Informazione

Microiniezione organoidi intestinali


Sto tentando di microiniettare organoidi dell'intestino tenue, utilizzando il microiniettore Eppendorf FemtoJet 4i e i capillari Femtotip, e ho riscontrato diversi problemi. Questa è una nuova configurazione nel nostro laboratorio e sono la prima a provarla, quindi mi scuso per le domande di base.

Quando si tenta di riempire i capillari Femtotip utilizzando un ago o una punta Western blot, il liquido si solleva e non riempie il capillare, lasciando una grande bolla d'aria. È un problema comune con i capillari Femtotip? Esistono altri metodi per il riempimento (che non richiedono un microloader specializzato)?

Quando ho tentato di utilizzare un puntale in cui avevo lasciato che il liquido venisse tirato verso il basso per gravità, ho avuto problemi con le perdite dal fondo del puntale. Giusto per essere assolutamente chiari, è necessario che l'intero puntale sia riempito di liquido prima dell'iniezione (senza bolle d'aria)?

Infine sarei grato per qualsiasi consiglio sulla pressione di iniezione e sul tempo utilizzato per gli organoidi.

Grazie


Ho scoperto che utilizzando i caricatori Femtotip si ottiene un blocco continuo di liquido, che può poi essere spostato all'estremità della punta iniettando più volte. Va bene avere un'aria sopra il liquido sulla punta.


Modelli intestinali umani per studiare le interazioni tra intestino e microbi

Instituto Mexicano del Seguro Social, Unidad de Investigación Médica en Medicina Reproductiva, Unidad Médica de Alta Especialidad en Ginecología y Obstetricia No. 4 ‘Dr. Luis Castelazo Ayala', Av. Río Magdalena n. 289, Col. Tizapán San Ángel, C.P. 01090 Ciudad de México, México

Institut Pasteur, Unité d'Analyse d'Images Biologiques, 25 Rue du Dr Roux, 75015 Parigi, Francia

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Centre National de la Recherche Scientifique, UMR3691, 25 Rue du Dr Roux, 75015 Parigi, Francia

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Centre National de la Recherche Scientifique, ERL9195, 25 Rue du Dr Roux, 75015 Parigi, Francia

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NOMENCLATURA PER LE CULTURE INTESTINALI TRIDIMENSIONALI

Il termine "organoide" è stato utilizzato per la prima volta nel 1987 per descrivere colture in vitro derivate da neuroblastomi (46) e polmone (134). Le colture intestinali a breve termine sono state descritte per la prima volta da Evans et al. (25), che ha definito un organoide intestinale come una struttura di cripte e villi che crescono in vitro. Sato e Clevers hanno descritto le colture tridimensionali di cellule staminali intestinali (ISC) nel 2009 come "organoidi" e hanno continuato a riferirsi a colture puramente epiteliali come organoidi (95a). Nello stesso anno, Ootani e Kuo riportarono colture tridimensionali di frammenti intestinali, che riferirono anche ad organoidi (65). Nel 2012, l'Intestinal Stem Cell Consortium ha pubblicato linee guida sulla nomenclatura per distinguere tra i tipi di colture intestinali (109). Gli autori di questo lavoro suggeriscono il termine "organoide" per culture che contengono più tipi di cellule, tra cui epiteliale e mesenchima, mentre le colture di popolazioni epiteliali pure sono designate come "enteroidi" o "colonoidi", se derivate dall'intestino tenue o dal colon, rispettivamente. Il termine "sferoide" è stato utilizzato anche per indicare culture tridimensionali epiteliali (76). In questa recensione, tutte le strutture organiche tridimensionali sono indicate come "organoidi" e qualificate per posizione del tessuto, specie e tipo di tessuto (ad esempio, "organoide del tumore del colon").


Approcci per promuovere la maturazione degli organoidi

Gli organoidi mostrano una crescita limitata in vitro in quanto devono fare affidamento sulla diffusione di ossigeno e nutrienti esogeni per sopravvivere. Inoltre, molti modelli di organoidi derivati ​​da hPSC assomigliano più da vicino a un tessuto immaturo e non riescono a maturare indipendentemente dalla durata della coltura. Tuttavia, il trapianto di organoidi in vari siti negli ospiti dei mammiferi ha portato alla maturazione degli organoidi e all'aumento della funzionalità dei tessuti (Fig. 2). Gli organoidi sono stati trapiantati sia ortotopicamente (cioè nell'analogo) in vivo posizione) ed ectopicamente (cioè in una regione al di fuori del nativo in vivo ambiente) ed entrambi i metodi di trapianto sono permissivi per la maturazione degli organoidi (Dye et al., 2016 Finkbeiner et al., 2015b Sugimoto et al., 2018 Takebe et al., 2013 van den Berg et al., 2018). Questi studi hanno dimostrato che i modelli di organoidi sono in grado di maturare quando vengono forniti ulteriori spunti dal in vivo ambiente, aumentando così il loro interesse per lo studio dell'organogenesi umana e per l'uso come modelli preclinici o nella medicina rigenerativa. Qui discutiamo i metodi per migliorare la complessità e la maturazione degli organoidi attraverso il trapianto in vivo.

Trapianto ortotopico ed ectopico di organoidi umani. Sia l'hPSC che il tessuto primario sono stati trapiantati in topi immunocompromessi. I colori rappresentano diversi tipi di organoidi, sia primari che/o derivati ​​da hPSC, che sono stati trapiantati nelle sedi indicate. Il trapianto ortotopico si riferisce al trapianto nell'analogo in vivo posizione, mentre il trapianto ectopico si riferisce al trapianto in una regione al di fuori del nativo in vivo ambiente (cioè sotto le capsule renali, all'interno dei cuscinetti adiposi).

Trapianto ortotopico ed ectopico di organoidi umani. Sia l'hPSC che il tessuto primario sono stati trapiantati in topi immunocompromessi. I colori rappresentano diversi tipi di organoidi, sia primari che/o derivati ​​da hPSC, che sono stati trapiantati nelle sedi indicate. Il trapianto ortotopico si riferisce al trapianto nell'analogo in vivo posizione, mentre il trapianto ectopico si riferisce al trapianto in una regione al di fuori del nativo in vivo ambiente (cioè sotto le capsule renali, all'interno dei cuscinetti adiposi).

Trapianto ectopico di organoidi

Molti esperimenti hanno trapiantato organoidi in topi immunocompromessi per la maturazione. Tipicamente, gli organoidi sono stati trapiantati in siti altamente vascolarizzati che sono suscettibili di attecchimento e crescita di organoidi fino a diversi mesi, senza ostacolare la necessaria funzione dell'organo murino. Tali siti includono cuscinetti adiposi dell'epididimo (Dye et al., 2016) e sotto le capsule renali (Finkbeiner et al., 2015a,b Múnera et al., 2017 Trisno et al., 2018 Tsai et al., 2017 Watson et al., 2014 Workman et al., 2016). In effetti, la complessità delle co-culture descritte in precedenza può essere ulteriormente rafforzata dal trapianto (Schlieve et al., 2017 Takebe et al., 2013 Workman et al., 2016).

