Informazione

Fosforilazione ossidativa inversa?


Ho notato che tutti i metodi di produzione di energia cellulare che ho trattato hanno un rapporto fisso tra ATP e NAD(P)H out. Ad esempio, nel processo combinato di glicolisi, ossidazione del piruvato e ciclo di Krebs, vengono prodotti 10 NADH, 2 FADH2 e 4 ATP (basati sul libro di testo biologico del mio liceo, se lo aggiungo bene). In questo modo, NADH e FADH2 possono essere facilmente scambiati con ATP attraverso la fosforilazione ossidativa. Questo mi ha portato a chiedermi cosa accadrebbe se una cellula utilizzasse così tanti elettroni (da NADH e/o FADH2) che ci sono troppo ATP. (Proprio come ipotetico: mi sembra abbastanza improbabile)

Stavo cercando un modo per invertire la fosforilazione ossidativa, ma non ho trovato molto. Ho scoperto che i batteri anaerobici possono ossidare i nitriti in questo modo, ma non sono riuscito a trovare molte prove di una versione che forma O2. Esiste una cosa del genere?


Teoria Chemiosmotica

L'Accademia Reale Svedese delle Scienze ha deciso di assegnare il Premio Nobel per la Chimica 1978 a
Dr Peter Mitchell, Glynn Research Laboratories, Bodmin, Cornovaglia, Regno Unito, per il suo contributo alla comprensione di trasferimento di energia biologica attraverso la formulazione della teoria chemiosmotica.

Teoria chemiosmotica del trasferimento di energia

Peter Mitchell è nato a Mitcham, nella contea di Surrey, in Inghilterra, il 29 settembre 1920. I suoi genitori, Christopher Gibbs Mitchell e Kate Beatrice Dorothy (nata) Taplin, erano caratterialmente molto diversi tra loro. Sua madre era una persona timida e gentile di pensiero e azione molto indipendente, con una forte percettività artistica. Essendo un razionalista e un ateo, gli insegnò che doveva accettare la responsabilità del proprio destino, e specialmente dei suoi fallimenti nella vita. Quella prima influenza potrebbe averlo portato ad adottare la filosofia personale atea religiosa alla quale ha aderito sin dal età di circa quindici anni. Suo padre era una persona molto più convenzionale di sua madre, ed è stato insignito dell'O.B.E. per il suo successo come funzionario.

Peter Mitchell ha studiato al Queens College di Taunton e al Jesus College di Cambridge. Nel Queens ha beneficiato in particolare dell'influenza del preside, C. L. Wiseman, che era un eccellente insegnante di matematica e un abile musicista dilettante. Il risultato dell'esame di borsa di studio che ha sostenuto per entrare al Jesus College di Cambridge è stato così tristemente negativo che è stato ammesso all'Università solo sulla base di una lettera personale scritta da C. L. Wiseman. Entrò nel Jesus College subito dopo l'inizio della guerra con la Germania nel 1939. Nella Parte I del Tripos di Scienze Naturali studiò fisica, chimica, fisiologia, matematica e biochimica, e ottenne un risultato di Classe III. Nella parte II, ha studiato biochimica e ha ottenuto un risultato II-I per la sua laurea con lode.

Ha accettato un posto di ricerca presso il Dipartimento di Biochimica, Cambridge, nel 1942 su invito di J. F. Danielli. È stato molto fortunato ad essere l'unico PhD di Danielli. studente in quel momento, e ha molto apprezzato e beneficiato dello stile amichevole e non autoritario di Danielli nella supervisione della ricerca. Danielli lo presentò a David Keilin, che imparò ad amare e rispettare più di ogni altro scienziato di sua conoscenza.

Ha conseguito il titolo di Ph.D. all'inizio del 1951 per lavori sul meccanismo d'azione della penicillina, e dal 1950 al 1955 ricoprì l'incarico di dimostratore presso il Dipartimento di Biochimica di Cambridge. Nel 1955 fu invitato dal professor Michael Swann a costituire e dirigere un'unità di ricerca biochimica , denominata Unità di Biologia Chimica, nel Dipartimento di Zoologia, Università di Edimburgo, dove è stato nominato a Senior Lectureship nel 1961, a Readership nel 1962, e dove è rimasto fino a quando le ulcere gastriche acute non hanno portato alle sue dimissioni dopo un periodo di congedo nel 1963.

Dal 1963 al 1965 si ritirò completamente dalla ricerca scientifica e agì come architetto e maestro dei lavori, supervisionando direttamente il restauro di un'affascinante residenza con facciata in stile Regency, conosciuta come Glynn House, nella bellissima boscosa Glynn Valley, vicino a Bodmin, Cornovaglia e #8211 adattandone e fornendone una parte importante per l'utilizzo come laboratorio di ricerca. In questo, è stato fortunato a ricevere il supporto entusiasta della sua precedente collega di ricerca Jennifer Moyle. Lui e Jennifer Moyle hanno fondato una società di beneficenza, nota come Glynn Research Ltd., per promuovere la ricerca biologica fondamentale e finanziare il lavoro dei Glynn Research Laboratories a Glynn House. La dotazione originale di circa £ 250.000 è stata donata in egual modo da Peter Mitchell e suo fratello maggiore Christopher John Mitchell.

Nel 1965, Peter Mitchell e Jennifer Moyle, con l'aiuto pratico di un tecnico, Roy Mitchell (non imparentato con Peter Mitchell), e con l'aiuto amministrativo della loro segretaria aziendale, avviarono il programma di ricerca sulle reazioni chemiosmotiche e sui sistemi di reazione per il quale il Glynn Research Institute è diventato noto. Fin dalla sua istituzione, il Glynn Research Institute non ha avuto risorse finanziarie sufficienti per impiegare più di tre ricercatori, incluso il direttore della ricerca, nel suo personale permanente. Ha continuato ad agire come Direttore della Ricerca presso il Glynn Research Institute fino ad oggi. Un'acuta mancanza di fondi ha recentemente portato alla possibilità che il Glynn Research Institute possa dover chiudere.

Mitchell ha studiato il mitocondrio, l'organello che produce energia per la cellula. L'ATP viene prodotto all'interno del mitocondrio aggiungendo un gruppo fosfato all'ADP in un processo noto come fosforilazione ossidativa. Mitchell è stato in grado di determinare come i diversi enzimi coinvolti nella conversione dell'ADP in ATP sono distribuiti all'interno delle membrane che suddividono l'interno del mitocondrio. Ha mostrato come la disposizione di questi enzimi ne faciliti l'uso di ioni idrogeno come fonte di energia nella conversione dell'ADP in ATP.

L'articolo del 1961 di Peter Mitchell che introduceva l'ipotesi chemiosmotica ha dato il via a una rivoluzione che ha echeggiato oltre la bioenergetica in tutta la biologia e ha plasmato la nostra comprensione dei meccanismi fondamentali di conservazione dell'energia biologica, trasporto di ioni e metaboliti, motilità batterica, struttura e biosintesi degli organelli, struttura della membrana e la funzione, l'omeostasi, l'evoluzione della cellula eucariotica, e in effetti ogni aspetto della vita in cui questi processi svolgono un ruolo. Il Premio Nobel per la Chimica nel 1978, assegnato a Peter Mitchell come unico destinatario, ha riconosciuto il suo contributo predominante nello stabilire la validità dell'ipotesi chemiosmotica, e ipso facto, la lunga lotta per convincere un'establishment inizialmente ostile.

PREMIO NOBEL IN CHIMICA PER IL TRASFERIMENTO DI ENERGIA BIOLOGICA

La ricerca di Mitchell è stata condotta all'interno di un'area della biochimica spesso definita negli ultimi anni come "bioenergetica", che è lo studio di quei processi chimici responsabili dell'approvvigionamento energetico delle cellule viventi. I processi vitali, come tutti gli eventi che comportano lavoro, richiedono energia, ed è del tutto naturale che attività come la contrazione muscolare, la conduzione nervosa, il trasporto attivo, la crescita, la riproduzione, nonché la sintesi di tutte le sostanze necessarie per svolgere e la regolamentazione di queste attività, non potrebbe aver luogo senza un adeguato apporto di energia.

È ormai assodato che la cellula è la più piccola entità biologica in grado di gestire l'energia. Comune a tutte le cellule viventi è la capacità, mediante opportuni enzimi, di ricavare energia dal loro ambiente, di convertirla in una forma biologicamente utile e di utilizzarla per guidare vari processi che richiedono energia. Le cellule delle piante verdi così come alcuni batteri e alghe possono catturare energia per mezzo della clorofilla direttamente dalla luce solare – l'ultima fonte di energia per tutta la vita sulla Terra – e utilizzarla, attraverso la fotosintesi, per convertire l'anidride carbonica e l'acqua in composti organici. Altre cellule, comprese quelle di tutti gli animali e molti batteri, dipendono interamente per la loro esistenza da composti organici che assorbono come nutrienti dal loro ambiente. Attraverso un processo chiamato respirazione cellulare, questi composti vengono ossidati dall'ossigeno atmosferico in anidride carbonica e acqua.

Sia durante la fotosintesi che durante la respirazione, l'energia viene conservata in un composto chiamato adenosina trifosfato, abbreviato in ATP. Quando l'ATP viene scisso in adenosina difosfato (ADP) e fosfato inorganico (Pi), viene liberata una quantità relativamente grande di energia, che può essere utilizzata, in presenza di enzimi specifici, per guidare vari processi che richiedono energia. Pertanto, l'ATP può essere considerato la "moneta energetica" universale delle cellule viventi. I processi mediante i quali l'ATP si forma dall'ADP e dal Pi durante la fotosintesi e la respirazione sono generalmente chiamati rispettivamente ‘fotofosforilazione’ e ‘fosforilazione ossidativa’, rispettivamente. I due processi hanno diverse caratteristiche in comune, sia nella loro composizione enzimatica – implicano entrambi un'interazione tra enzimi ossidanti (trasferimento di elettroni) e fosforilanti – e nella loro associazione con le membrane cellulari. Nelle cellule superiori, la fotofosforilazione e la fosforilazione ossidativa si verificano in specifici organelli racchiusi nella membrana, cloroplasti e mitocondri, rispettivamente nei batteri, entrambi questi processi sono associati alla membrana cellulare.

I concetti di cui sopra erano stati ampiamente delineati all'incirca all'inizio degli anni '60, ma i meccanismi esatti con cui il trasferimento di elettroni è accoppiato alla sintesi di ATP nella fosforilazione ossidativa e nella fotofosforilazione rimanevano sconosciuti. Sono state formulate molte ipotesi, soprattutto riguardo al meccanismo della fosforilazione ossidativa, la maggior parte di queste postulava un'interazione chimica diretta tra enzimi ossidanti e fosforilanti. Nonostante le intense ricerche in molti laboratori, tuttavia, non è stato possibile ottenere prove sperimentali per nessuna di queste ipotesi. In questa fase, nel 1961, Mitchell propose un meccanismo alternativo per l'accoppiamento del trasferimento di elettroni alla sintesi di ATP, basato su un'interazione indiretta tra enzimi ossidanti e fosforilanti. Ha suggerito che il flusso di elettroni attraverso gli enzimi delle catene respiratorie o fotosintetiche di trasferimento degli elettroni guida ioni di idrogeno carichi positivamente, o protoni, attraverso le membrane dei mitocondri, dei cloroplasti e delle cellule batteriche. Di conseguenza, viene creato un gradiente protonico elettrochimico attraverso la membrana. Il gradiente è costituito da due componenti: una differenza nella concentrazione di ioni idrogeno, o pH, e una differenza nel potenziale elettrico, i due insieme formano ciò che Mitchell chiama la "forza protonmotrice" 8217. La sintesi di ATP è guidata da un flusso inverso di protoni lungo il gradiente. La proposta di Mitchell è stata chiamata la ‘teoria chemiosmotica’.

