono arricchiti per H3K9me2 (punte di freccia) H3K9ac è arricchito sugli autosomi.

Il silenziamento meiotico della cromatina spaiata è un fenomeno diffuso che è stato descritto in molti organismi vertebrati e invertebrati. In C. elegans, come in altre specie, i cromosomi spaiati accumulano un alto livello di modificazioni repressive della cromatina che non si osservano sui cromosomi sinapsi. Ad esempio, il cromosoma X maschile accumula un alto livello di dimetilazione dell'istone H3 lisina 9 (H3K9me2), così come gli ermafroditi X che non riescono a sinapsi a causa della mutazione (vedi figura). Questa modifica dell'istone ampiamente conservata è associata all'assemblaggio della struttura chiusa della cromatina e alla repressione trascrizionale. I nostri obiettivi sono comprendere i meccanismi attraverso i quali la cromatina spaiata viene riconosciuta e silenziata durante la meiosi e identificare i bersagli cromosomici del silenziamento meiotico.

Abbiamo dimostrato che un ramo del C. eleganspiccole funzioni di rete di RNA nella regolazione dell'accumulo e della distribuzione meiotica di H3K9me2. I componenti di questo percorso includono l'RNA polimerasi RNA-diretta, EGO-1, e la proteina Argonaute/Slicer, CSR-1. MET-2 è l'istone metiltransferasi responsabile dell'accumulo di H3K9me2 nella linea germinale. Stiamo lavorando per capire come l'attività della via del piccolo RNA EGO-1/CSR-1 influenzi l'attività di MET-2 per dirigerlo verso i cromosomi non sinapsi.

Cellule germinali in profase della meiosi I da maschi wildtype e ego-1 mutanti. H3K9me2 è arricchito sul cromosoma X nel maschio wildtype (frecce) ma non ego-1.

C. elegans fornisce un sistema senza precedenti per studiare il meccanismo del silenziamento meiotico nel contesto dello sviluppo della linea germinale. Il C. elegans la linea germinale si è dimostrata un modello eccellente per lo studio della regolazione genetica e delle questioni relative allo sviluppo. Ampi strumenti genetici disponibili in C. elegans ci permettono di studiare il meccanismo di silenziamento meiotico e di affrontare domande più ampie sul ruolo del silenziamento meiotico nello sviluppo e nella funzione della linea germinale. Un obiettivo del nostro lavoro attuale è identificare ulteriori fattori che agiscono insieme a MET-2 e/o alla via EGO-1/CSR-1 per regolare l'accumulo di H3K9me2. Un altro obiettivo è identificare i siti in cui le modifiche di H3K9me2 sono depositate sui cromosomi spaiati. Comprendendo il meccanismo e gli obiettivi dell'accumulo di H3K9me2, saremo in grado di investigare le implicazioni evolutive di questo processo. Ci aspettiamo che i nostri risultati facilitino lo studio del silenziamento meiotico in animali più complessi, compresi i mammiferi.


PROSPETTIVE E CONCLUSIONE

Le nostre strutture crio-EM 3D a risoluzione 11 hanno fornito le caratteristiche strutturali fondamentali della sfuggente fibra di cromatina da 30 nm e una solida base per comprendere il principio di base della compattazione della cromatina, mentre sono necessarie strutture a risoluzione più elevata della fibra di cromatina per scoprire molto maggiori dettagli strutturali per le interazioni nucleosoma-nucleosoma, nucleosoma-H1 e H1-H1 nelle fibre della cromatina. Inoltre, le nostre strutture crio-EM implicano chiaramente la presenza di tre importanti interfacce di interazione nella fibra a 30 nm, mentre non è ancora chiaro come queste interfacce siano regolate da diversi fattori di cromatina. Per quanto riguarda la variazione degli NRL in vivo, anche le fibre di cromatina ricostituite con una combinazione di diversi NRL saranno buoni candidati per studi su singole molecole e crio-EM in futuro. Questi ulteriori studi non solo miglioreranno la nostra comprensione della diversità delle strutture della cromatina in vivo, ma forniranno anche basi strutturali su come diverse combinazioni di sequenze di DNA, NRL, varianti di istoni, modificazioni della cromatina e proteine ​​​​architettoniche della cromatina possono essere coordinate per regolare con precisione il biologico funzione del DNA genomico nel nucleo.