Gli HIO sono un esempio di un modello organoide che ha mostrato una maturazione significativa dopo il trapianto di capsule renali per diverse settimane (Finkbeiner et al., 2015b Watson et al., 2014). Sia l'epitelio che il mesenchima degli HIO trapiantati (tHIO) hanno mostrato un'organizzazione migliorata, con l'emergere di un'architettura della cripta dei villi correttamente modellata all'interno dell'epitelio che non era evidente prima del trapianto. Inoltre, i lignaggi mesenchimali che esprimono l'actina muscolare liscia (SMA) e il recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine alfa (PDGFRA) si sono organizzati in un modo che era indistinguibile dall'intestino umano nativo (Finkbeiner et al., 2015b). La vascolarizzazione da parte dei vasi sanguigni del topo ha sostenuto una crescita significativa di HIO trapiantati fino a 100 volte di dimensione (Watson et al., 2014). Recentemente, gli HIO sono stati trapiantati con successo nel mesentere intestinale e hanno dimostrato caratteristiche di crescita e maturazione simili a quelli trapiantati sotto la capsula renale (Cortez et al., 2018 Finkbeiner et al., 2015a). Il mesentere intestinale è quindi un sito di trapianto complementare che può essere più fisiologicamente rilevante per futuri studi traslazionali a causa della sua stretta vicinanza all'intestino nativo.

Gli organoidi polmonari derivati ​​da hPSC (HLO) sono un altro in vitro modello che ha mostrato una migliore architettura e maturazione dei tessuti dopo il trapianto. È interessante notare che, a differenza di molti altri modelli di organoidi, gli HLO non sono sopravvissuti al trapianto sotto la capsula renale (Dye et al., 2016). Piuttosto, uno scaffold microporoso di polilattide-co-glicolide (PLG), che è comunemente usato per trapiantare le cellule beta pancreatiche (Gibly et al., 2011 Hlavaty et al., 2014), è stato utilizzato per supportare il trapianto di HLO. Lo scaffold PLG fungeva da nicchia fisica per supportare la sopravvivenza e la maturazione degli HLO trapiantati, che mostravano una migliore organizzazione epiteliale, morfologia e differenziazione in linee aeree prossimali (cioè trachea/bronchi) che assomigliavano più alle vie aeree prossimali umane mature rispetto agli HLO cresciuti in vitro. Questo risultato ha suggerito che in vivo sono necessari segnali, insieme allo scaffold, per supportare la maturazione dell'HLO. Sebbene i lignaggi alveolari fossero presenti nel in vitro gli HLO del camice, i tipi di cellule alveolari e le strutture non erano supportati negli HLO trapiantati (Dye et al., 2015, 2016). In particolare, gli HLO devono essere trapiantati all'interno del cuscinetto adiposo dell'epididimo, perché il compartimento della capsula renale non era abbastanza grande da ospitare l'impalcatura. Nonostante la differenza nella posizione del trapianto, simile agli organoidi intestinali, gli HLO sono stati ampiamente vascolarizzati dai vasi ospiti e sia i componenti epiteliali che mesenchimali sono maturati dopo in vivo crescita (Dye et al., 2016 Finkbeiner et al., 2015b Watson et al., 2014). Questo studio ha dimostrato la necessità di una nicchia fisica per supportare la sopravvivenza, la differenziazione e la maturazione degli HLO trapiantati.

Questi studi hanno dimostrato che la vascolarizzazione è fondamentale per l'attecchimento, la crescita e la sopravvivenza dei tessuti organoidi trapiantati, ma la vascolarizzazione può essere lenta e/o inefficiente per i sistemi organoidi che non possiedono vascolarizzazione prima del trapianto. Organoidi di gemme epatiche con cellule endoteliali preesistenti (HUVEC) si sono innestate e hanno stabilito il flusso sanguigno in pochi giorni (Takebe et al., 2013). Inoltre, il trapianto in una finestra cranica ha consentito l'imaging in tempo reale degli organoidi e ha dimostrato che gli HUVEC formano una connessione vascolare stabile con l'ospite.

I dati suggeriscono che la maggior parte dei modelli di organoidi non contiene intrinsecamente il sistema vascolare, tuttavia, le cellule vascolari endogene sono presenti all'interno degli organoidi renali derivati ​​da hPSC. Ciò è probabilmente il risultato dell'approccio di differenziazione diretto, che spinge le hPSC in un destino mesoderma intermedio, generando lignaggi nefrogenici e cellule endoteliali (Freedman et al., 2015 Takasato et al., 2015, 2016). Dopo il trapianto sotto la capsula renale, gli organoidi renali sono stati ampiamente vascolarizzati dalle cellule endoteliali sia dell'ospite che degli organoidi che sono persistiti per almeno 2 settimane dal trapianto (van den Berg et al., 2018). Inoltre, l'uso di una finestra di imaging addominale ha consentito l'imaging in tempo reale degli organoidi durante il trapianto. L'infusione di destrano fluorescente nel sangue ha permesso la visualizzazione del flusso sanguigno e ha contribuito a dimostrare che le strutture glomerulari all'interno dell'organoide renale, che funzionano per filtrare l'urina dal sangue, sono diventate vascolarizzate. Ciò ha portato a una migliore maturazione glomerulare, inclusa la deposizione della membrana basale glomerulare e un endotelio fenestrato all'interno degli organoidi trapiantati.

Trapianto ortotopico di organoidi

Sebbene il trapianto ectopico sia uno strumento prezioso per consentire la maturazione degli organoidi, c'è interesse nel trapianto ortotopico di organoidi o tipi cellulari derivati ​​da organoidi per far progredire la nostra comprensione di in vivo nicchie nella regolazione della maturazione degli organoidi, oltre ad aumentare il potenziale traslazionale dei modelli di organoidi per le terapie di sostituzione d'organo. I modelli di lesione sono stati utilizzati in vari sistemi di organi per creare nicchie permissive per l'attecchimento di organoidi sia primari che derivati ​​da hPSC in siti fisiologicamente rilevanti in modelli di topi adulti (Huch et al., 2015 Miller et al., 2018 Sampaziotis et al., 2017 Sugimoto et al., 2018). Ad esempio, recenti sforzi hanno trapiantato con successo ortotopicamente organoidi epiteliali del colon derivati ​​​​da tessuti umani primari nel colon murino dopo la distruzione dell'epitelio endogeno (Sugimoto et al., 2018). Qui, è stato dimostrato che era necessaria un'area significativa di lesione per creare una nicchia abbastanza grande da promuovere l'attecchimento e la persistenza del tessuto umano per diversi mesi. Anche lesioni più piccole hanno consentito l'attecchimento, ma alla fine il tessuto umano trapiantato è andato perso nel tempo. Il tracciamento del lignaggio delle cellule staminali intestinali utilizzando un genoma LGR5-CreER specifico per le cellule staminali intestinali e un reporter del lignaggio negli organoidi del colon umano ha rivelato importanti differenze specie-specifiche nel tempo di ciclo tra cellule staminali del colon umano e di topo (Sugimoto et al., 2018 ). Questa visione della nicchia delle cellule staminali intestinali non sarebbe stata possibile con il trapianto ectopico.

Approcci simili all'attecchimento della lesione sono stati utilizzati per introdurre organoidi progenitori epiteliali della punta di gemme polmonari umane derivate da hPSC in un polmone di topo adulto ferito (Miller et al., 2018 Miller et al., 2019). I progenitori della punta del germoglio polmonare umano possono attecchire nella trachea e nelle vie aeree prossimali del polmone del topo a seguito di lesioni bronchiolari indotte chimicamente. Inoltre, queste cellule hanno dimostrato il potenziale di differenziazione multilineare in diversi fenotipi di linea prossimale tra cui cellule produttrici di muco, cellule ciliate e cellule neuroendocrine dopo 6 settimane dopo la lesione. In particolare, questi progenitori hanno mostrato in vitro capacità di differenziazione alveolare, ma tali lignaggi non sono stati osservati, probabilmente perché le cellule non si sono attecchite in aree alveolari in cui non vi era alcuna lesione in questo particolare modello di lesione. Questo risultato evidenzia l'importanza della in vivo microambiente nel mediare la differenziazione dei progenitori organoidi (Miller et al., 2018). Infine, organoidi primari derivati ​​da tessuto colangiocitario extraepatico seminati su scaffold sono stati in grado di attecchire nell'epitelio della cistifellea e dei dotti biliari comuni per salvare funzionalmente modelli murini di danno biliare extraepatico (Sampaziotis et al., 2017).

