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17.4: Microscopio - Biologia

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Obiettivi del laboratorio

Al termine del laboratorio, lo studente dovrebbe essere in grado di:

  • identificare quando in laboratorio verrebbe utilizzato uno stereomicroscopio (microscopio da dissezione) rispetto a un microscopio ottico composto
  • descrivere le principali differenze tra microscopi ottici e microscopi elettronici
  • descrivere il modo corretto di portare un microscopio
  • identificare le parti di un microscopio ottico composto
  • descrivere i passaggi per visualizzare un vetrino su un microscopio ottico composto
  • determinare l'ingrandimento totale di un oggetto visualizzato da un microscopio ottico composto se data la lente oculare e
  • ingrandimenti dell'obiettivo
  • spiega perché il campo visivo del microscopio diminuisce all'aumentare dell'ingrandimento

Cose che dovresti essere in grado di spiegare a qualcun altro dopo questo laboratorio:

  • Composto
  • Ingrandimento totale
  • Binoculare
  • Campo visivo
  • Profondità di messa a fuoco
  • Fenomeno di inversione

Presentazione

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Nota

I microscopi ottici utilizzati in questo corso sono strumenti sensibili e costosi che vengono maneggiati da molti studenti durante il semestre. Questo laboratorio ti insegnerà le informazioni e le abilità necessarie per usare e curare correttamente i microscopi.

Sfondo

Molti organismi (batteri) e parti di organismi (cellule) studiati dai biologi sono troppo piccoli per essere visti con l'occhio umano. Noi usiamo microscopi per ingrandire i campioni per la nostra indagine. La parola microscopio significa "vedere in piccolo" e il primo microscopio primitivo fu creato nel 1595.

Esistono diversi tipi di microscopi, ma utilizzerai principalmente a microscopio ottico composto. Questo tipo di microscopio utilizza la luce visibile focalizzata attraverso due lenti, l'oculare e l'obiettivo, per visualizzare un piccolo campione. Solo le cellule abbastanza sottili da consentire il passaggio della luce saranno visibili con un microscopio ottico in un'immagine bidimensionale.

Un altro microscopio che utilizzerai in laboratorio è un stereoscopico o un microscopio da dissezione. Questo tipo di microscopio utilizza campioni più spessi e più grandi della luce visibile, come un insetto, in 3D. Poiché stai visualizzando campioni più grandi, l'intervallo di ingrandimento del microscopio da dissezione è inferiore a quello del microscopio ottico composto.

Il tuo istruttore esaminerà le parti e le funzioni dei microscopi ottici composti che utilizzeremo durante il semestre. Compila la tabella nella pagina successiva per aiutarti a ricordare queste importanti informazioni. Probabilmente farai riferimento a questa pagina frequentemente. Ecco una foto di un microscopio ottico per etichettare e prendere appunti.

Parte del microscopioFunzione
Oculari (oculari)
Braccio
Girare il nasello
Palcoscenico
obiettivi
Clip diapositive
Manopola di controllo del palco
Condensatore
Diaframma a iride
Lampada da sottopalco (Illuminatore)
Regolazione grossolana
Regolazione fine
Base

Regole e istruzioni per l'uso dei microscopi ottici composti

Il tuo istruttore discuterà l'uso del microscopio con la tua classe. Verranno esaminati i passaggi corretti da seguire per una corretta messa a fuoco. Devi seguire la sequenza passo passo come indicato dal tuo istruttore. Anche se hai familiarità con questo tipo di microscopio, dovresti comunque passare attraverso la revisione della messa a fuoco con il resto della classe.

  1. Regole generali importanti:
    1. Trasportare sempre il microscopio con 2 mani: posizionare una mano sul braccio del microscopio e l'altra sotto la base del microscopio.
    2. Non toccare le lenti degli obiettivi (cioè le punte degli obiettivi).
    3. Mantenere gli obiettivi nella posizione di scansione e mantenere basso il tavolino quando si aggiungono o si rimuovono vetrini.
    4. Guardare sempre il microscopio di lato quando si apportano grandi modifiche all'altezza del tavolino.
    5. Le lenti dell'obiettivo devono essere pulite solo con carta speciale per lenti e liquido per la pulizia delle lenti.
    6. NON fare il tuttofare: nessun microscopio deve essere smontato. Segnala i malfunzionamenti al tuo istruttore.
  2. Per ottenere un microscopio dall'armadio di laboratorio:
    1. Prima area libera sul tavolo per il microscopio: evitare un'area di lavoro affollata.
    2. I microscopi sono numerati in base a dove sei seduto. Trova il numero sotto il tuo banco e usa il microscopio corrispondente.
    3. Trasportare il microscopio con DUE mani.
    4. Fissare il cavo elettrico: non lasciarlo penzolare dal tavolo!
  3. Quando si riporta il microscopio nell'armadietto del laboratorio:
    1. Abbassa il palco.
    2. Ruotare l'obiettivo di scansione in posizione sopra il tavolino.
    3. Rimuovi la diapositiva dal palco.
    4. Pulire il vetrino e l'obiettivo utilizzando lo speciale liquido per la pulizia delle lenti e la carta in dotazione.
    5. Centrare il palco in modo che non sporga troppo da entrambi i lati.
    6. Fissare il cavo avvolgendolo sotto il tavolino del microscopio..
    7. Sostituire il coperchio antipolvere.
    8. Trasportare il microscopio con DUE mani.
    9. Riportate il microscopio nello stesso cubicolo da cui l'avete ricavato avendo cura di metterlo in braccio fuori.
  4. Per mettere a fuoco il microscopio:
    Guarda il microscopio di lato:
    1. Abbassa il palco il più possibile.
      1. Ruotare gli obiettivi in ​​modo che l'obiettivo di scansione sia rivolto verso il basso sul palco.
      2. Regolare il tavolino in modo che l'apertura (l'apertura al centro del palco) sia centrata.
      3. Posiziona la tua diapositiva sul palco, usando il morsetto del palco per fissarlo. Il morsetto per tavolino si muove solo all'interno del piano orizzontale del tavolino e fissa la diapositiva toccando appena l'angolo in basso a destra della diapositiva.
      4. Centrare il campione sul vetrino sotto l'obiettivo spostando il tavolino.
      5. Sposta il tavolino quasi il più possibile, facendo attenzione a non lasciare che il vetrino tocchi la lente dell'obiettivo: guarda di lato in modo da poter vedere quanto in alto alzare il tavolino.
    2. Guarda attraverso gli oculari:
      1. Utilizzare la manopola di regolazione grossolana per spostare il tavolino verso il basso finché il campione non viene messo a fuoco, quindi affinare la messa a fuoco.
      2. Centrare il campione nel campo del microscopio spostando il tavolino.
    3. Guarda il microscopio di lato:
      1. Ruotare lentamente l'obiettivo a bassa potenza (10X) in posizione.
    4. Guarda attraverso gli oculari:
      1. Affinare la messa a fuoco, se necessario, con la manopola di regolazione grossolana. Di solito è necessaria solo una minima quantità di aggiustamento.
      2. Centrare il campione in campo, se necessario.
    5. Guarda il microscopio di lato:
      1. Ruota l'obiettivo ad alta potenza in posizione molto attentamente!
    6. Guarda attraverso gli oculari:
      1. Usando solo la manopola di regolazione fine, affinare la messa a fuoco. Ricentrare se necessario. (Se il tuo campione è "scomparso", torna immediatamente a bassa potenza e ricentra il campione.)
      2. Quando si rimuove un vetrino, riportare sempre gli obiettivi nella posizione di scansione e abbassare il tavolino prima di sollevare il vetrino!

Parte 1: Ingrandimento totale

Ingrandimento è il rapporto tra la dimensione dell'immagine al microscopio e la dimensione effettiva dell'oggetto. Quando dici che l'ingrandimento è 10, l'immagine che vedi usando il microscopio è dieci volte più grande della visualizzazione del campione ad occhio nudo. Ricorda che con un microscopio ottico composto stai ingrandendo con due lenti, quindi per calcolare l'ingrandimento totale devi moltiplicare l'ingrandimento dell'obiettivo per l'ingrandimento oculare. Guarda il microscopio e usa la tabella qui sotto per calcolare l'ingrandimento totale per ogni obiettivo:

ObiettivoLenti Oculari= Ingrandimento totale
Obiettivo di scansione
Obiettivo basso
Obiettivo alto

Parte 2: Fenomeno di inversione

Procurati una diapositiva con la lettera “e” disponibile in classe. Guarda il vetrino con i tuoi occhi, quindi posizionalo sul microscopio. Utilizzare la sequenza di messa a fuoco per visualizzare la diapositiva a bassa potenza.

Procedura

  1. Disegna la lettera "e" come appare quando guardi il vetrino senza il microscopio.
  2. Disegna la lettera "e" come appare quando guardi il vetrino al microscopio.
  3. Sposta la diapositiva a destra usando la leva del tavolino meccanico mentre guardi attraverso gli oculari. Da che parte si muove la "e"?
  4. Sposta la diapositiva lontano da te utilizzando la leva del tavolino meccanico mentre guardi attraverso gli oculari. Da che parte si muove la "e"?

Esponi con parole tue il fenomeno dell'inversione.

Parte 3: campo visivo

Il campo visivo è la quantità di campione che vedi quando guardi attraverso gli obiettivi. Il campo visivo diminuisce a ingrandimenti maggiori.

Procedura

Posiziona un righello di plastica blu sull'apertura del tavolino in modo che il bordo del righello sia visibile come una linea verticale lungo il diametro del campo. Stimare la dimensione del campo in millimetri per ciascuna delle lenti dell'obiettivo.

Scansione __________ Basso (10X) __________ Alto (40X) __________

Parte 4: Profondità di fuoco

Il profondità di messa a fuoco è lo spessore del campione che rimane a fuoco ad un dato ingrandimento. La profondità di messa a fuoco diminuisce a ingrandimenti maggiori.

Procedura

Procurati una diapositiva di fili colorati e visualizzala sotto scansione oa bassa potenza. Quindi, determina quale filo di colore è:

  • Sulla cima
  • Nel mezzo
  • Sul fondo

Suggerimento: utilizzando le istruzioni per la messa a fuoco, concentrati sull'area in cui i tre fili si incrociano. Usa la messa a fuoco fine per discernere l'ordine dei fili.

Parte 5: Realizzazione di una montatura bagnata

Durante tutto il semestre, dovrai eseguire con successo una serie di semplici preparazioni di vetrini chiamate "montaggi a umido". Il campione da osservare viene posto su un vetrino pulito, si aggiungono una o due gocce d'acqua e si posiziona con cura un vetrino coprioggetto sopra l'acqua e il campione. Il tuo istruttore ti mostrerà questa tecnica.

Realizzare un montaggio a umido dell'acqua del laghetto seguendo la procedura seguente:

  1. Mettere una goccia d'acqua del laghetto su un vetrino pulito usando la pipetta di plastica usa e getta.
  2. Coprire l'acqua del laghetto sul vetrino con un coprioggetto. Prova a posizionare il coprioggetto in un angolo per avido bolle d'aria.
  3. Eliminare il liquido in eccesso sulla diapositiva.
  4. Posizionare il vetrino sul microscopio per osservare il campione.
    1. Inizia dall'obiettivo di scansione
    2. Passare con attenzione agli obiettivi bassi e alti, se necessario.

Spero che vedrai alcuni organismi vivi nell'acqua del tuo laghetto. Se vedi materiale verde, probabilmente è una specie di pianta. Guarda per vedere se c'è qualcosa che si muove. Nello spazio sottostante, descrivi cosa stai osservando al microscopio e disegna una semplice immagine.

Parte 6: microscopio da dissezione stereoscopico

Il tuo istruttore dimostrerà l'uso corretto dell'ambito di dissezione. Questi microscopi generalmente danno un ingrandimento inferiore rispetto al microscopio composto che stai utilizzando.

Procedura

Visualizza i campioni disponibili al tavolo del laboratorio utilizzando il microscopio da dissezione. Notare che il microscopio ha due sorgenti luminose, una dalla base e una dall'alto. I campioni non sono sempre montati su un vetrino. Si noti inoltre che quando si visualizzano gli oggetti al microscopio da dissezione, questi sono tridimensionali.

Domande di laboratorio

  1. Elenca due modi in cui un microscopio da dissezione stereoscopico differisce da un microscopio composto.
  2. Quale microscopio, il microscopio ottico o quello da dissezione, ha un ingrandimento minore?

Pulizia e cura del microscopio

  1. Descrivi come e con cosa vuoi pulire la lente del microscopio.
  2. Elenca quattro cose che devi fare quando hai finito di usare il microscopio alla fine del laboratorio.

17.4: Microscopio - Biologia

La risoluzione finale di un dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD) o semiconduttore di ossido di metallo complementare (CMOS) il sensore di immagine è una funzione del numero di fotodiodi e della loro dimensione rispetto all'immagine proiettata sulla superficie della matrice di immagini dal sistema ottico del microscopio. Quando si tenta di far corrispondere la risoluzione ottica del microscopio a una specifica combinazione di fotocamera digitale e accoppiatore video, utilizzare questo calcolatore per determinare la densità di pixel minima necessaria per acquisire adeguatamente tutti i dati ottici dal microscopio.

Il tutorial si avvia con un campione scelto casualmente che appare nel Immagine campione finestra (scatola nera) e delimitata dall'apertura dell'oculare o dal diaframma di campo dell'obiettivo di proiezione. Un rettangolo colorato che designa le dimensioni del CCD (2/3 pollici per impostazione predefinita) viene sovrapposto all'immagine per rivelare l'area effettiva del campione catturata dal sensore. Nelle caselle grigie, gialle e rosse sotto i cursori, il microscopio Risoluzione ottica (grigio), CCD Dimensione pixel richiesta (giallo), Dimensione ottimale dell'array CCD (giallo), Ingrandimento monitor (rosso) e Ingrandimento totale (rosso) dell'immagine sono presentati in micrometri o un prodotto. Questi valori vengono continuamente aggiornati man mano che i cursori vengono tradotti. Una nuova Formato CCD (dimensione) può essere selezionato utilizzando i pulsanti di opzione che appaiono a sinistra del Immagine campione finestra. Il fisico Dimensioni CCD del sensore selezionato (in millimetri) vengono visualizzati sul lato destro della finestra dell'immagine lungo un rettangolo con le stesse proporzioni del chip di imaging.

Per eseguire il tutorial, spostare il Apertura numerica e Ingrandimento obiettivo cursori (i valori vengono visualizzati sopra le barre di scorrimento) per impostare i valori appropriati per la configurazione ottica del microscopio da considerare. Quindi, scegli un oculare o un obiettivo di proiezione Numero di campo (valori compresi tra 18 e 26 millimetri) e Accoppiatore video ingrandimento (tra 0,5x e 1,0x). Quando il cursore dell'accoppiatore viene traslato, la dimensione del rettangolo sovrapposto all'immagine del campione viene modificata dal tutorial in modo che corrisponda all'area del campione catturata dal sensore CCD. È possibile selezionare un nuovo campione in qualsiasi momento utilizzando il pulsante Scegli un campione menu a discesa.

L'efficienza di acquisizione di immagini generate da un microscopio ottico sull'array di fotodiodi di un sensore di immagine CCD o CMOS dipende da diversi fattori, che vanno dall'ingrandimento dell'obiettivo, dall'apertura numerica e dalla risoluzione, alla dimensione dell'array di fotodiodi del sensore di immagine elettronico, al rapporto di aspetto , ingrandimento dell'accoppiatore video e le dimensioni dei singoli elementi fotosensibili all'interno dell'array. Inoltre, devono essere considerati anche i parametri specifici del campione da acquisire, come il contrasto, il rapporto segnale-rumore, l'intervallo dinamico intrascena e il tempo di integrazione.

La risoluzione ottica finale di un CCD è una funzione del numero di fotodiodi e della loro dimensione rispetto all'immagine proiettata sulla superficie dell'array dal sistema di lenti del microscopio. Gli array CCD attualmente disponibili variano in dimensioni da diverse centinaia a molte migliaia di pixel. Le moderne dimensioni degli array utilizzate nei dispositivi destinati alle indagini scientifiche vanno da 1000 × 1000 fino a 5000 × 5000 elementi del sensore. La tendenza nella produzione di CCD di livello consumer e scientifico è che le dimensioni del sensore diminuiscano continuamente e attualmente sono disponibili fotocamere digitali con fotodiodi di dimensioni fino a 4 × 4 micrometri.

