Informazione

Problemi con i compiti a casa - Modulo di apprendimento della letteratura: il fattore di trascrizione Ikaros reprime la fosfatasi proteica 2A - Biologia

Problemi con i compiti a casa - Modulo di apprendimento della letteratura: il fattore di trascrizione Ikaros reprime la fosfatasi proteica 2A - Biologia



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Questa pagina contiene domande di valutazione/esame utilizzando dati, figure e grafici da riviste di ricerca come il Journal of Biological Chemistry che ne consentono l'uso, o da riviste come PLOS ad accesso completamente aperto Gli articoli e gli argomenti scelti sono stati selezionati per valutare comprensione da parte degli studenti dei concetti fondamentali e degli obiettivi di apprendimento dell'American Society for Biochemistry and Molecular Biology (ASBMB), nonché dei concetti e degli obiettivi fondamentali di MCAT2015. Sia ASBMB che MCAT2015 enfatizzano fortemente le capacità di indagine scientifica e di ragionamento, che sono forse meglio valutate da domande aperte derivate dalla letteratura in cui gli studenti devono impiegare capacità di applicazione e analisi Bloom di livello superiore.

Queste domande possono essere utilizzate anche dagli studenti che cercano maggiori opportunità per esercitarsi nell'interpretazione dei risultati della letteratura di ricerca. La capacità di applicare, analizzare e valutare informazioni e concetti sono al centro dell'indagine scientifica e delle capacità di ragionamento che sono fondamentali per i nuovi standard di competenza ASBMB e MCAT2015. Le domande in questo modulo di apprendimento sono progettate per valutare queste competenze utilizzando risposte aperte invece di domande a scelta multipla. Le risposte possono essere trovate al link in fondo a questa pagina.

Il fattore di trascrizione Ikaros reprime l'espressione della proteina fosfatasi 2A (PP2A) attraverso un sito di legame intronico

Il fattore di trascrizione Ikaros reprime l'espressione della proteina fosfatasi 2A (PP2A) attraverso un sito di legame intronico. Kamalpreet Nagpal, Katsue Sunahori Watanabe, Betty P. Tsao e George C. Tsokos. Il giornale di chimica biologica, 289, 13751-13757 (2014).

Contesto e recensione

Il lupus eritematoso sistemico (LES) è una malattia autoimmune multifattoriale che colpisce principalmente le donne nei loro anni riproduttivi. Le irregolarità del sistema immunitario, specialmente nelle cellule T, sono uno dei fattori che contribuiscono alla patologia di questa malattia. Nelle cellule T isolate da pazienti con LES, la segnalazione aberrante porta a caratteristiche atipiche, come una maggiore fosforilazione della tirosina.

Uno dei componenti chiave che contribuiscono ai difetti di segnalazione nella patogenesi del LES è la proteina fosfatasi 2A (PP2A) serina/treonina. PP2A è una fosfatasi serina/treonina ubiquitariamente espressa e altamente conservata che svolge un ruolo chiave in numerosi processi cellulari come la divisione cellulare, la motilità, la dinamica del citoscheletro, ecc. PP2A ha una struttura tripartita costituita dalla subunità impalcatura A e dalla subunità catalitica C formando l'enzima centrale e una delle tante subunità regolatorie che si legano all'enzima centrale per formare un oloenzima funzionale. I livelli di proteina PP2A e mRNA, così come l'attività enzimatica della subunità catalitica, sono aumentati nelle cellule T di pazienti con LES rispetto a individui sani.

Un elemento di risposta AMP ciclico (cAMP) (CRE) nel promotore PP2A è ipometilato nelle cellule T SLE. Inoltre, il legame del fattore di trascrizione cAMP response element-binding protein (CREBP) contribuisce ai livelli di espressione di PP2A. Il cAMP aumenta in una cellula in risposta a un segnale esterno che si lega a un recettore accoppiato a proteine ​​G (GPCR) portando all'attivazione dell'adenilato ciclasi, formando il cAMP. Il cAMP quindi si lega e attiva la proteina chinasi A che fosforila altre proteine, inclusa la proteina CREB che si trova principalmente nel citoplasma. CREB fosforilato trasloca nel nucleo portando alla trascrizione genica.

un. Disegna una vignetta che mostri come un aumento del cAMP porti alla trascrizione dei geni attivati ​​da CREB.