Anche gli organoidi cerebrali derivati ​​da hPSC umani sono stati trapiantati con successo nel cervello di topi adulti con un robusto attecchimento di organoidi e tassi di sopravvivenza dell'ospite, nonostante l'invasività della procedura (Mansour et al., 2018). In confronto con la corrispondenza per età in vitro-organoidi cerebrali cresciuti, organoidi cerebrali trapiantati contenevano una proporzione maggiore di destini di cellule neuronali mature che includevano astrociti e oligodendrociti, rispetto ai precursori neuronali relativamente immaturi osservati in vitro. Inoltre, è stato dimostrato che le proiezioni degli assoni invadono varie regioni del cervello ospite e l'analisi dei marcatori ha suggerito che questi assoni derivati ​​da organoidi umani stavano formando connessioni sinaptiche con i neuroni murini. Gli studi iniziali hanno dimostrato che gli organoidi cerebrali trapiantati hanno risposto alla stimolazione esterna del calcio in uno schema sincronizzato più simile a un cervello in via di sviluppo, piuttosto che maturo. Pertanto, sebbene questo sia stato un progresso impressionante negli organoidi cerebrali, gli attuali approcci di trapianto comportano solo una maturazione parziale (Mansour et al., 2018). Gli sforzi hanno anche derivato organoidi cerebrali con cellule endoteliali da hPSC che potrebbero essere co-coltivate in vitro per un massimo di 5 settimane e trapiantato in un ospite murino per almeno 2 settimane, dimostrando la prova del principio per la generazione di vascolarizzazione umana negli organoidi cerebrali trapiantati (Pham et al., 2018).

Nel complesso, la creazione di approcci di trapianto ortotopico consente lo studio della maturazione degli organoidi all'interno del microambiente tissutale nativo e allo stesso tempo avvicina i ricercatori alle applicazioni traslazionali per le tecnologie degli organoidi. In entrambi gli approcci ectopici e ortotopici, è stato difficile identificare i fattori esatti nella in vivo ambiente ospite responsabili della maturazione degli organoidi. Andando avanti sarà importante iniziare ad affrontarli in vivo interazioni al fine di applicare principi di maturazione per creare organoidi maturi nel piatto. Per rispondere a queste domande, esperimenti futuri potrebbero generare organoidi da una libreria knockout CRISPR o esaminare una libreria di piccole molecole per valutare in modo indipendente i fattori di maturazione.

Approcci di ingegneria-trapianto per aumentare la maturità degli organoidi

Gli organoidi intestinali sono una promettente fonte di tessuto sostitutivo per condizioni come la sindrome dell'intestino corto, ma l'implementazione clinica richiederà un aumento delle dimensioni e della maturità per produrre tessuto intestinale funzionale. Un approccio per affrontare questo problema ha impiegato HIO che sono stati seminati su scaffold per produrre intestino tenue mediante ingegneria tissutale (TESI) (Finkbeiner et al., 2015a). Gli HIO sono stati seminati su matrici intestinali suine acellulari e su scaffold sintetici comprendenti acido poliglicolico/poli L lattico (PGA/PLLA). Utilizzando questo approccio, gli HIO hanno riseminato con successo le matrici acellulari in vitro ma non persisteva o conservava l'identità intestinale quando trapiantato in topi immunocompromessi. Le scarse prestazioni delle matrici acellulari potrebbero essere dovute alla rimozione di segnali istruttivi durante la decellularizzazione o al blocco dell'infiltrazione vascolare agli HIO da parte della matrice. Tuttavia, gli HIO che sono stati seminati sulle matrici sintetiche hanno prosperato in vivo e mostrava la maturazione epiteliale, con conseguente tessuto che assomigliava all'intestino adulto. Questi scaffold a forma tubolare sono un approccio promettente per seminare più HIO e generare tessuto intestinale più lungo e maturo in vitro. Sebbene il TESI qui descritto mancasse di tipi di cellule intestinali chiave come un sistema nervoso enterico, questo può essere superato come descritto sopra (Schlieve et al., 2017 Workman et al., 2016).

Un approccio più recente per generare tessuto intestinale maturo scalabile da HIO ha incorporato sollecitazioni meccaniche utilizzando molle di allungamento (Poling et al., 2018). È stato dimostrato che il ceppo meccanico gioca un ruolo nello sviluppo intestinale (Kurpios et al., 2008 Savin et al., 2011 Shyer et al., 2015, 2013) e dispositivi di allungamento a molla o a base di stiramento sono stati progettati come metodi di trattamento per sindrome dell'intestino corto (Demehri et al., 2015, 2014 Ralls et al., 2012 Rouch et al., 2016 Stark et al., 2012 Sueyoshi et al., 2013). In questo approccio, gli HIO sono stati trapiantati in topi immunocompromessi per 10 settimane. Dopo questo tempo, le molle in nitinol compresse sono state inserite chirurgicamente negli HIO trapiantati per altri 14 giorni. Gli HIO trapiantati che erano stati sottoposti a ceppo mostravano una maggiore lunghezza intestinale, villi più grandi e cripte più profonde e sembravano essere più maturi in base alle firme genetiche globali, rispetto agli HIO trapiantati senza molle. Questi studi evidenziano approcci di bioingegneria per promuovere applicazioni cliniche di HIO e dimostrano l'importanza di segnali sia biologici che meccanici nel promuovere la maturazione degli organoidi.


Organoidi intestinali per microiniezione - Biologia

Questo codice è associato al documento di Hill et al., "La colonizzazione batterica stimola una risposta fisiologica complessa nell'epitelio intestinale umano immaturo". eLife, 2017. http://dx.doi.org/10.7554/eLife.29132

Misurazione in tempo reale della permeabilità della barriera epiteliale negli organoidi intestinali umani

David R. Hill 1#, Sha Huang 1, Yu-Hwai Tsai 1, Jason R. Spence 1,2 e Vincent B. Young 1,3,4,

1 Dipartimento di Medicina Interna, Divisione di Gastroenterologia, Università del Michigan, Ann Arbor MI 48109 2 Dipartimento di Biologia Cellulare e dello Sviluppo, Università del Michigan, Ann Arbor MI 48109 3 Dipartimento di Medicina Interna, Divisione di Malattie Infettive, Università del Michigan, Ann Arbor MI 48109 4 Dipartimento di Microbiologia e Immunologia, Università del Michigan, Ann Arbor MI 48109

# autore per la corrispondenza: David R. Hill ([email protected])

Questo protocollo descrive la misurazione della permeabilità della barriera epiteliale in tempo reale dopo il trattamento farmacologico in organoidi intestinali umani mediante microscopia a fluorescenza e microscopia a cellule vive

I progressi nella coltura 3D dei tessuti intestinali ottenuti tramite biopsia o generati da cellule staminali pluripotenti tramite differenziazione diretta hanno portato a sofisticate in vitro modelli della mucosa intestinale. Sfruttare questi sistemi modello emergenti richiederà l'adattamento degli strumenti e delle tecniche sviluppate per i sistemi di coltura 2D e gli animali. Qui, descriviamo una tecnica per misurare la permeabilità della barriera epiteliale negli organoidi intestinali umani in tempo reale. Ciò si ottiene mediante microiniezione di destrano marcato con fluorescenza e imaging su un microscopio invertito dotato di filtri epifluorescenti. La misurazione in tempo reale della permeabilità della barriera negli organoidi intestinali facilita la generazione di dati temporali ad alta risoluzione nel tessuto epiteliale intestinale umano, sebbene questa tecnica possa essere applicata anche ad approcci di imaging a tempo fisso. Questo protocollo è facilmente adattabile per la misurazione della permeabilità della barriera epiteliale in seguito all'esposizione ad agenti farmacologici, prodotti batterici o tossine o microrganismi vivi. Con piccole modifiche, questo protocollo può anche fungere da primer generale sulla microiniezione di organoidi intestinali e gli utenti possono scegliere di integrare questo protocollo con applicazioni a valle aggiuntive o alternative dopo la microiniezione.

