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Tipi di accoppiamento nei funghi (e nella somatogamia)

Tipi di accoppiamento nei funghi (e nella somatogamia)



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Avrei alcune domande correlate sui tipi di accoppiamento dei funghi.

  1. Una singola spora genera un micelio che possiede un solo tipo di accoppiamento? Se non lo fa in generale, Ascomycota e Basidiomycota possiedono un solo tipo di accoppiamento per singolo micelio?

  2. L'omotalismo e l'eterotallismo sono proprietà del micelio individuale o della specie? Le definizioni che trovo nel mio libro e on line mi confondono. lo capisco omotalismo è la proprietà di un micelio (che possiede un solo tipo di accoppiamento o può possedere molti tipi di accoppiamento in modo simile agli animali ermafroditi? cfr. domanda 1) che può accoppiarsi con se stesso (se può possedere molti tipi di accoppiamento e può accoppiarsi con stesso solo utilizzando gameti di diversi tipi di accoppiamento, è ancora omotallico?) e eterotalismo è la proprietà di un micelio che non è omotallico, ma non sono sicuro di aver capito, perché ho letto di omotallico e specie eterothallic anche: una specie omotallica è una specie in cui almeno qualche individuo è omotallico, in cui tutti gli individui sono omotallici o qualcos'altro?

  3. Sono sicuro che il tipo di accoppiamento sia una proprietà che caratterizza almeno i gameti, ma è anche una proprietà delle singole cellule? Ad esempio, so che è necessario, tra molte specie di funghi, che due gameti appartengano a due diversi tipi di accoppiamento per produrre uno zigote. Alcuni funghi, come è la regola tra i Basidiomycota, si riproducono per somatogamia, cioè i nuclei che generano lo zigote provengono da cellule somatiche, diverse dai gameti. In tali casi, esistono specie in cui è necessario che le cellule somatiche di un micelio omotallico appartengano a un tipo diverso da quello con cui stanno subendo la plasmogamia? Grazie mille per qualsiasi risposta!


Sfondo:

La maggior parte dei funghi può riprodursi sessualmente e asessualmente e alcuni anche parasessuali. La riproduzione fungina è complicata!

idiomorfi sono esattamente nello stesso locus (come gli alleli) ma producono una proteina completamente diversa piuttosto che una variante della proteina.

eterotalico - chiamato anche outbreeding: le strutture riproduttive maschili e femminili sono in individui diversi. I partner hanno tipi di accoppiamento opposti con idiomorfi MAT compatibili

omotalico - detta anche consanguineità: strutture riproduttive maschili e femminili nello stesso individuo. I partner hanno lo stesso tipo di accoppiamento ma entrambi gli idiomorfi MAT sono presenti nello stesso genoma e utilizzati nella commutazione del tipo di accoppiamento.

Si dice che le specie eterotalliche siano incompatibili omogenee, l'incompatibilità eterogenica si verifica quando la progenie di un incrocio eterothallico tra diversi ceppi mostra eterosi negativa. Esistono forme di incompatibilità eterogenee che sembrano agire solo nella fase sessuale.

Si noti che il tipo di accoppiamento e il sesso non sono gli stessi poiché il sesso è determinato dalla struttura dell'accoppiamento e il tipo di accoppiamento potrebbe non avere alcun effetto sulla struttura sessuale solo sul contenuto nucleico.

Risposte:

1. Non ne sono sicuro, ma la mia comprensione è che una spora aploide genererà un micelio aploide dello stesso tipo di accoppiamento. Nota che le cose possono diventare più complicate perché puoi avere tipi di accoppiamento incompatibili bifattoriali (ad esempio due loci di accoppiamento non collegati)

2. L'omotalismo e l'eterotallismo sono proprietà della specie

3. Non sono del tutto sicuro di aver capito la domanda qui. In Basidiomycota (Club Fungi) i miceli di tipo + o - si fondono per formare un micelio dicariotico (due nuclei) per la maggior parte del ciclo di vita. Solo in condizioni sfavorevoli si verificherà la cariogamia (la fusione dei nuclei aploidi) per formare ife diploidi e corpi fruttiferi dove avverrà la meiosi per creare spore aploidi con tipi di accoppiamento che genereranno i nuovi miceli. Parte di ciò che rende difficile il ciclo di vita qui è ricordare che le cellule somatiche diploidi avranno entrambi i tipi di accoppiamento. (Ciclo vitale)


Sesso, incroci e tipi di accoppiamento: questioni irrisolte nei funghi e oltre

La variabilità nel modo in cui gli organismi si riproducono solleva numerosi, e ancora irrisolti, interrogativi nella biologia evolutiva. In questo studio, sottolineiamo che i funghi meritano un'enfasi molto maggiore negli sforzi per affrontare queste domande a causa dei loro molteplici vantaggi come eucarioti modello. Un'enorme diversità di modalità riproduttive e sistemi di accoppiamento può essere trovata nei funghi, con molte transizioni evolutive tra specie strettamente correlate. Inoltre, i funghi mostrano alcune peculiarità nei loro sistemi di accoppiamento che finora hanno ricevuto poca attenzione, nonostante il potenziale per fornire approfondimenti su importanti questioni evolutive. In particolare, il selfing può verificarsi allo stadio aploide oltre allo stadio diploide in molti funghi, che generalmente non è possibile negli animali e nelle piante, ma ha un'influenza drammatica sulla struttura dei sistemi genetici. I funghi presentano inoltre diversi vantaggi che li rendono modelli trattabili per studi in evoluzione sperimentale. Qui, esaminiamo brevemente le domande irrisolte e le ipotesi esistenti sull'evoluzione e il mantenimento della riproduzione asessuata rispetto a quella sessuale e dell'autoinduzione rispetto all'incrocio, concentrandoci sui cicli vitali dei funghi. Quindi proponiamo come utilizzare i funghi per affrontare queste domande di vecchia data e far progredire la nostra comprensione della riproduzione sessuale e dei sistemi di accoppiamento in tutti gli eucarioti.


Introduzione

Il processo di riproduzione è uno dei tratti più variabili nel mondo vivente, con organismi che danno origine alla progenie sia clonalmente che sessualmente, e in quest'ultimo caso per selfing o outcrossing (vedi il Glossario per le definizioni). Comprendere quali fattori modellano la modalità riproduttiva di un organismo è di fondamentale importanza perché i modelli di ereditarietà influenzano drasticamente i principali processi evolutivi ed ecologici (adattamento, ad es. Charlesworth & Charlesworth, 1995 Otto, 2009 colonizzazione, ad es. Busch, 2011 Richards, 2003), così come la campi applicati della biotecnologia, dell'allevamento e della selezione artificiale ( Whitton et al., 2008), biologia della conservazione (es. Fréville et al., 2007 ), invasione di specie ( Barrett, 2011 ) ed evoluzione e controllo dei patogeni ( Shea et al., 2000 Zuk, 2009).