B. L'ipometilazione del promotore migliora la trascrizione. Quale sarebbe l'effetto dell'ipermetilazione dei promotori dei geni oncosoppressori sulle cellule tumorali? Quale effetto potrebbe avere l'ipometilazione sui geni coinvolti nelle cellule immunitarie nelle malattie autoimmuni come il LES?

Ulteriori meccanismi influenzano l'espressione di PP2A. Uno studio sull'associazione dell'intero genoma (GWAS) ha identificato un polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) nel primo introne di PPP2CA associato al LES. L'allele di rischio di questo SNP era associato a malattia renale, DNA anti-doppio filamento e anticorpi anti-ribonucleoproteina, entrambi marcatori di LES. Inoltre, l'espressione di PP2A era maggiore nei pazienti portatori di questo allele, suggerendo che questo SNP potrebbe svolgere un ruolo nella regolazione dell'espressione di PP2A. In che modo una mutazione in un introne può influenzare la trascrizione genica?


Domande dall'articolo

1. Sulla base dell'SNP trovato nell'introne 1 di PP2A nei pazienti con LES, i ricercatori hanno ipotizzato che il legame di un fattore di trascrizione all'introne 1 wild type sia coinvolto nella regolazione della trascrizione di PP2A.

un. Indicare due modi diversi in cui un SNP nell'introne potrebbe influenzare la trascrizione di PP2A?

La Figura 1A mostra uno schema della struttura del gene di PP2A (etichettato erroneamente nel documento originale). Le caselle verdi rappresentano gli introni.

La sequenza contenente il sito della variante è rappresentata in rosso e con una freccia.

B. Gli investigatori hanno scoperto un potenziale fattore di trascrizione, Ikaros, attraverso in silicone esperimenti che potrebbero legarsi a Intron 1. Per studiare il legame hanno usato un test di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). In breve, le cellule di controllo e sperimentali sono state trattate con formaldeide per attaccare in modo covalente le proteine ​​leganti il ​​DNA ai loro siti bersaglio sul DNA. Le cellule vengono prima lisate delicatamente per rimuovere le proteine ​​citoplasmatiche. Viene aggiunto l'1% di SDS per lisare completamente le cellule. Questo è seguito dalla sonicazione per tagliare il DNA in piccoli frammenti. Un anticorpo a una proteina bersaglio viene aggiunto alla cromatina tagliata e immunoprecipitato attraverso una perlina attaccata in modo covalente a una proteina (proteina A o G) che si lega al dominio Fc che non è coinvolto nel riconoscimento dell'anticorpo per la proteina bersaglio. Il legame incrociato può essere invertito e il sito di legame del DNA e/o la proteina bersaglio possono essere identificati. Disegna una vignetta che mostri le interazioni rilevanti.

I ricercatori hanno creato un oligo marcato con biotina che rappresenta la regione rilevante dell'introne 1 normale e un oligo di controllo casuale. Hanno aggiunto estratti nucleari di cellule Jurkat. Il complesso è stato abbattuto (immunoprecipitato) con perline contenenti avidina a legame covalente che lega strettamente la biotina. Gli eluati sono stati eseguiti su un gel SDS PAGE seguito da Western blot in cui le proteine ​​separate sono state trasferite su una membrana di nitrocellulosa. Le membrane sono state sondate con un anticorpo anti-Ikaros. I risultati dell'immunoblot (IB) sono mostrati nella Figura 1B. Interpretare i risultati? Se l'ipotesi degli autori fosse corretta, come sarebbe la macchia se avessero usato un oligo contenente l'SNP trovato in SLE?

2. I ricercatori hanno costruito costruttori reporter luciferasi in cui hanno collegato il promotore per PP2A seguito da Intron 1 come clonato appena a monte del gene per la proteina luciferasi, una proteina bioluminescente che può essere utilizzata per rilevare l'espressione proteica. Disegna un fumetto di questo costrutto.

Nella Figura 2B, 2 milioni di cellule 293T sono state trasfettate con il plasmide reporter di cui sopra da solo (250 ng) o in combinazione con diverse quantità del vettore di espressione Ikaros (contenente 50, 100 o 200 ng di vettore con il gene per Ikaros, IKZF1) utilizzando Lipofectamine 2000. Ventiquattro ore dopo la trasfezione, le cellule sono state raccolte e lisate e l'attività luciferasica è stata quantificata utilizzando il sistema di analisi Dual-Luciferase.