Questa teoria è stata accolta per la prima volta con scetticismo ma, negli ultimi 15 anni, il lavoro sia in Mitchell che in molti altri laboratori ha dimostrato che i postulati di base della sua teoria sono corretti. Anche se i dettagli importanti dei meccanismi molecolari sottostanti non sono ancora chiari, la teoria chemiosmotica è ora generalmente accettata come un principio fondamentale in bioenergetica. Questa teoria fornisce una base razionale per il lavoro futuro sui meccanismi dettagliati della fosforilazione ossidativa e della fotofosforilazione. Inoltre, è già stato dimostrato che questo concetto di trasmissione di energia biologica mediante forza protomotrice (o ‘proticità’, come Mitchell ha iniziato a chiamarlo in analogia con l'elettricità) è applicabile ad altri processi cellulari che richiedono energia. Questi includono l'assorbimento di nutrienti da parte delle cellule batteriche, il trasporto cellulare e intracellulare di ioni e metaboliti, la produzione di calore biologico, il movimento batterico, ecc. Inoltre, i cloroplasti delle piante, che raccolgono l'energia luminosa del sole, e i mitocondri di le cellule animali, che sono i principali convertitori di energia dalla respirazione, sono notevolmente simili ai sistemi solari miniaturizzati e alle celle a combustibile. Le scoperte di Mitchell sono quindi sia interessanti che potenzialmente preziose, non solo per la comprensione dei sistemi biologici di trasferimento dell'energia, ma anche in relazione alla tecnologia di conversione dell'energia.


L'inibizione della fosforilazione ossidativa induce cambiamenti anticancro nelle cellule dei pazienti con leucemia mieloide acuta resistenti alla terapia

Corrispondenza Aida Vitkevičienė, Dipartimento di biologia cellulare molecolare, Istituto di biochimica, Centro di scienze della vita, Università di Vilnius, Sauletekio av. 7, LT-10257 Vilnius, Lituania.

Dipartimento di biologia cellulare molecolare, Istituto di biochimica, Centro di scienze della vita, Università di Vilnius, Vilnius, Lituania

Centro di ematologia, oncologia e medicina trasfusionale, Ospedale universitario di Vilnius Santaros Klinikos, Vilnius, Lituania

Dipartimento di biologia cellulare molecolare, Istituto di biochimica, Centro di scienze della vita, Università di Vilnius, Vilnius, Lituania

Centro di proteomica, Istituto di biochimica, Centro di scienze della vita, Università di Vilnius, Vilnius, Lituania

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Corrispondenza Aida Vitkevičienė, Dipartimento di biologia cellulare molecolare, Istituto di biochimica, Centro di scienze della vita, Università di Vilnius, Sauletekio av. 7, LT-10257 Vilnius, Lituania.

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Astratto

Il trattamento della leucemia mieloide acuta (LMA) è ancora una sfida a causa delle comuni ricadute o della resistenza al trattamento. Pertanto, è necessario lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici. Vari studi hanno dimostrato che alcuni tipi di cancro, inclusi alcuni sottogruppi di LMA chemioresistenti, hanno sovraregolato la fosforilazione ossidativa. In questo studio, abbiamo mirato a valutare la modulazione cellulare dei pazienti con LMA resistenti al trattamento utilizzando metformina e atovaquone inibitori della fosforilazione ossidativa da soli e in varie combinazioni con l'analogo della citosina citarabina e venetoclax, induttore dell'apoptosi. L'analisi dell'attività metabolica utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare Agilent Seahorse XF ha rivelato che lo stato metabolico delle cellule mononucleate del sangue periferico era diverso tra i pazienti con LMA resistenti al trattamento. Abbiamo dimostrato che la metformina ha ridotto la fosforilazione ossidativa delle cellule LMA resistenti alla terapia ex vivo, il cotrattamento con citarabina e venetoclax ha leggermente aumentato l'effetto. Tuttavia, il trattamento con atovaquone non ha avuto un effetto marcato nel nostro esperimento. Il trattamento cellulare ha avuto un lieve effetto sull'inibizione della proliferazione cellulare. La combinazione di metformina, citarabina e venetoclax ha avuto l'effetto più forte. Inoltre, è stato dimostrato un effetto leggermente superiore sulla proliferazione cellulare e sulla regolazione del ciclo cellulare nelle cellule con un tasso di fosforilazione ossidativa iniziale più elevato, come dimostrato dall'analisi dell'espressione genica mediante la reazione a catena della polimerasi quantitativa a trascrizione inversa (RT-qPCR). L'analisi proteomica mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa ha dimostrato che il trattamento delle cellule LMA chemioresistenti con metformina modulava le vie metaboliche, mentre la combinazione di metformina con citarabina e venetoclax ne aumentava l'effetto. Suggeriamo che l'inibizione della fosforilazione ossidativa sia efficace ma non sufficiente per il trattamento della LMA chemioresistente. Infatti, provoca cambiamenti anticancro che potrebbero avere un importante ruolo additivo nel trattamento combinatorio.

Nota: l'editore non è responsabile per il contenuto o la funzionalità delle informazioni di supporto fornite dagli autori. Qualsiasi domanda (diversa dal contenuto mancante) deve essere indirizzata all'autore corrispondente per l'articolo.


Risultati

Fattibilità termodinamica e massima resa DHB

Il percorso proposto procede attraverso l'attivazione del gruppo β-carbossilato malato mediante fosforilazione seguita da due successivi cicli di riduzione per produrre DHB (Fig. 1). Lo standard negativo dell'energia libera di Gibbs per il percorso (Nota supplementare 1 Tabella supplementare 1) attesta la sua vitalità termodinamica. Analisi stechiometrica della rete metabolica in E. coli mostra che DHB può essere prodotto dal glucosio con una resa massima teorica di 1,5 mol mol -1 (Nota supplementare 2 Figura supplementare 1). Dato che DHB può essere convertito nell'HMTB metionina-analogo senza perdita di carbonio, la produzione di metionina tramite DHB aumenta la resa teorica di 100% rispetto alla biosintesi convenzionale in un unico passaggio di metionina da glucosio e solfato e di ∼ 30% rispetto alla biosintesi della metionina da glucosio e metantiolo 10 .

La via sintetica 2,4-diidrossibutirrato (DHB) si ispira alla via naturale dell'omoserina.

Data la somiglianza strutturale della DHB e degli intermedi della via dell'omoserina, abbiamo identificato tre enzimi della via dell'omoserina come candidati prototipo per lo screening e l'ingegneria dell'attività enzimatica nella via della DHB. Abbiamo scelto AK, codificato da lysC 17 e ASD, codificato da asd 18 , da E. coli, e HSD, codificato da HOM6 (rif. 19), da Saccharomyces cerevisiae poiché gli enzimi HSD in E. coli sono enzimi bifunzionali con un'attività AK associata 20,21. Abbiamo scoperto che Ec-Asd aveva solo attività in traccia sul substrato sintetico (Kgatto= 0,13 s -1 su malyl-P rispetto a 36 s -1 su aspartil-4-fosfato (aspartil-P), mentre Ec-LysC e Sc-Hom6 non avevano attività rilevabile su malato e semialdeide malato, rispettivamente (Tabella supplementare 2 supplementare Nota 3). Questi risultati hanno indicato che la fattibilità del previsto de novo via sintetica richiedeva l'ingegnerizzazione di tutte e tre le attività enzimatiche.

Ingegneria dell'attività della chinasi malato

Per prima cosa abbiamo deciso di ingegnerizzare l'attività MK in aspartato chinasi III da E. coli (Ec-LysC). Le interazioni di legame del substrato naturale (L)-aspartato nel sito attivo dell'enzima sono rivelate nella struttura cristallografica a raggi X 2,5 del complesso ternario abortivo dimerico wild-type LysC con (L)-aspartato e la reazione Mg-ADP co -prodotto nello stato R 22 . Il substrato amminoacidico è ancorato in posizione tramite interazioni mediate dall'acqua del gruppo β-carbossilato con lo ione metallico in Mg-ADP e dalle rispettive interazioni elettrostatiche del ponte salino del (L)-aspartato α-ammino e α-carbossilato gruppi con gruppi funzionali della catena laterale enzimatica carica di Glu119 e Arg198 come mostrato nella figura supplementare 2. Il legame produttivo del substrato (L)-aspartato è ulteriormente supportato da una rete di interazioni di van der Waals e legami idrogeno con altri residui Sito attivo.

(L)-malato è un isostere di (L)-aspartato in cui il gruppo α-amminico caricato positivamente è sostituito da un gruppo ossidrile non caricato. In comune con altri analoghi strutturali (succinato e malonato) del (L)-aspartato che non contengono un gruppo α-amminico, e che quindi non possono formare un ponte salino con la catena laterale di Glu119, (L)-malato ha stato segnalato per essere un debole inibitore competitivo di Ec-LysC con un Kio di 53 mM (rif. 23). Queste osservazioni suggeriscono che (L)-malato si lega in modo non produttivo all'enzima wild-type in assenza di ulteriore energia di legame fornita dall'interazione sale-ponte.

Per studiare l'impatto della sostituzione di Glu119 con altri amminoacidi, abbiamo effettuato la mutagenesi di saturazione in questa posizione del residuo e abbiamo analizzato le attività enzimatiche dei mutanti risultanti. Traccia ma misurabile attività enzimatica su (L)-malato potrebbe essere rilevata con i mutanti Ec-LysC E119Q e Ec-LysC E119N, in cui il gruppo carbossilato della catena laterale Glu119 è sostituito da un gruppo carbamoile non caricato (Tabella supplementare 3). Aumenti significativi fino a 200 volte nella Kgatto/Km il valore per (L)-malato è stato ottenuto nelle varianti E119G, E119A, E119S e E119C con catene laterali più corte nella posizione del residuo 119 (Fig. 2a Tabella supplementare 3).