La prevalenza della riproduzione sessuale o asessuata è molto variabile tra gli eucarioti, con la stragrande maggioranza dei taxa in grado di eseguire la riproduzione sessuale esclusivamente (es. mammiferi) o alternativamente con clonalità (es. afidi, ciliati, molte angiosperme e funghi). La riproduzione sessuale implica la successione di fasi aploidi e diploidi, transizioni che avvengono per meiosi, dove avvengono la ricombinazione e la segregazione cromosomica, e la singamia, dove due aploidi si fondono. La persistenza a lungo termine degli eucarioti che si affidano esclusivamente alla riproduzione asessuata è rara e si pensa che includa i famosi rotiferi bdelloid ( Welch et al., 2000 ), Glomeromycota funghi ( Kuhn et al., 2001 ), alcuni insetti e alcune piante ( Judson & Normark, 1996 ). Anche in questi esempi da manuale di asessualità, tuttavia, studi recenti hanno suggerito la presenza di sesso criptico, in particolare perché nei genomi sono mantenuti tutti i geni necessari per il macchinario meiotico (Schurko et al., 2009 Halary et al., 2011 ).

Anche i sistemi di accoppiamento, che determinano quali aploidi si fondono alla singamia, sono molto variabili: la maggior parte delle specie si autoalimenta o si incrocia prevalentemente, mentre alcune specie mostrano un sistema di accoppiamento misto sia negli animali che nelle piante (es. Jarne & Auld, 2006 Igic & Kohn, 2006 ). L'outcrossing risulta dalla singamia tra cellule aploidi prodotte da individui diploidi separati, mentre il selfing deriva dalla singamia tra cellule aploidi prodotte dallo stesso individuo diploide (Figg. 1 e 2). Il selfing si verifica nelle piante e negli animali attraverso la fusione di gameti prodotti dalle meiosi di un singolo individuo diploide, denominato selfing diploide. In alcuni eucarioti, in particolare quelli con uno stadio di vita aploide esteso come funghi ascomiceti, muschi, felci e alcune alghe, il selfing è talvolta possibile attraverso la fusione di due discendenti mitotici della stessa cellula aploide, che è chiamato accoppiamento intraaploide, selfing intragametofitico (Hedrick, 1987), accoppiamento dello stesso clone (Perrin, 2012), selfing gametofitico (Epinat & Lenormand, 2009) o selfing aploide (Biliard et al., 2011). Selfing diploide e selfing aploide possono avere conseguenze molto diverse per la struttura genetica e occorre prestare attenzione nell'applicazione di termini diversi per descrivere la loro presenza negli eucarioti.

Visione sintetica delle diverse possibili modalità di riproduzione in funghi e oomiceti omotallici vs eterotallici. *Alcuni selfing diploidi possono essere possibili per oomiceti eterothallic ma solo in presenza di un partner di accoppiamento diverso, cioè quando si esegue anche l'outcrossing.

Illustrazione delle diverse modalità di riproduzione e dei sistemi di accoppiamento nei funghi.

Anche i meccanismi prossimi che controllano i sistemi di accoppiamento sono molto diversi (a volte chiamati "sistemi di allevamento", Neal & Anderson, 2005) l'incrocio obbligato può derivare, ad esempio, dall'esistenza di (i) sessi separati (anche se l'incrocio potrebbe non essere il principale forza responsabile dell'evoluzione dei sessi separati), (ii) morph sessuali (ad es. eterostilia nelle angiosperme, dove coesistono nelle popolazioni due morph con diverse lunghezze di stigma e pistillo, l'accoppiamento è possibile solo tra individui di morph differenti), (iii) riconoscimento molecolare meccanismi (es. sistemi di autoincompatibilità nelle angiosperme), o (iv) asincronia nella produzione di gameti maschili e femminili in un individuo (vedi Barrett, 2010 per una rassegna). La tendenza al selfing può derivare, ad esempio, da fiori ermafroditi che non si aprono (cleistogamia) o dalla vicinanza dello sviluppo tra gameti dello stesso individuo ( Giraud et al., 2008 ).

I biologi hanno lottato per più di un secolo per identificare i fattori responsabili dell'evoluzione di tale preferenza per l'outcrossing rispetto al selfing o per la riproduzione sessuale rispetto a quella asessuale. La riproduzione sessuale è stata apparentemente persa indipendentemente in diversi eucarioti (rivisto nei funghi, Billiard et al., 2011 Lobuglio et al., 1993 López-Villavicencio et al., 2010 Kuhn et al., 2001 in microsporidi, Ironside, 2007 in animali, Simon et al., 2003 e nelle piante, Whitton et al., 2008). Tuttavia, vi sono prove crescenti che alcune specie a lungo ritenute asessuate subiscono sesso criptico ( Burt et al., 1996 Schurko et al., 2009 Lee et al., 2010). Tuttavia, le stirpi anticamente asessuali esistono indubbiamente in molti diversi gruppi tassonomici, come rivela, ad esempio, l'effetto Meselson, in cui la divergenza tra alleli nei due nuclei di ciascuna cellula è così grande che può essere spiegata solo da una lunga divergenza senza ricombinazione ( Kuhn et al., 2001 Enjalbert et al., 2002 Roose-Amsaleg et al., 2002 Schurko et al., 2009). Allo stesso modo, le transizioni tra le preferenze di outcrossing e selfing si sono verificate indipendentemente nell'evoluzione di molti gruppi di piante (ad esempio, il guadagno o la perdita dell'eterostilità, ad esempio Barrett & Shore, 2008 Busch, 2011 e negli animali, Jarne & Auld, 2006).

I biologi evoluzionisti tentano di spiegare la derivazione di particolari modalità riproduttive in termini di benefici e costi di fitness. La riproduzione sessuale può indurre costi di fitness attraverso la trasmissione energetica, genetica e vincoli demografici rispetto alla riproduzione asessuata (vedi Otto, 2009 Lehtonen et al., 2012, per le recensioni). Quando il sesso richiede maschi che contribuiscono solo con i loro geni e non producono direttamente prole, si prevede che una mutazione che consente alle femmine di riprodursi indipendentemente dai maschi, asessualmente o attraverso varie forme di autofecondazione, invada perché la sua progenie cresce al doppio della velocità del lignaggio ancestrale (il famoso 'doppio costo dei maschi' Maynard Smith, 1978). La ricombinazione può inoltre rompere combinazioni di alleli adattate localmente a più loci, che è chiamato carico di ricombinazione. Anche negli organismi senza sessi separati o incroci, tuttavia, la meiosi stessa può essere costosa perché richiede più tempo ed energia rispetto alle divisioni cellulari mitotiche. Altri costi del sesso possono essere applicati in sistemi specifici: costo per trovare e corteggiare un compagno, rischio di predazione o contrarre malattie sessualmente trasmissibili o elementi genetici parassitari. D'altra parte, si ritiene che il sesso fornisca benefici, sia immediati (ad esempio la riparazione del DNA) che ultimi, limitando l'accumulo di mutazioni deleterie e creando nuove e vantaggiose combinazioni genetiche, specialmente in ambienti che variano nello spazio e nel tempo. I lignaggi che subiscono solo la riproduzione asessuata o il selfing obbligato tendono infatti ad avere alti tassi di estinzione (Beck et al., 2011 Goldberg et al., 2010 Igic et al., 2008 Simone et al., 2003 ).