È ancora un mistero se i risultati strutturali degli studi in vitro possano rappresentare l'effettiva struttura delle fibre di cromatina in situ. Pertanto, l'organizzazione 3D delle fibre di cromatina nei nuclei intatti deve essere ulteriormente studiata utilizzando tecniche di nuova concezione. Fibre di cromatina ben caratterizzate ricostituite in vitro, comprese fibre compattate a 30 nm e array nucleosomiali aperti, sarebbero perfetti riferimenti strutturali per analizzare l'organizzazione 3D delle fibre di cromatina in situ in questi studi. La combinazione di cryo-EM con tecniche di imaging a fluorescenza a super risoluzione è stata recentemente sviluppata per visualizzare e quantificare l'ultrastruttura delle cellule crioconservate (Chang et al. 2014 Liu et al. 2015). La combinazione di approcci genomici (come micro-C e RICC-seq) e tecniche di imaging basate su CRISPR (clustered regolarmente interspaced short palindromic repeat) può consentirci di sondare l'ultrastruttura e l'organizzazione 3D della fibra cromatina in regioni genomiche definite nell'intatto nuclei. Indubbiamente, in futuro sarà possibile ottenere maggiori dettagli strutturali per l'organizzazione 3D delle fibre di cromatina in situ mediante l'applicazione di queste tecniche di imaging avanzate.


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Temi attuali in biologia dello sviluppo. vol. 56 2003. pag. 55-83 (Argomenti attuali in Biologia dello sviluppo Vol. 56).

Risultati della ricerca : Capitolo in Libro/Relazione/Atti di Convegno › Capitolo

T1 - Regolazione della struttura della cromatina e dell'attività genica da parte delle poli(ADP-ribosio) polimerasi

N2 - La poli(ADP-ribosio) polimerasi 1 (PARP1) è un'abbondante proteina nucleare che svolge un ruolo importante nella riparazione del DNA e nella risposta alle infezioni. Qui esaminiamo le prove recenti che PARP1 e le proteine ​​correlate svolgono anche funzioni cruciali che regolano i geni durante il normale sviluppo. Studi genetici sui mammiferi e sulla Drosophila hanno implicato che i PARP mediano risposte rapide agli stimoli ambientali, tra cui infezioni, stress, ormoni e segnali di crescita. Inoltre, queste polimerasi possono controllare processi fondamentali che modellano e rimodellano in modo differenziale la cromatina all'interno dei molti tipi cellulari di un embrione in via di sviluppo. Discutiamo un meccanismo unificato dell'azione di PARP durante la riparazione del DNA, la trascrizione genica e la modulazione della cromatina.

AB - La poli(ADP-ribosio) polimerasi 1 (PARP1) è un'abbondante proteina nucleare che svolge un ruolo importante nella riparazione del DNA e nella risposta alle infezioni. Qui esaminiamo le prove recenti che PARP1 e le proteine ​​correlate svolgono anche funzioni cruciali che regolano i geni durante il normale sviluppo. Studi genetici sui mammiferi e sulla Drosophila hanno implicato che i PARP mediano risposte rapide agli stimoli ambientali, tra cui infezioni, stress, ormoni e segnali di crescita. Inoltre, queste polimerasi possono controllare processi fondamentali che modellano e rimodellano in modo differenziale la cromatina all'interno dei molti tipi cellulari di un embrione in via di sviluppo. Discutiamo un meccanismo unificato dell'azione di PARP durante la riparazione del DNA, la trascrizione genica e la modulazione della cromatina.


Metilazione del DNA diretta dall'RNA

Steven E. Jacobsen è ricercatore presso l'Howard Hughes Medical Institute e professore di biologia molecolare e dello sviluppo presso l'Università della California, Los Angeles, USA. La sua ricerca si concentra sui meccanismi dell'ereditarietà epigenetica nelle piante, compresa la genetica e la genomica della metilazione del DNA, la metilazione dell'istone e le vie di silenziamento guidate da piccoli RNA. Con oltre 130 pubblicazioni relative all'epigenetica ha dato contributi fondamentali a questo emergente campo di ricerca.

Jacobsen ha tenuto conferenze sulla via della metilazione del DNA dipendente dall'RNA (RdDM) che Arabidopsis thaliana utilizza per mantenere e probabilmente stabilire la metilazione del DNA della citosina al fine di silenziare geni e trasposoni. Mentre le ben studiate DNA metiltransferasi MET1, CMT3 e DRM2 sono responsabili del mantenimento di schemi di metilazione prestabiliti tramite meccanismi classici, apparentemente DRM2 - un omologo del mammifero Dnmt3 – è l'unico a mediare RdDM. Il reclutamento di DRM2 nel rispettivo sito del DNA è quindi mediato da una complessa interazione di polimerasi IV (PolIV), polimerasi V (PolV), le specie di RNA da esse prodotte e numerosi altri fattori.