(un) Efficienza catalitica (Kgatto/Km) dell'aspartato chinasi wild-type e dei migliori mutanti della chinasi malato su (L)-aspartato e (L)-malato. I dati cinetici provengono dalla tabella supplementare 3. I risultati sono la media di almeno due esperimenti di replicazione biologica. Le barre di errore corrispondono alla deviazione standard della media. (B) Efficienze catalitiche (Kgatto/Km) di LysC wild type e del triplo mutante V115A E119S E434V Lys C su (L)-aspartato e (L)-malato. I dati cinetici provengono dalla tabella supplementare 3. (C) Regione del sito attivo nel modello molecolare del complesso della E. coli (Ec-LysC) E119S:V115A doppio mutante con (L)-malato e Mg-ADP. Gli atomi di carbonio in ADP e (L)-malato sono colorati in viola. Lo ione Mg 2+ è raffigurato come una sfera color ocra che riempie lo spazio e le molecole d'acqua che mediano le interazioni di legame come sfere gialle. Le posizioni dei residui enzimatici nella libreria combinatoria per lo screening sperimentale dell'attività della chinasi malato (Tabella supplementare 5) sono evidenziate con atomi di carbonio colorati di verde (o ciano) a seconda che sia possibile (o meno) un contatto diretto del residuo con (L)-malato in il complesso del modello Gli atomi sono diversamente colorati in base al tipo di elemento: altro carbonio, azoto grigio, ossigeno blu, rosso e fosforo, arancione. Le interazioni del legame idrogeno sono mostrate come vettori a linea tratteggiata che collegano le posizioni degli atomi pesanti donatori e accettori. Il modello è sovrapposto alla struttura a raggi X del complesso enzimatico wild-type dello stato R con (L)-aspartato e Mg-ADP (codice PDB 2j0w) da cui è stato derivato come descritto in Metodi. Le rappresentazioni diffuse della superficie molecolare dei siti attivi dell'enzima mutante e wild-type sono mostrate rispettivamente in verde e in grigio.

Per migliorare ulteriormente l'efficienza catalitica verso (L)-malato, è stata intrapresa la costruzione di una piccola libreria di mutanti combinatoria. L'analisi delle interazioni di legame di Ec-LysC nel complesso sperimentale con (L)-aspartato ha consentito la selezione di otto posizioni di residui amminoacidici tra cui Glu 119, evidenziate nella Fig. 2 supplementare. Di queste otto posizioni, cinque entrano in contatto diretto con il Il substrato di (L)-aspartato (Ala40, Thr45, Glu119, Phe184 e Ser201), e altri tre (Val115, Thr195 e Thr359) si trovano all'interno di un secondo guscio di residuo non a diretto contatto con il substrato. Il progetto della libreria, descritto nella Nota Integrativa 4, ha tenuto conto della variazione naturale della sequenza nella regione del sito attivo degli omologhi di Ec-LysC e dei risultati della riprogettazione computazionale a nove posizioni di residuo in prossimità della posizione di residuo 119. Le restrizioni poste sul numero di mutazioni consentite in ciascuna delle otto posizioni dei residui nella libreria hanno vincolato la sua dimensione complessiva a 2.160 possibili combinazioni teoriche (Tabella supplementare 5). È stato ideato un protocollo di screening miniaturizzato (vedi Metodi) per consentire la misurazione diretta dell'attività della (L)-malato chinasi mediante una singola misurazione dell'endpoint con una precisione di ± 8% in piastre di microtitolazione. Per garantire un'adeguata copertura dello spazio della sequenza 24, 6.720 cloni sono stati testati con questo metodo portando all'identificazione di nove varianti positive che sono state confermate dal saggio enzimatico di cloni sequenziati e purificati individualmente. Il miglior mutante Ec-LysC V115A:E119S:E434V ha mostrato a Kgatto/Km valore di 0,82 s −1 mM −1 su (L)-malato, approssimativamente solo due volte inferiore a quello dell'enzima wild-type che agisce sul substrato naturale (L)-aspartato. Inoltre, il mutante ha mantenuto pochissima attività verso (L)-aspartato, determinando un marcato cambiamento nella specificità dell'enzima (Fig. 2b). È da notare che la posizione Glu434 sulla superficie dell'enzima non è stata mirata nella costruzione della libreria, ma una mutazione E434V è stata trovata inaspettatamente nel miglior mutante della chinasi malato. Un modello molecolare di (L)-malato legato nel sito attivo del complesso ternario con il doppio mutante Ec-LysC V115A:E119S e Mg-ADP è mostrato in Fig. 2c.

Per rendere l'enzima malato chinasi più efficiente per in vivo applicazioni, abbiamo testato individualmente le mutazioni E250K, T344M, S345L e T352I che in precedenza avevano dimostrato di alleviare l'inibizione del feedback da parte della lisina nell'enzima wild-type 25 . Abbiamo scoperto che tutte queste mutazioni hanno ridotto fortemente l'effetto inibitorio della lisina sull'attività della chinasi malato (Figura 4 supplementare). Il mutante quadruplo, Ec-LysC V115A:E119S:E250K:E434V è stato quindi selezionato per l'implementazione del percorso DHB.

Ingegneria dell'attività della malato semialdeide deidrogenasi

L'aspartato semialdeide deidrogenasi da E. coli È stato scoperto che l'enzima (Ec-Asd) possiede solo attività in traccia su malil-P nella direzione della reazione riduttiva (biosintetica) e sulla semialdeide malato (MSA) nella reazione di fosforilazione ossidativa inversa (Tabella supplementare 6). Per prima cosa abbiamo cercato di ingegnerizzare una maggiore attività verso la coppia substrato/prodotto malil-P/MSA attraverso la mutagenesi sito-diretta dell'enzima batterico Gram-negativo Ec-Asd. I residui del sito attivo coinvolti nel legame dell'aspartato semialdeide (ASA) a Ec-Asd sono stati precedentemente identificati in una struttura cristallina a raggi X di un complesso covalente formato come prodotto di reazione dell'attacco del gruppo tiolico Cys135 sull'analogo del substrato S-metilcisteina solfossido in presenza di NADP+ (rif. 26). Il legame dei gruppi ASA α-ammino e α-carbossilato nel sito attivo Ec-Asd avviene tramite interazioni ponte salino con catene laterali di residui Glu241 e Arg267 di carica opposta. Questa disposizione a ponte di sale è simile a quella del substrato (L)-aspartato α-ammino e gruppi α-carbossilato nel complesso con E. coli aspartato chinasi III (rif. 22) che catalizza la fase di reazione precedente nel percorso fisiologico. Ci si potrebbe aspettare che il gruppo 2-OH in una coppia substrato/prodotto malil-P/MSA si leghi a idrogeno con Glu241 in Ec-Asd, fornendo così un legame al substrato simile a quello del derivato del substrato naturale nel complesso sperimentale. Tuttavia, la scarsa attività osservata dell'Ec-Asd wild-type su MSA rispetto all'ASA può essere in parte dovuta a un abbassamento dell'affinità di legame per un substrato alternativo che trasporta una carica netta negativa. Sostituzione del residuo Glu241 conservato nel wild-type E. coli ci si aspetterebbe quindi che l'enzima mediante residui con catene laterali non cariche migliori l'affinità di legame dell'MSA e riduca quella dell'ASA.

Per testare questa ipotesi, la mutagenesi per saturazione di Ec-Asd è stata effettuata nella posizione del residuo 241. Poiché l'aspartil-P e il malil-P sono molecole altamente instabili, la caratterizzazione cinetica iniziale degli enzimi wild-type e mutante è stata effettuata sul substrato MSA della reazione inversa (fosforilazione ossidativa). L'enzima wild-type e i mutanti più promettenti (E241Q ed E241C, vedere la Figura 5 supplementare) sono stati quindi caratterizzati cineticamente nella direzione della reazione biosintetica (fisiologica) in saggi di reazione enzimatica accoppiata, utilizzando MK o AK per generare un sul posto fornitura di malyl-P o aspartil-P a seconda dei casi. Abbiamo scoperto che l'introduzione delle mutazioni E241Q ed E241C rispettivamente ha migliorato la specificità dell'enzima di 71 e 17 volte a favore del substrato malil-P (Fig. 3a). Tuttavia, il cambiamento di specificità è stato determinato da una marcata diminuzione dell'attività verso il substrato naturale aspartil-P, piuttosto che da un aumento intrinseco dell'attività verso malil-P (Fig. 3b Tabella supplementare 6). Questo risultato ha mostrato da un lato che l'interazione elettrostatica tra il Glu241 caricato negativamente e il gruppo amminico caricato positivamente del substrato aspartilico-P naturale era un requisito importante per l'attività di tipo selvaggio di questo enzima. D'altra parte, è diventato chiaro che l'attività MSD in Ec-Asd non poteva essere aumentata in modo significativo semplicemente imponendo interazioni polari più favorevoli tra il gruppo α-idrossile di malil-P e residui di amminoacidi alternativi in ​​posizione 241. la regione del sito in una struttura modellata di un putativo derivato del substrato dell'emitioacetale MSA legato covalentemente a Cys135 nel mutante Ec-Asd E241Q (vedi Metodi) è mostrata in Fig. 3c. La figura evidenzia le interazioni elettrostatiche tra i residui nel sito attivo dell'enzima mutante e l'intermedio di reazione MSA legato covalentemente.

(un) Specificità (espressa come rapporto di attività massima su aspartil-P e malil-P) degli enzimi ASD wild-type e mutanti da E. coli (Ec), B. subtilis (Bs), e M. jannaschii (Mj). (B) Attività di questi enzimi su aspartil-P e malil-P. I risultati sono la media di almeno due esperimenti di replica biologica. Le barre di errore corrispondono alla deviazione standard della media. (C) Intermedio di reazione covalente tetraedrica putativo semialdeide malato semialdeide (MSA) attaccato a Cys135 nel sito attivo di un modello computerizzato di un mutante E241Q di E. coli complesso quaternario di aspartato semialdeide deidrogenasi (Ec-Asd) con coenzima NADP(H) non legato in modo covalente e fosfato inorganico (Pi). Gli atomi di carbonio nelle rappresentazioni in stick dei residui enzimatici, dell'intermedio della reazione MSA e del coenzima sono rispettivamente colorati in grigio, verde e ciano. Altri atomi sono mostrati in blu (azoto), rosso (ossigeno), giallo (zolfo) e arancione (fosforo). Le interazioni del legame idrogeno sono rappresentate come vettori lineari tratteggiati.

Nel tentativo di aumentare ulteriormente l'attività di defosforilazione riduttiva della malil-P, sono stati esaminati gli ortologhi della famiglia ASD dai rami Gram negativi e archeali e fungine filogenetici come piattaforme di ingegneria enzimatica alternative. Gli ASD di questi rami filogenetici si differenziano per la presenza di inserzioni e delezioni strutturali caratteristiche nella regione del sito di legame del coenzima e all'interfaccia della subunità dell'omodimero enzimatico. Sebbene esista un alto grado di conservazione dei gruppi funzionali residui amminoacidici all'interno del nucleo del sito attivo, le identità di sequenza condivise degli enzimi della famiglia ASD scendono fino al 10% (rif. 27). Questa variazione strutturale è strettamente correlata a marcate differenze nell'efficienza catalitica della fosforilazione ossidativa dell'ASA, che varia di due ordini di grandezza 28 . La variazione naturale nella struttura e nella sequenza offerta dai batteri Gram-positivi e archeale Gli ASD possono quindi fornire opportunità per modulare i tassi di reazione cinetica oltre all'introduzione di ulteriori mutazioni nel sito attivo dell'enzima.