UN Organoidi intestinali umani derivati ​​da cellule staminali (HIO) microiniettati con 2 mg/ml di destrano FITC (4 kDa) sottoposti a imaging per 20 ore. Gli HIO sono stati anche microiniettati con PBS (controllo) o il Clostridium difficile tossina TcdA (12,8 ng/μl) o trattata con 2 mM EGTA aggiunto al terreno di coltura esterno. Ingrandimento 4X. B Grafico dell'intensità FITC media normalizzata nel tempo in HIO trattati con PBS (controllo), TcdA o EGTA. Le barre di errore rappresentano S.E.M e N = 4-6 HIO per gruppo.

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Quindi vai al tuo clone locale di questo repository e digita quanto segue nel prompt dei comandi:

Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Misurazione in tempo reale della permeabilità della barriera epiteliale negli organoidi intestinali umani. J. Vis. Scadenza (), e56960, doi:10.3791/56960 (2017).


Screening degli organoidi delle cripte intestinali: una lettura semplice per una biologia complessa

La mucosite orale e intestinale è un effetto collaterale debilitante del trattamento con radiazioni. Un modello murino di mucosite indotta da radiazioni porta a perdita di peso e danni ai tessuti, riflettendo la malattia umana mentre risponde al fattore di crescita dei cheratinociti (KGF), il trattamento standard di cura. Gli organoidi della cripta intestinale coltivati ​​hanno consentito lo sviluppo di un'analisi che monitora l'effetto dei trattamenti dell'epitelio intestinale sui danni indotti dalle radiazioni. Questo test in vitro assomiglia al modello murino come KGF e spondina-1 specifica per la piastra del tetto (RSPO1) ha migliorato il recupero degli organoidi della cripta in seguito alle radiazioni. Lo screening ha identificato composti che hanno aumentato la sopravvivenza della post-radiazione degli organoidi. I test di questi composti hanno rivelato che gli organoidi hanno cambiato le loro risposte nel tempo. L'analisi imparziale del trascrittoma è stata eseguita su colture di organoidi di cripta in vari momenti della cultura per indagare su questo comportamento adattivo. È stato scoperto che un certo numero di geni e percorsi sono modulati nel tempo, fornendo un razionale per l'alterata sensibilità delle colture di organoidi. Questo rapporto descrive un test in vitro che riflette gli aspetti della malattia umana. Il saggio è stato utilizzato per identificare i composti bioattivi, che sono serviti come sonde per interrogare la biologia degli organoidi delle cripte durante una coltura prolungata. I percorsi che cambiano nel tempo possono offrire potenziali bersagli per il trattamento della mucosite.

Parole chiave: KGF RSPO mucosite colture cellulari 3D primarie organoidi della cripta dell'intestino tenue.


La standardizzazione rimane la sfida principale per In vitro Modelli di infiammazione

Come delineato, sono emersi enormi progressi nel campo delle cellule staminali e degli organoidi e il loro potenziale nella ricerca traslazionale e persino nell'assistenza sanitaria è ovvio, tuttavia, le attuali limitazioni degli organoidi rimangono un avvertimento importante (Figura 2B).

Una limitazione generale della derivazione organoide è l'elevata variabilità dei fenotipi che possono produrre. I sistemi di coltura di cellule staminali e organoidi e il loro risultato molecolare dipendono in modo critico dalla qualità e dalle proprietà del tessuto campionato. Le variazioni nella fase di pre-elaborazione interferiscono pesantemente con le firme immunitarie di questi campioni. Inoltre, il tessuto infiammato ha maggiori probabilità di subire la morte cellulare, potrebbe avere esigenze nutrizionali e colturali diverse e quindi il tasso di recupero degli organoidi vitali dal tessuto infiammato è significativamente inferiore (60). Mentre le firme infiammatorie ex vivo sono simili ai loro in vivo origine (9), malattie particolarmente complesse come l'IBD sono caratterizzate da una diversità di sapori infiammatori. Inoltre, le biopsie riflettono la biologia della regione campionata e pertanto le cellule staminali/organoidi dovrebbero essere raccolte da regioni diverse. Quando si utilizzano iPSC, esistono variazioni negli organoidi a seconda del background genetico dell'individuo e del protocollo di coltura utilizzato dal laboratorio. Linee isogene generate attraverso gli approcci di modifica genetica possono limitare questa variabilità per quanto riguarda le differenze genetiche.

Poiché gli organoidi delle iPSC si formano attraverso la differenziazione di una popolazione omogenea, i tipi di cellule tessuto-specifici e il loro microambiente devono essere nuovamente creati. Ciò sfida l'uso delle iPSC e, nonostante le significative somiglianze nella struttura e nella funzione tra organoide e tessuto adulto, gli organoidi spesso mantengono caratteristiche immature, rendendoli più simili al tessuto fetale. In un esempio di organoide intestinale derivato da iPSC, questa limitazione potrebbe essere risolta co-coltivandolo con cellule T che forniscono una nicchia di crescita più realistica (61), progettando scaffold 3D più sofisticati per migliorare l'architettura degli organoidi e quindi aumentare la somiglianza con il tessuto originale in vivo (62, 63), o in vivo trapianto, che ha portato a un epitelio intestinale maturo con nicchie di cellule staminali intestinali conservate, architettura di cripte/villi e un mesenchima umano laminato, entrambi supportati da crescita vascolare interna di topo (64). A parte le caratteristiche immature, gli organoidi mostrano spesso una durata di vita limitata una volta raggiunta una certa dimensione. A causa della mancanza di diffusione, le cellule non ricevono nutrienti sufficienti per sostenere lo sviluppo continuo. L'uso di bioreattori potrebbe migliorare l'apporto di nutrienti. Idealmente, gli organoidi sono progettati per indurre lo sviluppo dell'endotelio con conseguente vascolarizzazione come mostrato di recente (41). Un'altra strategia sarebbe quella di integrare le cellule endoteliali, oi loro progenitori, durante lo sviluppo degli organoidi, e di includere metodi di bioprinting per progettare scaffold 3D per le cellule endoteliali (65, 66). Tuttavia, il tessuto materiale originale degli organoidi derivati ​​da iPSC di solito non è infiammato, ad es. fibroblasti cutanei, e sono stati riprogrammati e coltivati ​​per molte settimane o mesi in assenza di un ambiente infiammatorio. Per lo studio dell'infiammazione complessa e multifattoriale, i sistemi derivati ​​da iPSC non sono quindi la prima scelta in termini di modello. Viceversa, gli organoidi derivati ​​da iPSC potrebbero essere strumenti eccellenti per studiare disordini infiammatori principalmente geneticamente guidati, come l'IBD monogenico.

Un'altra sfida importante è l'entità dello sforzo, del tempo e delle spese spese per le colture di organoidi. Sebbene siano disponibili protocolli piuttosto semplici per colture di organoidi convenzionali a costi gestibili, i protocolli di differenziazione includono fattori costosi o terreni di coltura o richiedono terreni condizionati, che devono essere prodotti da linee cellulari di alimentazione. I sistemi di co-coltura spesso includono modelli 2D, che richiedono sforzi e tempi di coltura molto più elevati. In aggiunta a questa sfida, la generazione di iPSC e la loro differenziazione in tessuti specifici spesso richiedono diverse settimane di intenso sforzo di coltura, il che aumenta il rischio di eventi avversi, ad es. contaminazione o differenziazione indesiderata.