Una risoluzione adeguata di un campione ripreso con gli elementi ottici di un microscopio può essere ottenuta solo se vengono realizzati almeno due campioni per ciascuna unità risolvibile, sebbene molti ricercatori preferiscano tre campioni per unità risolvibile per garantire un campionamento sufficiente. Negli strumenti ottici a diffrazione limitata, come il microscopio, il limite di Abbe della risoluzione ottica a una lunghezza d'onda della luce visibile media (550 nanometri) è di 0,20 micrometri quando si utilizza una lente dell'obiettivo con un'apertura numerica di 1,4. In questo caso, una dimensione del sensore di 10 micrometri quadrati sarebbe abbastanza grande da consentire di abbinare la risoluzione ottica ed elettronica, con una dimensione del sensore di 7 × 7 micrometri preferita. Sebbene i fotodiodi più piccoli in un sensore di immagine CCD migliorino la risoluzione spaziale, limitano anche la gamma dinamica del dispositivo.

Tabella 1 - Requisiti delle dimensioni dei pixel per la corrispondenza della risoluzione ottica del microscopio

Obbiettivo
(Apertura numerica)
Risoluzione
Limite
(Micrometri)
proiettato
Taglia
(Micrometri)
Pixel richiesto
Taglia
(Micrometri)
1x (0,04) 6.9 6.9 3.5
2x (0,06) 4.6 9.2 4.6
2x (0,10) 2.8 5.6 2.8
4x (0,10) 2.8 11.2 5.6
4x (0,12) 2.3 9.2 4.6
4x (0,20) 1.4 5.6 2.8
10x (0,25) 1.1 11.0 5.5
10x (0,30) 0.92 9.2 4.6
10x (0,45) 0.61 6.1 3.0
20x (0,40) 0.69 13.8 6.9
20x (0,50) 0.55 11.0 5.5
20x (0,75) 0.37 7.4 3.7
40x (0,65) 0.42 16.8 8.4
40x (0,75) 0.37 14.8 7.4
40x (0,95) 0.29 11.6 5.8
40x (1.00) 0.28 11.2 5.6
40x (1,30) 0.21 8.4 4.2
60x (0,80) 0.34 20.4 10.2
60x (0,85) 0.32 19.2 9.6
60x (0,95) 0.29 17.4 8.7
60x (1,40) 0.20 12.0 6.0
100x (0,90) 0.31 31.0 15.5
100x (1,25) 0.22 22.0 11.0
100x (1,30) 0.21 21.0 10.5
100x (1,40) 0.20 20.0 10.0

In microscopia, l'immagine viene tipicamente proiettata dal sistema ottico sulla superficie di un rivelatore, che può essere la retina di un occhio umano, un sensore di immagine elettrico o l'emulsione chimica sensibile su pellicola tradizionale. Per ottimizzare il contenuto informativo dell'immagine risultante, la risoluzione del rivelatore deve corrispondere strettamente a quella del microscopio. Lo spettro di lunghezze d'onda della luce visibile utilizzato per creare l'immagine di un campione è uno dei fattori determinanti nelle prestazioni del microscopio rispetto alla risoluzione ottica. Le lunghezze d'onda più corte (375-500 nanometri) sono in grado di risolvere i dettagli in misura maggiore rispetto alle lunghezze d'onda più lunghe (maggiori di 500 nanometri). I limiti della risoluzione spaziale sono dettati anche dalla diffrazione della luce attraverso il sistema ottico, termine che viene generalmente indicato come diffrazione limitata risoluzione. I ricercatori hanno derivato diverse equazioni che sono state utilizzate per esprimere la relazione tra apertura numerica, lunghezza d'onda e risoluzione ottica:

Formula 1 - Apertura numerica, lunghezza d'onda e risoluzione ottica

Formula 2 - Apertura numerica, lunghezza d'onda e risoluzione ottica

Formula 3 - Apertura numerica, lunghezza d'onda e risoluzione ottica

In cui si R è la risoluzione (la più piccola distanza risolvibile tra due punti del campione), N / A è uguale all'apertura numerica dell'obiettivo, uguale alla lunghezza d'onda, NA(Oggetto) è uguale all'apertura numerica dell'obiettivo, e NA (Cond) è l'apertura numerica del condensatore. Nota che l'equazione (1) e (2) differiscono per il fattore di moltiplicazione, che è 0,5 per l'equazione (1) e 0,61 per l'equazione (2). Queste equazioni si basano su una serie di fattori, inclusa una varietà di calcoli teorici fatti dai fisici ottici per spiegare il comportamento di obiettivi e condensatori, e non dovrebbero essere considerate un valore assoluto di nessuna legge fisica generale. Il presupposto è che due sorgenti luminose puntiformi possano essere risolte (immagini separate) quando il centro del disco di Airy generato da una delle sorgenti si sovrappone alla riflessione di primo ordine nello schema di diffrazione del secondo disco di Airy, una condizione nota come Criterio di Rayleigh. In alcuni casi, come la microscopia a fluorescenza confocale e multifotonica, la risoluzione può effettivamente superare i limiti posti da una qualsiasi di queste tre equazioni. Altri fattori, come il basso contrasto del campione e l'illuminazione impropria, possono servire a ridurre la risoluzione e, il più delle volte, il valore massimo reale di R (circa 0,20 micron utilizzando una lunghezza d'onda dello spettro medio di 550 nanometri) e un'apertura numerica da 1,35 a 1,40 non sono realizzati in pratica.

Quando il microscopio è in perfetto allineamento e ha gli obiettivi opportunamente abbinati al condensatore sotto il tavolino, il valore di apertura numerica dell'obiettivo può essere sostituito in equazioni (1) e (2), con il risultato aggiunto che l'equazione (3) si riduce all'equazione (2). Un concetto importante da notare è che l'ingrandimento non appare come un fattore in nessuna di queste equazioni, perché solo l'apertura numerica e la lunghezza d'onda dell'illuminazione determinano la risoluzione del campione. Come accennato in precedenza (e si può osservare nelle equazioni) la lunghezza d'onda della luce è un fattore importante nella risoluzione di un microscopio. Le lunghezze d'onda più corte producono una risoluzione più elevata (valori più bassi per R) e viceversa. Il più grande potere risolutivo nella microscopia ottica è realizzato con la luce quasi ultravioletta, la lunghezza d'onda di imaging effettiva più corta. La luce quasi ultravioletta è seguita dalla luce blu, poi verde e infine rossa nella capacità di risolvere i dettagli del campione. Nella maggior parte dei casi, i microscopisti utilizzano la luce bianca ad ampio spettro generata da una lampadina alogena al tungsteno per illuminare il campione. Lo spettro della luce visibile è centrato a circa 550 nanometri, la lunghezza d'onda dominante per la luce verde (i nostri occhi sono più sensibili alla luce verde). È questa lunghezza d'onda che è stata utilizzata per calcolare i valori di risoluzione per il tutorial e presentata nella Tabella 1. Anche il valore dell'apertura numerica è importante in queste equazioni e anche aperture numeriche più elevate produrranno una risoluzione più elevata (vedere la Tabella 1).

Autori partecipanti

Matthew J. Parry-Hill, Kimberly M. Vogt, John D. Griffin, e Michael W. Davidson - National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.

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Scoperta e rilevamento

I virus sono stati scoperti per la prima volta dopo lo sviluppo di un filtro in porcellana, il filtro Chamberland-Pasteur, in grado di rimuovere tutti i batteri visibili al microscopio da qualsiasi campione liquido. Nel 1886, Adolph Meyer dimostrò che una malattia delle piante di tabacco - la malattia del mosaico del tabacco - poteva essere trasferita da una pianta malata a una sana tramite estratti liquidi di piante. Nel 1892, Dmitri Ivanowski dimostrò che questa malattia poteva essere trasmessa in questo modo anche dopo che il filtro Chamberland-Pasteur aveva rimosso tutti i batteri vitali dall'estratto. Tuttavia, sono passati molti anni prima che fosse dimostrato che questi agenti infettivi "filtrabili" non erano semplicemente batteri molto piccoli, ma erano un nuovo tipo di particelle molto piccole che causavano malattie.

Maggior parte virioni , o singole particelle virali, sono molto piccole, da 20 a 250 nanometri di diametro. Tuttavia, alcuni virus scoperti di recente dalle amebe variano fino a 1000 nm di diametro. Ad eccezione dei grandi virioni, come il poxvirus e altri grandi virus a DNA, i virus non possono essere visti con un microscopio ottico. Fu solo con lo sviluppo del microscopio elettronico alla fine degli anni '30 che gli scienziati ottennero la loro prima buona visione della struttura del virus del mosaico del tabacco (TMV) (Figura 1), discusso sopra, e di altri virus (Figura 2). La struttura superficiale dei virioni può essere osservata sia mediante microscopia elettronica a scansione che a trasmissione, mentre le strutture interne del virus possono essere osservate solo nelle immagini di un microscopio elettronico a trasmissione. L'uso della microscopia elettronica e di altre tecnologie ha permesso la scoperta di molti virus di tutti i tipi di organismi viventi.

Figura 2. In queste micrografie elettroniche a trasmissione, (a) un virus è sminuito dalla cellula batterica che infetta, mentre (b) queste cellule di E. coli sono sminuite dalle cellule del colon in coltura. (credito a: modifica del lavoro di U.S. Dept. of Energy, Office of Science, LBL, credito PBD b: modifica del lavoro di J.P. Nataro e S. Sears, dati non pubblicati, dati CDC scale-bar di Matt Russell)


I 10 migliori esperimenti sulle piante (con diagramma)

Stai facendo ricerche su esperimenti sulle piante? Sei nel posto giusto. L'articolo sotto menzionato include una raccolta di dieci esperimenti sulle piante: 1. Distribuzione dei pigmenti nelle piante 2. Ascensione della linfa nelle piante 3. Guttazione nelle piante 4. Traspirazione nelle piante 5. Nutrizione minerale nelle piante 6. Fotosintesi 7. Respirazione nelle piante 8 Tasso di crescita nelle piante 9. Crescita delle piante attraverso la promozione di sostanze 10. Biotecnologia.

  1. Esperimenti sulla distribuzione dei pigmenti vegetali
  2. Esperimenti sull'ascesa della linfa nelle piante
  3. Esperimenti sulla guttazione nelle piante
  4. Esperimenti sulla traspirazione nelle piante
  5. Esperimenti sulla nutrizione minerale nelle piante
  6. Esperimenti sulla fotosintesi
  7. Esperimenti sulla respirazione nelle piante
  8. Esperimenti sul tasso di crescita nelle piante
  9. Esperimenti sulla crescita delle piante attraverso la promozione di sostanze
  10. Esperimenti sulla biotecnologia

1. Esperimenti sulla distribuzione dei pigmenti vegetali:

Scopo dell'esperimento:

Per rilevare la presenza di antoxantina nei tessuti vegetali.

Fiori di qualsiasi pianta di colore bianco, ammoniaca concentrata, bagnomaria, alcool, alcali, HCl, acetato di piombo basico, cloruro ferrico.

1. Fiori bianchi o petali di fiori bianchi della data pianta (es. Phlox o Chrysanthemum) vengono posti a contatto con alcune gocce di ammoniaca concentrata. Si ottiene un colore giallo.

2. Estrarre i fiori bianchi a bagnomaria con alcol acquoso.

3. Decantare l'estratto e dividerlo in tre porzioni:

(i) A una porzione aggiungere un alcali. Il colore cambia in giallo. Acidificare questo aggiungendo alcune gocce di HCl. Il colore scompare.

(ii) Alla seconda porzione aggiungere una soluzione basica di acetato di piombo. Viene prodotto un precipitato giallo o arancione.

(iii) Alla terza porzione dell'estratto aggiungere la soluzione di cloruro ferrico. Appare un colore verde o marrone.

Tutti e tre questi test indicano la presenza di antoxantina nel materiale.

2. Esperimenti sull'ascesa della linfa nelle piante:

Scopo dell'esperimento:

Per dimostrare che l'acqua sale attraverso lo xilema della pianta.

Una pianta di balsamo, provetta grande, portaprovette, acqua, cotone, colorante eosina, rasoio, vetrini, glicerina, microscopio, coprioggetto.

1. Prendi una pianta di balsamo completa con radici, stelo, foglie e fiori.

2. Conserva la pianta in una grande provetta contenente una soluzione di eosina.

3. Fissare un tampone di cotone all'imboccatura della provetta e mantenere l'esperimento indisturbato per 2-3 ore (Fig. 14).

4. Tagliare la sezione trasversale dello stelo con un rasoio, posizionarlo sul vetrino e studiare al microscopio.

Si osserva che le basi del picciolo ed i petali sono diventati di colore rosa. Nella sezione trasversale del fusto solo lo xilema ha preso la macchia.

La macchia rosa delle basi del picciolo e dei petali indica che la macchia di eosina ha raggiunto le basi del picciolo e i fiori attraverso lo stelo della radice e le foglie. Lo studio della sezione trasversale al microscopio rivela che solo le cellule dello xilema sono colorate, indicando così che la soluzione si è spostata attraverso lo xilema.

3. Esperimenti sulla guttazione nelle piante:

Scopo dell'esperimento:

Per dimostrare il processo di guttazione con pianta intera in vaso.

Una pianta in vaso di nasturzio da giardino, acqua, campana di vetro (al posto del nasturzio da giardino si possono prendere anche altre piante come piantine di avena, piantine di grano, pomodoro, colocasia, ecc.).

1. Prendi una pianta in vaso di nasturzio da giardino e annaffiala abbondantemente.

2. Copri il vaso lungo la pianta con una campana di vetro e riponilo in un luogo fresco e buio.

3. Collegare l'apparecchio ad un aspiratore e renderlo ermetico (Fig. 17).

4. Mantieni l'esperimento a per alcune ore e osserva i cambiamenti.

L'essudazione lenta dell'acqua inizia sulla punta di ogni foglia. Queste gocce d'acqua si ingrandiscono gradualmente e possono cadere o scorrere lungo il lato della foglia.

Questa essudazione d'acqua è dovuta al fenomeno della guttazione. Quando la pianta viene annaffiata abbondantemente, l'acqua viene espulsa dai vasi xilematici attraverso gli spazi intercellulari e fuori dalla pianta da strutture simili a pori e timide (chiamate hydathodes, pori d'acqua o stomi d'acqua, Fig. 19) presenti ai margini delle foglie.

L'acqua trasuda attraverso idatodi con l'aiuto di una pressione sviluppata nella linfa degli elementi xilematici. Si ritiene che sia una pressione identica alla pressione della radice. L'acqua essudata contiene anche aminoacidi, sali minerali, zuccheri e tracce di altri soluti.

La guttazione si verifica abbondantemente quando le condizioni sono tali che l'assorbimento dell'acqua da parte delle radici è molto elevato e la velocità di traspirazione è molto lenta. La guttazione può essere dimostrata anche con una singola foglia di nasturzio da giardino appena tagliata quando è fissata a un'estremità di un tubo a U munito di un tappo di sughero e riempito d'acqua. Dall'altra estremità del tubo a U aggiungere una piccola quantità di mercurio che aiuta a forzare l'acqua nel picciolo.

4. Esperimenti sulla traspirazione nelle piante:

Scopo dell'esperimento:

Per confrontare la traspirazione stomatica e cuticolare delle foglie di piante diverse con il metodo del cloruro di cobalto.

Foglie delle piante da confrontare per traspirazione (preferibilmente da lavorare nelle condizioni allegate), soluzione al 3% di cloruro di cobalto, carta da filtro, vetrini, pinze, graffette, cronometro, essiccatore, cloruro di calcio anidro e vaselina.

(a) Preparazione dei dischi di cloruro di cobalto:

1. Preparare una soluzione al 3% di cloruro di cobalto e immergervi le carte da filtro.

2. Rimuovere l'eccesso di soluzione di cloruro di cobalto dalle carte da filtro strizzandole con un rullo di gomma e lasciarle asciugare.

3. Tagliare la carta da filtro in piccoli dischi di diametro definito, farli asciugare assolutamente in forno a 30°-40°C e conservarli in essiccatore. I dischi asciutti sono di colore blu.

(b) Confronto della perdita d'acqua da entrambe le superfici fogliari:

4. Prendi una foglia della pianta e metti un disco di carta al cloruro di cobalto sulla sua superficie superiore e uno su quella inferiore. Premili con vetrini puliti.