Le attività di ASD wild-type e mutanti del batterio Gram-positivo Bacillus subtilis (Bs), che condivide il 26% di identità di sequenza con Ec-Asd, e il Archeon Methanocaldococcus jannaschii (Mj) che è il 21% identico a Ec-Asd, sono stati saggiati su aspartil-P e malil-P. Le attività enzimatiche di Bs-Asd e Mj-Asd wild-type su malyl-P erano circa tre volte inferiori a quelle osservate per Ec-Asd (Fig. 3b Tabella supplementare 6). Tuttavia, per analogia agli effetti osservati in Ec-Asd, la specificità di reazione di questi enzimi è significativamente migliorata a favore di malil-P quando i residui di glutammato del sito attivo conservato (Glu218 in Bs-Asd, Glu210 in Mj-Asd) sono mutati alla glutammina o alla cisteina. Il miglior risultato è stato ottenuto per l'enzima mutante Bs-Asd E218Q, che ha mostrato un'attività aumentata di quasi otto volte su malyl-P, e un Kgatto valore di 0,31 s −1 . Questo è paragonabile all'attività wild-type di Mj-Asd verso aspartil-P (Kgatto=0,38 s −1 ). È, tuttavia, molto inferiore a quello del wild-type Bs-Asd (Kgatto =14,5 s −1 ). Il meccanismo cineticamente efficiente dei siti alternati che opera nelle forme batteriche di ASD è assente in Mj-ASD e altri archeale DSA 28,29. Il confronto dei numeri relativi del turnover suggerisce che la conversione di malyl-P in MSA catalizzata dal mutante Bs-Asd E218Q può anche essere limitata in termini di velocità dalla comunicazione inter-subunità disaccoppiata. Tenendo conto della perdita di attività sul substrato naturale, la specificità di Bs-Asd E218Q è stata spostata di 650 volte verso malyl-P (Fig. 3a, b Tabella supplementare 6). Questa variante enzimatica è stata quindi scelta per l'integrazione nella costruzione della via DHB.

Ingegneria dell'attività della semialdeide reduttasi del malato

Avendo trovato l'omoserina deidrogenasi da Saccharomyces cerevisiae (Sc-Hom6) per essere inattivi su MSA, abbiamo cercato di identificare un modello enzimatico alternativo per l'ingegnerizzazione dell'attività MSR. Abbiamo esaminato sperimentalmente l'attività della MSA reduttasi nelle ossidoriduttasi che agiscono su substrati strutturalmente simili a MSA (Tabella supplementare 7). È stata rilevata un'attività significativa della MSA reduttasi per l'aldeide reduttasi ad ampio raggio, Ec-YqhD 30 , da E. coli, metilbutirraldeide reduttasi, Sc-Ypr1 (rif. 31), da S. cerevisiae, 4-idrossibutirrato deidrogenasi, Pg-4hbd 32,33 , da Porphyromonas gingivalis, e la semialdeide deidrogenasi succinica, Ms-Ssr 34 , da Metallosphaera sedula. Tra gli enzimi attivi su MSA, la semialdeide reduttasi succinica NADP+-dipendente da Metallosphaera sedula 34 (Ms-Ssr) ha mostrato la più alta attività specifica (4,0 μmol min -1 mg -1 ) e la migliore affinità (1,1 mM). Tuttavia, è Kgatto/Km il valore era 112 volte inferiore a quello dell'enzima di riferimento dell'omoserina deidrogenasi (Sc-Hom6) nella via naturale sull'aspartato semialdeide (Tabella supplementare 7 Nota supplementare 5). Pertanto, è stato utilizzato un approccio di modellazione molecolare comparativa basato sullo sfruttamento di caratteristiche strutturali e funzionali relazionali conservate per migliorare l'efficienza catalitica di Ms-Ssr verso MSA.

Ms-Ssr è un alcol deidrogenasi zinco-dipendente 34 appartenente alla superfamiglia deidrogenasi/reduttasi a catena media (MDR) alcol deidrogenasi (ADH) 35 . Un modello molecolare del dimero Ms-Ssr in un complesso ternario con NADP + e (L)-2,4-diidrossibutirrato (DHB) è stato costruito utilizzando i dati delle coordinate atomiche da strutture di alcol deidrogenasi determinate sperimentalmente (vedi Metodi). Le interazioni di legame dell'anione alcolato DHB coordinato dallo zinco nella regione del sito attivo sono mostrate in Fig. 4a. I principali contatti dei gruppi DHB α-carbossile e 2-idrossile nel modello sono con i residui Gln108 e Asn305. La presenza di ingombranti catene laterali Phe85 e Leu281 che rivestono la tasca di legame del substrato suggerisce che l'enzima Ms-Ssr ha una preferenza intrinseca per i substrati alcolici primari (non ramificati). L'analisi strutturale ha inoltre rivelato che l'enzima utilizza una via di trasmissione protonica che è diversa dalla via archetipica presente nella maggior parte degli enzimi della famiglia dell'ADH e che è considerata meno efficiente 35,36,37 (Fig. 4b). L'ingegnerizzazione di un sistema di relè protonico simile all'ADH1E in Ms-Ssr, comprendente un'istidina in posizione 43 e un'arginina in posizione 39, è stata quindi considerata un mezzo promettente per migliorare direttamente l'attività catalitica di Ms-Ssr.

(un) Regione del sito attivo in un complesso modellato di ione alcolato legato allo zinco dell'acido 2,4-diidrossibutirrico (DHB) con M. sedula semialdeide reduttasi succinica (Ms-Ssr) e NADP + coenzima. Gli atomi di carbonio nelle rappresentazioni in stick di residui enzimatici, DHB e coenzima sono rispettivamente colorati in grigio, verde e ciano. Gli altri atomi sono colorati in base al tipo di elemento: azoto, ossigeno blu, zolfo rosso, fosforo giallo arancione. Le linee tratteggiate indicano le interazioni del legame idrogeno. Lo ione Zn 2+ è mostrato come una sfera che riempie lo spazio in grigio. (B) Sistemi alternativi di relè protonico operanti negli omologhi dell'alcol deidrogenasi del fegato di cavallo (ADH1) e degli enzimi Ms-Ssr. L'overlay mostra le posizioni dei residui topologicamente equivalenti nel complesso modellato di Ms-Ssr e lo ione alcolato DHB legato allo zinco (atomi di carbonio di colore grigio) e la struttura cristallina a raggi X del complesso ternario mutante ADH1 F93W del fegato di cavallo (codice PDB 1axe) con NAD+ e inibitore del trifluoroetanolo (ETF) (atomi di carbonio in verde). Le navette dei relè protonici nei due enzimi sono rappresentate come vettori di collegamento interatomici a linee tratteggiate di colore grigio e verde corrispondentemente. Gli altri atomi sono colorati in base al tipo di elemento come in (un), con atomi di fluoro in ETF inoltre mostrati in viola.Il relè protonico wild-type Ms-Ssr può essere scambiato con l'archetipo della navetta ADH1 nel doppio mutante Ms-Ssr H39R:N43H. (C) Parametri cinetici per mutanti Ms-Ssr su semialdeide succinica (SSA) e malica (MSA). I risultati sono la media di almeno tre esperimenti replicati. Le barre di errore corrispondono al s.d.

Il doppio mutante Ms-Ssr H39R: N43H ha mostrato un'efficienza catalitica aumentata di circa quattro volte su MSA rispetto all'enzima wild-type, ma ha comunque mantenuto una forte preferenza per SSA rispetto a MSA (Fig. 4c, Tabella supplementare 8). Tuttavia, SSA è prodotto in E. coli solo in condizioni di stress acido estremo, e il suo apporto può essere interrotto eliminando sia il glutammato decarbossilasi GadA che GadB 38 . Pertanto, la potenziale competizione tra SSA e MSA non è stata considerata un impedimento significativo alla biosintesi efficiente di DHB e l'enzima Ms-Ssr H39R:N43H è stato quindi scelto per l'incorporazione nella via DHB.

L'ingegneria metabolica minima consente la biosintesi di DHB

Per assicurare l'espressione funzionale della via DHB, abbiamo assemblato un operone sintetico nel plasmide pACT3 con numero medio di copie 39, che esprimeva i tre geni che codificano per i migliori enzimi della via DHB (MK: Ec-LysC V115A: E119S: E250K: E434V, MSD: Bs-Asd E218Q, MSR: Ms-Ssr H39R:N43H) sotto il controllo del promotore tac inducibile. Il plasmide pDHB risultante è stato trasformato nel wild-type E. coli MG1655 e ha prodotto 60 mg l -1 DHB dopo 24 ore di coltivazione in beuta in mezzo minerale di glucosio. Il ceppo di controllo wild-type che esprimeva i corrispondenti enzimi della via dell'omoserina (AK resistente alla lisina: LysC E250K, ASD: Ec-Asd, HSD: Sc-Hom6) non ha prodotto quantità rilevabili di DHB (Fig. 5 Tabella supplementare 9). Questi risultati hanno indicato che è possibile ottenere la produzione cellulare di DHB attraverso la via sintetica e abbiamo deciso di aumentare la produzione di DHB mediante l'ingegneria metabolica del ceppo ospite e l'ottimizzazione del sistema di espressione.

Le cellule sono state coltivate in beute su terreno minerale contenente 20 g per l di glucosio. I valori corrispondono alle concentrazioni dopo 24 h di coltivazione. Le barre di errore rappresentano STDV da almeno due esperimenti replicati. Tutti i ceppi sono derivati ​​da E. coli K-12 substr. MG1655. Tutti i plasmidi sono stati derivati ​​dal plasmide del numero medio di copie pACT3. pHOM esprime i geni che codificano per gli enzimi della via omoserina AK: Ec-LysC E250K, ASD: Ec-Asd, HSD: Sc-Hom6. pDHB esprime i geni che codificano per gli enzimi della via DHB MK: Ec-LysC V115A:E119S:E250K:E434V, MSD: Bs-Asd E218Q, MSR: Ms-Ssr H39R:N43H. pDHB-ppc* esprime inoltre il mutante carbossilasi PEP insensibile al malato PpcK620S. pDHBopt-ppc* ha ottimizzato i siti di legame del ribosoma davanti a ciascun gene della via DHB. pDHBopt-ppc*(Ec-asd*) e pDHBopt-ppc*(Mj-asd*) esprimono, rispettivamente, l'Ec-AsdE241Q o Mj-AsdE210Q enzimi mutanti invece di Bs-AsdE218Q.