Nella Figura 2C, esperimenti simili sono stati condotti in un test di espressione transitoria con il costrutto reporter mutante (mut) in cui è stato eliminato il sito di legame di Ikaros. I risultati rappresentano la media � S.D. di tre osservazioni. I cunei indicano concentrazioni crescenti. È stato utilizzato anche un vettore di controllo che non conteneva il promotore PP2A - inserto Intron 1.

B. Spiegare i risultati mostrati in 2B.

C. Spiegare i risultati mostrati in 2C.

3. Gli investigatori hanno chiesto se Ikaros può regolare l'espressione di PP2A. A tal fine, abbiamo sovraespresso Ikaros in cellule T CD3+ (cellule immunitarie) isolate da individui sani, non in saggi reporter. Dopo 36 ore di coltura, le cellule sono state raccolte e processate per l'immunoblotting. Per la Figura 3A (sotto), le cellule T isolate da individui sani sono state trasfettate con il vettore vuoto o 0,5, 1 o 2 μg del plasmide di espressione Ikaros/1 milione di cellule. Cinque milioni di cellule sono state utilizzate per condizione. 36 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state raccolte per procedere con la PCR in tempo reale (che monitora l'mRNA in tempo reale, pannello di sinistra) o l'analisi delle proteine ​​mediante Western blotting (pannello centrale). Per la PCR in tempo reale, per la normalizzazione è stato utilizzato il gene housekeeping β-actina. Nel caso delle analisi Western blot, la membrana è stata sondata con anti-Ikaros, spogliata delle proteine ​​e nuovamente sondata con anti-PP2A. La -actina è stata utilizzata come controllo del carico. Le densità di banda di IKZF1 e PP2A sono state quantificate utilizzando il software Quantity One e normalizzate alla -actina. Barre aperte, IKZF1; barre nere, PP2A. IB, immunoblot.

Spiega i risultati. Perché gli autori hanno fatto un immunoblot per l'actina?

Nella Figura 3B, le cellule T sono state trasfettate con siRNA criptato o siRNA specifico per IKZF (concentrazione finale di 5 o 10 nm) utilizzando AMAXA. 72 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state raccolte e sottoposte ad analisi PCR in tempo reale o analisi proteica mediante Western blotting. Nel caso delle analisi Western blot, la membrana è stata sondata con anti-Ikaros, rimossa dalle proteine ​​e riprovata con anti-PP2A. Spiega i risultati.

4. Gli autori hanno impiegato un saggio ChIP per confermare il reclutamento di Ikaros in questo particolare sito in un ambiente cellulare. Hanno usato cellule 293T trasfettate con il costrutto reporter promotore-introne PP2A (descritto sopra) in combinazione con il vettore vuoto (pCMV) o un vettore di espressione Ikaros. Gli immunoprecipitati sono stati prodotti utilizzando un anticorpo Ikaros o un IgG di controllo. Il DNA immunoprecipitato è stato purificato e la presenza del DNA intronico specifico è stata quantificata utilizzando l'analisi PCR in tempo reale.

un. Di seguito è mostrato uno schema dei reporter mutanti (Mut) utilizzati in questi esperimenti.

B. Nella Figura 4B di seguito, ChIP reporter nelle cellule 293T. Le cellule 293T sono state trasfettate con solo il tipo selvaggio (pannello sinistro) o il giornalista mutante (pannello di destra) o il reporter in combinazione con il plasmide di espressione Ikaros utilizzando Lipofectamine 2000. Ventiquattro ore dopo la trasfezione, le cellule sono state raccolte ed è stato eseguito un saggio ChIP. La regione che attraversa il sito specifico dell'introne è stata amplificata mediante PCR quantitativa e normalizzata ai valori ottenuti dal DNA di input. Il grafico mostra significa � S.D. cntrl, controllo; ab, anticorpo; Rb, coniglio. .

Interpreta e spiega il risultato.

4C. Per un test più fisiologicamente rilevante, gli autori hanno studiato l'endogeno PPP2CA gene nelle cellule T mediante saggi ChIP nelle cellule T primarie e immunoprecipitazione condotta della proteina Ikaros endogena utilizzando un anticorpo specifico per Ikaros. Per ogni anticorpo/campione sono state utilizzate 5 milioni di cellule T primarie appena isolate. Non c'è stata trasfezione e le proteine ​​endogene sono state utilizzate per l'immunoprecipitazione della cromatina. Il grafico mostra la media + SD Interpreta e spiega il risultato.