Poiché il legame del DNA di PolIV e PolV non mostra alcuna specificità di sequenza significativa, è più probabile che i segni epigenetici rappresentino i loro siti di riconoscimento. È stato dimostrato che PolIV interagisce con SHH1, che si lega a H3K9me, un segno di silenziamento che si trova frequentemente nei siti RdDM, mentre l'interazione indiretta di PolV con SUVH2 lo mira al DNA metilato. Mediante la fusione di SUVH2 con un dominio zinc finger mirato a un epiallele non metilato del fattore di trascrizione omeodominio FWA, il laboratorio di Jacobsen ha dimostrato che SUVH2 è sufficiente per reclutare PolV, stabilire la metilazione del DNA e infine causare il silenziamento genico.

Meccanicisticamente, PolV e PolV associati ai siti RdDM producono rispettivamente 24 siRNA nucleotidici e lncRNA. Questi RNA interagiscono con una serie di ulteriori fattori come AGO4 per stabilire una rete molto complessa che alla fine si traduce nel reclutamento di DRM2 per preservare i modelli di metilazione esistenti. È interessante notare che esiste una stretta interdipendenza tra tali segni di metilazione e altre modificazioni epigenetiche come ad esempio la metilazione dell'istone, che genera robusti anelli di rinforzo. Tuttavia, non è chiaro come avvenga la costituzione iniziale di RdDM.


Astratto

I fattori di trascrizione pionieri svolgono un ruolo primario nello stabilire la competenza per l'espressione genica e nell'iniziare la programmazione e la riprogrammazione cellulare e la loro disregolazione provoca gravi effetti sulla salute umana, come la promozione della tumorigenesi. Sebbene più di 200 fattori di trascrizione siano espressi in ciascun tipo di cellula, solo un piccolo numero di fattori di trascrizione è necessario per provocare cambiamenti drammatici del destino cellulare nello sviluppo embrionale e nella conversione del destino cellulare. Tra questi fattori di trascrizione chiave, un sottoinsieme chiamato "fattori di trascrizione pionieri" ha una notevole capacità di colpire il DNA nucleosomiale, o cromatina chiusa, all'inizio dello sviluppo, portando spesso all'apertura locale della cromatina, stabilendo così la competenza per l'espressione genica. Sebbene più fattori di trascrizione chiave siano stati identificati come fattori di trascrizione pionieri, i meccanismi molecolari alla base delle loro proprietà speciali stanno appena iniziando a essere rivelati. Comprendere i meccanismi pionieristici migliorerà la nostra capacità di controllare con precisione il destino delle cellule a piacimento per scopi terapeutici e di ricerca.

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8.4: Geni e cromatina negli eucarioti

  • Contributo di Gerald Bergtrom
  • Professore emerito (Bioscienze) presso l'Università del Wisconsin-Milwaukee

I cromosomi e la cromatina sono un'associazione eucariotica unica del DNA con più o meno proteine. Il DNA batterico (e il DNA procariotico in generale) è relativamente "nudo" e non è visibilmente associato alle proteine.

La micrografia elettronica di an interfase cella (sotto) rivela che la cromatina stessa può esistere in vari stati di condensazione.

La cromatina viene condensata al massimo durante la mitosi, formando i cromosomi. Durante l'interfase, la cromatina esiste in forme più o meno condensate, chiamate eterocromatinae eucromatinarispettivamente. La transizione tra queste forme di cromatina comporta cambiamenti nelle quantità e nei tipi di proteine ​​legate alla cromatina e ciò può verificarsi durante la regolazione genica, cioè quando i geni vengono attivati ​​o disattivati. I geni attivi tendono a trovarsi nell'eucromatina più dispersa in modo che gli enzimi di replicazione e trascrizione abbiano un accesso più facile al DNA. I geni che sono inattivi nella trascrizione sono eterocromatici, oscurati da ulteriori proteine ​​della cromatina presenti nell'eterocromatina. In un capitolo successivo esamineremo alcuni esperimenti che lo dimostrano.