Il ceppo produttore di DHB ha accumulato il 50% in più di acetato rispetto al ceppo di controllo (Fig. 5). Pertanto, abbiamo prima testato se la produzione di DHB potesse essere aumentata inattivando la piruvato ossidasi (PoxB) 40 o le vie dell'acetato 41 dipendenti da acetato chinasi/fosfato acetiltransferasi (AckA-Pta). La cancellazione di vaiolo e ackA-pta da solo o in combinazione ha ridotto significativamente la produzione di acetato (Fig. 5). La produzione di DHB dopo 24 h è aumentata a 0,3 g l -1 e 0,4 g l -1 nella ackA-pta e vaiolo mutanti, rispettivamente. La delezione di entrambi i percorsi dell'acetato non ha migliorato ulteriormente le prestazioni del ceppo e ha prodotto 0,27 g l -1 DHB (Fig. 5, Tabella supplementare 9). Inoltre, la conversione del malato in DHB per via sintetica riduce la rigenerazione dell'ossalacetato attraverso il ciclo di Krebs. Il conseguente squilibrio tra ossalacetato e produzione di acetil-CoA potrebbe quindi aver portato alla conversione dell'acetil-CoA in eccesso in acetato. Per aumentare la disponibilità di ossalacetato, abbiamo sovraespresso l'enzima anaplerotico fosfoenolpiruvato carbossilasi (Ppc). Per prevenire l'inibizione dell'attività di Ppc da parte dell'aspartato o del malato 42, abbiamo impiegato il mutante Ppc K620S che è insensibile all'inibizione del feedback da parte dei due composti 43 e abbiamo clonato il gene corrispondente nell'operone DHB risultando nel plasmide pDHB-ppc*. Quando questo plasmide è stato espresso in un ceppo wild-type, è stato prodotto 1l di DHB dopo 24 ore di coltivazione ed erano rilevabili solo tracce di acetato (Fig. 5). Questo risultato rafforza l'idea che uno squilibrio stechiometrico tra la produzione di ossalacetato e acetil-CoA fosse effettivamente la causa principale dell'aumento della produzione di acetato nelle cellule che esprimono il plasmide pDHB.

Per migliorare l'espressione degli enzimi della via DHB, sono stati ottimizzati i singoli siti di legame dei ribosomi (RBS)44. L'operone con sequenze RBS ottimizzate è stato assemblato mediante fusione PCR e clonato a valle del ppcK620S gene il cui RBS non è stato modificato poiché la moderata sovraespressione di Ppc è stata precedentemente segnalata come più vantaggiosa per la produzione di acidi C4 derivati ​​dal ciclo di Krebs rispetto alla massimizzazione dell'attività di Ppc 45,46,47. Quando il pDHB . ottimizzatooptare-ppc* plasmide è stato espresso in un ceppo wild-type, abbiamo osservato l'accumulo di 1,8 g l -1 DHB dopo 24 ore di coltivazione, corrispondente a una resa molare di 0,15 (Fig. 5 Tabella supplementare 9). Questo miglioramento quasi doppio può essere attribuito a un aumento significativo delle attività MK e MSD, mentre le attività di Ppc e MSA reduttasi sono rimaste quasi invariate all'espressione del nuovo plasmide (Tabella supplementare 10). L'espressione del plasmide ottimizzato nei mutanti della via dell'acetato non ha aumentato ulteriormente la produzione di DHB (Tabella supplementare 9), in accordo con l'assenza di accumulo di acetato nei ceppi che producono DHB. Inoltre, la sintesi di DHB è scesa a ∼ 0,7 g l -1 quando Mj-Asd E210Q o Ec-Asd E241Q sono stati applicati come enzima MSD, indicando che il superiore in vitro le prestazioni di Bs-Asd E218Q si traducono anche nella migliore produzione di DHB cellulare (Fig. 5). Presi insieme i nostri risultati mostrano che la sovraespressione dell'attività anaplerotica di Ppc è un fattore chiave nell'abilitare la produzione cellulare di DHB e che aumentare l'attività MSD appena misurabile è un requisito importante per l'ulteriore miglioramento dei livelli di produzione di DHB.


I mitocondri ossidano i substrati per generare l'ATP che alimenta la contrazione muscolare e la locomozione. Questa recensione si concentra su tre passaggi nella fosforilazione ossidativa che hanno ruoli indipendenti nell'impostazione del flusso complessivo di ATP mitocondriale e quindi hanno un impatto diretto sulla locomozione. Il primo è la catena di trasporto degli elettroni, che determina il ritmo dell'ossidazione. Nuovi studi indicano che la capacità della catena di trasporto degli elettroni per mitocondri diminuisce con l'età e la malattia, ma può essere ripristinata con trattamenti sia acuti che cronici. La conseguente maggiore produzione di ATP si riflette in una migliore produzione di potenza muscolare e prestazioni locomotorie. Il secondo passo è l'accoppiamento della fornitura di ATP da O2 uptake (efficienza di accoppiamento mitocondriale). I trattamenti che elevano l'accoppiamento mitocondriale aumentano sia l'efficienza dell'esercizio che la capacità di esercizio prolungato sia nei muscoli giovani che in quelli anziani. Il passo finale è la stessa sintesi dell'ATP, che è sotto controllo dinamico in più siti per fornire la gamma di 50 volte del flusso di ATP tra il muscolo a riposo e l'esercizio alla capacità mitocondriale. Pertanto, la malleabilità nei siti di questi sottosistemi di fosforilazione ossidativa ha un impatto sul flusso di ATP, con effetti diretti sulla prestazione fisica. Stanno emergendo interventi che mirano a questi tre sottosistemi indipendenti per fornire molti percorsi per migliorare il flusso di ATP ed elevare le prestazioni muscolari perse a causa dell'inattività, dell'età o della malattia.

I mitocondri sono le centrali elettriche dei tessuti biologici. Nei muscoli, collegano l'ossidazione dei substrati alla fosforilazione che genera ATP. Le fibre contrattili utilizzano quindi l'ATP per generare forza e movimento. Il ruolo dei mitocondri come pozzo terminale per O2 nell'apparato respiratorio che fissa il limite alla massima O2 l'assorbimento a livello muscolare è ben consolidato (Weibel et al., 1991). È anche chiaro un percorso causale che collega questa ossidazione alla fosforilazione che genera ATP per alimentare la produzione di forza muscolare e le prestazioni dell'esercizio. Tuttavia, meno chiaro è il ruolo diretto che i mitocondri svolgono nel fissare i limiti alla prestazione fisica. Alcuni studi hanno effettuato questa connessione in soggetti umani utilizzando esperimenti di allenamento all'esercizio, che sono ben noti per aumentare la capacità di fornitura di ATP (Jubrias et al., 2001) e la densità del volume mitocondriale (Hoppeler et al., 1985). Questi studi dimostrano che un aumento diretto delle prestazioni muscolari deriva dalla maggiore capacità di apporto energetico dopo l'allenamento di resistenza. Quindi i mitocondri forniscono il ponte tra i percorsi che forniscono ossigeno e la sintesi di ATP che alimenta la contrazione muscolare e le prestazioni fisiche.

Un percorso per aumentare l'apporto di ATP per aumentare le prestazioni dell'esercizio è aumentare il contenuto mitocondriale del muscolo, come si trova tipicamente nell'allenamento di resistenza di soggetti giovani (Hoppeler et al., 1985). Un secondo percorso consiste nel migliorare la capacità di generazione di ATP per mitocondrio mirando ai processi alla base della fornitura di ATP. Uno di questi meccanismi è l'accoppiamento dell'ossidazione alla fosforilazione (efficienza di accoppiamento mitocondriale), che può essere migliorata per elevare la generazione di ATP per O2 assorbimento. Un esempio di questo miglioramento è l'effetto acuto del nitrato alimentare sull'efficienza dell'accoppiamento mitocondriale, con effetti diretti sull'efficienza dell'esercizio nell'uomo (Jones, 2014 Larsen et al., 2007). Il nitrato libero viene rilasciato nella cellula muscolare bevendo succo di barbabietola e agisce attraverso la via del protossido di azoto per elevare la sintesi mitocondriale di ATP per O2 assorbimento (spesso espresso diviso per 2 per ottenere il termine biochimico di P/O). Dopo aver bevuto succo di barbabietola, i soggetti umani che mostravano il maggiore aumento di P/O avevano un'efficienza dell'esercizio corrispondentemente elevata (potenza delle gambe per O2 captazione) su un cicloergometro (Larsen et al., 2007). Questo legame tra efficienza mitocondriale ed esercizio fisico è la risposta prevista basata sulla connessione termodinamica tra questi processi (Whipp e Wasserman, 1969). Pertanto è possibile regolare i processi sottostanti nella fosforilazione ossidativa per migliorare le prestazioni dell'esercizio.

Un secondo esempio della malleabilità della fosforilazione ossidativa deriva dal rapido effetto di un antiossidante mirato al mitocondrio, SS-31, sulla capacità dei mitocondri di generare ATP. Un'infusione di SS-31 di 1 ora in topi anziani ha aumentato la P/O del 50% ma ha raddoppiato la capacità di fosforilazione (ATPmax) in vivo nei muscoli degli arti posteriori (Siegel et al., 2013). Questo aumento maggiore di ATPmax che in P/O implica non solo un miglioramento dell'efficienza di accoppiamento mitocondriale, ma anche un rapido aumento della capacità di flusso della catena di trasporto degli elettroni (ETC) (O2 capacità di assorbimento). Si pensa che il meccanismo per questo aumento della capacità di flusso dell'ETC sia la stabilizzazione della cardiolipina sulla membrana mitocondriale interna, ripristinando così un ponte chiave nel flusso di elettroni attraverso l'ETC (Birk et al., 2014 Szeto, 2014). Questi trattamenti dimostrano che ci sono molti siti nella fosforilazione ossidativa che sono potenziali bersagli per il trattamento per migliorare la funzione mitocondriale. Ciò che è notevole del succo di barbabietola e dell'SS-31 è la loro velocità di azione nell'aumentare la capacità di fornitura di ATP e le prestazioni durante l'esercizio (1 h!). Al contrario, sono necessari molti mesi di esercizio fisico per raggiungere lo stesso obiettivo (Jubrias et al., 2001). Pertanto, più siti nella fosforilazione ossidativa hanno il potenziale per elevare l'apporto energetico e le prestazioni di esercizio - molto rapidamente con alcuni trattamenti - senza aumentare il pool mitocondriale.

In questa recensione valuto i tre passaggi principali nella fosforilazione ossidativa per la malleabilità (Fig. 1) (Nicholls e Ferguson, 2002) che possono migliorare le prestazioni dell'esercizio. Il primo passo è l'ETC, che ossida NADH per pompare H + per generare una forza motrice protonica attraverso la membrana mitocondriale interna. Il secondo passaggio utilizza la forza motrice del protone per guidare la fosforilazione tramite F1F0-ATP sintasi. Il terzo passaggio prevede il cortocircuito del gradiente H + attraverso una serie di processi che perdono H + attraverso la membrana mitocondriale interna, aggirando così la fosforilazione. Il mio obiettivo è valutare come ogni passaggio contribuisce alla produzione di ATP e quindi ha un impatto sulla prestazione fisica. L'interessante implicazione di queste intuizioni è che i mitocondri hanno più siti di malleabilità che forniscono obiettivi per l'ottimizzazione della funzione per migliorare il flusso di ATP ed elevare le prestazioni dell'esercizio muscolare sia negli stati sani che in quelli malati.