I gruppi biologici che mostrano una grande diversità di strategie riproduttive offrono opportunità uniche per identificare i fattori alla base dell'evoluzione del sesso e dei sistemi di accoppiamento. La maggior parte delle teorie e delle osservazioni si è basata su modelli di vertebrati, insetti e piante, mentre altri gruppi di eucarioti, con strategie riproduttive ancora più diverse, sono stati troppo spesso esclusi dal dibattito ( Birky, 1999 ). Gruppi come i funghi sono ottimi modelli per studiare questi argomenti (Lee et al., 2010 Biliardo et al., 2011 Whittle et al., 2011). I funghi includono specie con specie sessuali obbligate (ad es. Microbotryum, Giraud et al., 2008), specie che mostrano riproduzione sia sessuata che asessuata e altre che appaiono strettamente asessuali (Taylor et al., 1999 Roose-Amsaleg et al., 2002 Schurko et al., 2009) sembrano esserci state molteplici transizioni dalla sessualità all'asessualità ( Lobuglio et al., 1993 López-Villavicencio et al., 2010 Coelho et al., 2011 Schurko et al., 2009). I funghi sono anche potenzialmente informativi perché presentano un'enorme diversità nel grado di tassi di selfing aploidi e diploidi ( Billiard et al., 2011 ), e forniscono vantaggi significativi rispetto ad altri modelli eucariotici per studi empirici ( Goddard et al., 2005 , Bruggeman et al., 2003, 2004). Ad esempio, molti possono essere facilmente coltivati ​​in condizioni di laboratorio, possono essere clonati, hanno tempi di generazione relativamente brevi e possono essere rianimati dopo una conservazione congelata a lungo termine, che è quindi utile negli studi di evoluzione sperimentale.

Qui, quindi, vorremmo sostenere che i funghi hanno molto da portare alle domande sull'evoluzione del sesso e dei sistemi di accoppiamento, essendo modelli sperimentali trattabili per affrontare i vantaggi e i costi dei vari sistemi riproduttivi, e trarrebbero vantaggio da un ulteriore studio all'interno di un contesto evolutivo. Diversi concetti riferiti al sistema di accoppiamento dei funghi, tuttavia, necessitano di chiarimenti perché gli stessi termini (es. selfing e outcrossing) sono usati per fenomeni diversi con conseguenze evolutive completamente diverse ( Giraud et al., 2008 Neal & Anderson, 2005). Inoltre, la conoscenza dei vantaggi e dei costi delle modalità di riproduzione e dei sistemi di accoppiamento nei funghi può avere applicazioni dirette, ad esempio, sui numerosi funghi utilizzati nell'industria o che minacciano la salute e la produzione agricola.

Per prima cosa descriviamo le diverse modalità di riproduzione e sistemi di accoppiamento nei funghi, evidenziando frequenti malintesi, e esaminiamo i loro rispettivi benefici e costi evolutivi. Prenderemo in considerazione anche gli oomiceti, che sono protisti, ma sono stati a lungo studiati dai micologi e condividono con i funghi molte peculiarità morfologiche e genetiche. Riteniamo che la comprensione dell'evoluzione dei modi e dei sistemi di riproduzione, specialmente nei funghi, richieda (i) la valutazione delle loro frequenze nelle popolazioni naturali, e esamineremo le (scarse) prove disponibili in letteratura, (ii) mappare anche queste come altri tratti della storia della vita sulle filogenesi, e (iii) misurare sperimentalmente i vantaggi ottenuti dalle diverse modalità di riproduzione e dai sistemi di accoppiamento. Proporremo alcune possibili impostazioni sperimentali per confrontare l'idoneità della progenie risultante da diversi modi e sistemi di riproduzione.


Tipi di accoppiamento nei funghi (e nella somatogamia) - Biologia

Gli zigomiceti sono un gruppo relativamente piccolo di funghi appartenenti al Phylum Zigomicota . Includono il familiare stampo del pane, Rhizopus stolonifer, che si propaga rapidamente sulle superfici di pane, frutta e verdura. La maggior parte delle specie sono saprobi, che vivono di materiale organico in decomposizione, alcuni sono parassiti, in particolare degli insetti. Gli zigomiceti svolgono un ruolo commerciale considerevole. Ad esempio, i prodotti metabolici di alcune specie di rizopo sono intermedi nella sintesi di ormoni steroidei semisintetici.

Gli zigomiceti hanno un tallo di ife cenocitiche in cui i nuclei sono aploidi quando l'organismo è in fase vegetativa. I funghi di solito si riproducono asessualmente producendo sporangiospore (Figura 1).

Figura 1. Ciclo di vita dello zigomicete. Gli zigomiceti hanno fasi asessuali e sessuali nei loro cicli di vita. Nella fase asessuale, le spore sono prodotte da sporangi aploidi per mitosi (non mostrato). Nella fase sessuale, i tipi di accoppiamento aploidi più e meno si coniugano per formare uno zigosporangio eterocariotico. La cariogamia produce quindi uno zigote diploide. Le cellule diploidi nello zigote subiscono la meiosi e germinano per formare uno sporangio aploide, che rilascia la prossima generazione di spore aploidi.

Le punte nere della muffa del pane sono gli sporangi gonfi e pieni di spore nere (Figura 2). Quando le spore atterrano su un substrato adatto, germinano e producono un nuovo micelio. La riproduzione sessuale inizia quando le condizioni ambientali diventano sfavorevoli. Due ceppi di accoppiamento opposti (tipo + e tipo -) devono essere in stretta vicinanza affinché i gametangi delle ife vengano prodotti e si fondono, portando alla cariogamia. Ogni zigospora può contenere diversi nuclei diploidi. Il diploide in via di sviluppo zigospore hanno strati spessi che li proteggano dall'essiccamento e da altri pericoli. Possono rimanere dormienti fino a quando le condizioni ambientali non sono favorevoli. Quando la zigospora germina, subisce la meiosi e produce spore aploidi, che a loro volta si trasformeranno in un nuovo organismo. Questa forma di riproduzione sessuale nei funghi è chiamata coniugazione (sebbene differisca notevolmente dalla coniugazione nei batteri e nei protisti), dando origine al nome di "funghi coniugati".

Figura 2. Gli sporangi asessuati crescono all'estremità degli steli, che appaiono come (a) lanugine bianca vista su questo stampo di pane, Rhizopus stolonifer. Le punte nere (b) della muffa del pane sono gli sporangi contenenti spore. (credito b: modifica dell'opera di “polandeze”/Flickr)


Riproduzione nei funghi - Parte 3: Riproduzione sessuale (Note della lezione & PPT)

Ø I funghi si riproducono con metodi vegetativi, asessuati e sessuali
Ø Questo post descrive i metodi di riproduzione sessuale nei funghi
Ø La riproduzione sessuale avviene in tutti i gruppi di funghi eccetto i Deuteromiceti
Ø I funghi possono essere monoici (bisessuali) o dioici (unisessuali)

Ø Le specie moneiche producono due organi sessuali (maschio e femmina) nello stesso tallo, per questo sono chiamate omotalliche
Ø Le forme dioiche producono organi sessuali in talli separati, quindi chiamati eterothallic
Ø In base alla complessità della riproduzione sessuale, i funghi possono essere raggruppati in due categorie:
(1). funghi eucarpici
(2). Funghi olocarpici

Ø Funghi eucarpici: Nella maggior parte dei funghi solo una parte del micelio vegetativo forma l'unità riproduttiva e il resto rimane vegetativo, tale fungo è chiamato funghi eucarpici (tipo avanzato)

Ø Funghi olocarpici: in alcune forme unicellulari l'intera cellula vegetativa si trasforma in unità riproduttiva al momento della maturazione (tipo primitivo)

Ø Il processo di riproduzione sessuale nei funghi si completa in tre fasi distinte.