5. Agganciare le due slitte con due clip separate, renderle ermetiche con vaselina e avviare il cronometro (Fig. 24).

6. Annotare l'ora in cui il colore blu del disco diventa rosa.

7. Ripetere lo stesso esperimento con le foglie delle altre piante da confrontare per il tasso di traspirazione.

Le osservazioni di cui sopra indicano che il tempo necessario per il cambiamento dal blu al rosa sulla pagina inferiore delle foglie è inferiore a quello della pagina superiore.

Poiché il colore cambia rapidamente sulla superficie inferiore rispetto alla superficie superiore in tutte le foglie lavorate, si può concludere che più acqua è traspirata dalla superficie inferiore, e quindi sono presenti più stomi su questa superficie rispetto alla superficie superiore.

5. Esperimenti sulla nutrizione minerale nelle piante:

Scopo dell'esperimento:

Dimostrare l'esperimento di coltura dell'acqua per mostrare la nutrizione minerale nelle piante.

Sette grandi vasi di vetro, sughero diviso, piantine di dimensioni quasi uguali (di mais, avena, pomodoro o tabacco), soluzione nutritiva di Sach (soluzione normale e soluzioni con carenza di calcio, carenza di azoto, carenza di potassio, carenza di fosforo, carenza di ferro e carenza di magnesio), carta nera.

(A) Preparazione della normale soluzione nutritiva di Sach:

La seguente composizione rende la normale soluzione nutritiva di Sach:

(B) Preparazione della soluzione nutritiva di Sach con diverse carenze:

(a) Soluzione per carenza di calcio:

Invece di solfato di calcio e fosfato di calcio utilizzare solfato di potassio e fosfato di sodio.

(b) Soluzione per carenza di azoto:

Invece del nitrato di potassio, usa il cloruro di potassio.

(c) Soluzione per la carenza di fosforo:

Al posto del fosfato di calcio utilizzare nitrato di calcio.

(d) Soluzione per carenza di potassio:

Al posto del nitrato di potassio utilizzare nitrato di sodio.

(e) Soluzione per la carenza di ferro:

Non usare solfato ferroso.

(f) Soluzione per carenza di magnesio:

Al posto del solfato di magnesio utilizzare solfato di potassio.

1. Prendete sette barattoli di vetro grandi e fateli pulire bene con acqua calda e infine con acqua distillata.

2. In un vasetto riempire la normale soluzione nutritiva Sach’s e nei restanti sei vasetti, riempire le soluzioni che hanno rispettivamente la carenza di calcio, azoto, fosforo, potassio, ferro e magnesio. Segna tutti questi barattoli come Normal, Ca, N, P, K, Fe e Mg con una matita per marcare il vetro (Fig. 33).

3. Prendere giovani piantine di dimensioni quasi uguali alle piante (di avena, mais, pomodoro o tabacco), inserirle in sette diversi tappi di sughero e fissare un tappo di sughero in ciascuno dei barattoli in modo che le radici delle piantine sono immersi nelle soluzioni.

4. Avvolgere i vasetti con carta nera per controllare la crescita delle alghe e mantenerli in condizioni luminose e calde.

5. Cambiare il liquido quasi ogni giorno con uno nuovo e annotare i cambiamenti per circa un mese.

La crescita e la salute generale delle piantine è assolutamente normale nella soluzione normale mentre è diversa, rachitica o frenata in molti modi nelle soluzioni con carenza di qualche o altro elemento.

Gli effetti della carenza di diversi minerali sono diversi nelle diverse piante.

6. Esperimenti sulla fotosintesi:

Scopo dell'esperimento:

Per dimostrare che l'anidride carbonica è necessaria per la fotosintesi.

Due campane, pianta in vaso, aspiratore, bicchieri, calce sodata, potassa caustica, lastra di vetro (2), materiale inerte, due tubi larghi che terminano con un tubo sottile, grasso, iodio.

1. Prendi due piante in vaso e mettile al buio per due giorni per farle deamidate.

2. Posizionare le pentole su un piatto di vetro e coprirle con una campana di vetro.

3. L'imboccatura di entrambe le campane è munita di un tappo di sughero a due fori. Attraverso un foro viene inserito un tubo a bocca larga che termina in un tubo sottile e attraverso l'altro foro viene inserito un tubo piegato che rimane collegato con un aspiratore (Fig. 35).

4. Il tubo a bocca larga di una campana è pieno di calce sodata. Nella campana mettete due bicchieri contenenti potassa caustica.

5. Il tubo a bocca larga di un'altra campana è riempito con del materiale inerte come i sassolini, e in questa campana metti due bicchieri contenenti acqua al posto della potassa caustica. Funziona come un controllo.

6. Applicare grasso alla base della campana di vetro per evitare il passaggio dell'aria e tenere entrambi gli apparecchi al sole per alcune ore e osservare.

Prova separatamente le foglie di entrambe le piante per l'amido. Le foglie della pianta, poste sotto una campana di vetro con potassa caustica nel bicchiere e calce sodata nel tubo, mostrano test negativo per l'amido mentre le foglie dell'altra campana (in cui i bicchieri contengono acqua e il tubo è pieno di sassolini) sono positive prova per l'amido.

Il test negativo per l'amido nelle foglie di una pianta indica che non c'è formazione di amido nelle sue foglie a causa dell'assenza di CO2. Tutte le altre condizioni per la fotosintesi (cioè luce, clorofilla, acqua e temperatura) sono normali.

Solo CO2 non è presente nei dintorni dell'impianto perché la CO2 dell'aria in ingresso attraverso il tubo a bocca larga viene assorbita dalla calce sodata e l'aria in ingresso è esente da CO2. D'altra parte la CO2, che sta uscendo nel processo di respirazione della pianta, viene assorbito dalla potassa caustica posta nei bicchieri.

Le foglie dell'altra pianta mostrano un test positivo per l'amido perché tutti i requisiti essenziali per la fotosintesi, cioè luce, clorofilla, acqua, temperatura e anche CO2, sono presenti nei suoi dintorni.

Quindi, CO2 è necessario per la fotosintesi.

7. Esperimenti sulla respirazione nelle piante:

Scopo dell'esperimento:

Per misurare e confrontare il tasso di respirazione di varie parti di piante con metodo volumetrico utilizzando i tubi di Pettinkoffer.

Vasi, substrato respiratorio, apparato di Pettinkoffer, soluzione di idrossido di bario, supporto in legno, regolatore di pressione (pompa aspirante), grasso, calce sodata, acido ossalico, fenoloftaleina, carbonato di bario, potassa caustica, buretta, bicchieri, cilindro graduato, bilancia con pesatura scatola.

1. Riempire i vasetti con soda lime e metterci circa 100 g. materiali respiratori nella camera del tubo a U.

2. Ora riempire le provette lunghe e strette di Pettinkoffer con una soluzione di idrossido di bario a concentrazione nota (N/10). Posizionare i tubi del Pettinkoffer in modo tale da essere orientati obliquamente su un supporto di legno.

3. Collegare i tubi con una pompa di aspirazione o un regolatore di pressione.

4. Rendere ermetico l'intero apparecchio applicando grasso.

5. Ora consentire al regolatore di pressione di funzionare. A causa di ciò la corrente d'aria si precipita nei barattoli pieni di calce sodata che assorbe l'anidride carbonica dell'aria. L'aria ora passa attraverso il materiale vegetale posto nella camera respiratoria a forma di U (Fig. 53).

6. Dalle camere a forma di U, l'aria viene ora fatta gorgogliare attraverso i tubi del Pettinkoffer riempiti con una soluzione di idrossido di bario.

7. Per regolare un lento movimento di aria e bolle attraverso la calce sodata, il substrato respiratorio e la soluzione di idrossido di bario, il regolatore di pressione può funzionare. L'aria prima passa attraverso uno dei tubi di Pettinkoeffer e poi viene lasciata fluire attraverso il secondo tubo.

8. Ora rimuovere la prima provetta e titolare il suo contenuto. A causa della presenza di carbonato di bario precipitato (BaCO3) il contenuto diventa torbido.

9. Misura circa 25 ml. del contenuto della provetta di Pettinkoffer, cioè carbonato di bario e titolare contro una soluzione N/10 di acido ossalico.

10. Le gocce di fenolftaleina vengono utilizzate come indicatore nel becher contenente carbonato di bario e annotare il punto finale.

Osservazioni e risultati:

Osservazioni e risultati possono essere annotati nella forma della seguente tabella:

(un1 = Normalità nota dell'acido ossalico.

Si calcola come segue:

Peso molecolare dell'acido ossalico = 126

Peso equivalente 126/2 = 63

N/10= 6,3 g. di acido ossalico sciolto in 1000 cc di acqua

(b) V1 = Volume noto di acido ossalico utilizzato = 10 cc

(c) N2 = Normalità della soluzione di idrossido di bario, da determinare.

(d) V2 = Volume di carbonato di bario =25 cc

In questo modo N1V1 = N2V2 può essere calcolato come segue:

Pertanto, N2 = 6.3 × 10 / 25= 2.52

La quantità di CO2 prodotto da 100 g. di un dato materiale vegetale (substrato respiratorio) è 2,5 mg/litro in un'ora. Allo stesso modo, è possibile determinare la velocità di respirazione di diversi substrati respiratori o diverse parti di piante.

8. Esperimenti sul tasso di crescita nelle piante:

Scopo dell'esperimento: misurare il tasso di crescita delle piante con un microscopio orizzontale.

Microscopio orizzontale con stativo verticale dotato di scala lineare scorrevole, penna, pianta o ramoscello della pianta da misurare.

Nel microscopio orizzontale (Fig. 57), l'ottica rimane in posizione orizzontale. È sostenuto da un supporto verticale dotato di una scala lineare scorrevole. Il suo tubo ottico può essere spostato sia verso l'alto che verso il basso con l'aiuto di una vite. Con l'aiuto di una scala lineare, è possibile misurare il movimento verticale.

La crescita da questo microscopio viene misurata nel modo seguente:

1. Fai un piccolo punto sull'apice del tiro con l'aiuto di una penna.

2. Mettere a fuoco questo punto di inchiostro del microscopio osservando attraverso il suo oculare.

3. Dopo 24 ore osservare di nuovo lo stesso punto di inchiostro che ora si è alzato a causa della crescita della pianta. Spostare il microscopio verso l'alto, metterlo a fuoco e annotare la distanza tra la lettura iniziale e quella finale.

4. Annotare le letture giornalmente per 10 giorni dopo un intervallo definito di 24 ore.

Ogni giorno si osserva un aumento delle letture. Ciò indica che la pianta cresce ogni giorno.

9. Esperimenti sulla crescita delle piante attraverso la promozione di sostanze:

Biodosaggio di auxina, gibberellina, citochinina, acido abscissico (ABA) ed etilene utilizzando materiale vegetale appropriato.

Per saggio biologico si intende la determinazione quantitativa di una sostanza misurando i suoi effetti biologici ad esempio sulla crescita, ovvero l'uso di un organismo per testare l'ambiente, oppure è la determinazione della potenza di un prodotto biologico testando il suo effetto su un organismo .

Materiali vegetali appropriati o materiali per analisi biologiche menzionati nella tabella seguente.

Metodo, osservazioni e risultati:

Vedi la tabella seguente:

10. Esperimenti sulla biotecnologia:

Scopo dell'esperimento:

Elaborare i passaggi generalizzati utilizzati nella metodologia della coltura tissutale in un materiale vegetale.

Materiale vegetale (ad es. pianta di carota matura), acqua, bisturi o rasoio, piralide di sughero, piastre di Petri sterili, terreno di iniziazione del callo (ad es. terreno di Murashige-Skoog’s) con 2, 4-D, terreno di sviluppo dei germogli, vaso con terreno.

1. Prendi una pianta di carota matura (Fig. 2A) con la sua radice a fittone intatta, rimuovi le foglie e lava accuratamente la sua radice a fittone (Fig. 2B).

2. Tagliare la radice del fittone in 3 o 4 pezzi (Fig. 2C) con un bisturi affilato o un rasoio.

3. Inserire la piralide del sughero in un pezzo di radice del rubinetto (Fig. 2D) ed estrarre le regioni di radice desiderate.

4. Mettere un pezzo di radice del rubinetto così rimosso in un petridish sterile e tagliarlo trasversalmente in piccoli pezzi come mostrato in (Fig. 2E).

5. Prendere del terreno per l'iniziazione del callo (ad es. Murashige-Skoog’s medium o medium MS) con 2, 4-D in un petridish sterile, posizionare alcuni dischi o tagliare pezzi di radice del fittone su di esso e incubare per 6-8 settimane. La formazione del callo inizia entro 4-6 settimane (Fig. 2 F).

6. Trasferire i calli in un altro mezzo di sviluppo dei germogli contenente petridish. Le giovani piante con radici e germogli (Fig. 2G) iniziano a svilupparsi entro 4-8 settimane.

7. Queste giovani piante vengono trasferite in vasi contenenti terriccio (Fig. 2 H) dove si sviluppano in piante mature (Fig. 2A).


Formazione in microscopia e imaging digitale

La microscopia a fluorescenza widefield e confocale è in grado di ingrandire e visualizzare fluorofori che emettono luce con una risoluzione che si avvicina a un quarto di micrometro, consentendo così lo studio di eventi dinamici e i dettagli strutturali fini dell'architettura cellulare. Utilizzando queste tecniche, sono state ottenute informazioni chiave su numerosi eventi che si verificano all'interno di cellule, tessuti e interi organismi, incluso il trasporto intracitoplasmatico di vescicole, la struttura del citoscheletro, i meccanismi di rimodellamento dei tessuti e la migrazione delle cellule tumorali in un organismo malato. Al centro del recente drammatico aumento dell'uso della microscopia a fluorescenza nella biologia cellulare è stato lo sviluppo di proteine ​​​​fluorescenti geneticamente codificate che agiscono come etichette endogene per consentire a qualsiasi proteina o peptide di diventare un faro fluorescente per l'imaging e l'analisi. L'ampia disponibilità di nuova strumentazione avanzata e sistemi di rilevamento altamente sensibili ha inoltre consentito l'acquisizione di immagini superiori con caratteristiche spazio-temporali appropriate per affrontare una vasta gamma di questioni biologiche.

Nonostante il suo impatto rivoluzionario sulla biologia, tutte le forme tradizionali di microscopia a fluorescenza (inclusi widefield, confocale e multifotone) affrontano un limite di risoluzione imposto dalla diffrazione della luce attraverso lenti e aperture circolari. Il carattere ondulatorio della luce diffratta impedisce agli oggetti più piccoli di circa 200 nanometri nelle dimensioni laterali ( x , y ) e di circa 500 nanometri nella dimensione assiale ( z ) di essere visualizzati come qualcosa di diverso da una sfocatura. A causa del fatto che la maggior parte delle strutture subcellulari (come le fibre di actina, i filamenti intermedi, i microtubuli, i ribosomi e le vescicole di trasporto) presentano caratteristiche molto più piccole di queste dimensioni, un meccanismo per rompere la barriera di diffrazione e l'imaging al di sotto del limite di dimensione che esso definisce, è stato per secoli il Santo Graal della microscopia ottica.

Nell'ultimo decennio sono state introdotte diverse strategie concettuali distinte per superare la barriera di diffrazione e consentire l'analisi delle strutture biologiche a livello di superrisoluzione. Una strategia altamente sviluppata, spesso definita ingegneria della funzione di diffusione del punto o superrisoluzione basata sull'illuminazione, utilizza approcci ottici non lineari per ridurre le dimensioni del punto focale. Esempi di questo tipo di imaging a superrisoluzione sono la microscopia a deplezione di emissione stimolata (STED), a deplezione dello stato fondamentale (GSD) e a illuminazione strutturata saturata (SSIM). Modificando il modello di luce di eccitazione attraverso l'ingegneria controllata della funzione di diffusione del punto per produrre una dimensione del punto focale molto più piccola, queste tecniche avanzate sono in grado di risolvere dettagli strutturali fini nei campioni biologici. Risoluzioni che si avvicinano a 20 e 50 nanometri nelle dimensioni laterali sono state ottenute rispettivamente con STED e SSIM.