Materiali e metodi

Linee cellulari e condizioni di coltura

Le cellule epiteliali del rene di topo di bambino immortalato (iBMK) sono state generate come descritto in precedenza (Degenhardt et al, 2002). In breve, le cellule epiteliali renali primarie di topi con doppio deficit di Bax e Bak (Bax -/- /Bak -/-) sono state immortalate da E1A e dall'espressione di p53 dominante-negativa ( Degenhardt et al, 2002 Matteo et al, 2008). Cellule iBMK che esprimono l'oncogenico umano H-Ras V12G o mio-Akt sono stati derivati ​​mediante elettroporazione con pcDNA1.H-Ras V12G ( Lin et al, 1995) o pcDNA3.mio-Akt ( Plas et al, 2001), rispettivamente, seguito dalla selezione della zeocina. Le linee cellulari risultanti sono state coltivate in terreno aquila modificato di Dulbecco (DMEM) senza piruvato (Cellgro), integrato con siero bovino fetale dializzato al 10% (HyClone) in tutti gli esperimenti di metabolomica. Per esperimenti di normossia, le cellule vengono coltivate in un incubatore contenente il 5% di CO2 e ossigeno ambiente a 37°C. Per gli esperimenti di ipossia, le cellule vengono coltivate e tutti gli esperimenti vengono completati all'interno di un vano portaoggetti per ipossia (Coy Lab) contenente l'1% di ossigeno e il 5% di CO2 a 37°C. Per gli esperimenti di etichettatura, il terreno è stato preparato da DMEM senza glucosio o glutammina (Cellgro), con l'aggiunta della forma isotopica desiderata di glucosio e/o glutammina ad una concentrazione finale di 4,5 g/l di glucosio e 0,584 g/l di glutammina. Esperimenti a breve termine (ad esempio, assorbimento di nutrienti e profili di flusso cinetico) sono stati condotti a una confluenza del 70-80% per esperimenti di etichettatura a lungo termine, la confluenza variava man mano che le cellule si moltiplicavano.

Misure del tasso di cambio

I campioni di media sono stati raccolti in vari momenti. Glucosio, glutammina e lattato sono stati misurati mediante analisi enzimatica con rilevamento elettrochimico su uno strumento YSI7200 (YSI, Yellow Springs, OH). Alanina e piruvato sono stati misurati mediante LC-MS. Il consumo di ossigeno è stato misurato utilizzando un analizzatore di flusso Seahorse XF24 (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA). Per misurare l'assorbimento di ossigeno nell'ipossia, lo strumento Seahorse è stato posizionato nella camera dell'ipossia con l'1% di ossigeno. Per sondare la frazione del consumo di ossigeno, che è effettivamente accoppiata con la catena di trasporto degli elettroni, abbiamo misurato il tasso di consumo di ossigeno quando le cellule sono state trattate con un inibitore della catena di trasporto degli elettroni, l'antimicina A. Abbiamo osservato che ∼ 80% del consumo di ossigeno in tutta la linee cellulari e condizioni di crescita sono state utilizzate per la fosforilazione ossidativa.

Esperimenti metabolomici e analisi LC-MS

Per tutti gli esperimenti metabolomici e con traccianti isotopici, il metabolismo è stato spento e i metaboliti sono stati estratti aspirando rapidamente il mezzo e aggiungendo immediatamente una soluzione di estrazione 80:20 metanolo:acqua a -80°C.

I campioni sono stati analizzati utilizzando più sistemi LC-MS (ciascuno di Thermo Scientific e alimentato da ionizzazione elettrospray), come descritto in precedenza ( Munger et al, 2008 Limoni et al, 2010 Lu et al, 2010). In breve, uno spettrometro di massa orbitrap autonomo (Exactive) operante in modalità ioni negativi è stato accoppiato alla cromatografia ad accoppiamento ionico in fase inversa e utilizzato per scansionare da m/z 85–1000 a 1 Hz e risoluzione 100.000, uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo TSQ Quantum Ultra operante in modalità ioni positivi è stato accoppiato a una cromatografia di interazione idrofila su una colonna di aminopropile e utilizzato per analizzare composti selezionati mediante monitoraggio di reazioni multiple e un TSQ Quantum Discovery Lo spettrometro di massa a triplo quadrupolo operante in modalità a ioni negativi è stato accoppiato alla cromatografia ad accoppiamento ionico a fase inversa e utilizzato per analizzare composti selezionati mediante il monitoraggio di reazioni multiple. I dati sono stati analizzati utilizzando la suite software MAVEN (Melamud et al, 2010). I risultati sono aggiustati per l'abbondanza naturale di 13 C e l'impurità di arricchimento del substrato etichettato fornito alle cellule.

I livelli assoluti dei metaboliti sono stati quantificati come descritto in precedenza ( Bennett et al, 2008) e normalizzato dal volume di cellule impaccate.

Di nuovo tasso di sintesi della serina

Per quantificare la velocità di sintesi della serina, le cellule sono state coltivate in terreni DMEM contenenti U-13 C-serina. Il pattern di etichettatura allo stato stazionario di 3-fosfoglicerato intracellulare, serina e glicina è stato misurato estraendo i metaboliti dopo aver lavato tre volte con PBS ghiacciato. Il 3-fosfoglicerato marcato non è mai stato osservato, confermando che il flusso della via di sintesi della serina inversa è trascurabile. La glicina è stata osservata in due forme: senza etichetta e M+2 (le cui frazioni relative sono indicate come G0 e G2 sotto). La serina è stata osservata in quattro forme: senza etichetta, M+1, M+2 e M+3, con frazioni S0, S1, S2, S3, rispettivamente. Queste forme sorgono tramite de novo sintesi da 3-fosfoglicerato (rendendo non etichettato tramite F1, vedere Figura 9 supplementare), assorbimento dai media (rendendo M + 3 tramite F2) e flusso inverso di SHMT dalla glicina (rendendo tutte le forme possibili, a seconda dell'etichettatura della glicina e del metilene -THF gruppo metilico, via F3). La frazione di metilene-THF con l'unità reattiva a un carbonio non etichettata è indicata con T0 e quello etichettato sull'unità a un carbonio è indicato con T1. Abbiamo anche misurato il flusso netto di assorbimento della serina F2 monitorando la variazione della concentrazione di serina nei media.

In condizioni stazionarie isotopiche, le equazioni di bilancio per le quattro forme di etichettatura della serina possono essere formulate come segue:


Risultati

Alla scoperta del motivoADE. L'identificazione sistematica dei fattori di trascrizione coinvolti nei processi biologici nei mammiferi rimane un problema largamente irrisolto (17). Un approccio promettente mette in relazione i profili di espressione dell'intero genoma con le sequenze del promotore per scoprire influenti cis motivi (18�). Tali metodi hanno prodotto risultati impressionanti in organismi semplici come il lievito, ma è stato difficile estendere questi algoritmi ai genomi dei mammiferi, dove le regioni intergeniche sono grandi, l'annotazione della struttura del gene è imperfetta e la sequenza del DNA può essere altamente ripetitiva.La maggior parte di questi metodi ricerca motivi per confronto con un modello di fondo fisso di composizione nucleotidica (che non riesce a rappresentare le fluttuazioni osservate in grandi genomi) o per confronto tra due serie di geni (che probabilmente catturerà solo differenze molto nette). Inoltre, molti di questi metodi presuppongono che i dati dell'espressione siano distribuiti normalmente, il che potrebbe non essere sempre vero.

Per superare alcuni di questi ostacoli, abbiamo ideato una strategia semplice e non parametrica per l'identificazione del motivoADE ( Fig. 1UN ). L'algoritmo prevede tre passaggi: (io) classifica dei geni in base all'espressione differenziale tra due condizioni (ii) dato un motivo candidato, identificando il sottoinsieme di geni le cui regioni promotrici contengono il motivo e (iii) testare mediante una statistica di somma dei ranghi non parametrica se questi geni tendono ad apparire verso la parte superiore o inferiore della lista classificata (che indica l'associazione) o se sono distribuiti casualmente nella lista. reasonADE può essere applicato a uno specifico motivo candidato di interesse o all'elenco di tutti i possibili motivi di una data dimensione (nel qual caso il livello di significatività dovrebbe essere aggiustato per riflettere più test di ipotesi). Utilizzando una procedura di punteggio non parametrico, non facciamo ipotesi sulla distribuzione dei dati dell'espressione. Inoltre, considerando l'intero elenco in ordine di rango, i promotori senza il motivo forniscono implicitamente uno sfondo della composizione del DNA per il confronto e non è necessario delimitare o raggruppare un gruppo di geni come “responsive.” Il metodo può operare su un database di promotori tradizionale o anche su un database di promotori che sono stati mascherati in base alla conservazione evolutiva.

Panoramica schematica di reasonADE e applicazione al corso temporale PGC-1α. (UN) La strategia MotiveADE. Inizia con un elenco di geni ordinati sulla base dell'espressione differenziale tra due condizioni. Ogni gene viene quindi annotato per la presenza di un determinato motivo nella regione del promotore. Una statistica non parametrica viene utilizzata per valutare se i geni con il motivo tendono a posizionarsi in alto in questo elenco. In questo esempio, i geni con Motivo 1 sono distribuiti casualmente nell'elenco, mentre i geni con Motivo 2 tendono a posizionarsi in alto, suggerendo un'associazione tra Motivo 2 e l'espressione differenziale. (B) Le cellule C2C12 sono state infettate con un adenovirus che esprime GFP (controllo) o con PGC-1α e sono state profilate per un periodo di 3 giorni. Gli esperimenti sono stati eseguiti in duplicato e sono mostrate le relative misure di espressione genica. I geni sono classificati in base alla differenza di espressione tra PGC-1α e GFP al giorno 3. Geni di topo che hanno un motivo Errα perfetto (5′-TGACCTTG-3′), un motivo Gabpa/b perfetto (5& #x02032-CTTCCG-3′), o entrambi i motivi sono etichettati con una barra nera sul lato destro del correlogramma.

I siti di legame per Errα e Gabpa sono i motivi con il punteggio più alto associati al programma di trascrizione PGC-1α. Per identificare i motivi correlati all'azione di PGC-1α, abbiamo infettato cellule muscolari C2C12 di topo con un adenovirus che esprime PGC-1α e ottenuto profili di espressione genica per 12.488 geni a 0, 1, 2 e 3 giorni dopo l'infezione. Abbiamo trovato 649 geni che sono stati indotti almeno 1,5 volte (nominale P < 0,05) al giorno 3. Come previsto, questi geni sono stati arricchiti per i geni coinvolti nel metabolismo dei carboidrati e nel mitocondrio (1). È interessante notare che vengono indotti anche molti geni coinvolti nella sintesi proteica (termini di ontologia genica: biosintesi proteica, ribosoma mitocondriale e ribosoma).