5. Ikaros è un fattore di trascrizione a dita di zinco che ospita anche un dominio di dimerizzazione al suo terminale carbossilico attraverso il quale può reclutare molte proteine ​​diverse e regolatori trascrizionali, inclusi complessi modificanti la cromatina come Sin3A, Sin3B e l'istone deacetilasi 1 o HDAC1.

- se l'HDAC si legasse a Ikaros come ipotizzato sopra, quale sarebbe il probabile effetto della deacetilazione degli istoni sulla trascrizione di PP2A?

un. Sono state effettuate trasfezioni transitorie in cellule HEK 293T, seguite da saggi di immunoprecipitazione. Utilizzando oligo biotinilati, mostriamo anche che HDAC1 si lega al particolare sito nel primo introne di PP2A (Figura 5B). Sia nel ChIP reporter che nel ChIP endogeno nelle cellule T primarie, potremmo vedere un aumento del reclutamento di HDAC1 nel sito intronico rispetto alle IgG di controllo (Figura 5C, pannelli sinistro e destro, rispettivamente), confermando così che HDAC1 si lega a questo sito in PP2A introne 1.

La Figura 5A mostra i risultati di un saggio di coimmunoprecipitazione (IP) che mostra il legame di Ikaros con HDAC1. Le cellule 293T sono state trasfettate con le varie combinazioni di plasmidi utilizzando Lipofectamine 2000. Ventiquattro ore dopo la trasfezione, le cellule sono state lisate e i surnatanti sono stati incubati con l'anticorpo Ikaros per 2 ore a 4°C. Dopo la preincubazione con l'anticorpo, a ciascun campione sono state aggiunte perle di agarosio A/G e incubate per una notte a 4 °C. Gli immunoprecipitati sono stati successivamente analizzati su un gel, trasferiti su una membrana PVDF e macchiati per le proteine ​​indicate. Gli input salvati sono stati anche eseguiti sul gel per confermare l'uguale espressione delle proteine ​​in tutti i campioni. IB, immunoblot.

Interpreta i risultati:

B. La Figura 5B mostra i risultati di un oligo introne-specifico coniugato con biotina (sp. oligo) o un test di pulldown oligo a controllo casuale con estratti nucleari di cellule Jurkat. Gli eluati sono stati eseguiti su un gel e sondati con l'anticorpo anti-HDAC1.

Spiega i risultati.

C. Nella Figura 5C sono mostrati i risultati di un reporter ChIP (pannello sinistro) e ChIP (pannello destro) rispettivamente in cellule 293T e T primarie. Le cellule 293T (pannello di sinistra) sono state trasfettate con il reporter in combinazione con i plasmidi di espressione Ikaros e HDAC1 utilizzando Lipofectamine 2000. Ventiquattro ore dopo la trasfezione, le cellule sono state raccolte ed è stato eseguito un test ChIP utilizzando il kit MAGnify ChIP. Per ChIP con proteina endogena nelle cellule T primarie (pannello di destra), sono state utilizzate 5 milioni di cellule T primarie appena isolate per ciascun anticorpo (ab)/campione. Il grafico mostra la media � S.D. cntrl, controllo; Rb, coniglio; Signora, topo. Spiega il risultato.

D. Nella Figura 5D, le cellule T sono state trasfettate con siRNA di controllo o siRNA specifico per HDAC1 da 10 nm con o senza cotrasfezione del plasmide Ikaros. 72 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state raccolte e sottoposte ad analisi PCR in tempo reale. Il gene housekeeping β-actina è stato utilizzato per la normalizzazione. Spiega i risultati.

Figura 5E. E, le cellule T primarie sono state trasfettate con il plasmide Ikaros utilizzando AMAXA. Ventiquattro ore dopo la trasfezione, le cellule sono state trattate con 100 ng/ml di tricostatina A (TSA) per 12 ore. È stato utilizzato lo stesso volume di dimetilsolfossido del controllo veicolare. Le cellule sono state raccolte ed è stata eseguita la PCR in tempo reale. Spiega il risultato.

6. Scrivi un paragrafo che riassuma le principali conclusioni di questo articolo:


Guarda il video: Menyusun Modul Pembelajaran (Agosto 2022).