(UN). Plasmogamia: fusione del citoplasma

(B). Cariogamia: fusione di nuclei

(C). Meiosi: divisione di riduzione

(UN). Plasmogamia

Ø La plasmogamia è la prima fase della riproduzione sessuale nei funghi

Ø È la fusione di protoplasti di due gameti compatibili o cellule sessuali o ife

Ø Come risultato della plasmogamia, due nuclei compatibili si avvicinano l'uno all'altro

(B). cariogamia

Ø Fusione di due nuclei per formare un nucleo diploide

Ø In alcuni funghi (Ficomiceti) la cariogamia si verifica immediatamente dopo la plasmogamia

Ø In alcuni altri funghi (Ascomiceti e Basidiomiceti) la cariogamia è molto ritardata

Ø In quest'ultimo caso (cariogamia ritardata) due ceppi opposti di nucleoli si dispongono a coppie (dikaryon) in una singola cellula

Ø Questo dikaryon si divide mitoticamente come al solito insieme alla divisione simultanea del citoplasma

Ø Ciò si traduce nella creazione di una fase cariotica separata nel ciclo di vita dei funghi

Ø Questa fase del ciclo di vita è chiamata fase dicariotica

Ø Il processo mediante il quale si realizza la fase dicariotica si chiama dicariotizzazione

Ø Dopo l'instaurarsi della fase dicariotica, i due nuclei di un dikaryon si fondono per formare lo zigote diploide

Ø Lo zigote è l'unica fase diploide nel ciclo di vita dei funghi

Ø Lo zigote subisce immediatamente una divisione di riduzione (meiosi) per produrre meiospore

Ø Dopo la riduzione della cariogamia, la divisione ha luogo nel nucleo diploide e quindi si stabilisce lo stadio aploide

Ø Nella riproduzione sessuale dei funghi, i due nuclei compatibili (maschio e femmina) sono uniti dai seguenti processi.

(1). Copulazione planogametica

(2). Contatto gametangiale

(3). Copulazione gametangiale

(4). spermatizzazione

(5). somatogamia

(1). Copulazione planogametica

Ø La copulazione planogametica comporta la fusione di due gameti mobili nudi (planogameti)

Ø In base alla struttura e alle dimensioni dei gameti in fusione, nei funghi possono verificarsi tre tipi di planogamia

Ø I gameti di fusione sono morfologicamente simili ma fisiologicamente sono due ceppi (+ e -)

Ø I gameti si formano su diversi talli

Ø Tipo di riproduzione primitivo

Ø I gameti di fusione sono sia morfologicamente che fisiologicamente diversi

Ø Il gamete maschile è più piccolo e attivo dei gameti femminili

Ø I gameti femminili sono più grandi e meno attivi dei gameti maschili

Ø Il gamete femminile è grande e non mobile

Ø Il gioco maschile è più piccolo e mobile (flagellato)

Ø I gameti maschili sono chiamati anterozoidi

Ø Si formano su strutture riproduttive specializzate chiamate anteridi

Ø Il gamete femminile si chiama oogonio

Ø L'oogamia è un tipo avanzato di riproduzione sessuale

(2). Contatto gametangiale

Ø Qui i gameti non vengono rilasciati dal gametangia

Ø Invece i gametangi maschili e femminili entrano in stretto contatto con l'aiuto del tubo di fecondazione

Ø Quindi uno o più nuclei maschili migrano nel gametangio femminile

Ø I gametangi non si fondono né perdono mai la loro identità durante l'atto sessuale

Ø I gametangi maschili e femminili sono chiamati rispettivamente anteridi e oogonia (Ascogonium in Ascomycetes)

Ø Esempio: Albugo, Aspergillus, Pythium

(3). L'accoppiamento gametangiale

Ø Qui l'intero contenuto di due gametangi compatibili si fonde l'un l'altro

Ø I gametangi entrano in stretto contatto, il muro nel punto di contatto si dissolve e il loro contenuto si mescola tra loro

Ø Allora si stabilisce la cariogamia

(4). spermatizzazione

Ø In alcuni funghi avanzati gli organi sessuali sono completamente assenti

Ø Qui il processo sessuale è compiuto da minuscole spore come spermati e ife specializzate (ricettive) che agiscono rispettivamente come strutture maschili e femminili

Ø La spermazia è trasportata dall'aria, dall'acqua o dagli insetti alle ife ricettive

Ø Gli spermatozoi si attaccano al tricogino delle ife ricettive e migrano nel citoplasma

(5). somatogamia

Ø Qui non si formano gli organi sessuali

Ø Si verifica in gruppi fungini avanzati come i basidiomiceti

Ø Due cellule vegetative o ife vegetative assumono la funzione sessuale e si fondono insieme

ØEs. Morchella, Peziza, Agaricus

Spore sessuali nei funghi

Ø Importanti spore sessuali nei funghi sono

(1). Zigospore

(2). Ascospore

(3). basidiospore

(1). Zigospora:

Ø Le zigospore sono formate dalla fusione di strutture maschili e femminili durante la riproduzione sessuale

Ø Sono spore diploidi

Ø Sono spore di alcuni funghi che riposano con pareti spesse

Ø Solitamente prodotto da gruppi inferiori di funghi

Ø Le specie fungine che producono zigospore sono raggruppate nella classe Zygomycete (Rizopo)

Ascus con ascospore (fonte wikipedia)

(2). Ascospore

Ø Spore sessuali prodotte nella classe degli Ascomiceti

Ø Le ascospore sono endospore

Ø Le ascospore sono prodotte in un sacco specializzato come una struttura chiamata asco

Ø Le ascospore sono spore aploidi

Ø Tipicamente un singolo asco contiene otto ascospore

Ø Le otto ascospore sono prodotte dopo una meiosi, subito seguita da una mitosi

Basidiospore (fonte wikipedia)

(3). basidiospore

Ø Spore sessuali prodotte nella classe Basidiomiceti

Ø Le basidiospore sono esospore

Ø Le basidiospore sono prodotte su una struttura specializzata chiamata basidio

Ø Le basidiospore sono anche spore aploidi

Ø Tipicamente il singolo basidio produce quattro basidiospore

Ø Le quattro basidiospore sono prodotte dopo la meiosi di uno zigote diploide


Accoppiamento in ascomiceti filamentosi

In specie come Neurospora crassa e Podospora anserina, due specie modello, l'accoppiamento viene avviato tra cellule differenziate maschili e femminili, rispettivamente il microconidio e l'ascogonio. Il microconidio si fonde con il tricogino, la punta ricettiva dell'ifa ascogoniale, e il suo nucleo si replica con i nuclei residenti (Figura 2). Segue lo smistamento nucleare per generare cellule dicariotiche tipicamente binucleate, le ife ascogene, in cui avviene la divisione nucleare sincronizzata e i nuclei figli sono partizionati tramite una struttura analoga alla connessione a morsetto vista nei dicarioti basidiomiceti. Così gli ascomiceti filamentosi, come i basidiomiceti, ritardano la fusione nucleare e proliferano i nuclei di una coppia di accoppiamento con una dicariofase. Questa fase è di durata limitata negli ascomiceti ed è confinata all'interno del corpo fruttifero in via di sviluppo. La segnalazione dei feromoni è stata a lungo implicata nell'attrazione dei microconidi verso il tricogino (Bistis, 1983), ma solo di recente i geni che codificano per i feromoni sono stati identificati in questo gruppo di funghi (Zhang et al, 1998 Shen et al, 1999Pöggeler, 2000). Le somiglianze tra le ife ascogene e il basidiomicete dikaryon illustrate nella Figura 2 indicano chiaramente una forte conservazione nel modo in cui sono regolate le vie di accoppiamento di questi funghi, ma questo non è immediatamente ovvio quando si osservano i geni sequestrati nel locus del tipo di accoppiamento!