Possiamo definire tre livelli di organizzazione della cromatina in termini generali:

1. Si forma il DNA avvolto attorno alle proteine ​​istoniche nucleosomi in una struttura "perline su una stringa".

2. Nucleosomi multipli si avvolgono (condensano), formando strutture in fibra di 30 nm (solenoide).

3. L'imballaggio di ordine superiore della fibra da 30 nm porta alla formazione di cromosomi in metafase osservati nella mitosi e nella meiosi.

I livelli della struttura della cromatina sono stati determinati in parte dall'isolamento selettivo e dall'estrazione della cromatina cellulare interfase, seguita dall'estrazione chimica selettiva dei componenti della cromatina. I passaggi sono:

· I nuclei vengono prima isolati dalle cellule.

· L'involucro nucleare si è rotto delicatamente in modo da non distruggere fisicamente la struttura della cromatina.

· la cromatina può essere delicatamente estratta mediante uno dei diversi trattamenti chimici (alto contenuto di sale, basso contenuto di sale, acido. ).

I livelli di struttura della cromatina sono illustrati di seguito.

L'estrazione del sale dissocia la maggior parte delle proteine ​​dalla cromatina. Quando un estratto a basso contenuto di sale viene centrifugato e il pellet risospeso, la cromatina rimanente si presenta come perline su un filo. avvolto nel DNA nucleosomi sono le perline, che a loro volta sono collegate da lunghezze uniformi di DNA metaforico &ldquostring&rsquo ( # 1 nell'illustrazione sopra). Un estratto di cromatina ad alto contenuto di sale appare come una spirale di nucleosomi, o Fibra a solenoide da 30 nm (# 2 sopra). Altri protocolli di estrazione hanno rivelato altri aspetti della struttura della cromatina mostrati in #s 3 e 4 sopra. I cromosomi osservati nella metafase della mitosi sono la forma più condensata di cromatina di "ordine più elevato".

Il filamento di 10 nm del nucleosoma &lsquobeads-on-a-string&rsquo rimanente dopo un'estrazione a basso contenuto di sale può essere visto al microscopio elettronico come mostrato di seguito.

Quando queste collane di nucleosomi sono state digerite con l'enzima desossiribonucleasi (DNAsi), il DNA tra le "sfere" è stato degradato, lasciando dietro di sé filamenti accorciati da 10 nm dopo un breve periodo di digestione, o solo singole perline dopo una digestione più lunga (sotto).

Roger Kornberg (figlio del premio Nobel Arthur Kornberg che scoprì il primo enzima di replicazione della DNA polimerasi) partecipò alla scoperta e alla caratterizzazione dei nucleosomi mentre era ancora un post-doc! Rivelata l'elettroforesi del DNA estratto da questi digest nucleosomi separati da un tratto di DNA "linker" di circa 80 coppie di basi. Il DNA estratto dai nucleosomi era lungo circa 147 paia di basi. Questo è il DNA che era stato avvolto attorno alle proteine ​​del nucleosoma.

Dopo aver separato tutte le proteine ​​dal DNA nucleosomiale, sono state identificate cinque proteine ​​(illustrate di seguito).

Gli istoni sono proteine ​​basiche che ne contengono molti lisina e arginina aminoacidi. Le loro catene laterali caricate positivamente consentono a questi amminoacidi di legare l'acido, caricato negativamente spina dorsale di fosfodiestere di DNA a doppia elica. Il DNA si avvolge attorno a un ottamero di istoni (2 ciascuno di 4 delle proteine ​​istoniche) per formare il nucleosoma. Ad ogni grammo di DNA è associato circa un grammo di istoni. Dopo un'estrazione di cromatina ad alto contenuto di sale, la struttura visibile al microscopio elettronico è il solenoide da 30 nm, la bobina di nucleosomi modellata nella figura sottostante.

As shown above, simply increasing the salt concentration of an already extracted nucleosome preparation will cause the &lsquonecklace&rsquo to fold into the 30nm solenoid structure.

As you might guess, an acidic extraction of chromatin should selectively remove the basic histone proteins, leaving behind an association of DNA with non-histone proteins. This proved to be the case. An electron micrograph of the chromatin remnant after an acid extraction of metaphase chromosomes is shown on the next page.

DNA freed of the regularly spaced histone-based nucleosomes, loops out, away from the long axis of the chromatin. Dark material along this axis is a protein scaffolding that makes up what&rsquos left after histone extraction. Much of this protein is topoisomerase, an enzyme that prevents DNA from breaking apart under the strain of replication.


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