Abbiamo quindi applicato reasonADE per studiare i 5.034 geni di topo per i quali disponiamo di misure di espressione genica, nonché annotazioni affidabili del TSS. Per ogni gene, la regione bersaglio è stata definita come una regione di 2 kb centrata sul TSS. Abbiamo quindi testato tutto il possibile K-meri di dimensioni variabili da K = 6 a K = 9 nucleotidi per l'associazione con l'espressione differenziale in ciascuno dei 3 giorni del decorso temporale. Un totale di 20 motivi ha raggiunto un'elevata significatività statistica (P < 0.001, dopo la correzione di Bonferroni per la verifica di ipotesi multiple) e questi erano quasi esclusivamente correlati a due motivi distinti (Tabella 1 e Tabella 2, che è pubblicata come informazione di supporto sul sito web del PNAS). Il primo motivo, 5′-TGACCTTG-3′ è stato significativo nei giorni 1, 2 e 3 (aggiustato P = 2.1 × 10 -6 ,2.9 × 10 -9 e 7.7 × 10 -7 , rispettivamente). Corrisponde al sito di legame pubblicato per il recettore nucleare orfano Errα (22), che è noto per essere in grado di essere coattivato da PGC-1α e -1β (23�). Il ErrÈ noto che il gene α è coinvolto nei processi metabolici, sulla base di studi che dimostrano che i topi knockout hanno ridotto il peso corporeo e il tessuto adiposo periferico, nonché un'espressione alterata dei geni coinvolti nelle vie metaboliche (26). Il secondo motivo è 5′-CTTCCG-3′ (aggiustato P = 8.9 × 10 -9 ), che è il motivo con il punteggio più alto il giorno 3. Corrisponde al sito di legame pubblicato per Gabpa (27), che si complessa con Gabpb (15) per formare l'eterodimero, fattore respiratorio nucleare- 2 (NRF-2), un fattore noto per regolare l'espressione di alcuni geni OXPHOS (28). È interessante notare che anche i complementi inversi di questi motivi non hanno segnato altrettanto, suggerendo una preferenza per l'orientamento di questi motivi, e alcune occorrenze dei motivi sono state trovate a valle del TSS. Considerando che ciascuno di questi motivi è associato individualmente con PGC-1α, le nostre analisi suggeriscono che un gene che ha entrambi i motivi si colloca tipicamente più in alto nell'elenco dei geni differenzialmente espressi rispetto ai geni con uno solo dei motivi (Fig. 6, che è pubblicato come informazioni di supporto sul sito web del PNAS), suggerendo che i due motivi potrebbero avere un effetto additivo o sinergico.

Tabella 1.

Giorno Motivo Frequenza Nominale P valore Aggiustato P valore Annotazione Rif.
1 TGACCTTG 0.07 3.15 × 10 -11 2.06 × 10 -6 Errα 22
TGACCTTGA 0.02 4.59 × 10 -10 1.20 × 10 -4 Errα
2 TGACCTTG 0.07 4.44 × 10 -14 2.91 × 10 -9 Errα 22
TGACCTT 0.16 3.62 × 10 -12 5.93 × 10 -8 Errα
TGACCT 0.45 1.46 × 10 -11 5.97 × 10 -8 NR semi-sito 34
GACCTTG 0.16 7.92 × 10 -11 1.30 × 10 -6 Errα
GACCTT 0.41 1.42 × 10 -9 5.81 × 10 -6 Errα
TTGACC 0.27 2.42 × 10 -7 9.92 × 10 -4 Errα
3 CTTCCG 0.33 2.19 × 10 -12 8.97 × 10 -9 Gabpa 35
TGACCTTG 0.07 1.17 × 10 -11 7.66 × 10 -7 Errα 22
TGACCTT 0.16 1.23 × 10 -10 2.02 × 10 -6 Errα
CCCGCC 0.54 2.04 × 10 -8 8.36 × 10 -5
GCGGCG 0.43 3.78 × 10 -8 1.55 × 10 -4
AGGTCA 0.42 3.90 × 10 -8 1.60 × 10 -4 NR semi-sito 34
CTTCCGG 0.16 1.95 × 10 -8 3.19 × 10 -4 Gabpa
TTCCGG 0.31 1.09 × 10 -7 4.46 × 10 -4 Gabpa
GGGGCG 0.54 1.24 × 10 -7 5.08 × 10 -4
TTCCGCT 0.07 3.30 × 10 -6 5.41 × 10 -4 Gabpa
GCCGGC 0.42 1.57 × 10 -7 6.44 × 10 -4
ACTTCCG 0.09 5.11 × 10 -8 8.38 × 10 -4 Gabpa

motiFADE è stato eseguito utilizzando il database del promotore del mouse in ciascuno dei giorni 1, 2 e 3. Tutti i motivi hanno ottenuto una correzione Bonferroni P viene visualizzato il valore < 1 × 10 -3. Sono indicate le annotazioni del motivo e i riferimenti bibliografici, quando disponibili. NR, recettore nucleare.

I motivi Errα e Gabpa sono conservati in modo evolutivo e arricchiti a monte dei geni OXPHOS. Abbiamo poi ripetuto l'analisi di reasonADE utilizzando un database di promotori “masked” (Tabella 3, che è pubblicata come informazioni di supporto sul sito Web PNAS). Abbiamo ancora considerato le 2.000 coppie di basi centrate sul TSS, ma abbiamo considerato solo quei nucleotidi allineati e conservati tra topo e uomo. Tuttavia, i motivi principali nei giorni 1 e 3 erano correlati a Errα (aggiustato P = 4.8 × 10 -6 , P = 1.2 × 10 -11 , rispettivamente) e a Gabpa (giorno 3 P = 3.1 × 10 -11 ), fornendo ulteriore supporto che questi motivi sono biologicamente rilevanti.

I motivi Errα e Gabpa sono particolarmente arricchiti a monte di un sottoinsieme coregolato di geni OXPHOS, che mostrano una ridotta espressione nel diabete umano (5, 6). Mentre il motivo Errα con il punteggio più alto (5′-TGACCTTG-3′ o il suo complemento inverso) si verifica solo nel 12% dei promotori nel database, nel 29% dei geni responsivi alla PGC (cioè quei geni indotti almeno 1,5 volte il giorno 3), e nel 27% dei geni mitocondriali, si trovano nel 52% del sottoinsieme coregolato dei geni OXPHOS (significato dell'arricchimento, P = 1 × 10 -4 ). Circa la metà di questi siti sono perfettamente conservati nella regione sintenica nell'uomo (dati non mostrati). I siti di legame Gabpa con il punteggio più alto (5′-CTTCCG-3′ o il suo complemento inverso) sono molto più comuni (62% di tutti i promotori del database e nel 79% dei geni PGC-responsive), tuttavia, anch'essi mostrano un significativo arricchimento nel sottoinsieme coregolato dei geni OXPHOS (89%, P = 0.02).

Errα e Gabpa sono essi stessi indotti da PGC-1α. I risultati di cui sopra suggeriscono che Errα e Gabpa possono essere i fattori trascrizionali chiave che mediano l'azione di PGC-1α nel muscolo. A questo proposito, è da notare che in base ai dati del microarray, sia Errα che Gabpa sono essi stessi indotti 𢒂 volte (P < 0,01) il giorno 1 dopo l'espressione di PGC-1α, che è coerente con studi precedenti (2, 23). Inoltre, un'attenta analisi della Errα e Gabpa i geni suggeriscono che ciascuno contenga potenziali siti di legame per entrambi i fattori di trascrizione nelle vicinanze dei loro promotori. Il ErrIl gene α ha il motivo Errα, così come una variante conservata del sito Gabpa-binding (27) a monte del TSS, mentre il gene Gabpa gene ha un sito Errα a monte del TSS e una variante conservata del sito di legame Gabpa nel suo primo introne. Questi risultati sollevano la possibilità che Errα e Gabpa possano regolare la propria espressione e quella reciproca.

Un interruttore trascrizionale che guida la biogenesi mitocondriale. Nel loro insieme, l'analisi sistematica del programma trascrizionale guidato da PGC-1α nel muscolo scheletrico suggerisce un modello (Fig. 2) in cui l'aumento dei livelli di proteina PGC-1α determina un aumento dell'attività trascrizionale di Gabpa e Errα sui propri promotori, determinando un aumento stabile dell'espressione di questi due fattori mediante un doppio loop di feedback positivo. Questi due fattori, forse in combinazione con PGC-1α, sono quindi cruciali nell'induzione di geni bersaglio a valle, molti dei quali hanno siti di legame per questi motivi (Fig. 2). Tale circuito può fungere da interruttore regolatorio, analogo a un circuito feed-forward che svolge un ruolo chiave nelle prime fasi dello sviluppo endomesodermico nel riccio di mare (29).

Modello proposto del meccanismo d'azione di PGC-1α. PGC-1α è un gene altamente regolato che risponde a stimoli esterni, ad esempio, ridotto nel diabete e aumentato dopo l'esercizio. Quando i livelli di PGC-1α aumentano, l'espressione di Errα e Gabpa viene immediatamente indotta mediante un doppio loop di feedback positivo. Questi livelli aumentano e nel corso di 2𠄳 giorni, questi fattori si accoppiano con PGC-1α per indurre l'espressione di NRF-1 e centinaia di bersagli a valle, come OXPHOS e altri geni mitocondriali che sono arricchiti per questi trascrizione siti vincolanti per i fattori.

Validazione Sperimentale del Modello. Abbiamo testato sperimentalmente questo modello di regolazione genica. Per determinare se Errα e Gabpa sono effettivamente partner trascrizionali chiave di PGC-1α, abbiamo testato se sono coattivati ​​da PGC-1α sul Errα e Gabpa promotori (Fig. 3). Abbiamo clonato porzioni appropriate di questi promotori in vettori di espressione e testato la capacità di questi fattori di guidare l'espressione di un gene reporter, in presenza e assenza di PGC-1α. I risultati confermano la prevista coattivazione tra PGC-1α e i due fattori di trascrizione nelle cellule muscolari. Inoltre, i risultati per il ErrIl frammento promotore di α contenente entrambi i siti mostra che i fattori di trascrizione agiscono in modo additivo o anche sinergico (Fig. 3).

Errα e Gabpa collaborano con PGC-1α per indurre la propria espressione. (UN) Motivi putativi Errα e Gabpa 1 kb a monte e a valle dei TSS Errα e Gabpa. (BD) Le cellule C2C12 sono state trasfettate con un plasmide del gene reporter contenente 2 kb del promotore Errα (B), Gabpa promotore (C), o Gabpa introne 1 (D), insieme ai plasmidi di espressione per Errα, Gabpa, Gabpb1 e PGC-1α. Quarantotto ore dopo la trasfezione, sono stati determinati i livelli del gene reporter e sono stati normalizzati ai livelli di β-galattosidasi.

Successivamente abbiamo cercato di esplorare il ruolo funzionale di Errα nell'esecuzione della risposta mediata da PGC-1α, utilizzando un agonista inverso selettivo di Errα recentemente sviluppato, chiamato XCT790 (di seguito indicato come inibitore Fig. 7, che è pubblicato come informazione di supporto sul sito web del PNAS). Questo composto non inibisce o attiva significativamente altri recettori nucleari a dosi vicine al suo IC50 (583 nM) per Errα, sebbene sia stato riscontrato che concentrazioni più elevate (ϣ.3 μM) attivano debolmente PPARγ (R.A.H., comunicazione personale). In un test di cromatografia di affinità, XCT790 ha specificamente ridotto l'interazione tra PGC-1α ed Errα, mentre il legame di PGC-1α con un altro recettore nucleare, il fattore nucleare epatico 4α non è stato influenzato (Fig. 8, che è pubblicata come informazione di supporto sul sito web del PNAS).