Gli idiomorfi di P. anserina e N. crassa il locus del tipo di accoppiamento contiene geni simili (Debuchy et al, 1993Ferreira et al, 1996 recensito da Coppin et al, 1997) quelli di P. anserina sono designati stuoia − e stuoia + loci e sono illustrati nella Figura 1. Due geni hanno dimostrato di essere essenziali per la fecondazione, FMR1 nel stuoia − idiomorfo e FPR1 nel stuoia + idiomorfo. È interessante notare che questi due geni sono gli unici geni che si trovano negli idiomorfi di specie meno strettamente correlate (Turgeon et al, 1993 Turgeon, 1998). Entrambi i geni hanno evidenti omologhi nei loci del tipo di accoppiamento del lievito. FMR1 codifica un omologo di S. cerevisiae α1 e S. pombe Mat1-Mc, una proteina che è presumibilmente necessaria per attivare la trascrizione di stuoia − feromoni e recettori di accoppiamento specifici delle cellule. FPR1 codifica per una proteina appartenente alla famiglia del dominio HMG ed è il probabile omologo della proteina Mat1-Pc di S. pombe, e tenuto a regolamentare la trascrizione di stuoia + feromoni di accoppiamento specifici per le cellule e geni recettoriali. I due geni aggiuntivi nella stuoia − l'idiomorfo codifica per proteine ​​essenziali per il completamento dello sviluppo sessuale, ma queste vengono indotte solo durante l'accoppiamento (Coppin e Debuchy, 2000). SMR2 codifica per un altro membro della famiglia del dominio HMG ed è necessario per mantenere un corretto accoppiamento nucleare nelle ife ascogene (Zickler et al, 1995), che per analogia con il dikaryon dei basidiomiceti si prevede che dipenda dal segnale del feromone. Sembra probabile che SMR2 è il P. anserina omologo di S. pombe ste11 e U. maydis prf1. Non c'è alcun vantaggio evidente nell'avere questo gene sequestrato in un locus di tipo accoppiamento, come evidenziato dal fatto che non tutti gli ascomiceti filamentosi lo fanno, ma il fatto che possa essere indica che la sua funzione è richiesta solo dopo la fusione cellulare.


Deuteromicota: il fungo imperfetto

I funghi imperfetti, quelli che non mostrano una fase sessuale, sono classificati nella forma phylum deuteromicoti. Deuteromycota è un gruppo polifiletico in cui molte specie sono più strettamente correlate agli organismi in altri phyla che tra loro, quindi non può essere chiamato un vero phylum e deve, invece, ricevere il nome di phylum. Poiché non possiedono le strutture sessuali utilizzate per classificare altri funghi, sono descritti meno bene rispetto ad altre divisioni. La maggior parte dei membri vive sulla terraferma, con poche eccezioni acquatiche. Formano miceli visibili con un aspetto sfocato e sono comunemente noti come muffa. L'analisi molecolare mostra che il gruppo più vicino ai deuteromiceti è quello degli ascomiceti. Infatti, alcune specie, come Aspergillo, che una volta erano classificati come funghi imperfetti, ora sono classificati come ascomiceti.

La riproduzione di Deuteromycota è strettamente asessuata e avviene principalmente per produzione di conidiospore asessuate (Figura 8). Alcune ife possono ricombinarsi e formare ife eterocariotiche. È noto che la ricombinazione genetica avviene tra i diversi nuclei.

Figura 8. Aspergillus niger è un fungo imperfetto che si trova comunemente come contaminante alimentare. La struttura sferica in questa micrografia ottica è un conidioforo. (credito: modifica del lavoro della dott.ssa Lucille Georg, dati della barra della scala CDC di Matt Russell)

I funghi imperfetti hanno un grande impatto sulla vita umana quotidiana. L'industria alimentare si affida a loro per la stagionatura di alcuni formaggi. Le venature blu del formaggio Roquefort e la crosta bianca del Camembert sono il risultato della crescita dei funghi. L'antibiotico penicillina è stato originariamente scoperto su una piastra Petri troppo cresciuta, su cui una colonia di Penicillium i funghi hanno ucciso la crescita batterica che lo circondava. Molti funghi imperfetti causano gravi malattie, sia direttamente come parassiti (che infettano sia le piante che l'uomo), o come produttori di potenti composti tossici, come si vede nelle aflatossine rilasciate dai funghi del genere Aspergillus.


Gli Zigomiceti

Delle circa 900 specie descritte negli Zygomycota, la maggior parte sono terrestri ed esistono come saprobi nel suolo, su materiale vegetale in decomposizione o su sterco animale (Fig. 10). Molti comuni stampi per il pane (ad es. Rhizopus stolonifer) sono zigomiceti. Morfologicamente presentano ife cenocitiche, con setti formati solo in associazione con strutture riproduttive. Il phylum prende il nome dalla produzione del zigosporangio.



Figura 10. Un fungo zigomicete, Pilobolus cristallino, su sterco di cervo (http://www.herbarium.iastate.edu/fungi/fungispecies.php?sp=Pilobolus+crystallinus+%28F.H.+Wigg.%29+Tode) (Clicca per ingrandire)

La Figura 11 illustra gli eventi nel ciclo di vita di uno zigomicete. Concentrati sulla parte superiore del diagramma. Come hai appreso, spesso sono necessari due diversi tipi di accoppiamento aploide per la riproduzione sessuale nei funghi. Primo, gametangia iniziano a formarsi su ife di diversi tipi di accoppiamento, "+" e "-" (passo 1). I gametangi quindi si fondono (passaggio 2) per formare lo stato eterocariotico (passaggio 3). Successivamente si sviluppa lo zigosporangio eterocariotico (passaggio 4). Lo zigosporangio sviluppa una parete cellulare ruvida e ispessita, che lo rende resistente alle dure condizioni di "svernamento". Quando le condizioni diventano favorevoli per zigospora germinazione, i nuclei si fondono (cariogamia) e si forma brevemente un diploide (fase 5). Segue immediatamente la meiosi e milioni di zigospore aploidi si formano nello sporangio per mitosi (fase 6). Lo zigosporangio germina e rilascia le spore e il ciclo ricomincia (fase 7). La fase asessuale alterna tra crescita miceliale e produzione di spore asessuate (come mostrato nella parte inferiore della figura).