Per combattere i suddetti problemi, una stretta collaborazione tra ricerca accademica e partner industriali ad alta tecnologia può essere una strategia promettente per superare le sfide infrastrutturali. Mentre il mondo accademico può fornire idee derivate da problemi e una visione basata su ipotesi di nuovi modelli di malattia, l'industria può fornire la tecnologia necessaria, le capacità per la produzione su larga scala e la standardizzazione. La creazione di queste infrastrutture collaborative è necessaria e può favorire futuri progressi della tecnologia delle cellule staminali.


Organoidi intestinali per modellare lo sviluppo intestinale e la malattia

Le malattie gastrointestinali stanno diventando sempre più diffuse nei paesi sviluppati. Le cellule immortalate e i modelli animali hanno fornito informazioni importanti ma limitate sui meccanismi che avviano e propagano queste malattie. Sono disperatamente necessari modelli umani di sviluppo intestinale e malattia che possano ricapitolare la struttura e la funzione dell'intestino in vitro. I progressi nelle cellule staminali pluripotenti e nelle tecniche di coltura dei tessuti primari hanno permesso di coltivare cellule epiteliali intestinali in tre dimensioni che si autoassemblano per formare "organoidi intestinali". Questi organoidi consentono nuovi modelli specifici per l'uomo che possono essere utilizzati per ottenere informazioni sulle malattie gastrointestinali e potenzialmente fornire nuove terapie per curarle. Qui esaminiamo l'attuale in vitro modelli di sviluppo e malattie intestinali, considerando dove potrebbero essere apportati miglioramenti e potenziali applicazioni future nei campi della modellazione dello sviluppo, test di farmaci/tossicità e usi terapeutici.

Questo articolo fa parte del numero tematico "Designer human tissue: coming to a lab near you".

1. Struttura e funzione intestinale

L'intestino è un organo vitale derivato dall'endoderma definitivo e può essere suddiviso in intestino tenue e crasso [1]. Collectively, the small and large intestines perform the vital function of digestion, nutrient absorption and waste elimination [2]. The small intestine contains several functionally distinct areas including the duodenum, jejunum and ilium, and its surface comprises a highly folded epithelium of villi, microvilli and intestinal crypts [3]. This intricate folding of villi and microvilli serves to dramatically increase the total surface area of the small intestine, thereby facilitating greater nutrient absorption. The intestinal crypt functions as the niche in which the LGR5 + stem cells reside [4]. LGR5 + cells are relatively slow cycling cells and give rise to a highly proliferative and multipotent progenitor population known as the transit-amplifying (TA) cells, which differentiate as they migrate from the crypt towards the villi. By the time TA cells have moved out of the crypt, they are fully differentiated into one of the many cell types required for normal functionality of the epithelium [5].

The large intestine comprises four main regions: the ascending, transverse, descending and sigmoid colon [6]. While most digestion occurs in the small intestine, the large intestine functions to absorb water and ions, in addition to vitamins and short chain fatty acids (SCFA) synthesized by commensal bacteria. Production of SCFA by commensal bacteria in the large intestine is recognized as an important feature of maintaining normal gut health and has been shown to have several protective effects including creating an environment hostile to pathogenic microbes, providing an energy source for intestinal epithelial cells and enhancing mucus production [7].

2. Cells of the small and large intestine

The intestinal epithelium comprises several different cell types including enterocytes, goblet cells, Paneth cells and enteroendocrine cells, all of which are derived from the resident LGR5 + stem cells found at the base of intestinal crypts [8] (figure 1). Epithelial cells are critical in maintaining immune homeostasis within intestinal tissue, closely regulating the interplay between the intestinal mesenchyme, and commensal and pathogenic bacteria. They maintain a barrier formed with tight junctions, essential to the control of macromolecular transport and immune homeostasis. Enterocytes are the most common cell type found in the epithelium, and they mainly function in nutrient absorption. Secretory epithelial cells consist of Paneth and goblet cells and multiple enteroendocrine cell types, with functions ranging from cytokine to hormone production [9].

Figure 1. Anatomy of the small and large intestine. The small intestine is composed of repetitive villus and crypt structures. LGR5 + stem cells and Paneth cells are located at the base of the crypts, followed by the TA cells, and then mature epithelium composed of goblet cells, enteroendocrine cells and enterocytes (un). The large intestine lacks the villi structures of the small intestine and instead is composed of colonic crypts. At the base of colonic crypts are LGR5 + stem cells and Reg4 + cells, followed by TA cells and mature epithelium that contains a high proportion of goblet cells (B).

Goblet cells play a critical role in the functioning and protection of the intestinal tract. There are nearly twice as many goblet cells in the colon as in the small intestine, which is in proportion to the increase in bacteria [10]. Goblet cells function by producing glycoproteins known as mucins, which are vital constituents of the mucus that lines the epithelium. This mucosal layer acts as the first line of defence, preventing the bacteria present in the gut from being in direct contact with the intestinal epithelium [11]. Mucus production is increased in response to inflammatory cytokines including interferon-γ and interleukins-9, -10 and -13 [12]. The glycoproteins that comprise this mucus are toxic to many strains of bacteria. Additionally, this layer acts as a matrix to which defensins and antibodies adhere that target specific pathogenic bacteria adhere. When mucus production is hindered, this can cause commensal bacteria in the gut microbiota to penetrate the epithelial barrier, triggering an immune response [13]. Goblet cells also produce other constituents of the mucus layer, including trefoil factors that stabilize the mucus layer by forming cross-links between different components of the mucus [14]. This cross-linking creates a unique property in that the innermost layer is thicker and more viscous while the outer layer is more aqueous, allowing commensal bacteria to reside there.

The small and large intestine is a high turnover organ, with complete epithelial renewal approximately every 7 days. This process is driven by LGR5 + intestinal stem cells (figure 1un,B). The pioneering work of Hans Clevers demonstrated that LGR5 + stem cells reside at the base of the intestinal crypts that form the intestinal stem-cell niche [8,15]. LGR5 + cells are crucial for the continual renewal of the intestinal epithelium and undergo asymmetric division approximately every 24 h, giving rise to a daughter stem cell and a TA cell. These rapidly proliferating TA cells begin in the TA zone and migrate up the intestinal crypt, while dividing four to five times along the way, before terminally differentiating into any of the intestinal cell types [16]. Once differentiated, these cells continue to migrate upwards towards the top of the crypts and have a lifespan of approximately 7 days. Once these cells have reached the top of the villi, they typically undergo anoikis and are shed into the intestinal lumen.

Paneth are also generated from the asymmetrical division of the LGR5 + stem cell [16]. However, instead of migrating upwards, Paneth cells migrate downwards into the base of the crypt. Paneth cells are a longer-lived cell type, surviving for approximately 30 days at the base of intestinal crypts where they play an integral role in producing and maintaining the stem-cell niche [17,18]. In addition to maintaining the niche, Paneth cells secrete a substantial amount of antimicrobrial peptides such as defensins that help regulate intestinal microbiota and protect against invading pathogens.