Una seconda (e sempre più popolare) strategia per superare la barriera di diffrazione impiega sonde fluorescenti fotocommutabili per risolvere le differenze spaziali in dense popolazioni di molecole con superrisoluzione. Questo approccio si basa sull'attivazione stocastica della fluorescenza per fotocommutare in modo intermittente singole molecole fotoattivabili in uno stato luminoso, che vengono quindi fotografate e fotosbiancate. Pertanto, le molecole molto ravvicinate che risiedono nello stesso volume limitato dalla diffrazione (e sarebbero altrimenti spazialmente indistinguibili vedi Figura 1 (a)), sono temporalmente separate. L'unione di tutte le posizioni delle singole molecole ottenute da ripetuti cicli di fotoattivazione seguiti da imaging e sbiancamento produce l'immagine finale a superrisoluzione (Figura 1 (b)). Le tecniche basate su questa strategia sono spesso indicate come superrisoluzione basata su sonda e sono comunemente denominate microscopia di localizzazione fotoattivata ( PALM ), microscopia di localizzazione di fotoattivazione a fluorescenza ( FPALM ) e microscopia di ricostruzione ottica stocastica ( STORM ). Tutti e tre i metodi si basano sugli stessi principi, ma sono stati originariamente pubblicati utilizzando diverse sonde fotocommutabili. Presentato in Figura 1 è un esempio di imaging a superrisoluzione utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF). La Figura 1 (a) è l'immagine pixelata di singole molecole proteiche fluorescenti attaccate a un coprioggetto. Le posizioni delle singole molecole non possono essere determinate con precisione a causa delle loro funzioni di diffusione puntuale sovrapposte, ma il centro delle molecole proteiche può essere risolto temporalmente con elevata precisione (Figura 1 (b)) utilizzando PALM o tecniche simili.

PALM e FPALM sono stati sviluppati utilizzando proteine ​​fluorescenti fotoattivabili o fotoconvertibili (tandem dimero Eos e GFP fotoattivabile, PA-GFP) come sonde commutabili, mentre STORM è stato originariamente pubblicato utilizzando i coloranti carbocianina sintetici, Cy3 e Cy5, per etichettare molecole di DNA corte. Indipendentemente dalle piccole differenze nello sviluppo storico, è possibile e pratico condurre esperimenti PALM con coloranti sintetici ed esperimenti STORM con proteine ​​fluorescenti. In contrasto con la situazione con la classica microscopia a fluorescenza, la microscopia a superrisoluzione basata su sonda consente di definire strutture biologiche con precisione nanometrica, simile alle più sofisticate tecniche di superrisoluzione basate sull'illuminazione. Tuttavia, l'applicazione di tecniche di imaging di localizzazione di singole molecole consente anche alle sonde fluorescenti che evidenziano le strutture subcellulari di essere identificate individualmente ad alte densità molecolari in modo che possano essere analizzate le loro distribuzioni e dinamiche. Tale alta risoluzione apre le porte a molte possibilità per affrontare questioni meccanicistiche riguardanti la funzione biologica, inclusa la mappatura del macchinario molecolare, nonché la stechiometria e la dinamica.

La configurazione di base del microscopio per la superrisoluzione a singola molecola a riflessione interna totale (TIRF) widefield è presentata nella Figura 2. I laser di fotoattivazione e lettura (rispettivamente 405 e 561 nanometri) sono posizionati in modo che possano essere chiusi o utilizzati contemporaneamente quando necessario. La disposizione più versatile accoppia direttamente i laser al microscopio senza fibre ottiche per fornire la massima quantità di potenza (sebbene gli strumenti commerciali abbinino in modo efficiente i laser utilizzando fibre ottiche). Un sistema di telecamere raffreddato con dispositivo ad accoppiamento di carica moltiplicatore di elettroni ( EMCCD ) è collegato alla porta posteriore del microscopio, che dovrebbe ricevere il 100 percento della luce di emissione per il massimo segnale-rumore. Il campione è montato in un supporto specializzato e imbullonato allo stadio di precisione x - y per raccogliere immagini transitorie di singole molecole. Un obiettivo ad alta apertura numerica è posizionato sotto il campione e opera in modalità TIRF. L'uso di un sistema condensatore ausiliario a campo chiaro (non mostrato) dotato di contrasto di interferenza differenziale (DIC) consente l'esame del campione per cercare regioni adatte del campione per l'imaging di singole molecole. Al centro della strumentazione c'è un sistema informatico ad alta velocità che acquisisce ed elabora le immagini registrate dalla telecamera.

Sia le tecniche di superrisoluzione basate sull'illuminazione, come STED, sia le tecniche basate su sonde, come PALM, consentono ora ai biologi di visualizzare strutture e processi dinamici nelle cellule a livello molecolare o in prossimità di esso. Il miglioramento dell'ordine di grandezza nella risoluzione spaziale ottenuto rispetto alla precedente metodologia di microscopia ottica indica che questi nuovi approcci mostrano un enorme potenziale per affrontare innumerevoli questioni biologiche che richiedono una risoluzione punto-punto al di sotto del limite di diffrazione di 200 nanometri. Ad oggi, la microscopia a superrisoluzione ha fornito dettagli sull'architettura fine delle strutture cellulari come mitocondri, lisosomi, adesioni focali, microtubuli, filamenti di actina e vescicole rivestite. Sono stati anche osservati processi dinamici, incluso il movimento di complessi di adesione focale, trasporto di vescicole a sub-risoluzione e complessi di polarità dei batteri, nonché singole molecole vincolate alla membrana plasmatica. Senza dubbio, questi sforzi esplorativi alla fine cederanno a numerose indagini sui misteri della struttura e della funzione cellulare.

Torna all'inizio ^ Concetti fondamentali nell'imaging PALM

Il principio che circonda la microscopia di localizzazione fotoattivata e le tecniche correlate si basa su una combinazione di imaging di singoli fluorofori (imaging a singola molecola) insieme all'attivazione controllata e al campionamento di sottoinsiemi sparsi di queste etichette nel tempo. L'imaging a singola molecola è stato inizialmente dimostrato nel 1989, prima a temperature criogeniche e successivamente a temperatura ambiente utilizzando la microscopia ottica a scansione in campo vicino. Da quel momento, la metodologia si è evoluta fino a diventare una tecnica standard di microscopia widefield. La conoscenza a priori che l'immagine di una molecola a diffrazione limitata proviene da un'unica fonte consente di stimare la posizione (centro) di quella molecola con una precisione ben oltre quella del limite di diffrazione. Questo alto livello di precisione è scalabile con l'inverso del quadrato del numero di fotoni rilevati, come verrà descritto di seguito.

In termini generali, una singola molecola fluorescente forma un'immagine diffrazione limitata avente dimensioni laterali e assiali definite dalla lunghezza d'onda di eccitazione, dall'indice di rifrazione del mezzo di imaging e dall'apertura angolare dell'obiettivo del microscopio:

Risoluzione x,y = λ / 2[η • sin(α)] (1) Risoluzione z = 2λ / [η • sin(α)] 2 ( 2)

dove λ è la lunghezza d'onda della luce (eccitazione in fluorescenza) e il termine combinato η • sin(α) è noto come apertura numerica dell'obiettivo ( NA ). Gli obiettivi comunemente usati in microscopia hanno un'apertura numerica inferiore a 1,5 (sebbene i nuovi obiettivi ad alte prestazioni si avvicinino molto a questo limite), limitando il termine α nelle equazioni (1) e (2) a meno di 70 gradi. Pertanto, il limite teorico di risoluzione alla lunghezza d'onda di eccitazione pratica più corta (circa 400 nanometri quando si utilizza un obiettivo avente un'apertura numerica di 1,40) è di circa 150 nanometri nella dimensione laterale e si avvicina a 400 nanometri nella dimensione assiale. In termini pratici per l'imaging della proteina fluorescente verde potenziata ( EGFP ) nelle cellule viventi, questi valori sono rispettivamente di circa 200 e 500 nanometri. Pertanto, le strutture che si trovano a una distanza inferiore a 200-250 nanometri non possono essere risolte sul piano laterale utilizzando un microscopio a fluorescenza a campo largo o confocale.

Quando si esamina il piano dell'immagine laterale in un campo visivo di emettitori di singole molecole, la porzione centrale di ciascun punto limitato dalla diffrazione corrisponde alla probabile posizione di una molecola e può essere localizzata con elevata precisione nanometrica raccogliendo un numero sufficiente di fotoni. I metodi per determinare il centro di localizzazione si basano su un adattamento della curva statistica della distribuzione dei fotoni misurati (in effetti, lo spot dell'immagine, ma indicato anche come funzione di diffusione del punto) a una funzione gaussiana (vedi Figura 3). L'obiettivo finale di questo esercizio è determinare il centro o il valore medio della distribuzione dei fotoni ( μ = x 0 , y 0 ) e la sua incertezza, l'errore standard della media, σ , secondo l'equazione:

dove N è il numero di fotoni raccolti, a è la dimensione in pixel del rilevatore CCD di imaging, b è la deviazione standard dello sfondo (che include l'emissione di fluorescenza di sfondo combinata con il rumore del rilevatore) e si è la deviazione standard o larghezza del distribuzione (in direzione i ). L'indice i si riferisce alla direzione x o y. Il primo termine sotto la radice quadrata sul lato destro dell'equazione (3) si riferisce al rumore del fotone, mentre il secondo termine comprende l'effetto della dimensione finita dei pixel del rivelatore. L'ultimo termine tiene conto dell'effetto del rumore di fondo. Applicando queste semplici tecniche matematiche, è possibile ottenere una precisione di localizzazione di circa 10 nanometri con una distribuzione di circa 1000 fotoni quando il rumore di fondo è trascurabile. L'estensione di questa intuizione ha portato a una serie di esperimenti intelligenti che studiano strutture isolate che sono separate da meno del limite di diffrazione, come motori molecolari etichettati e "righelli" molecolari di DNA su scala nanometrica. Un importante sviluppo tecnologico nel supportare la superrisoluzione basata su sonda è la disponibilità diffusa e la facilità d'uso dei sistemi di telecamere EMCCD (vedere la Figura 2), che hanno sensibilità al singolo fotone.

Come descritto dall'equazione (3), la chiave per risultati di alta precisione per la localizzazione molecolare nell'imaging a superrisoluzione a singola molecola è ridurre al minimo il rumore di fondo e massimizzare l'uscita di fotoni dalla sonda fluorescente, un compito più facile da descrivere che da realizzare. Nel migliore dei casi, se è possibile raccogliere 10.000 fotoni in assenza di sfondo prima che il fluoroforo si schiarisca o si spenga, il centro di localizzazione può essere determinato con una precisione di circa 1-2 nanometri. Al contrario, se vengono raccolti solo 400 fotoni, l'accuratezza della localizzazione scende a circa 20 nanometri o peggio. Lo sfondo nei campioni in superrisoluzione deriva dall'autofluorescenza naturale o indotta dal reagente di trasfezione, nonché dalla fluorescenza residua delle sonde circostanti che sono entrate nello stato oscuro. Pertanto, per le tecniche di imaging a superrisoluzione a singola molecola basate su sonda come PALM, le molecole fluorescenti dovrebbero visualizzare un elevato rapporto di contrasto (o intervallo dinamico), che è definito come il rapporto di fluorescenza prima e dopo la fotoattivazione. La variabilità nei rapporti di contrasto nelle proteine ​​fluorescenti e nei fluorofori sintetici è dovuta alle differenze nella loro fotoconversione spontanea in assenza di attivazione controllata.

Illustrati nella Figura 3 sono i passaggi coinvolti nella localizzazione di singole molecole con elevata precisione adattando la funzione point-spread a una funzione gaussiana. Nella Figura 3 (a), la funzione di diffusione del punto di un microscopio a fluorescenza ad ampio campo è sovrapposta a una rappresentazione wireframe della matrice di pixel da una fotocamera digitale in due (in alto a sinistra) e diagrammi tridimensionali. La funzione di diffusione del punto pixel di un singolo fluoroforo come ripreso con un EMCCD è mostrata in alto a sinistra della Figura 3 (b) e modellata da una funzione gaussiana tridimensionale, con l'intensità per ogni pixel mappato a colori nella parte centrale porzione della Figura 3(b). Una mappa di contorno delle intensità è presentata nella Figura 3 (c). Nei casi in cui due mappe di contorno si sovrappongono a causa dell'emissione da parte di fluorofori con una distanza di separazione inferiore al limite di diffrazione, il baricentro per ciascun fluoroforo può essere localizzato individualmente sottraendo la funzione di diffusione del punto di un fluoroforo dall'altro (dopo che è entrato in un buio stato o è fotosbiancato) a causa della strategia di mappatura temporale per la generazione di immagini PALM.

La maggior parte delle strutture e degli organelli osservati dalla microscopia a fluorescenza nei sistemi biologici sono molto densamente popolati di fluorofori, con significativamente più di una molecola che condivide lo stesso volume limitato dalla diffrazione. In tali casi, la localizzazione di una singola molecola è virtualmente impossibile a causa del fatto che le immagini di fluorescenza risultanti appaiono come una distribuzione altamente sovrapposta di punti sfocati limitati dalla diffrazione. Il meccanismo attorno a questa situazione, e centrale per il concetto che circonda PALM, è localizzare in sequenza sottoinsiemi sparsi di molecole. Questo concetto è stato dimostrato per la prima volta da Eric Betzig e Harald Hess un decennio prima che PALM fosse introdotto risolvendo centri luminescenti densamente distribuiti (con spettri distinti) in un pozzo quantistico mediante imaging con una lunghezza d'onda finemente classificata. Di conseguenza, sebbene vi fossero molti centri confinati all'interno di un volume a risoluzione spaziale, diventavano risolvibili quando separati lungo un'altra dimensione, la lunghezza d'onda.

La generalizzazione dell'esperimento di Betzig e Hess per la microscopia è che se la risposta fluorescente di un insieme di molecole può essere distribuita in uno spazio dimensionale superiore, allora sarebbe possibile visualizzare le sorgenti individualmente, localizzare ciascuno dei loro centri, e quindi accumulare le coordinate del centro per creare un'immagine a superrisoluzione. Il concetto è stato applicato con successo in diverse indagini prima dell'introduzione di PALM e STORM. Utilizzando la spettroscopia laser, gli spettri (e la localizzazione) dei fluorofori organici sovrapposti sono stati separati con successo, sebbene a temperature criogeniche. Successivamente, la metodologia è stata estesa alla localizzazione di singole molecole tramite photobleaching sequenziale o reclutamento stocastico di sonde fluorescenti in un sito di legame stazionario. Inoltre, la localizzazione di singole molecole è stata dimostrata attraverso l'analisi del lampeggio stocastico dei punti quantici.

La microscopia a superrisoluzione basata su sonda è diventata una realtà con la scoperta di etichette fluorescenti fotoattivabili (sia proteine ​​fluorescenti che fluorofori sintetici) che potrebbero essere attivate in sequenza in tempo per produrre migliaia di sottoinsiemi sparsi. Il principio di funzionamento di questa metodologia è iniziare con la stragrande maggioranza delle etichette fluorescenti allo stato inattivo e non contribuire alla fluorescenza del campione. Una piccola frazione (meno dell'1%) viene quindi attivata dall'illuminazione con luce quasi ultravioletta (in alcuni casi sono utili altre regioni spettrali) per indurre una modificazione chimica in poche molecole che consenta loro di diventare fluorescenti.Quel sottoinsieme sparso viene quindi ripreso e localizzato per generare coordinate con precisione a livello di nanometro (vedi Figura 3). Le etichette registrate vengono quindi rimosse mediante photobleaching in modo che un nuovo sottoinsieme sparso possa essere trasferito nello stato attivo e campionato per raccogliere un nuovo insieme di coordinate molecolari. Il processo può essere ripetuto molte migliaia di volte fino al punto in cui milioni di tali coordinate molecolari si accumulano all'interno della regione oggetto dell'immagine. Un'immagine composita resa da tutti gli insiemi di coordinate produce un'immagine a superrisoluzione a singola molecola della struttura con etichetta fluorescente in esame. Si noti che le coordinate molecolari non sono effettivamente rappresentate da un singolo punto per identificare la loro posizione spaziale, ma per costruire la mappa dell'immagine viene impiegata una distribuzione di intensità gaussiana corrispondente all'incertezza di posizione della loro posizione.