Figura 11. Ciclo di vita dello zigomicete. (Clicca sull'immagine per ingrandirla)


La distribuzione globale dei tipi di accoppiamento mostra opportunità limitate per l'accoppiamento tra popolazioni di funghi che causano la malattia da peronospora del bosso

La peronospora del bosso è una minaccia di malattia per i paesaggi naturali e gestiti in tutto il mondo. To determine mating potential of the fungi responsible for the disease, Calonectria pseudonaviculata and C. henricotiae, we characterized their mating-type (MAT) loci. Genomes of C. henricotiae, C. pseudonaviculata and two other Calonectria species (C. leucothoes, C. naviculata) were sequenced and used to design PCR tests for mating-type from 268 isolates collected from four continents. All four Calonectria species have a MAT locus that is structurally consistent with the organization found in heterothallic ascomycetes, with just one idiomorph per individual isolate. Mating type was subdivided by species: all C. henricotiae isolates possessed the MAT1-1 idiomorph, whereas all C. pseudonaviculata isolates possessed the MAT1-2 idiomorph. To determine the potential for divergence at the MAT1 locus to present a barrier to interspecific hybridization, evolutionary analysis was conducted. Phylogenomic estimates showed that C. henricotiae and C. pseudonaviculata diverged approximately 2.1 Mya. However, syntenic comparisons, phylogenetic analyses, and estimates of nucleotide divergence across the MAT1 locus and proximal genes identified minimal divergence in this region of the genome. These results show that in North America and parts of Europe, where only C. pseudonaviculata resides, mating is constrained by the absence of MAT1-1. In regions of Europe where C. henricotiae and C. pseudonaviculata currently share the same host and geographic range, it remains to be determined whether or not these two recently diverged species are able to overcome species barriers to mate.

Parole chiave: Boxwood Calonectria MAT1 architecture Mating type Synteny.


Materiali e metodi

Reference Genome (m. lychnidis-dioicae)

Information on the a1 haploid genome of the Lamole reference strain of m. lychnidis-dioicae parasitizing S. latifolia was obtained from the Broad Institute web-server. This included the scaffolds (i.e., supercontigs) corresponding to the nonmitochondrial regions, the associated CDS annotations (gff files), and the annotations obtained with Interproscan, a powerful integrated database and diagnostic tool ( Jones et al. 2014).

Resequencing of the a1 Mating-Type Chromosomes (m. lychnidis-dioicae)

The a1 mating-type chromosome from the same haploid Lamole genotype whose whole genome was sequenced by the Broad Institute was isolated using electrophoretic karyotype analysis as previously described ( Hood et al. 2004). The DNA was subjected to multiple displacement amplifications with the REPLI-g Kit (QIAGEN), and then sequenced at a coverage of 1,175 × using 2- and 5-kb insert size, mate-paired libraries for Titanium version 454 technology (www.roche.com). A first assembly using Newbler (the Roche assembler) was performed with approximately 30-fold and approximately 20-fold coverage.

Identifying the Mating-Type Chromosome Scaffolds on the a1 Reference Genome

To determine which scaffolds of the M. lychnidis-dioicae genome belonged to the a1 mating-type chromosomes and which to non-MAT chromosomes, the assembled contigs from the gel-isolated mating-type chromosomes were mapped against the M. lychnidis-dioicae reference genome using NUCmer (http://mummer.sourceforge.net/). Matches were assigned to the mating-type chromosome, and scaffolds without any match were assigned to non-MAT chromosomes. To validate these results, our 454 data (Newbler) were mapped onto the Broad Institute assembly scaffolds to identify contamination from non-MAT chromosomes by their scattered weak read coverage. Finally, all nonmitochondrial Broad Institute assembly scaffolds with coverage greater than 20-fold when mapped with contigs from the gel-isolated mating-type chromosomes were assigned to mating-type chromosomes.

Sequencing and Assembly of the a2 Mating-Type Chromosome (m. lychnidis-dioicae)

The a2 mating-type chromosome from the Lamole reference strain was isolated and amplified as described above for the a1 mating-type chromosome. Four libraries were sequenced on Illumina HiSeq 2000, one paired-end library (insert size of 250 bp) and three mate-pair libraries (expected insert sizes 3, 8, 20 kb observed insert sizes of 2.2, 9, 12.5 kb, respectively). The sequence data for the paired-end library (100 bp sequenced at both ends of fragments) represent a coverage of 1,175 × (given the expected genome size of 25 Mb). The 2.2-, 9- and 12.5-kb libraries include 34, 6.4 and 2.2 millions of base pairs, respectively.

Contigs were generated from the paired-end data, with SOAPdenovo 2.04 ( Li et al. 2010) using a kmer of 91. Then, a three-step process was applied to remove artifacts from the assembly: 1) Contigs fully included in longer contigs were removed 2) contigs containing 15-mers that were not present in raw reads were split, as they are likely to be chimeras and 3) contigs were trimmed (46 bp ∼ 1/2 kmer length) to remove the artificial overlaps created by the large kmer used.

Paired-end and mate-pair reads were mapped on contigs using the glint software (Faraut T and Courcelle E, unpublished data http://lipm-bioinfo.toulouse.inra.fr/download/glint parameters - -best-score - -step 2 - -no-lc-filtering - -mmis 5 - -lrmin 80). Due to the large numbers of highly conserved repeats, additional stringent criteria were used for further hit selection (length of the hit ≥ 90 bp identity = 100%). LYNX scaffolder (Gouzy J, unpublished data) was used to generate scaffolds. A minimum number of five links was required for linking information from the 250-nt and 2.2-kb libraries to be considered, and at least two links for the 9- and 12.5-kb libraries. Finally, SOAPGapCloser was used to fill in gaps in the assembly. The final assembly was 24,832,594 nucleotides long in 388 scaffolds (N50 of scaffolds longer than 1,000 nt = 299 kb 4.75% of n).

Identification of the MATRRs (m. lychnidis-dioicae)

To identify sequence assemblies corresponding to the two MATRRs of M. lychnidis-dioicae mating-type chromosomes reported in optical maps ( Hood et al. 2013), contigs were aligned with restriction-digest optical maps using the MapSolver software (OpGen) ( Latreille et al. 2007). This software predicts restriction digest patterns from DNA sequence data for comparison with the observed optical maps (restriction-digest fragments sizes) alignments are based on a cumulative scoring function that rewards matching cut-site distributions and penalizes mismatch or missing sites. The software’s default settings were used to calculate alignments.

Genome Sequencing of Additional Microbotryum Species and Mapping against the Reference

The fungal material used in this study was collected as diploid teliospores from natural populations in North America and Europe. Alcuni Microbotryum species have not received a specific Latin name yet and are referred to as M. violaceum sensu lato with the additional indication of their host plant species ( fig. 3). Microbotryum species have been distinguished on the basis of a combination of multiple gene genealogies, interfertility assays, and hybrid fitness and fertility assessments ( Le Gac, Hood, Fournier, et al. 2007 Le Gac, Hood, and Giraud 2007 de Vienne, Hood, et al. 2009 de Vienne, Refrégier, et al. 2009). Haploid cultures of the 11 Microbotryum species were obtained by micromanipulation of the postmeiotic yeast-like sporidial cells, which were grown on potato dextrose agar (Difco). Mating types of the haploid cultures were identified by pairing with cultures of known mating types and examining the conjugation response elicited by the alternate mating pheromone ( Day 1979). Also, PCR primers that discriminate between a1 e un2 pheromone receptors ( Devier et al. 2009) were used to test extracted DNA for mating type with the DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN). The extracted DNA from the Microbotryum species was also used to obtain shotgun sequence libraries using the Titanium version 454 technology (performed at the University of Virginia, Genomics Core Facility) with a coverage of 2–2.5 × . Only reliable sequenced positions, with sufficient qualities, were taken into account.