Paneth cells are absent in the majority of colonic crypts. However, secretory cells expressing typical Paneth cell markers, including CD24 are present. Reg4 has been found to be a reliable marker of these cells, residing adjacent to LGR5 + stem cells in all colonic crypts [19]. These cells have been shown to secrete epidermal growth factor (EGF) and the Notch ligands DII1 and DII4, while LGR5 + stem cells were found to express the corresponding receptors [19]. These secretory Reg4 + cells were found to more closely resemble Paneth cells, rather than goblet cells found in either the small or large intestine. Reg4 + cells are integral to controlling stem-cell positioning in the crypt and for maintaining stemness of LGR5 + colonic stem cells. These cells have many distinct similarities with Paneth cells of the small intestine, with the exception that Reg4 + cells do not produce Wnt ligands, while colonic LGR5 + stem cells do express Wnt receptors [19]. Therefore, mesenchymal tissue surrounding the colonic crypts, known to produce Wnt ligands, may provide the necessary Wnt required for stem-cell maintenance in the intestinal crypt in vivo [20].

3. Cell signalling in the intestinal epithelium

Self-renewal and differentiation of LGR5 + stem cells are achieved via tight regulation of several signalling pathways within the intestinal crypts. Wnt signalling is considered the central signalling pathway maintaining LGR5 + stem-cell proliferation, controlling cell positioning within the crypt and activating terminal differentiation of Paneth cells. Dysregulation of this pathway has been shown to be important in the development of some colon cancers [21].

Higher concentrations of Wnt3a and EGF are present at the base of the crypts and are required for stem-cell maintenance and proliferation, respectively [22] (figure 2un). A concentration gradient of Wnt3a is established in the intestinal crypt, with highest levels found in the base of the crypt that then decrease towards the top of the crypt [23]. This concentration gradient along with a decrease in Notch signalling and increased BMP signalling at the top of the crypts facilitates the initial differentiation of the LGR5 + stem cells along with the proliferation and terminal differentiation of the TA cells [24]. Paneth cells are integral in producing the crypt environment via secretion of several factors, including Wnt3a, EGF, transforming growth factor α (TGFα) and the Notch ligand D114 [18].

Figure 2. Regulation of stemness in the intestinal stem-cell niche. During normal maintenance of the stem-cell niche several signalling gradients are established that either promote stemness (Wnt) or differentiation (BMP) (un). Multiple signal pathway agonists and antagonists are active in the intestinal crypts that are also used during in vitro culture to simulate the crypt niche environment (B).

4. Intestinal organoids

The identification of LGR5 + stem cells and the characterization of the intestinal stem-cell niche has led to the development of three-dimensional (3D) organoid cultures and the ability to amplify intestinal epithelium in vitro. These primary tissue cultures can be maintained long term without any substantial changes to genetic integrity or tissue physiology.

Organoids are now becoming an increasingly popular option for exploring an array of diseases currently lacking suitable treatments. Multiple organoid culture platforms have now been described including liver and pancreatic organoids [25–28], kidney organoids [29], central nervous system organoids [30] and intestinal organoids [31–33]. An organoid is often defined as ‘an in vitro 3D cellular cluster derived exclusively from primary tissue, ESCs or IPSCs, capable of self-renewal and self-organization, and exhibiting similar organ functionality as the tissue of origin' [34]. Indeed, intestinal organoids are clusters of cells that self-organize in 3D structures that recapitulate major features of their native tissue. Intestinal organoids have been derived from both human stem cells and direct biopsy of adult intestinal tissue. In each case, the resulting intestinal organoids share many features, including a highly folded epithelium structure consisting of crypts and villi similar to native intestinal epithelium. Once embedded in Matrigel™, they self-assemble so that the luminal surface of epithelium is directed towards the centre of the organoid and the basolateral side is in contact with the Matrigel™ and surrounding medium. Analysis of the different cell types present within intestinal organoids has shown that all cell types usually found in vivo are present, and are therefore useful for studying the complexities of interplay between cell types during homeostasis and disease states.

Intestinal organoids have been shown to exhibit the same functions as those that occur in vivo, including mucus production, and absorptive and secretory functions [24]. Intestinal organoids mimic in vivo epithelial regenerative capacity, with apoptotic cells being continually released into the lumen of the organoid as new cells are differentiated from the LGR5 + cells within the crypts to replenish the epithelium.

5. Isolation and culture of intestinal organoids

There are two approaches to creating intestinal organoids: either through isolation of intestinal crypts from patient donors or via in vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hIPSCs). Both methods result in organoids comprising all intestinal epithelial cell types found in vivo, in similar proportions and arrangements.

Culture conditions for both primary tissue and stem-cell-derived organoids are essentially the same, requiring a basal media comprising Advanced DMEM/F12, supplemented with N2 and B27, nicotinamide and n-acetylcysteine. To the basal medium additional growth factors are added to support the growth of the organoids including EGF, Noggin and gastrin, which are essential for regulation of gut mucosal growth and proliferation of intestinal epithelial cells. The presence of Wnt3a is crucial to regulate self-renewal, proliferation and differentiation, as expression of LGR5 in stem cells found in intestinal crypts is dependent upon the canonical Wnt signalling pathway, regulated by R-Spondin-1 and BMP4 inhibition by Noggin [35,36] (figure 2B).

Intestinal crypts can be isolated from intestinal biopsies during endoscopy or surgical resection [18,37] (figure 3). Crypts are manually dissected from the epithelium and embedded into a Matrigel™ containing Wnt, R-Spondin, EGF and Noggin. Once Matrigel™ has solidified and encapsulated the isolated crypts, the Matrigel™ is overlaid with tissue culture medium containing all additives and growth factors. Over the course of 7–10 days intestinal crypts elongate and expand to form the first organoid structures, which can then be manually dissociated and expanded. In addition to LGR5 + stem cells, mature enteroids and colonoids comprised enterocytes, enteroendocrine cells, goblets cells and Paneth cells.

Figure 3. Schematic of human intestinal organoid creation. Intestinal organoids can be generated directly from intestinal biopsy or tissue from surgical resection. Isolated crypts can be placed directly into 3D Matrigel™ cultures along with Wnt, Noggin, EGF and R-Spondin to establish stable cell lines. An alternative approach to generating patient-specific intestinal organoids requires a skin biopsy, isolation and amplification of skin fibroblasts. Skin fibroblasts can then be reprogrammed to hIPSCs using the Yamanaka factors and differentiated into endoermal cells and finally, intestinal epithelium before long-term culture in 3D Matrigel™ conditions.

Using a stem-cell-based approach, hESCs or hIPSCs can be differentiated following normal developmental stages to generate intestinal epithelium (figure 3). This includes differentiation of cells via the major developmental milestones of definitive endoderm, hindgut endoderm and intestinal progenitor cell stages. Once differentiated into sufficiently committed intestinal progenitor cells, they can be transitioned from what is normally a two-dimensional (2D) differentiation platform into the 3D organoid platform, where cells then spontaneously rearrange themselves into intestinal organoids.

6. Functional analysis of organoids

A variety of assays have been used to assess functionality of intestinal organoids. A primary function of enterocytes is transport of water and electrolytes across the intestinal barrier. In vitro, organoids have been shown to maintain this function via derivation of organoids lacking the apical transporters SGLT-1 or PEPT1. These organoids were shown to have inhibited d -glucose, d -fructose and peptide transport across the epithelial membrane, validating their potential use as a model of nutrient and drug transport mechanisms [38].

Permeability of the intestinal epithelium is an important factor in both health and disease, affecting the diffusion of small molecules across the intestinal barrier and preventing bacterial translocation via the bloodstream. Recently, it has been demonstrated that intestinal organoids can be used to model epithelial permeability and changes can be recorded in real time [39]. collina et al. [39] demonstrated this technique by injecting fluorescently labelled dextran into the lumen of organoids while automated microscopy was used to capture, in real time, live cells and quantify breaks in the luminal surface. Using this technique, alterations to intestinal permeability can be studied under chronic inflammatory conditions and during bacterial invasions.