Torna su ^ Tecniche di localizzazione molecolare

È stata descritta una serie di tecniche di localizzazione molecolare che identificano più di una molecola per punto focale limitato dalla diffrazione. Come discusso sopra, uno dei primi esperimenti di successo in questo campo è stato realizzato utilizzando il binning spettrale su singole specie luminescenti densamente distribuite in un pozzo quantistico. Una tecnica simile è stata applicata alle molecole di pentacene incorporate in un cristallo di para-terfenile per ottenere precisioni di localizzazione di circa 40 e 100 nanometri rispettivamente nelle dimensioni laterale e assiale. Un altro approccio ha esaminato le diverse durate fluorescenti nel colorante carbocianina, Cy5 e nel derivato della rodamina JF9 per localizzare due diverse molecole fluorescenti con lunghezze d'onda simili all'interno della stessa regione di diffrazione limitata. Allo stesso modo, le variazioni nei tassi di fotosbiancamento sono state utilizzate per visualizzare e localizzare sequenzialmente i campi di molecole fino a quando tutti non sono stati sbiancati. In questo esperimento, la determinazione del centroide è iniziata con la molecola più fotostabile, ha localizzato quella molecola e ha ripetuto il processo per localizzare fino a cinque molecole con una precisione di 10 nanometri nello stesso punto focale.

Sono stati segnalati anche diversi altri approcci alla localizzazione di singole molecole ad alta precisione, ma nessuno è stato applicato con successo a grandi insiemi, come quello trovato in un'adesione focale altamente fluorescente. Al contrario, PALM e tecniche strettamente correlate (come FPALM) hanno esteso questi concetti alla localizzazione di migliaia di molecole utilizzando proteine ​​fluorescenti fotoconvertibili o fotoattivabili. La tecnica STORM è stata introdotta sulla base del fenomeno di fotocommutazione dei comuni coloranti alla cianina quando situati in stretta vicinanza l'uno all'altro (meno di 2 nanometri). Questi progressi significativi hanno consentito ai ricercatori di attivare e disattivare ripetutamente le molecole in modo controllato e quindi di mantenere la bassa densità richiesta delle molecole rilevate. Poiché le nuove tecniche di superrisoluzione a singola molecola di PALM, FPALM e STORM hanno avanzato la localizzazione molecolare a un numero molto più elevato di molecole, questi approcci hanno avuto un impatto rivoluzionario sulla biologia cellulare e dovrebbero portare a molti altri nuovi sviluppi basati su principi simili.

Come accennato, al centro del concetto di imaging a superrisoluzione basata su sonda è la capacità di commutare selettivamente una molecola fluorescente tra uno stato luminoso e scuro (fotocommutazione) o tra uno spettro di emissione di fluorescenza e un altro (fotoconversione). Questo tipo di transizione è la base per un interruttore molecolare, che è dettagliato in un concetto denominato transizione fluorescente ottica reversibile saturabile/commutabile ( RESOLFT ). Il concetto RESOLFT include la commutazione dell'isomerizzazione tra gli stati cis e trans e varie altre transizioni otticamente bistabili nei fluorofori. Praticamente tutte le tecniche di superrisoluzione riportate, inclusi STED e GSD, comportano un qualche tipo di fotocommutazione o fotoconversione. Ad esempio, un metodo denominato PALM con acquisizione in esecuzione indipendente ( PALMIRA ) utilizza proteine ​​fluorescenti fotocommutabili, mentre molte altre tecniche, tra cui STORM diretta ( dSTORM ), microscopia fotosbiancante reversibile ( RPM ), deplezione dello stato fondamentale con ritorno di singole molecole ( GSDIM ), e la microscopia con funzione di diffusione del punto a doppia elica ( DH-PSF ) utilizzano tutti il ​​fotocommutamento in stati scuri utilizzando uno o più coloranti sintetici convenzionali, come verrà discusso di seguito.

Illustrato nella Figura 4 è la fotocommutazione di diversi fluorofori contenenti un sistema ad anello di xantene con una potenza laser moderata per dimostrare il concetto di esaurimento dello stato fondamentale e ritorno di una singola molecola. Il grafico presentato nella Figura 4 (a) mostra il rapido calo dell'intensità di fluorescenza per le sonde rodamina 6G e ATTO 532 in presenza di un agente di spegnimento dello stato di tripletta (beta-mercaptoetanolo) all'aumentare dell'intensità del laser di eccitazione. Si noti che l'intensità della fluorescenza inizia a diminuire rapidamente alla potenza laser relativamente bassa di circa 2 kilowatt per centimetro quadrato e poi scende molto più lentamente (quasi raggiungendo un plateau) sul resto della gamma di potenza. La Figura 4(b) mostra una traccia time-lapse dell'emissione di fluorescenza di singola molecola da molecole di ATTO 532 coniugate ad anticorpi secondari di capra diretti contro l'alfa-tubulina di topo in cellule HeLa cresciute su coprioggetto. Le cellule fissate e colorate sono state immerse in alcool polivinilico in presenza di quantità millimolari di beta-mercaptoetanolo. Si noti che a potenze laser più elevate, coloranti sintetici simili (come Alexa Fluor 488 e 568) entreranno in uno stato scuro di lunga durata da cui ritornano stocasticamente utilizzando solo semplici soluzioni saline senza l'aggiunta di tiolo o alcool ad alta viscosità. Quest'ultima tecnica è indicata come microscopia di photobleaching reversibile, come menzionato sopra, anche se il photoswitching sarebbe probabilmente un termine più appropriato per descrivere il fenomeno.

Torna all'inizio ^ Localizzazione molecolare ad alta densità

Poiché la raccolta di grandi insiemi di dati nella microscopia a superrisoluzione di localizzazione a singola molecola richiede tempistiche estese (soprattutto rispetto all'imaging widefield e confocale tradizionale), la maggior parte degli esperimenti PALM viene condotta su preparazioni cellulari o tissutali fissate. È improbabile che le cellule di coltura tissutale aderenti fissate con paraformaldeide subiscano alterazioni strutturali, quindi il tempo di acquisizione dell'immagine non è un fattore critico ed è normalmente dettato dal numero di molecole fluorescenti nel campione accoppiato con la pazienza dello sperimentatore. I campioni in questa categoria hanno prodotto una vasta gamma di immagini che rivelano l'organizzazione molecolare delle proteine ​​all'interno delle strutture subcellulari a risoluzione nanometrica, comprese le reti di actina filamentosa e microtubuli. Poiché i microtubuli sono filamenti distinti e ben caratterizzati con un diametro di circa 25 nanometri e situati a distanze variabili l'uno dall'altro, queste strutture sono ottimi candidati per i test di risoluzione e gli esercizi di configurazione del microscopio. Altri campioni potenzialmente utili per la convalida sono i costituenti di adesione focale e le proteine ​​incorporate nella membrana plasmatica o nei mitocondri.

Una caratteristica unica associata a tutte le tecniche di localizzazione di singole molecole è che il ricercatore ha la libertà di definire l'insieme di molecole che vengono visualizzate nell'output finale. Ad esempio, in alcuni casi vengono visualizzate solo le molecole che si localizzano con un'incertezza migliore di 10 nanometri, mentre in altri casi, basandosi sullo stesso set di dati, possono essere incluse molecole che si localizzano con una precisione di 20 nanometri o meno. Questa versatilità solleva un punto critico nell'imaging PALM a singola molecola che distingue tra l'elevata precisione molecolare e la risoluzione ottenibile con sonde e preparazioni di campioni specifici. Anche se la posizione delle molecole all'interno di un campione può essere determinata con elevata precisione (fino a un paio di nanometri nei casi migliori), la risoluzione dichiarata di elementi strutturali distinti deve comunque obbedire al criterio di campionamento di Nyquist di circa due punti dati per unità di risoluzione . Pertanto, la densità delle molecole localizzate diventa un fattore importante per le richieste di risoluzione, come illustrato nella Figura 5 per una fotografia tradizionale di un ragazzo.

Il concetto di precisione della localizzazione, risoluzione e densità molecolare nella localizzazione di una singola molecola è illustrato in modo astratto nella Figura 5. La serie di immagini di un ragazzo dimostra come l'immagine a superrisoluzione sia costruita tracciando molecole localizzate, rappresentate nella Figura 5 come punti. A scopo illustrativo, le dimensioni dei punti nei riquadri da (a) a (c) sono rappresentate molto più grandi di quanto sarebbe necessario per ottenere l'immagine finale presentata nel riquadro (d). L'immagine del ragazzo nella Figura 5 (a) mostra molti punti localizzati, ma la densità relativamente bassa non consente il riconoscimento dell'immagine. Man mano che vengono aggiunti più punti alle immagini in Figura 5(b) e 5(c), il ragazzo diventa più riconoscibile, ma distinguere (risolvere) i lineamenti fini associati al suo viso richiede una maggiore densità di punti dati, come mostrato in Figura 5 D). Il concetto importante da notare è che è possibile generare un'immagine che contiene punti dati localizzati con precisione utilizzando tecniche di localizzazione di singole molecole, ma la densità di quei punti influisce direttamente sulla capacità di risolvere le caratteristiche nell'immagine.

In PALM e altri metodi di localizzazione di singole molecole, le immagini possono essere rese con le molecole localizzate con la massima precisione (un nanometro o due) escludendo selettivamente i punti dati con scarsa localizzazione, ma questo successo va a scapito della densità molecolare (e quindi, risoluzione) nell'immagine finale. Questa situazione può sorgere semplicemente in base al tipo di campione e molecola bersaglio di interesse piuttosto che a una limitazione arbitrariamente imposta sulla precisione molecolare. Pertanto, può sorgere una bassa densità molecolare a causa del fatto che la molecola bersaglio è scarsamente rappresentata nel campione. Ad esempio, se il diametro medio di una proteina fluorescente è di circa 2,5 nanometri e la proteina è incorporata in un organello confinato su un piano bidimensionale (come una membrana), la densità massima delle molecole proteiche fluorescenti sarebbe circa 20.000 per micrometro quadrato. Inoltre, per raggiungere una densità così elevata, questo calcolo presuppone che solo le molecole proteiche fluorescenti si trovino all'interno di questo piano.

Sebbene possano verificarsi rare situazioni in cui le densità molecolari sono eccessivamente elevate nei campioni biologici, come la membrana compatta discussa sopra, è generalmente una situazione fisiologica improbabile in altre parti della cellula. Se le fusioni di proteine ​​fluorescenti comprendono l'1% delle molecole in una membrana di organelli, questo porta a circa 2000 molecole per micrometro quadrato o circa due molecole ogni 40-50 nanometri. Densità di campionamento di questo livello impallidiscono rispetto alla precisione molecolare ottenibile osservata dalla microscopia elettronica e limitano qualsiasi pretesa di risoluzione sulle caratteristiche strutturali. Indipendentemente da ciò, un esperimento PALM che osserva 2000 molecole per centimetro quadrato in una membrana di organelli offre una quantità significativa di informazioni, nonostante i limiti di risoluzione. In effetti, le immagini a questa densità possono rivelare distribuzioni molecolari relative all'interno del campione, che è spesso l'obiettivo di un esperimento di imaging. Se questi dati vengono inseriti nel contesto con altre caratteristiche note del campione (come l'uso della microscopia elettronica correlativa), il potenziale aumenta per ottenere molte più informazioni.

Torna all'inizio ^ Sonde per microscopia a superrisoluzione a singola molecola

Diverse importanti classi di fluorofori sono emerse come i migliori candidati per l'etichettatura di bersagli subcellulari in PALM e tecniche correlate. Questi includono fusioni di proteine ​​fluorescenti geneticamente codificate, coloranti sintetici, punti quantici e sistemi ibridi che combinano un peptide bersaglio geneticamente codificato con un componente sintetico separato che è permeabile di membrana (come il sistema FlAsH/ReAsH). Ogni specifica classe di sonde fluorescenti ha i suoi particolari punti di forza e di debolezza, tuttavia non è stata ancora sviluppata una singola classe o singolo fluoroforo che combini tutte le caratteristiche preferite di una sonda ideale per qualsiasi applicazione nella microscopia a superrisoluzione a singola molecola. La considerazione fondamentale per lo sviluppo di sonde a superrisoluzione è che devono essere in grado di essere fotoattivate, fotocommutate o fotoconvertite dalla luce di una banda di lunghezze d'onda definita come mezzo per alterare le loro proprietà spettrali per il rilevamento di sottopopolazioni selezionate.

Tra gli attributi più desiderabili per le sonde a superrisoluzione a singola molecola ci sono livelli di luminosità e contrasto molto elevati, necessari per massimizzare il numero di fotoni che possono essere rilevati per molecola prima che si fotoscolorisca o ritorni a uno stato scuro e non fluorescente. La luminosità è determinata dal prodotto del coefficiente di estinzione molare ( ε abs ) e la resa quantica della fluorescenza ( φ ). Pertanto, le migliori sonde hanno coefficienti di estinzione e rese quantiche elevati e forniscono un eccellente contrasto sullo sfondo. In generale, i livelli di luminosità dei comuni coloranti sintetici, come Cy5, ATTO 650 e Alexa Fluor 488, sono molto elevati a causa di coefficienti di estinzione in media di 100.000 e rese quantiche superiori a 0,90. Allo stesso modo, i punti quantici hanno livelli di luminosità ugualmente elevati. Al contrario, le proprietà ottiche per le proteine ​​fluorescenti dell'evidenziatore ottico sono molto meno ottimali con coefficienti di estinzione che vanno da circa 15.000 a 85.000 e rese quantiche tra 0,05 e 0,80. Chiaramente, c'è una significativa necessità di ingegnerizzare geneticamente proteine ​​fluorescenti più utili per l'imaging a superrisoluzione.

Oltre ad avere alti livelli di luminosità, le migliori sonde per la microscopia a superrisoluzione dovrebbero mostrare profili spettrali per le specie attive e inattive che sono sufficientemente ben separate e termicamente stabili in modo che le energie di interconversione spontanea siano molto basse rispetto all'energia di attivazione controllata dalla luce. Idealmente, queste sonde dovrebbero anche esibire un'elevata affidabilità di commutazione, bassi tassi di fatica (in effetti, il numero di cicli di commutazione sopravvissuti) e cinetiche di commutazione che possono essere facilmente controllate. In termini di photobleaching o photoswitching a uno stato oscuro, le migliori sonde sono quelle la cui inattivazione può essere bilanciata con il tasso di attivazione per garantire che solo una piccola popolazione di molecole sia attivata (per essere fluorescente) per la lettura e che queste molecole attivate siano separati da una distanza maggiore dei limiti di risoluzione del sistema di telecamere. Inoltre, ogni molecola fotoattivata dovrebbe emettere abbastanza fotoni mentre è in uno stato attivato per determinare con precisione le coordinate della loro posizione laterale.

Oltre a mostrare la necessaria emissione di fluorescenza e altre proprietà fotofisiche, le sonde a superrisoluzione PALM devono anche essere in grado di localizzare i bersagli previsti con elevata precisione e mostrare i livelli di rumore di fondo più bassi possibili. Le proteine ​​fluorescenti, i sistemi ibridi e i fluorofori sintetici altamente specifici (come i MitoTracker) sono in grado di indirizzare selettivamente gli assemblaggi proteici o gli organelli, ma la maggior parte dei coloranti sintetici e dei punti quantici deve prima essere coniugata a una molecola portatrice per un'etichettatura precisa. In molti casi, l'esatta vicinanza della sonda fluorescente al bersaglio è discutibile, così come il numero di unità fluoroforiche effettive coinvolte, specialmente quando piccole molecole di colorante sintetico o punti quantici sono coniugati a grandi anticorpi. Inoltre, le variazioni nelle proprietà fotofisiche (come la resa quantica della fluorescenza) indotte dalle fluttuazioni ambientali o dalle interazioni intermolecolari possono complicare l'analisi dei dati. Infine, indipendentemente dal fatto che l'analisi di localizzazione venga eseguita su cellule fisse o viventi, l'autofluorescenza derivante da fissativi e reagenti di trasfezione può spesso produrre un segnale di fondo eccessivamente elevato, riducendo così l'accuratezza della localizzazione.