Sequence libraries for each of the 11 Microbotryum species were assembled individually by mapping against the M. lychnidis-dioicae reference genome using Newbler. Pairwise mapped sequences were realigned within species libraries using Prank ( Loytynoja and Goldman 2005, 2008) with the “-codon” option in accordance with recent recommendations based on simulations for the use of codon-based models to detect selection ( Fletcher and Yang 2010 Markova-Raina and Petrov 2011). In the pairwise alignments obtained, the positions creating gaps on the reference sequence were discarded to maintain the initial coordinates in the reference.

Sequences matching the same fragments of the reference M. lychnidis-dioicae genome were clustered together as putative orthologs using Newbler-generated coordinates of the mapped contigs on the reference genome. Noncoding regions were filtered out from POGs using the CDS annotations of the reference genome provided by the Broad Institute. Loci shorter than 300 bp and those missing from more than six Microbotryum species were discarded.

An outgroup species, M. pustulatum, parasitizing P. bistorta ( Kemler et al. 2006), was also sequenced and assembled against the reference genome as described above. Given its distance from the Microbotryum species (mean number of substitutions per site between the outgroup and the ingroups is 0.085 ± 0.067), few POGs (46) were available for the phylogenetic studies. Consequently a second, larger data set was generated without the outgroup species, including 5,726 POGs, which was used for all the subsequent analyses.

Species Phylogeny Inference

To avoid potential biases in the phylogenetic signal caused by trans-specific polymorphism, as observed at some mating-type genes ( Devier et al. 2009 Abbate and Hood 2010b Petit et al. 2012), only POGs not belonging to mating-type chromosomes were used for the species tree reconstruction. The 5,453 POGs not belonging to mating-type chromosomes were concatenated and JMODELTEST ( Posada 2008) was used to infer the most suitable nucleotide substitution model. Phylogenetic trees were constructed in a maximum-likelihood framework using RAxML 7.8.1 ( Stamatakis et al. 2005) with a GTR + gamma substitution model and on gene-partitioned data sets (substitution model parameters were optimized for each partition of genes with JMODELTEST). Other phylogenies based on codon position partitioning (computing estimations separately for the first two codon positions, GC12, vs. the third codon position, GC3) or on other amino acid substitution models, had identical topologies. A rooted phylogeny was also produced based on the small subset of 46 POGs for which orthologs were found in the Microbotryum species and the P. bistorta outgroup species ( Lutz et al. 2005 Kemler et al. 2006).

The robustness of nodes in our tree was tested using only the POGs not belonging to the mating-type chromosomes yielding individual trees with a high mean bootstrap support (MBS) or a high Tree Certainty (TC) ( Salichos and Rokas 2013). For each POG, ModelTest v 2.3.1 ( Darriba et al. 2012) was used to find the best model, and PhyML v3 ( Guindon and Gascuel 2003) to reconstruct each tree with 100 bootstrap replicates. For each tree, the MBS and the TC (using RAxML 7.8.1) were then computed. MBS and TC values being highly correlated (R 2 = 0.8276, P < 2.2e-16), only MBS was used thereafter. POGs with MBS ≥ 80 were selected: The sequences of the 288 POGs selected were concatenated. RAxML v 7.2.8 was used to reconstruct the final trees using the gtr+gamma substitution model and 100 bootstrap replicates. Note that the tree obtained when selecting the genes based on their TC was the same as that based on MBS.

Placement of NRR Alleles in a1 e un2 di M. lychnidis-dioicae in the Species Tree and Computation of Their Divergence

BLASTn and tBLASTn searches (NCBI blast 2.2.29 universal macosx) of the M. lychnidis-dioicae un1 alleles for predicted genes in NRRs were performed to search for hits in the a2 mating-type chromosome of M. lychnidis-dioicae. Both methods converged on the same hits. The a2 protein hits obtained from the tBLASTn search were added to the respective POG protein alignments obtained above and realigned using t-coffee 10.00.r1613 ( Notredame et al. 2000) with default settings. The resulting alignments were trimmed with Trimal version 1.2rev59 ( Capella-Gutierrez et al. 2009), removing 20% of the gaps introduced when adding the a2 sequenze. We kept only the 45 reliable alignments, and used them to build the trees with RAxML version 7.4.4 ( Stamatakis 2006) and the GTRGAMMA model. The placement of the a1 e un2 alleles relative to alleles of other species was visually inspected in the predicted trees. The synonymous divergence of NRR alleles between a1 e un2 di M. lychnidis-dioicae was computed as the estimated number of synonymous substitutions, including inferred multiple substitutions, divided by the number of synonymous sites in the sequence. The synonymous divergence and their associated standard error values were computed using the yn00 program in the PAML package (v. 4.7a) ( Yang 2007) ( fig. 1).

Detection of Selection Signatures

The efficacy of purifying selection to maintain gene function was assessed by two approaches. First classic models of codon substitution ( Yang 2007) were used: Parameters were inferred from the species phylogeny to reconstruct changes in the ratios of nonsynonymous to synonymous substitutions (ω = dn/DS). The rationale is that nonsynonymous, deleterious substitutions are expected to accumulate if purifying selection is weak or relaxed. Ratios of dn/DS were estimated for each POG using codon models with CODEML in the PAML package ( Yang 2007). The tree used was the species tree ( fig. 3). Species not represented in these POGs were pruned from the species tree using the Ape package in R. We also ran analyses using individual gene trees for NRR POGs instead of species tree, and similar results were obtained ( supplementary fig. S3C , Supplementary Material online).

The efficacy of purifying selection was also investigated using an estimation of the global ω per branch (the “free-ratio branch model” under CODEML): Mean and median ω values per branch for each terminal lineage were calculated, and genes with dS values close to 0 that would produce artifactually very large ω values were excluded. Positive selection was tested by comparing neutral and selective codon models. Genes displaying unrealistically high dn or dS values (i.e., “999” in the codeml output) were discarded from the analysis as they probably corresponded to saturated levels of substitutions and would bias ω estimations. We also excluded from the analysis those genes with null dS and dn valori. More stringent filtering (discarding sequences with SdS lower than 2, 3, or 4, or filtering using branch length parameters) led to results for ω similar to those presented.

To control for the possibility of positive selection increasing dn/DS, which would not constitute degeneration, positive selection was also tested using a branch-site test based on codon models which accounts for variation of the ω ratio between both sites and lineages ( Yang and Nielsen 2002 Zhang et al. 2005). A likelihood ratio test was used to compare a null model without positive selection and an alternative model allowing positive selection ( Nielsen and Yang 1998). In cases where the null hypothesis was rejected, and the “selective” model retained, positions under positive selection among foreground branches were determined using a Bayesian empirical Bayes approach ( Yang et al. 2005). Similar automated procedures (python + R scripts) were used to run codeml automatically and both extract and filter parameter values as in the free-ratio branch model described above.

The second approach used to assess the efficacy of purifying selection focused on recently derived substitutions these have the advantage of being free of assumptions on phylogenic relationships and are more likely to have occurred while being in the current genomic compartment indeed, substitutions may have occurred before the putative transfer of genes between recombining regions and NRRs ( Abbate and Hood 2010b Petit et al. 2012). Recent substitutions were identified as singletons in aligned POGs. From the singleton data set for all alignments of orthologous loci, median dn/DS ratios between different genomic compartments (NRRs, MATRRs, and non-MAT chromosomes) were computed and compared. The nonsynonymous rate was computed as dn = n/n, dove n is the nonsynonymous singleton count and n is the number of nonsynonymous sites in the alignment. Similarly, the synonymous rate was computed as dS = S/S dove S is the count of synonymous singleton substitutions and S the number of synonymous sites in the alignment. This approach, however, does not take into account multiple substitutions at a given site so it may underestimate substitution counts.