Forskolin-induced organoid swelling assay has also been used to demonstrate functionality of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) ion channel. Organoids with a functional CFTR swell in response to forskolin treatment, while any changes to the function of CFTR due to inhibition or genetic mutation can be detected due to lack of swelling [40]. This assay has the potential to be adapted to a drug-screening platform for cystic fibrosis (CF).

7. Applications of organoid technology

Owing to its differing physiology and distinct functions, the gastrointestinal tract is affected by an array of disorders. The intestinal epithelium is continuously exposed to antigens from commensal bacteria and consumed food, hence it has an extensive immune system, inclusive of adjacent lymphoid tissue, heavily populated with lymphocytes. The mucosa is the main site at which the immunological functions take place however, loss of this carefully maintained immune homeostasis can cause chronic inflammation and multiple disorders. Intestinal organoids have now become increasingly popular as a platform to model many intestinal diseases caused by chronic inflammation or physical injury.

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic, progressive and relapsing disease affecting the entire gastrointestinal tract. It is a result of dysregulated innate and adaptive immune responses against antigens present in the gastrointestinal tract. IBD is categorized into two main subtypes: ulcerative colitis (UC), which is restricted to the colon, and Crohn's disease (CD), which can affect any area of the digestive tract [41]. During active IBD, the small and large intestine can become highly inflamed, leading to destruction of the epithelium and deterioration in digestive capacity. Intestinal organoids derived from IBD patients present an opportunity to understand how innate immunity is regulated in IBD patients and to identify novel therapeutics to reduce the severity of the disease.

Short bowel syndrome (SBS) develops often due to partial resection of large intestine as a result of IBD, colorectal cancer (CRC) or ischaemic disease, or can be present at birth. Owing to a significantly reduced surface area of the intestinal epithelium, malabsorption and malnutrition are major issues. Congenital SBS has a genetic basis linked with the CLMP gene. Patient-derived small intestinal organoids offer a chance to study the genetic susceptibility in greater detail, including the molecular mechanisms involved in impaired intestinal elongation during development that are currently not well understood [42]. Furthermore, the combination of intestinal organoids with tissue-engineering techniques for the lengthening of the small intestine, offer a potential method for the restoration of normal functioning of the bowel irrespective of the cause of SBS.

Coeliac disease is an example of an autoimmune disease mainly affecting the small intestine upon consumption of gluten. The resulting inflammation causes malabsorption, leading to a range of other successive symptoms. Without exclusion of all gluten products from the diet, prolonged inflammation can lead to osteoporosis and cancer. Organoids cultured from patients suffering from coeliac disease can offer insight into genetic predispositions and mechanisms driving the disease forward. Alterations to intestinal barrier integrity, which are known to occur in coeliac patients, can be explored using organoids [43]. Similarly, patient-derived organoids could be used as a drug-screening platform for the identification of novel therapies.

Diverticular disease occurs typically in the sigmoid colon and is the result of physical damage to the intestines leading to loss of function. Diverticula are sacs that form from the herniation of the intestinal epithelium, erupting through the surrounding muscular layer. They are suspected to form due to excessive pressure throughout the large intestine, due, in part, to a low-fibre diet, however, aetiology remains largely unknown. These diverticula can become infected and inflamed, leading to the patient developing fever, pain, nausea and diarrhoea. A genetic element is suspected that predisposes individuals to developing diverticulitis. Therefore, genetic factors involved in the pathogenesis of diverticulitis can be studied using patient tissue-derived organoids from a relatively non-invasive intestinal biopsy. These can then be compared to healthy intestinal tissue to determine genetic and functional differences. Owing to the mechanical nature of the development of diverticular disease, mechanical stress could be applied to the individual organoids to examine the response of the intestinal epithelium under differing levels of stretch stress. However, a tissue-engineering approach is required in combination with organoid technology to model the development of diverticula. Intestinal organoids alone would not be suitable to model diverticula development due to the involvement of the mesenchyme and muscular layer surrounding the intestinal epithelium in vivo.

Cystic fibrosis is perhaps best known for its effect in the lung but also causes complications in other organs, including the pancreas and intestines. The most serious acute complication of the intestine in CF is obstruction of the terminal ileum or proximal large intestine, which if untreated can result in rupture and sepsis. Intestinal organoids are a suitable model of CF due to their expression of CFTR and by using a combination of forskolin-induced swelling and voltage-gate measurements, fluid and ion transport can be accurately measured. This assay has been performed on human intestinal organoids, demonstrating physiologically accurate CFTR function [44]. Drug responsiveness can, therefore, be measured using the current organoid model to identify the most effective treatment for CF or as a diagnostic tool [45].

CRCs are among the most commonly diagnosed cancers in the developed world. There are many contributing factors to development of CRC, but importantly long-term CD or UC significantly increases lifetime risk. Organoids are increasingly being used as models of CRC. Current models of CRC are unable to reproduce the progression of the disease at the early stages and are not representative of the heterogeneous nature of tumours. Genome-editing techniques, such as CRISPR/Cas9, however, can be used as a means to introduce genetic mutations into genes of interest. Following genetic manipulation organoids can then be transplanted into mice, in which the in vivo mechanisms of tumour progression and invasion can be measured [46].

8. Host–pathogen interactions

Different methods are employed to expose intestinal organoids to bacteria. Microinjection of live bacteria or bacterial proteins is a common approach to study intestinal infections, including Salmonella e Clostridium difficile infezioni. For example, Forbester et al. [31] used hIPSCs to generate intestinal organoids that were then microinjected with Salmonella. mRNA sequencing was used to create a global profile of changes in gene expression in response to Salmonella infection [31]. Similarly, Leslie et al. [35] used a microinjection methodology to deliver C. difficile into the lumen of hIPSC-derived intestinal organoids. They then observed that C. difficile remained in the lumen for a prolonged duration, suggesting that organoids possess suitable conditions for the survival of C. difficile and hence other obligate anaerobes. Microinjection of C. difficile toxins has also been shown to exhibit expected effects on epithelial integrity and changes to the expression of certain tight junctions [35].

9. Limitations of organoids

Despite increasing interest in organoid platforms to model intestinal development and disease, organoids used in today's research lack certain elements of the complete organ found in vivo (Tabella 1). This includes a lack of mesenchymal tissue, immune and neural cells that in vivo contribute to the overall structure and functioning of the intestines. Organoids currently used in research are comprised mainly of epithelium, including the niche that enables self-renewal of intestinal stem cells.

Table 1. Advantages and disadvantages for the use of intestinal organoids in the study of disease.

Organoids differentiated from induced pluripotent stem cells (IPSCs) into intestinal epithelial structures are known as induced intestinal organoids [47]. The differentiation protocols promoting the generation of such organoids also generates mesenchyme that, when transplanted under the renal capsule of mice, differentiate into smooth muscle and myofibroblasts [24]. These, therefore, are more representative of the intestines in vivo. However, they require a longer period of time to generate and are still devoid of immune cells which are necessary to address the most common intestinal disease IBD.

Other limitations of intestinal organoid include practical limitations due to the fact that cells must be embedded in Matrigel™ and grown in 3D. This creates additional complications when manipulating cells for simple procedures such as isolating mRNA, DNA and performing immuncytochemistry because organoids will require removal from Matrigel™ prior to processing. 3D culture also creates problems when attempting genetic manipulation via transfection and CRISPR/Cas9 gene editing approaches. Again, cells require removal of Matrigel™ prior to manipulation, which can create suboptimal conditions for organoid maintenance and growth.