Proprietà delle sonde fluorescenti selezionate per la microscopia a superrisoluzione


Proteina
(Acronimo)
Ex
(nm)
Em
(nm)
EC
(x 10 -3 )
QY N fotoni
emesso
Contrasto
Rapporto
Quaternario
Struttura
Luminosità
(% di EGFP)
Proteine ​​fluorescenti fotoattivabili
PA-GFP (N) 400 515 20.7 0.13 70 N / A monomero 8
PA-GFP (G) 504 517 17.4 0.79 300 100 monomero 41
PS-CFP2 (C) 400 468 43.0 0.20 ns N / A monomero 26
PS-CFP2 (G) 490 511 47.0 0.23 260 1500 monomero 32
PA-mCherry1 (R) 564 595 18.0 0.46 ns 4000 monomero 25
PA-TagRFP (R) 562 595 66.0 0.38 500 550 monomero 75
proteine ​​fluorescenti fotoconvertibili
mKikGR (G) 505 515 49.0 0.69 ns N / A monomero 101
mKikGR (R) 580 591 28.0 0.63 970 400 monomero 53
tdEos (G) 506 516 34.0 0.66 ns N / A Dimero tandem 165
tdEos (R) 569 581 33.0 0.60 750 >4000 Dimero tandem 59
mEos2 (G) 506 519 56.0 0.74 ns N / A monomero 140
mEos2 (R) 573 584 46.0 0.66 500 >2000 monomero 90
Dendra2 (G) 490 507 45.0 0.50 ns N / A monomero 67
Dendra2 (R) 553 573 35.0 0.55 ns 300 monomero 57
Proteine ​​fluorescenti fotocommutabili
Dronpa 503 517 95.0 0.85 120 monomero 240
Dronpa-3 487 514 58.0 0.33 ns ns monomero 56
rsFastLime 496 518 39.1 0.77 ns ns monomero 89
Padron 503 522 43.0 0.64 ns ns monomero 82
bsDronpa 460 504 45.0 0.50 ns ns monomero 67
KFP1 580 600 59.0 0.07 ns ns Tetramero 12
mTFP0.7 453 488 60.0 0.50 ns ns monomero 89
E2GFP 515 523 29.3 0.91 ns ns monomero 79
rsCherry 572 610 80.0 0.02 ns ns monomero 5
rsCherryRev 572 608 84.0 0.005 ns ns monomero 1
Proteine ​​fluorescenti fotoconvertibili/fotocommutabili
IrisFP (G) 488 516 52.2 0.43 ns ns Tetramero 67
IrisFP (R) 551 580 35.4 0.47 ns ns Tetramero 50
Fluorofori sintetici
Cy5 649 664 250.0 0.28 6000 ns N / A 208
Cy5.5 675 694 190.0 0.23 6000 ns N / A 130
Cy7 747 767 200.0 0.28 1000 ns N / A 167
Alexa Fluor 647 650 665 240.0 0.33 6000 ns N / A 236
ATTO 532 532 553 115.0 0.90 ns ns N / A 308
Rodamina B 530 620 105.0 0.65 750 ns N / A 203
C-Rodamina 545 575 90.0 0.90 ns ns N / A 241
C-fluoresceina 494 518 29.0 0.93 ns ns N / A 80

Tabella 1

Una raccolta delle proprietà delle proteine ​​fluorescenti e dei coloranti sintetici più utili per la microscopia a superrisoluzione è presentata nella Tabella 1. Insieme al nome comune e/o all'acronimo per ciascun fluoroforo, le lunghezze d'onda di eccitazione (Ex) e di emissione (Em), l'estinzione molare Sono elencati il ​​coefficiente ( EC ), la resa quantica ( QY ), la luminosità relativa, il numero di fotoni emessi per molecola ( N Fotoni ) e la struttura quaternaria fisiologicamente rilevante. C-Rodamina e C-Fluoresceina si riferiscono a derivati ​​ingabbiati. I valori di luminosità calcolati sono stati derivati ​​dal prodotto del coefficiente di estinzione molare e della resa quantica, diviso per il valore di EGFP. La designazione ND indica che i valori non sono stati determinati, mentre NA significa che il valore non è applicabile per la sonda elencata. Questo elenco è stato creato da risorse di letteratura scientifica e commerciale e non intende essere completo. I valori di picco di eccitazione ed emissione elencati possono variare nei rapporti pubblicati a causa in alcuni casi degli ampi profili spettrali. Nelle attuali indagini di microscopia a fluorescenza, la luminosità sperimentale di un particolare fluoroforo può differire (in termini relativi) dalla luminosità fornita in questa tabella. Tra le molte potenziali ragioni di queste differenze vi sono le variazioni dipendenti dalla lunghezza d'onda nella trasmissione o riflettanza dell'ottica del microscopio e l'efficienza della fotocamera.

La capacità intrinseca di un sottoinsieme di proteine ​​fluorescenti di alterare le loro proprietà spettrali in seguito all'esposizione alla luce di una specifica lunghezza d'onda accoppiata con la loro eccellente specificità di targeting è stata ampiamente sfruttata nell'imaging a superrisoluzione (vedere le sonde elencate nella Tabella 1).Sebbene sia noto che le proteine ​​fluorescenti subiscono una varietà di caratteristiche di fotocommutazione indotte dalla luce, inclusa la generazione di stati distinti emissivi e non emissivi, nonché il comportamento di lampeggiamento on-off, le proprietà più utili sono la fotoattivazione, la fotoconversione e la fotocommutazione, proprietà che possono essere collettivamente denominate evidenziazione ottica (come descritto di seguito). Le proteine ​​fluorescenti fotoattivabili sono in grado di essere attivate da uno stato scuro a uno stato fluorescente luminoso dopo l'illuminazione con luce ultravioletta o viola, mentre le proteine ​​fluorescenti fotoconvertibili possono essere trasformate otticamente da una larghezza di banda di emissione di fluorescenza a un'altra. Tra i membri più utili nella cassetta degli attrezzi delle proteine ​​fluorescenti fotoattivabili per l'imaging a superrisoluzione ci sono PA-GFP e PA-mCherry1. proteine ​​fluorescenti fotoconvertibili che hanno trovato utilità in PALM e tecniche correlate sono Eos dimero tandem (tdEos), mEos2, Dronpa, rsCherry (e il derivato inverso) e PS-CFP2.

I membri della classe potenzialmente più utile di evidenziatori ottici di proteine ​​fluorescenti, quelli che sono in grado di fotocommutare tra uno stato brillantemente fluorescente e scuro, non sono stati particolarmente utili nelle indagini di superrisoluzione a singola molecola a causa della bassa emissione di fotoni nello stato luminoso. Dronpa è stato utilizzato nell'imaging PALM a due colori, come verrà discusso successivamente, ma è marginale rispetto alla maggior parte delle proteine ​​fluorescenti fotoattivabili e fotoconvertibili in termini di output di fotoni per molecola. Tuttavia, Dronpa presenta un contrasto di fotocommutazione molto elevato ed emette fluorescenza per un periodo prolungato, il che può essere vantaggioso per l'imaging di cellule vive (ad esempio, utilizzando il tracciamento di singole particelle come descritto di seguito). A parte il requisito che le proteine ​​fluorescenti debbano mostrare un qualche tipo di comportamento di evidenziazione ottica per l'imaging in superrisoluzione, devono anche avere una luminosità sufficiente, tassi di maturazione dei cromofori e carattere monomerico per esprimere la fusione senza artefatti, come scarsa mira e disfunzione. Inoltre, l'oligomerizzazione nelle proteine ​​fluorescenti può presentare un problema nella microscopia stocastica a superrisoluzione poiché vi è più di un cromoforo per ogni molecola sonda localizzata.

Un numero in rapida crescita di fluorofori organici sintetici sta emergendo come candidati eccellenti per l'imaging a superrisoluzione a singola molecola, comprese molte delle sonde tradizionali che sono state utilizzate per diversi decenni nella preparazione di campioni per la microscopia a fluorescenza confocale e widefield (vedi Tabella 1). Da allora è stato dimostrato che molti composti che originariamente erano ritenuti fotostabili entrano in stati oscuri in condizioni di basso contenuto di ossigeno in presenza di tioli alifatici. Pertanto, il photoswitching reversibile è probabilmente un fenomeno più diffuso di quanto inizialmente sospettato, che apre le porte a un numero ancora maggiore di potenziali candidati alla sonda. Inoltre, la fotoattivazione irreversibile può essere ottenuta "ingabbiando" i fluorofori con una frazione reattiva protettiva che viene rimossa mediante irradiazione con luce ultravioletta. Sfortunatamente, tuttavia, fino ad oggi non sono stati segnalati composti organici o punti quantici in grado di essere fotoconvertiti da una banda di lunghezze d'onda di emissione a un'altra.

Nella Figura 6 sono illustrate le strutture a nastro, i modelli molecolari e/o i disegni a fumetti delle varie sonde fluorescenti che sono potenzialmente utili nell'imaging a superrisoluzione a singola molecola. Il colorante carbocianina sintetico, Cy5 (Figura 6 (a)) è significativamente più piccolo di un punto quantico giallo (Figura 6 (c)) o della tipica architettura polipeptidica a forma di lattina beta di una proteina fluorescente (struttura a nastro verde Figura 6 ( D)). Allo stesso modo, tutte queste sonde sono di dimensioni ridotte rispetto a un anticorpo IgG primario o secondario, che può estendersi da 12 a 15 nanometri (struttura a nastro rosso Figura 6 (b)). I punti quantici devono essere trattati con frammenti di anticorpi, streptavidina, falloidina o qualche altra frazione funzionale per colpire specifiche regioni subcellulari. In molti casi, la dimensione combinata di un punto quantico coniugato a uno o più anticorpi secondari può variare fino a 25-30 nanometri, che supera notevolmente la dimensione di una proteina fluorescente monomerica. Le sonde fluorescenti più piccole sono i coloranti sintetici (Figura 6 (a)), ma presentano un'efficienza di targeting relativamente scarsa e generalmente generano un segnale di fondo di grandi dimensioni.

Il vantaggio principale dell'utilizzo di fluorofori sintetici e punti quantici rispetto alle proteine ​​fluorescenti per l'imaging in superrisoluzione è la loro elevata luminosità intrinseca, eccellente fotostabilità, buon contrasto e maggiore resistenza alla fatica. Ad esempio, tdEos produce circa 750 fotoni per molecola in contrasto con gli oltre 6000 fotoni tipicamente osservati per la combinazione di fluorofori fotocommutabili di Cy3 e Cy5. Inoltre, i coloranti alla carbocianina possono subire oltre 200 cicli di commutazione prima del fotosbiancamento. Lo svantaggio principale dell'utilizzo di punti quantici e fluorofori sintetici è la difficoltà nel prendere di mira posizioni specifiche e un segnale di fondo elevato rispetto alle proteine ​​fluorescenti. La strategia di targeting più affidabile per i fluorofori in questa classe è la coniugazione a un anticorpo primario o secondario, sebbene sia stato dimostrato che diversi nuovi coloranti sintetici si localizzano in organelli specifici in modo indipendente.

Lo svantaggio dell'utilizzo di anticorpi e tecniche di immunofluorescenza per etichettare le strutture intracellulari per l'imaging a superrisoluzione è che le proteine ​​sono troppo grandi per permeare le membrane e sono quindi utili solo nelle cellule fisse e permeabilizzate a meno che il bersaglio non venga visualizzato sulla regione esterna della membrana plasmatica. Anche l'etichettatura con anticorpi ha un'efficienza relativamente bassa e aggiunge da 10 a 20 nanometri all'incertezza di localizzazione tra l'etichetta e il bersaglio. Inoltre, i coniugati di punti quantici agli anticorpi non funzionano alla pari con coniugati analoghi che utilizzano coloranti sintetici come Alexa Fluors e carbocianine. In prospettiva, tuttavia, l'uso di anticorpi per mirare a sonde sintetiche per PALM e tecniche correlate fornisce un livello di segnale molto più elevato rispetto alle proteine ​​fluorescenti, che sono più utili nell'imaging di cellule vive. Sfortunatamente, gli spazzini di ossigeno e i tioli necessari per produrre il fotocommutatore con i comuni coloranti sintetici sono incompatibili con le cellule viventi, quindi fino a quando non verrà sviluppata una soluzione alternativa, le proteine ​​fluorescenti saranno le sonde preferite per la microscopia a superrisoluzione delle cellule vive.

I punti quantici sono nanocristalli semiconduttori inorganici composti da un nucleo di seleniuro di cadmio (CdSe) circondato da un guscio di solfuro di zinco (ZnS) che esibisce proprietà fluorescenti a causa dell'emissione di eccitoni confinata. Uno strato di passivazione e un rivestimento idrofilo devono essere applicati ai punti quantici per applicazioni biologiche e devono anche essere coniugati con streptavidina o anticorpi per il targeting. Il profilo di emissione della fluorescenza dei punti quantici è notevolmente simmetrico e generalmente mostra una grande resa quantica, mentre il loro ampio profilo di assorbimento consente loro di essere eccitati su un intervallo di lunghezze d'onda insolitamente ampio. La dimensione del nucleo CdSe determina il profilo spettrale di emissione, con nuclei più piccoli (che vanno fino a circa 2 nanometri) che emettono nelle regioni blu e ciano e nuclei più grandi (da 5 a 7 nanometri) che emettono nelle lunghezze d'onda del giallo e del rosso.

In generale, la fotostabilità per i punti quantici supera notevolmente quella di tutti gli altri fluorofori noti, compresi i fluorofori sintetici e le proteine ​​fluorescenti, il che crea un problema per l'imaging a superrisoluzione stocastica a meno che i punti quantici non possano essere convertiti in uno stato fotocommutabile. Recentemente, i ricercatori hanno dimostrato che il drogaggio con manganese dei punti quantici di ZnSe può essere utilizzato per generare una specie che può essere fotocommutata in modo reversibile con alta efficienza utilizzando la luce senza la necessità di attivatori o quencher esterni (effettori). Il targeting rimane un problema con i punti quantici, tuttavia, i continui progressi nella chimica dei punti quantici porteranno senza dubbio a nuove e migliori sonde in questa classe.

Tra le sonde fotocommutabili sintetiche reversibili che hanno trovato utilità nell'imaging a superrisoluzione ci sono i derivati ​​della rodamina, i coloranti della carbocianina (da Cy2 a Cy7), Alexa Fluors e coloranti ATTO, con nuovi candidati in fase di sviluppo e test su base continua. I coloranti di cianina fotocommutabili sono state le sonde organiche sintetiche più ampiamente utilizzate nell'imaging a superrisoluzione stocastica. Il colorante nel vicino infrarosso, Cy5, è stato quello più utilizzato e può essere utilizzato senza un effettore, sebbene la combinazione di Cy5 con un cromoforo secondario (come Cy3, Cy2 o Alexa Fluor 405) faciliti notevolmente il fotocommutamento. Come applicazione di esempio, la combinazione di Cy5 con Cy3 consente l'uso di un laser rosso (635 nanometri) per fotocommutare Cy5 in uno stato scuro stabile, mentre l'esposizione alla luce a 543 nanometri riconverte Cy5 alla specie fluorescente. Il tasso di conversione alla specie fluorescente dipende dalla vicinanza dell'effettore secondario (Cy3).

Sono state segnalate ulteriori combinazioni di cianina e coloranti Alexa Fluor, come Cy3 e Cy5.5 o Cy7 e Alexa Fluor 647 con Cy2 o Cy3, ampliando notevolmente la tavolozza dei colori disponibile per l'imaging a superrisoluzione. Inoltre, è stato dimostrato che un gran numero di sintetici disponibili in commercio, tra cui la maggior parte delle famiglie di coloranti Alexa Fluor e ATTO, è in grado di fotocommutare in modo reversibile in cellule fisse utilizzando un protocollo che include agenti riducenti contenenti tiolo (β-mercaptoetilammina, ditiotreitolo o glutatione) per generare uno stato stabile non fluorescente. Pertanto, il potenziale per la generazione di fotocommutatori organici sintetici per l'imaging multicolore, anche se il meccanismo di commutazione deve ancora essere determinato, attualmente supera la gamma limitata di FP che subiscono modulazione indotta dalla luce. Nella Figura 7 sono presentate le strutture di diverse sonde sintetiche che illustrano l'ampia diversità di fluorofori che sono stati trovati utili per l'imaging a superrisoluzione.

Simile agli FP fotoattivabili (PA-GFP e PA-mCherry), un'ampia libreria di materiali sintetici ingabbiati sarebbe particolarmente utile per l'imaging a superrisoluzione stocastica. Sfortunatamente, fino ad oggi sono stati segnalati solo pochi candidati promettenti: versioni in gabbia di fluoresceina e rodamina, che hanno dimostrato di agire in modo simile a PA-GFP nell'imaging PALM. In pratica, i sintetici ingabbiati vengono liberati dai loro gruppi estere protettivi utilizzando l'irradiazione con luce ultravioletta per generare una specie fluorescente che mostra un eccellente contrasto che può essere localizzata con alta precisione e quindi fotosbiancata. Fino a quando non emergerà una più ampia varietà di fluorofori in gabbia, questa classe rimarrà limitata nelle applicazioni di imaging a superrisoluzione.