Gene Conversion Analyses

Geneconv v1.81 ( Sawyer 1989) was used to look for footprints of gene conversion in NRRs directly. To be conservative, only results from estimations of “inner” gene converted fragments are reported. As defined in the Geneconv manual, such fragments represent evidence of possible gene conversion events between ancestors of two sequences in the alignment. Geneconv was executed through a batch script independently for the alignments of putative CDS regions (i.e., POGs) in NRRs.

TE Analyses

TE contents of contigs were estimated and assigned to non-MAT chromosomes, NRRs, and MATRRs in each Microbotryum specie. Because many contigs were small, especially in the NRRs, the analysis was run on fragments of similar sizes using databases of 200-bp fragments generated in each species and genomic compartment (non-MAT chromosomes, NRR, and MATRR). To compare databases of equivalent sizes, 1,000 reads were randomly resampled without replacement from each database. A set of full-length TEs of the most common types in Microbotryum ( Hood 2005 Hood et al. 2005 Yockteng et al. 2007) (Copia-like, e.g., Supercontig 147: 1,901–7,063 bp Gypsy-like, e.g., Supercontig 151: 14,408–18,631 bp and rolling circle Helitron-like, e.g., Supercontig 124:8,251–12,551 bp) were used as queries to search against the 1,000 read databased using tBLASTx (Basic Local Alignment Search Tool blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) with the significance threshold set at E value < 10 − 6 . To assess the significance of the differences in TE counts between genomic compartments, Z tests were used. P values were assigned by comparing the computed Z value to the critical Z value for a two-tailed test in a standard normal distribution table. The null hypothesis was that the difference between the proportions of the two samples considered is zero.

Expression Analysis in the Reference Species (m. lychnidis-dioicae)

Expression data were generated under five different conditions using the Lamole reference strain, with two biological replicates per condition. Haploid fungal cells of Lamole a1 sporidial cells (p1A1Rich) and a2 sporidial cells (p1A2Rich) were grown separately for 5 days on yeast peptone dextrose media (1% yeast extract, 10% dextrose, 2% peptone, 2% agar rich growth conditions) at room temperature, and then harvested for RNA extraction. Similarly, haploid cells grown separately on 2% water agar for 2 days were harvested for RNA extraction and named p1A1Water and p1A2Water these samples allowed comparison between the gene expression when haploid cells of different mating types were subjected to a nutrient-free environment without a mating partner. We also studied a “mated” condition: An equal mixture of a1 and a2 cells was kept at 14 °C on 2% water agar for 2 days, which induces conjugation, the first stage of mating ( Day 1979).

RNA was extracted from samples of the cells cultured in these various conditions using the RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, cat no: 74904) according to the manufacturer’s instructions. Ambion’s TURBO DNA-free (Applied Biosystems, cat no: AM1907) DNase was used according to the manufacturer’s instruction. For quality assessment before Illumina sequencing, 5 μg of DNase-treated RNA was reverse transcribed with SuperScript III First Strand Synthesis System for reverse transcription PCR (Life Technologies, cat no: 18080-051). PCR was performed using TaKaRa Ex Taq Hot-Start DNA Polymerase (Takara, cat. no: RR001B) in a reaction volume of 25 μl. To check for DNA contamination and possible inhibitory substances in the RNA, two sets of housekeeping primers (Eurofins/MWG/Operon) were used. Targeting the Microbotryum mepA gene, the forward primer, 5′-CTTTTGCGTAGGAAGAATGC-3′ and the reverse primer, 5′-AGCACTGAACACCCCAACTT-3′ were used this combination yielded a 532-bp fragment from cDNA, and a 1,039-bp fragment from genomic DNA. The other primer combination targeted the Microbotryum beta-tubulin gene, with forward primer, 5′-CGGACACCGTTGTCGAGCCT-3′, and reverse primer, 5′-TGAGGTCGCCGTGAGTCGGT-3’, yielding a 150-bp fragment from cDNA and a 215-bp fragment from genomic DNA. The PCR program was 30 s at 94 °C, 30 s at 60 °C, and 1 min at 72 °C for 35 cycles. An Agilent BioAnalyzer was also used to determine the quality of the RNA prior to Illumina RNA-Seq.

De novo assemblies of both the a1 e un2 RNA-Seq data were generated with Trinity ( Grabherr et al. 2011) to identify genes specific to each mating chromosome. Assembled transcripts were compared between a1 e un2 using blast to identify transcripts specific for each cell type: a1 transcripts were mapped to the gene set based on the whole genome assembly the a2 assembly is available at the Broad website, at http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/Microbotryum_violaceum/assets/Mvio_A2_trinity.fa.gz.

Differential expression scripts in the Trinity pipeline version r2013-02-25 ( Grabherr et al. 2011) were run to process RNA-Seq reads from the ten libraries (two biological replicates of each of p1A1Water, p1A2Water, p1A1Rich, p1A2Rich, and Mated). The RNA-Seq reads were aligned by bowtie ( Langmead et al. 2009) against protein CDS extracted from the reference genome, adding 100 bases of flanking sequence to approximate UTRs. The read alignment files were then processed with RSEM ( Li and Dewey 2011) to quantify transcript abundances. To identify genes differentially expressed between each pair of conditions, edgeR with the trimmed mean of m-value normalization method (TMM) ( Robinson et al. 2010 Kadota et al. 2012) was run using an adjusted P value cutoff of 1E-10 TMM normalization is a method for estimating relative RNA production levels from RNA-Seq data by estimating scale factors between samples. The agglomerative hierarchical clustering method implemented in the R package cluster ( Maechler et al. 2013) was then used to identify coexpressed gene clusters of those genes with significant differential expression between conditions. Expression data are available at the Broad Institute website, www.broadinstitute.org/annotation/genome/Microbotryum_violaceum.

Some genes displayed mating-type-specific expression profiles, which could be the result of a lack of expression of these genes on one of the mating-type chromosomes or of hemizygosity (there is only a single copy of the gene, on only one of the mating-type chromosomes). To distinguish these possibilities, the presence of the genes expressed only from one mating-type chromosome was investigated using BLASTn by aligning the assembled cDNA against the genomic sequence of the opposite mating type (the published a1 haploid genome for a2-specific transcripts, and the a2 mating type chromosome for a1-specific ones).

The absence of some genes from one of the mating-type chromosomes was then checked with primers specific for these genes ( supplementary table S2 , Supplementary Material online): DNAs extracted from a2 e un1 cells from the reference Lamole strain, 20 other M. lychnidis-dioicae strains, and one strain from each other species studied here, were tested for amplification with these primers.

Statistical Tests Using Monte Carlo Resampling of the Genomic Background

To test for the significance of the differences in the values of several variables described above (dn/DS, GC content, preferred/unpreferred codons) between the NRRs, MATRRs, and non-MAT chromosomes, a null genomic distribution of the variable values was constructed through randomization. To do this, 1,000 sets of non-MAT chromosome loci were randomly sampled and the mean and median values were computed for the variables of interest. The size of each of these sets was selected to be equal to the number of loci observed in the region of interest (NRR or MATRR). Significance thresholds of 0.01 or 0.05 were used to score the mating-type chromosome data set (MATRR or NRR) as significantly different from the non-MAT chromosome set.


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