It is clear that intestinal organoids can be used as an effective model of host–pathogen interactions that occur within the intestinal tract. However, further study is required to incorporate additional immune elements into the model to give a more complete illustration of inflammatory response. Thus far, microinjection has been used effectively to deliver the bacteria into the lumen of the organoid. However, this is a time-consuming technique. Therefore, other techniques have been trialled as more efficient alternatives. Treating a monolayer, for example, is much quicker to execute, however, this method is less indicative of how the 3D in vivo intestine would respond due to the lack of 3D architecture and the stem-cell niche. Without this native architecture it cannot be determined how intestinal stem cells would respond to such an infection.

10. Future challenges

Intestinal organoids remain a promising, tunable model for developmental and disease modelling, drug and toxicity testing, and host–pathogen interaction studies. In the future, in conjunction with CRISPR/Cas9 technology intestinal organoids hold great potential for gene therapy and transplantation applications in humans to treat chronic inflammatory disorders, such as CD, UC and CRCs. However, there are many aspects of this technology that still require significant investment to create a model that is more representative of in vivo tissue and their translational use in humans to become a reality.

Culturing intestinal organoids in 3D creates additional layers of complexity when attempting manipulations involving gene editing, transfection or when studies require access to the apical surface of intestinal epithelium. Previously, processing organoids has required specialized and time-consuming procedures such as the use of micromanipulator and microinjection platforms. More recently, several studies have addressed this problem and have begun developing methodologies to use 2D culture of dissociated intestinal organoids as a platform for high-throughput drug testing, migration assays and host–pathogen interaction studies. By using transwells with permeable membranes, experimentation can be performed with ease of access to both the apical and basolateral sides of the newly formed epithelial membrane [24]. However, this approach also disrupts the stem-cell compartment, meaning that using current culture conditions cells cannot be propagated long term using this 2D culture approach. It is feasible, however, to maintain organoids in 3D while performing manipulations in transient 2D cultures.

Current organoid platforms require the spontaneous self-assembly of epithelial tissue following dissociation and then embedding in Matrigel™. This approach creates organoids of differing shapes and sizes that lack the gross anatomical features of the intestine. Accuracy in developmental and disease modelling will be dramatically enhanced by the use of 3D scaffolds constructed from either decellularization and then recellularization of an ex vivo extracellular matrix or a cellularized synthetic scaffold. This approach offers a base on which to culture the cells into the tubular structure with more precise patterning of epithelium and consistent numbers of cells. This technique is potentially tunable, enabling the cell composition to be altered depending on the region of intestinal tract being studied or disease process being modelled. This model, as well as being a closer approximation of the intestine, is likely to be easier to manipulate by providing easier access to apical and basolateral sides of cells. Studies carried out into the development of this model have shown that it can accumulate a mucus layer on the luminal surface, as with organoids, with a thickness of 20 µm [48]. This can, therefore, recapitulate the host–pathogen interactions, occurring in vivo, that require an intact mucosal layer. So far, these models lack neural and immune cells to form a complete organ and require many months of set-up until the platform is suitable for experimental use. A notable disadvantage to this system is the deterioration in the model after only a few weeks following the seeding of cells to the 3D scaffold, which could be due to nutrient and oxygen starvation of cells, further reinforcing the need for models that recapitulate the complete organ including vascularization. This, therefore, must be overcome before it can be used for longer-term studies, including that of chronic inflammation.

Several studies have demonstrated the potential for direct transplantation of intestinal organoids into mice and rodents [32,49]. Fordham et al. successfully transplanted fetal intestinal progenitors, which had not yet been differentiated into intestinal organoids, into a colonic injury mouse model [32]. They found that immature enterospheres have regenerative capacity when transplanted into adult damaged colonic epithelium. Additionally, they demonstrated the ability of these immature cells to mature in vivo, appropriate for the region of engraftment, expressing Mucin-2-positive goblet cells and lacking markers of small intestine. Whether the same approach could be used to treat human intestinal injury from both acute and chronic IBD is yet to be determined. When combined with decellularization/recellularization techniques, 3D printing and development of synthetic and biodegradable scaffold technologies, stem-cell-derived intestinal tissue or patient-derived intestinal tissue could be used to replace large segments of the small and large intestine.

One of the more significant drawbacks to modelling disease using intestinal organoids is the absence of an immune element that can be used to understand mechanisms driving the autoimmune destruction of the intestinal mucosa that occurs during CD and UC in vivo. Thus far, intestinal organoids have been able to model the immune response at an innate level, determining the effects of gene expression and cytokine signalling in the development of CD and in host–pathogen interaction studies. CD is known to be triggered by a combination of genetic susceptibility and environmental factors, resulting in dysregulation of immune homeostasis. Studies have shown that human intestinal organoids generated from hIPSCs are a suitable model for studying the interactions between intestinal epithelium and the enteric pathogen Salmonella typhimurium to dissect elements of the innate immune response [31]. The model, however, needs to be further developed to include elements of systemic immune regulation including cells such as macrophages, neutrophils, T cells, B lymphocytes, NK cells and dendritic cells. Addition of these cell types will create a more complete model but will be a significant challenge requiring all cell types to be from the same donor.

Intestinal organoids, whether derived from primary tissue biopsy or stem-cell differentiation techniques, have great potential in the future of disease modelling, drug discovery and personalized medicine. They have been shown to have stable phenotype, are relatively simple to create and manipulate while at the same time able to be maintained in long-term culture. However, current organoid derivation and culture techniques do not allow for the assembly of complex multi-cell-type organoids that can model the complete complexity of a multifactoral disease such as IBD. Furthermore, as our need to modify and manipulate organoids and organoid culture conditions advances, the practice of culturing intestinal organoids may pose technical limitations on what is achievable. Developing our understanding of the initiation and development of complex intestinal disease, such as IBD and CRC, will require continued investment and research into the development of more complex intestinal organoid platforms.


Astratto

Oral and intestinal mucositis is a debilitating, often dose limiting side effect of radiation treatment. A mouse model of mucositis, induced by gamma irradiation, leads to weight loss and tissue damage, similar to that observed in patients. This model reflects the human ailment as it responds to keratinocyte growth factor (KGF), the standard of care treatment.
Culturing of intestinal crypt organoids derived from primary cells allowed the development of a 3D assay to monitor the effect of treatments of intestinal epithelium to radiation-induced damage. This in vitro assay closely resembles the mouse model as KGF and Roof Plate-Specific Spondin-1 (RSPO1) enhanced the recovery of crypt organoids following radiation. Screening identified tool compounds that increased the survival of organoids post radiation. Repeated testing of these compounds revealed that the organoids changed their response over time. To investigate this adaptive behavior, intestinal organoid cultures were studied over time. Samples of organoids at various time points were used to prepare mRNA for unbiased transcriptome analyses. This expression profiling revealed a number of genes and pathways that were modulated over time, providing a rationale for the altered sensitivity of the intestinal crypt organoid cultures.
This report describes the development of an in vitro assay that reflects the response of disease to therapeutic treatment. The assay was miniaturized and used to identify bioactive tool compounds, which served as probes to interrogate the patho-physiology of organoids over prolonged culture conditions. In vitro disease models based on primary 3D cell cultures represent valuable tools to identify potential drug targets and bioactive hits.


Affiliazioni

Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology and Harvard University, Cambridge, MA, USA

Benjamin E. Mead & Jeffrey M. Karp

Institute for Medical Engineering and Science (IMES), Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Department of Chemistry, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Ragon Institute of Massachusetts General Hospital, Massachusetts Institute of Technology and Harvard University, Cambridge, MA, USA

Engineering in Medicine, Department of Medicine, Center for Regenerative Therapeutics, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Harvard−Massachusetts Institute of Technology Division of Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA


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