Il futuro dell'imaging a superrisoluzione si basa sull'aumento della specificità e dell'efficienza di etichettatura dei fluorofori fotocommutabili molto luminosi, riducendo contemporaneamente le dimensioni dei peptidi bersaglio. Un ampio spettro di sistemi ibridi progettati per accoppiare fluorofori sintetici con obiettivi codificati geneticamente potrebbe un giorno essere in grado di raggiungere questo obiettivo. Tutti questi sistemi utilizzano una sequenza peptidica o proteica che è espressa nelle cellule viventi ed è in grado di reclutare una piccola molecola sintetica per conferire fluorescenza. Il candidato più sviluppato in questa classe utilizza un motivo di tetracisteina fuso con una varietà di bersagli genetici per reclutare fluorofori blu, verdi o rossi (rispettivamente CHoAsH, FlAsH e ReAsH) in grado di legarsi ai residui di cisteina per generare una sonda simile in specificità ai FP. Il principale svantaggio di queste combinazioni è l'incapacità di superare gli elevati livelli di fondo di fluoroforo non legato che riducono il contrasto. Sono stati sviluppati numerosi altri candidati per sistemi ibridi, ma nessuno ha visto un uso significativo nell'imaging a superrisoluzione.

Torna all'inizio ^ Microscopia a superrisoluzione a due colori

L'esecuzione di immagini a superrisoluzione a singola molecola a due colori richiede una coppia di sonde fluorescenti con spettri di emissione ben separati e, nel caso ideale, fotocommutate o fotoattivate dall'illuminazione a diverse lunghezze d'onda. Attualmente, la gamma di proteine ​​fluorescenti che sono potenzialmente utili per l'imaging a doppio colore è limitata dai conflitti di sovrapposizione spettrale di emissione, dal basso output di fotoni nelle sonde con profili spettrali strategici (emissione rossa) e dal fatto che la maggior parte delle sonde di questa classe sono attivate da luce nella stessa regione di lunghezza d'onda (ultravioletti o viola). Esiste un potenziale significativamente maggiore per l'accoppiamento di due o più fluorofori insieme per l'imaging simultaneo o sequenziale nella crescente classe di sonde sintetiche, comprese le carbocianine, Alexa Fluors e coloranti ATTO, che possono essere attivati ​​da linee laser che vanno da una lunghezza d'onda da 405 a più di 647 nanometri. Poiché la chiave per l'imaging a doppio o triplo colore nel PALM e nelle tecniche correlate è la capacità di identificare e separare temporaneamente l'emissione di ciascuna sonda attivata, la versatilità offerta dai coloranti sintetici per utilizzare lunghezze d'onda di emissione, eccitazione o attivazione per distinguere tra le sonde è una risorsa potente.

L'applicazione di proteine ​​fluorescenti per l'imaging multicolore è resa più difficile dal fatto che la maggior parte delle sonde a emissione di rosso attualmente disponibili hanno un'emissione di fluorescenza pre-attivazione che si sovrappone all'emissione di post-attivazione delle sonde a emissione di verde. Ad esempio, l'accoppiamento di Dronpa e tdEos è ostacolato dal fatto che il profilo spettrale verde di Dronpa si sovrappone in modo significativo al profilo preconvertito di tdEos. Tuttavia, i ricercatori sono riusciti a visualizzare questa coppia di proteine ​​fluorescenti in PALM a due colori mediante fotoattivazione e imaging di tdEos fino a quando tutte le molecole non sono state rilevate, localizzate e fotosbiancate prima di disattivare le molecole Dronpa utilizzando una luce intensa di 488 nanometri. Le molecole di Dronpa sono state successivamente riattivate, localizzate e combinate con le immagini tdEos per costruire un'immagine finale a due colori. In pratica generale, tuttavia, l'esaurimento di una sonda fluorescente prima dell'imaging dell'altra non consente l'imaging a due colori della stessa regione in più punti temporali e ha scarso potenziale per la registrazione di eventi dinamici.

Nella Figura 8 è illustrata l'organizzazione nanostrutturale dell'actina citoscheletrica e della proteina di adesione focale, la paxillina, in una cellula di fibroblasti umani (linea HFF-1) ripresa con PALM a due colori. La Figura 8 (a) è un'immagine composita (sovrapposizione a doppio colore) di actina fusa alla proteina fluorescente Dronpa (pseudocolore verde) e paxillina fusa all'evidenziatore ottico, tdEos (pseudocolore rosso), come appaiono in un'adesione focale ad alto ingrandimento . La casella bianca nella Figura 8 (a) è ingrandita nella Figura 8 (b) per rivelare che è stata osservata una sovrapposizione diretta molto ridotta tra actina e paxillina (punte di freccia bianche), sebbene i fasci di actina si raggruppino densamente attorno a diverse adesioni fibrillari di paxillina (frecce bianche) . Nell'imaging TIRF widefield, actina e paxillina sembrano co-localizzare nelle aderenze focali, contrariamente alle informazioni fornite dalla microscopia a superrisoluzione.

Un approccio superiore per condurre esperimenti PALM a due colori utilizza proteine ​​fluorescenti che emettono verde e rosso che hanno poca o nessuna sovrapposizione spettrale. Lo sviluppo di un derivato della proteina fluorescente mCherry fotoattivabile ad alta emissione di fotoni rosso fluorescente, PA-mCherry1, ha consentito l'imaging a doppio colore con il derivato PA-GFP verde fluorescente della proteina fluorescente verde. Pertanto, PA-GFP e PA-mCherry1 sono entrambi accesi contemporaneamente con un laser a 405 nanometri, mentre la fluorescenza a singola molecola viene visualizzata utilizzando rispettivamente laser a 488 nanometri e 651 nanometri. Sebbene PA-mCherry1 trarrà vantaggio da ulteriori miglioramenti delle prestazioni, la sonda può anche essere potenzialmente utilizzata con diverse altre proteine ​​fluorescenti fotoattivabili verdi, come Dronpa, rsFastLime e PS-CFP2 per ottenere risultati simili. Con lo sviluppo di nuovi evidenziatori ottici con output di fotoni e proprietà spettrali migliorate, ci saranno probabilmente notevoli miglioramenti nella capacità di condurre esperimenti PALM a due colori con proteine ​​fluorescenti sia nelle cellule fisse che in quelle viventi.

I coloranti carbocianina fotocommutabili offrono un'ampia gamma di sonde per l'imaging PALM multicolore e STORM quando accoppiati a fluorofori attivatori con lunghezze d'onda di attivazione variabili. I coloranti del rosso lontano e del vicino infrarosso Cy5, Cy5.5 e Cy7, possono funzionare come reporter accettori fotocommutabili per un'ampia gamma di coloranti attivatori che includono Alexa Fluor 405, Cy2 e Cy3. Mescolando la coppia di attivatori e reporter in questa classe si espande il numero di potenziali combinazioni che possono essere discriminate in base alla loro attivazione o lunghezze d'onda di emissione per l'imaging multicolore. Inoltre, le carbocianine da Cy5 a Cy7 possono anche essere attivate e disattivate spontaneamente con un singolo laser senza la necessità di attivatori, pur continuando a produrre spettri di emissione di fluorescenza facilmente separabili. Un certo numero di coloranti xantenici, come Alexa Fluors nell'intervallo di emissione tra 500 e 647 nanometri e alcuni coloranti rodamina fotocromatici, così come i coloranti ATTO, possono essere fotocommutati con lo stesso laser, consentendo potenzialmente l'imaging multicolore. Le proteine ​​fluorescenti possono anche essere combinate con coloranti sintetici per l'imaging multicolore, come dimostrato per PALMIRA utilizzando rsFastLime abbinato a Cy5. Man mano che nuove sonde vengono sviluppate e testate per la loro utilità nell'imaging a superrisoluzione a singola molecola, l'elenco dei candidati per esperimenti multicolori aumenterà senza dubbio nei prossimi anni.

Torna all'inizio ^ Imaging PALM tridimensionale

Come originariamente sviluppato, PALM e le relative tecniche di superrisoluzione di localizzazione di singole molecole sono state in gran parte limitate all'imaging nel piano bidimensionale laterale per acquisire informazioni sulla posizione sui singoli fluorofori. Il sondaggio della dimensione assiale è stato limitato a causa dell'applicazione della microscopia a riflessione interna totale per implementare l'imaging e perché i campioni erano costituiti da sezioni relativamente sottili prodotte con un microtomo. Entrambe le metodologie limitano l'imaging nel piano z a una profondità di circa 100 nanometri, che offre una certa latitudine rispetto all'imaging assiale di piccole sovrastrutture, ma è inferiore alle dimensioni di molte altre. Le informazioni di posizione verticale (assiale) espanse possono essere rivelate attraverso una varietà di tecniche combinate con la fotoattivazione e la localizzazione. Questi metodi possono essere raggruppati in diverse categorie, compreso lo sfruttamento della funzione di diffusione puntuale dipendente da z, l'esame del campione da un approccio di vista laterale e l'utilizzo dell'interferometria lungo la direzione assiale.

In termini di funzione di diffusione del punto dipendente dall'asse ( z ), l'esempio più semplice è la sfocatura di un oggetto puntiforme (come un emettitore di una singola molecola) che è posizionato sopra o sotto il piano dell'immagine laterale a fuoco ideale. L'immagine di una tale sorgente puntiforme può allargarsi, sviluppare anelli concentrici attorno a un picco centrale, o altrimenti evolvere in una forma che devia dalla normale funzione di diffusione puntuale. L'approccio di base a questo tipo di imaging consiste nell'acquisire due immagini simultanee su due piani laterali diversi, uno sfocato e l'altro iperfocalizzato.Ciò può essere ottenuto utilizzando un divisore di fascio accoppiato a rilevatori impostati per l'immagine di due diverse distanze focali. Il rapporto tra le dimensioni degli spot è una funzione monotona della posizione assiale e può essere facilmente calcolato. Conosciuto come metodo biplano, questo approccio ha raggiunto dal 20 al 30 percento della risoluzione laterale PALM standard per produrre una funzione di diffusione del punto a larghezza intera a metà massima (FWHM) di circa 75 nanometri con proteine ​​fluorescenti. Il vantaggio principale dell'imaging biplano è la relativa semplicità di accesso alla dimensione extra.

Un simile approccio di overfocus e underfocus può essere implementato lungo due assi ortogonali di una singola immagine, in modo che l'asse x possa mettere a fuoco in una posizione assiale diversa rispetto all'asse y. La tecnica è stata dimostrata per la prima volta con STORM attraverso l'aggiunta di una debole lente cilindrica tra l'obiettivo e il rilevatore EMCCD. In pratica, la fluorescenza di una singola molecola produce un'immagine ellittica caratterizzata da un rapporto di diametri x e y che rivela la posizione assiale relativa dell'emettitore. La lettura delle ellitticità fluorescenti ha fornito una risoluzione laterale di circa 20 nanometri e verticale da 50 a 60 nanometri utilizzando coppie di coloranti di carbocianina (Cy3 e Cy5) nell'imaging STORM. Funzioni di diffusione puntuale dipendenti dall'asse più esotiche sono state prodotte con un modulatore di fase spaziale. Ad esempio, un'immagine a doppio punto può essere generata da una sorgente a punto singolo in cui l'orientamento angolare di questo doppietto dipende dalla posizione assiale. Pertanto, l'orientamento angolare può essere utilizzato come lettura delle coordinate assiali.

In alternativa alla messa a fuoco spaziale, gli impulsi di luce di eccitazione a femtosecondi possono essere focalizzati nel tempo, ma è necessaria una configurazione del microscopio significativamente più sofisticata e la tecnica dipende dall'eccitazione non lineare a due fotoni piuttosto che dall'eccitazione lineare a singolo fotone. Il vantaggio principale di questo metodo è che l'eccitazione spuria viene ridotta nelle regioni rimosse dall'area di interesse. In quanto tale, preserva la fluorescenza fotoattivabile, consentendo a più piani da 1 micrometro di formare pile di immagini PALM fino a circa 10 micrometri di spessore. Una diversa strategia di imaging tridimensionale consiste nel catturare un'immagine PALM da una direzione ortogonale utilizzando un'immagine virtuale laterale generata da una superficie riflessa dello specchio. La configurazione del microscopio prevede il montaggio del campione in un supporto contenente specchi con scanalatura a V o semplicemente su una superficie dello specchio fortemente inclinata. È necessario un software specializzato per la calibrazione e per calcolare i dati dai dati combinati.

Forse la migliore risoluzione nell'imaging tridimensionale a singola molecola si ottiene con l'interferometria combinata con PALM. La tecnica è nota come interferenza-PALM ( iPALM ) e ha dimostrato una precisione di localizzazione verticale di 10 nanometri combinata con una precisione di localizzazione laterale di 20 nanometri utilizzando etichette proteiche fluorescenti. L'interferometria è una tecnica comune per misurare le posizioni e si basa su come la luce interferisce dopo aver percorso due diversi percorsi dipendenti dalla posizione prima di essere ricombinata con un divisore di fascio. I requisiti speciali di coerenza, calibrazione e tolleranza della natura fluttuante altamente instabile della fluorescenza richiedono un'attenta attenzione ai dettagli della configurazione dello strumento, che è meglio implementata con obiettivi opposti simili a un sistema 4Pi. La coerenza può essere mantenuta realizzando che ogni fotone emesso è sempre coerente con se stesso, un concetto critico per iPALM. L'interferenza che coinvolge lo stesso fotone che prende due percorsi con diverse lunghezze di percorso assiali-dipendenti soddisfa questo requisito. Il requisito di autocalibrazione è soddisfatto anche dall'autointerferenza di un singolo fotone e può essere tollerante alle fluttuazioni di una sorgente fluorescente utilizzando l'interferometria multifase simultanea fornita da un divisore di fascio specializzato.

In Figura 9 è presentato un confronto delle tecniche di localizzazione tridimensionale di singole molecole per proteine ​​fluorescenti e coloranti sintetici rispetto al numero di fotoni emessi e alla risoluzione assiale e laterale FWHM. La precisione tridimensionale di iPALM e della tecnica di sfocatura è mostrata in funzione del numero di fotoni emessi dalle perle d'oro. iPALM (rappresentato da cerchi e quadrati pieni) mostra una migliore precisione di localizzazione per fotone emesso rispetto alle tecniche di sfocatura (cerchi e quadrati aperti) e mostra una migliore risoluzione assiale (cerchi rossi pieni) che laterale (quadrati blu pieni). Al contrario, le tecniche di sfocatura hanno una precisione significativamente inferiore per fotone emesso nella dimensione assiale (cerchi rossi non riempiti) rispetto alla direzione laterale (quadrati blu non riempiti). In generale, la maggior parte delle tecniche di microscopia a fluorescenza, comprese quelle per la superrisoluzione, mostrano una risoluzione assiale inferiore a quella laterale, con iPALM come eccezione.

Per una valutazione completa dei diversi approcci PALM tridimensionali per un particolare esperimento, devono essere considerati i vincoli pratici sui parametri del campione, inclusi lo spessore tollerabile, la dimensione laterale, la scala temporale, la densità e l'accuratezza dell'etichettatura della sonda, insieme alla risoluzione. Va tenuto presente che la risoluzione non è solo un numero strumentale, ma è in realtà intrecciata in modo critico con l'approccio dell'etichettatura. Ad esempio, le etichette più luminose che producono più fotoni producono una migliore precisione di localizzazione, ma sono mitigate da considerazioni come le lunghezze dei collegamenti anticorpali, la specificità del targeting e la densità dell'etichettatura molecolare. I marcatori di proteine ​​fluorescenti endogene, come tdEos, hanno una luminosità ridotta e richiedono una procedura di localizzazione più efficiente per acquisire dati soddisfacenti. I compromessi coinvolti per l'imaging iPALM e le tecniche di sfocatura sono presentati nella Figura 9.

Torna all'inizio ^ Live-Cell Imaging con PALM

Il processo ripetitivo di fotoattivazione, imaging e photobleaching coinvolto con PALM e tecniche di localizzazione di singole molecole simili impone vincoli temporali significativi all'osservazione dei campioni. Per migrare la tecnica all'imaging di cellule vive, il processo PALM può essere accelerato aumentando l'intensità della luce sia di attivazione che di eccitazione per accelerare il turnover delle molecole, ma le cellule viventi devono essere attentamente monitorate per assicurarsi che siano sane. Sebbene l'imaging di cellule vive con la microscopia a superrisoluzione sia ancora agli inizi, diverse indagini servono a rafforzare le basi su cui si baseranno probabilmente le ricerche future. Questi includono l'uso di proteine ​​fluorescenti con evidenziatori ottici per creare immagini PALM time-lapse, per determinare le distribuzioni medie o le distanze tra le molecole nelle cellule viventi e per creare mappe molecolari dinamiche. Simile alle tecniche descritte sopra, la densità molecolare dell'immagine in ogni singolo fotogramma di un esperimento PALM time-lapse deve rimanere sufficientemente bassa da isolare singole molecole.

Un punto importante da notare è che nel PALM delle cellule vive, la densità delle molecole localizzate deve essere sufficientemente alta da creare un'immagine a superrisoluzione se l'obiettivo è misurare i movimenti e i riarrangiamenti delle strutture arricchite di proteine ​​con precisione di sub-diffrazione. Per questo motivo, le strutture macromolecolari a movimento lento, come i complessi di adesione focale, il citoscheletro di actina filamentosa, i microtubuli, i filamenti intermedi o i cambiamenti morfologici del reticolo endoplasmatico sono candidati appropriati. In pratica, con la configurazione dello strumento è necessario acquisire l'immagine da circa 500 a 1000 molecole per frame il più rapidamente possibile (gli intervalli di raccolta dei dati dovrebbero essere limitati a un minuto o meno). L'imaging di cellule vive con PALM è stato condotto su aderenze focali per rivelare che un singolo complesso di adesione si muoveva a velocità variabili, reclutava o perdeva un numero complessivo diverso di molecole e subiva diversi cambiamenti di forma. Gli studi futuri affronteranno una serie di altri scenari di imaging.

In un'implementazione unica dell'imaging PALM di cellule vive (vedi Figura 10), migliaia di singole fusioni di proteine ​​fluorescenti sono state monitorate con una tecnica nota come PALM a tracciamento di una singola particella ( sptPALM ). Le traiettorie delle proteine ​​fluorescenti sono state utilizzate per confrontare la distribuzione e la dinamica di due proteine ​​virali (proteina G virale della stomatite vescicolare ts045, VSVG e la proteina strutturale del virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1, Gag) espresse nella membrana plasmatica. Nella Figura 10, il movimento molecolare della proteina fluorescente VSVG-tdEos è stato ripreso in una cellula COS7 utilizzando una luce a 561 nanometri e contemporaneamente fotoattivando sottoinsiemi delle molecole tdEos. Le molecole sono state localizzate in ciascun frame e le loro posizioni determinate in frame consecutivi sono state collegate in tracce. Le tracce nella Figura 10 (a) rappresentano le molecole che sono rimaste fluorescenti per più di 0,75 secondi (tracciate con colori diversi per distinguere le singole tracce). Il coefficiente di diffusione per ogni traccia è stato determinato e tracciato come un cerchio pieno all'inizio della traccia (Figura 10 (b)). Ad ogni traccia è stato assegnato un colore in base al suo valore di diffusione.

Il risultato dell'imaging sptPALM nella Figura 10 erano mappe risolte spazialmente dei coefficienti di diffusione di singole molecole, che hanno rivelato un comportamento di diffusione sorprendentemente diverso. Le molecole VSVG sono state determinate per essere altamente mobili per esplorare liberamente la membrana plasmatica, mentre le proteine ​​Gag sono state spesso trovate in ammassi immobili che si avvicinano alla dimensione delle particelle simili a virus tra 100 e 200 nanometri di diametro. Esperimenti simili nei batteri che utilizzano Dendra2 hanno tracciato l'omologo della tubulina dei mammiferi, Ftx, che forma una struttura filamentosa elicoidale (denominata anello Z) che è coinvolta nella citochinesi batterica. A differenza dei video in superrisoluzione delle aderenze focali che catturano le dinamiche lente, il tracciamento molecolare di singole particelle può rivelare dinamiche molto più rapide in insiemi di molecole.

Sebbene sia ancora una tecnica emergente, la microscopia a superrisoluzione a singola molecola sta ricevendo una crescente attenzione tra i biologi interessati a comprendere i processi cellulari su scala nanometrica. Attualmente sono disponibili numerose metodologie e altre sono in fase di sviluppo per aggirare la barriera di risoluzione limitata alla diffrazione imposta dalla microscopia a fluorescenza confocale e widefield. Le tecniche di superrisoluzione basate sull'illuminazione, come STED, GSD e SSIM, hanno spinto le risoluzioni nell'intervallo da 30 a 50 nanometri utilizzando fluorofori convenzionali, mentre le tecniche di localizzazione a singola molecola (PALM e STORM) richiedono speciali sonde fotoattivabili. Le sonde convenzionali sono state utilizzate con successo nella localizzazione di singole molecole basandosi sulle transizioni di molecole tra stati di luce e stato di oscurità, ma queste possono benissimo venire con la perdita di densità molecolare durante le fasi di irradiazione pre-esperimento necessarie per ridurre la fluorescenza all'imaging a singola molecola livelli.

La principale forza trainante di PALM è l'assoluta semplicità sia nel concetto che nella strumentazione, che richiede solo un microscopio a fluorescenza ad ampio campo modificato (per condurre l'imaging a singola molecola) e la capacità di esprimere fusioni fluorescenti in colture cellulari aderenti. Tuttavia, il futuro del PALM e delle relative tecniche di localizzazione di singole molecole sarà probabilmente illuminato con strumentazione più avanzata e nuovi fluorofori che sono migliori emettitori di fotoni con eccellenti caratteristiche di fotocommutazione e mostrano fluorescenza sull'intero spettro visibile. Inoltre, i ricercatori devono essere consapevoli che queste tecniche sono iniziate sul serio meno di un decennio fa e possono ancora essere considerate nella fase di sviluppo. Indipendentemente da ciò, le tecniche sono sufficientemente sviluppate da rendere ora disponibile la strumentazione commerciale. In futuro, perfezionamenti nel comportamento fotofisico delle sonde fluorescenti accoppiati a miglioramenti nella strumentazione e nell'analisi potrebbero aumentare la velocità degli esperimenti e ridurre significativamente i tempi di acquisizione. Nonostante questi crescenti dolori, il rapido ritmo della microscopia a superrisoluzione dà fiducia che l'imaging al di sotto della barriera di diffrazione, nei prossimi anni, diventerà tanto comune quanto lo è oggi l'imaging confocale.

Autori partecipanti

Eric Betzig e Harald F. Hess - Howard Hughes Medical Institute, Janelia Farm Research Campus, Ashburn, Virginia, 20147.

Hari Shroff - Sezione sull'imaging ottico ad alta risoluzione, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, 20892.

George H. Patterson - Sezione di biofotonica, Istituto nazionale di imaging biomedico e bioingegneria, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, 20892.

Jennifer Lippincott-Schwartz - Programma di biologia cellulare e metabolismo, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, 20892.

Michael W. Davidson - National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.


Figura 3

Figura 3. Fotostabilità di GaInP rispetto a bisbenzimide e FITC per scansioni confocali sequenziali. Intensità relativa del DNA cellulare marcato con bisbenzimide (blu), filamenti di actina marcati con FITC-falloidina (verde) e nanofili GaInP (rosso) in funzione del numero di frame confocale (ciascun frame costituito da due scansioni sequenziali, una con 405 nm e uno con una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm). I nanofili sono meno inclini al fotosbiancamento rispetto a bisbenzimide e FITC. In ogni caso, il segnale è stato normalizzato al valore misurato nel frame iniziale.

Come prova di principio che le eterostrutture GaP-GaInP possono essere utilizzate per identificare i nanofili in modo simile ai sistemi di identificazione dei codici a barre, in vitro e in vivo, abbiamo eseguito due serie di esperimenti come illustrato di seguito, per diverse dimensioni di nanofili e per nanofili con differenti trattamenti superficiali.

Per distinguere tra nanofili di lunghezze simili ma diametri diversi, abbiamo sintetizzato nanofili di diametro 40 nm con un singolo segmento fluorescente (GaP-GaInP) e nanofili di diametro 80 nm con due segmenti fluorescenti (GaP-GaInP-GaP-GaInP) (Figura 4) e li ha aggiunti a una coltura cellulare (vedere Informazioni di supporto per un protocollo sperimentale dettagliato).


17.4: Microscopio - Biologia

a Key Laboratory of Supramolecular Structure and Materials, Jilin University, Changchun 130012, R.P. Cina
E-mail: [email protected], [email protected]

b Beijing National Laboratory for Molecular Sciences, CAS Key Laboratory of Organic Solids, Institute of Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Repubblica Popolare Cinese

c Dipartimento di Fisica, Chimica e Biologia (IFM), Linköping University, Linkoping 58183, Svezia

Astratto

Un complesso di poliossometallato a basso costo (<$1 per g), ad alto rendimento (>90%), tensioattivo solubile in alcool [(C8h17)4N]4[SiW12oh40] è stato sintetizzato e utilizzato come intercalare catodico (CIL) in celle solari polimeriche (PSC). Un'efficienza di conversione di potenza del 10,1% può essere ottenuta per PSC basati su PTB7-Th (poli[[2,6′-4,8-di(5-etilesiltienil)benzo[1,2-B3,3-B]-ditiofene][3-fluoro-2[(2-etilesil)carbonil]tieno [3,4-B]-tiofenediil]]):PC71BM ([6,6]-fenil C71-butirrico acido metil estere) dovuto all'incorporazione di [(C8h17)4N]4[SiW12oh40]. Le misurazioni combinate delle caratteristiche di densità di corrente-tensione, fotocorrente transitoria, mobilità del portatore di carica e caratteristiche di tensione-capacità dimostrano che [(C8h17)4N]4[SiW12oh40] può aumentare efficacemente il potenziale integrato, la densità e la mobilità dei portatori di carica e accelerare l'estrazione dei portatori di carica nei PSC. Ancora più importante, il meccanismo di utilizzo di [(C8h17)4N]4[SiW12oh40] poiché il CIL viene ulteriormente portato alla luce dalla spettroscopia di fotoemissione a raggi X (XPS) e dalla spettroscopia di fotoemissione ultravioletta (UPS) del metallo/[(C8h17)4N]4[SiW12oh40] interfaccia. I risultati suggeriscono che [(C8h17)4N]4[SiW12oh40] non solo ha diminuito la funzione di lavoro dei catodi metallici, ma è stato anche drogato con n al contatto con i metalli, il che fornisce approfondimenti sul meccanismo di lavoro dei CIL migliorando contemporaneamente la tensione a circuito aperto, la corrente di cortocircuito e il fattore di riempimento nei PSC.


6 TRADUZIONE DI VACCINI VLP

Dalla ricerca e sviluppo alle licenze, i nuovi vaccini possono richiedere fino a due decenni per essere realizzati e si stima che costino da 500 milioni di dollari a oltre 1 miliardo (S. A. Plotkin, Mahmoud e Farrar, 2015). I vaccini VLP sono in fase di sviluppo da >30 anni (Lua et al., 2014). Oggi ci sono sei vaccini VLP con licenza commerciale e oltre 110 studi sui vaccini VLP (completati e in corso) documentati su www.clinicaltrials.gov. Oltre il 50% di questi studi sono progettati per valutare i candidati al vaccino VLP contro vari tipi di cancro (dove Merck Sharp & Dohme Corp. e GlaxoSmithKline plc. sono gli sponsor principali) e oltre il 20% contro l'influenza (dove Novavax, Inc. e Medicago Inc. dominano). le prove). VBI Vaccines Inc. e Takeda Pharmaceutical Co. Ltd. stanno attualmente conducendo prove per vaccini contro il citomegalovirus e il norovirus, rispettivamente. I produttori con sede in India, CPL Biologicals Pvt. Ltd. ha sviluppato Cadiflu-S, il primo vaccino antinfluenzale VLP al mondo a completare con successo gli studi di fase 3 (http://cadilapharma.com). Questi studi clinici multistadio valutano la sicurezza e l'efficacia e determinano l'idoneità dei candidati al vaccino per l'approvazione della licenza. Il successo della traduzione dei vaccini, tuttavia, dipende da processi di produzione del vaccino praticabili per garantire una fornitura affidabile di vaccini e ridurre al minimo i costi di produzione.

6.1 Regolamentazione ed economia

L'aumento dei costi e l'incertezza normativa associati alla produzione di nuovi vaccini sono state a lungo sfide per i produttori di vaccini (Ulmer, Valley e Rappuoli, 2006). Le complessità della produzione di vaccini richiedono una notevole quantità di competenze e contribuiscono in modo significativo ai costi (S. Plotkin et al., 2017). Le spese associate a ricerca e sviluppo, test e produzione di vaccini, nonché uno scarso margine di profitto rispetto agli attuali mercati dei farmaci, hanno portato a un drastico calo dei finanziamenti da parte delle aziende farmaceutiche orientate al profitto (Offit, 2005). Tuttavia, si ritiene che questo declino sia prematuro. Come dimostrato in tutta questa recensione, le tecnologie VLP stanno avanzando rapidamente con una forte attenzione allo sviluppo delle capacità della piattaforma e al miglioramento dei rendimenti di produzione VLP per consentire una rapida produzione di vaccini più sicuri ed economici, in particolare se combinate con sistemi di biotrattamento monouso. Questo progresso è destinato a continuare con investimenti finanziari forniti da fonti "non-profit", come governi nazionali, organizzazioni internazionali ed enti filantropici. In particolare, Gavi, l'Alleanza per i vaccini (Balaji, 2004) e la Fondazione Bill & Melinda Gates (www.gatesfoundation.org) sono motivati ​​a fornire vaccini a prezzi accessibili ai paesi del terzo mondo che sono il più grande mercato mondiale di vaccini. Per garantire la purezza, la sicurezza, l'efficacia e la stabilità del vaccino, le autorità di regolamentazione governano ogni fase della produzione del vaccino, dalle materie prime e dai processi di produzione alle sperimentazioni cliniche e oltre. Ciò include la valutazione e la certificazione di processi produttivi sicuri e sostenibili (S. Plotkin et al., 2017).Soddisfare i requisiti normativi può essere un processo complicato, in particolare quando si producono vaccini per i mercati esteri o si utilizzano bioprocessi di nuova concezione. Semplificando i processi a monte ea valle e utilizzando una base VLP generica, si prevede che la tecnologia della piattaforma VLP ridurrà il carico normativo dei singoli vaccini, dato che le normative per la base e la sua purificazione saranno ben caratterizzate. Le piattaforme VLP possono persino accelerare la consegna del vaccino in risposta a circostanze pandemiche.


Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare il Dr. Stephen R. Palumbi della Stanford University per lo spazio del laboratorio, Raymond Direen del Monterey Bay Aquarium per aver fornito i campioni di corallo e il Dr. Varghese K. George e il Dr. Savita Pahwa per l'assistenza con questo progetto. Ringraziamo la Dott.ssa Lorraine Ling e il Dott. John R Pringle per averci gentilmente fornito A. pallida tensioni. Vorremmo anche ringraziare Karla J. palmeri, Dr. Jody M. Beers e Paul A. K. Bump per il montaggio. Questo lavoro è stato finanziato dalla National Science Foundation Ocean Science Postdoctoral Fellowship OCE-1323652 e dal premio #1012629 del Burroughs Wellcome Postdoctoral Enrichment Fund for N.T.K. Il lavoro di B.R. è stato sostenuto dalla borsa di studio post-dottorato dell'organizzazione del programma scientifico di frontiera umana e dalla borsa di studio di ematologia NIH T32 HL120824-03.


Affiliazioni

Dipartimento di Spettroscopia, Divisione di Fisica, Centro Nazionale di Ricerca, Dokki, Cairo, 12622, Egitto

Indirizzo attuale: Institute of Bioengineering, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Losanna, Svizzera

Dipartimento di Bionanoscienze, Delft University of Technology, 2628 CJ, Delft, Paesi Bassi

Laboratoire de Biologie Moléculaire Eucariote (LBME), Centre de Biologie Intégrative (CBI), CNRS, UPS, Università di Tolosa, 31062, Tolosa, Francia


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