L'inibitore è stato utilizzato per la prima volta per sondare il ruolo di Errα nell'attivazione di Errα e Gabpa, ripetendo gli esperimenti sopra descritti in presenza o assenza dell'inibitore a una dose leggermente superiore al suo IC50. L'inibitore ha notevolmente ridotto l'attivazione del Errα promotore di Errα e PGC-1α, ma non ha avuto alcun effetto sull'espressione del gene reporter Gabpa/b-driven ( Fig. 4UN ). L'effetto dell'inibitore di Errα assomiglia all'effetto della mutagenesi sito-diretta del sito di legame di Errα sul Errα promotore ( Fig. 4B ).

Un inibitore di piccole molecole di Errα inibisce la risposta a PGC-1α. (UN) I mioblasti C2C12 trasfettati con il promotore Errα wild-type e i rispettivi plasmidi di espressione sono stati trattati con il veicolo (0,1% DMSO) o 1 μM XCT790 per 48 ore prima che fossero misurati i livelli del gene reporter. (B) Le cellule C2C12 sono state trasfettate con un promotore wild-type o Errα che ospita un motivo Errα mutato (mutante), insieme a plasmidi di espressione per Errα, Gabpa, Gabpb1 e PGC-1α. Dopo 48 ore, i livelli del gene reporter sono stati determinati e normalizzati ai livelli di β-galattosidasi. (C) I miotubi C2C12 sono stati infettati con adenovirus GFP- o PGC-1α e sono stati trattati con veicolo (0,1% DMSO) o 1μM XCT790 per 1 giorno. I livelli di espressione relativa di diversi geni sono stati quindi determinati mediante PCR semiquantitativa in tempo reale e sono stati normalizzati rispetto ai livelli di rRNA 18S. (D) Le cellule di epatoma di ratto Fao sono state infettate con GFP adenovirale o PGC-1α e sono state trattate con veicolo (0,1% DMSO) o 1μM XCT790 per 1 giorno prima che i livelli di espressione genica relativi fossero misurati mediante PCR in tempo reale, e sono state normalizzato contro i livelli di 18S rRNA. * , P < 0.05. NS, non significativo.

Il ruolo di Errα è stato successivamente studiato nella regolazione dei geni bersaglio PGC-1α endogeni. PGC-1α è stato espresso in miotubi C2C12, trattati con inibitore o veicolo, e abbiamo misurato il livello di espressione di geni specifici il giorno 1 utilizzando RT-PCR. Abbiamo studiato cinque geni che contengono varianti del motivo Errα, inclusi due del sottoinsieme coregolato di geni OXPHOS, Gabpa ed Errα, nonché acil-CoA deidrogenasi a catena media (MCAD), un bersaglio pubblicato di Err& #x003b1 (30). L'espressione di tutti questi geni è indotta da PGC-1α, e questa induzione è diminuita dall'inibitore ( Fig. 4C ). La specificità della risposta è stata confermata utilizzando due geni indotti da PGC-1α che mancano di evidenti siti di legame Errα ( Fig. 4C ). Insieme, questi risultati suggeriscono che un sottoinsieme di geni PGC-1α è regolato da Errα, principalmente i geni bersaglio contenenti un motivo Errα. Il fatto che l'inibizione di questi geni da parte dell'agonista inverso ERRα non fosse completa suggerisce che anche altri fattori potrebbero essere coinvolti in questa regolazione. Per garantire che gli effetti dell'inibitore di Errα non fossero dovuti all'attivazione di PPARγ, sono stati eseguiti esperimenti di controllo utilizzando l'agonista sintetico di PPARγ rosiglitazone e hanno confermato che non aveva alcun effetto sull'espressione di questi geni (Fig. 9, che è pubblicato come informazione di supporto sul sito web del PNAS).

L'inibizione di Errα riduce il programma PGC-1α nei test cellulari. Il ruolo di Errα nella risposta fisiologica mediata da PGC-1α è stato caratterizzato utilizzando saggi funzionali della respirazione mitocondriale. L'inibitore Errα riduce potentemente l'induzione di PGC-1α della respirazione cellulare totale e riduce anche significativamente gli aumenti innescati da PGC-1α nella respirazione disaccoppiata (Fig. 5). I dati suggeriscono che l'inibizione di Errα suscita alcuni aspetti di un fenotipo diabetico nelle cellule muscolari coltivate.

La respirazione mitocondriale totale e disaccoppiata è inibita dall'agonista inverso sintetico Errα XCT790. (UN e B) I miotubi C2C12 sono stati infettati con GFP o adenovirus PGC-1α e sono stati trattati con veicolo (0,1% DMSO) o 1μM XCT790 per 2 giorni prima della respirazione mitocondriale totale (UN) e respirazione disaccoppiata (B) era determinato. * , P < 0.05 in coppia T test.

L'inibizione di Errα non influisce sulla gluconeogenesi nel fegato. Abbiamo esteso l'analisi alle cellule derivate dal fegato, dove è stato dimostrato che PGC-1α induce geni della risposta al digiuno, inclusi quelli coinvolti nella gluconeogenesi e nell'ossidazione degli acidi grassi (1). Queste risposte sono generalmente elevate nei diabetici scarsamente controllati.Come previsto, MCAD e due geni chiave correlati alla gluconeogenesi (glucosio-6-fosfatasi e fosfoenol-piruvato carbossichinasi) sono stati tutti indotti da PGC-1α. Tuttavia, l'antagonista Errα ha represso l'induzione PGC-1α di MCAD ma non i geni gluconeogenici ( Fig. 4D ).

NRF-1 è a valle di Errα e Gabpa. Infine, abbiamo studiato la relazione di NRF-1 con la funzione Errα nelle cellule muscolari. È stato suggerito che NRF-1 sia un fattore di trascrizione chiave coinvolto nella biogenesi mitocondriale (31) ed è indotto e coattivato da PGC-1α in questo processo (2). Tuttavia, ciò che lascia perplessi è che la sovraespressione transgenica di NRF-1 nel muscolo non è sufficiente per indurre la biogenesi mitocondriale (32). Utilizzando l'agonista inverso sintetico Errα, abbiamo scoperto che l'induzione di NRF-1 da parte di PGC-1α è in realtà a valle degli eventi iniziali mediati da Errα (Fig. 10, che è pubblicata come informazione di supporto sul PNAS sito web). È interessante notare che l'analisi reasonADE del motivo di consenso NRF-1 (5′-GCGCAYGCGC-3′ o complemento inverso) produce un punteggio significativo se considerato come un test di singola ipotesi (nominale P = 0.001 il giorno 3). Nel complesso, questi risultati suggeriscono che NRF-1 è un mediatore importante ma relativamente tardivo del programma trascrizionale mitocondriale indotto da PGC-1α.


  • Dedizione
  • Riguardo agli Autori
  • Prefazione
  • Ringraziamenti
  • Parte I. Il disegno molecolare della vita
    • Capitolo 1. Preludio: la biochimica e la rivoluzione genomica
      • 1.1. Il DNA illustra la relazione tra forma e funzione
        • 1.1.1. Il DNA è costruito da quattro elementi costitutivi
        • 1.1.2. Due singoli filamenti di DNA si combinano per formare una doppia elica
        • 1.1.3. L'RNA è un intermediario nel flusso di informazioni genetiche
        • 1.1.4. Le proteine, codificate dagli acidi nucleici, svolgono la maggior parte delle funzioni cellulari
        • 1.3.1. Le interazioni reversibili delle biomolecole sono mediate da tre tipi di legami non covalenti
        • 1.3.2. Le proprietà dell'acqua influenzano le capacità di legame delle biomolecole
        • 1.3.3. Entropia e leggi della termodinamica
        • 1.3.4. Il ripiegamento proteico può essere compreso in termini di cambiamenti di energia libera
        • Rendering stereochimici
        • Proiezioni di Fischer
        • Parole chiave
        • 2.1. Le molecole organiche chiave sono utilizzate dai sistemi viventi
          • 2.1.1. Molti componenti delle macromolecole biochimiche possono essere prodotti in semplici reazioni prebiotiche
          • 2.1.2. Le incertezze oscurano le origini di alcune biomolecole chiave
          • 2.2.1. I principi dell'evoluzione possono essere dimostrati in vitro
          • 2.2.2. Le molecole di RNA possono agire come catalizzatori
          • 2.2.3. Gli amminoacidi e i loro polimeri possono svolgere ruoli biosintetici e catalitici
          • 2.2.4. La sintesi di polipeptidi orientata al modello di RNA collega i mondi dell'RNA e delle proteine
          • 2.2.5. Il codice genetico chiarisce i meccanismi dell'evoluzione
          • 2.2.6. Gli RNA di trasferimento illustrano l'evoluzione mediante la duplicazione genica
          • 2.2.7. Il DNA è una forma di conservazione stabile per le informazioni genetiche
          • 2.3.1. L'ATP, una valuta comune per l'energia biochimica, può essere generata attraverso la scomposizione di molecole organiche
          • 2.3.2. Le cellule sono state formate dall'inclusione di acidi nucleici all'interno delle membrane
          • 2.3.3. La compartimentazione ha richiesto lo sviluppo di pompe ioniche
          • 2.3.4. I gradienti di protoni possono essere utilizzati per guidare la sintesi di ATP
          • 2.3.5. L'ossigeno molecolare, un sottoprodotto tossico di alcuni processi fotosintetici, può essere utilizzato per scopi metabolici
          • 2.4.1. Strutture filamentose e motori molecolari consentono il movimento intracellulare e cellulare
          • 2.4.2. Alcune cellule possono interagire per formare colonie con funzioni specializzate
          • 2.4.3. Lo sviluppo di organismi pluricellulari richiede la differenziazione orchestrata delle cellule
          • 2.4.4. L'unità della biochimica consente di sondare efficacemente la biologia umana attraverso studi su altri organismi
          • Le principali molecole organiche sono utilizzate dai sistemi viventi
          • L'evoluzione richiede riproduzione, variazione e pressione selettiva
          • Le trasformazioni energetiche sono necessarie per sostenere i sistemi viventi
          • Le cellule possono rispondere ai cambiamenti nei loro ambienti
          • Parole chiave
          • Dove iniziare
          • libri
          • Chimica prebiotica
          • Evoluzione in vitro
          • Replicazione e RNA catalitico
          • Transizione da RNA a DNA
          • membrane
          • Organismi multicellulari e sviluppo
          • 3.1. Le proteine ​​sono costruite da un repertorio di 20 aminoacidi
          • 3.2. Struttura primaria: gli amminoacidi sono collegati da legami peptidici per formare catene polipeptidiche
            • 3.2.1. Le proteine ​​hanno sequenze di aminoacidi uniche che sono specificate dai geni
            • 3.2.2. Le catene polipeptidiche sono flessibili ma conformazionalmente limitate
            • 3.3.1. L'alfa elica è una struttura a spirale stabilizzata da legami idrogeno intracatena
            • 3.3.2. I fogli beta sono stabilizzati dal legame a idrogeno tra i filamenti di polipeptidi
            • 3.3.3. Le catene polipeptidiche possono cambiare direzione eseguendo giri e anelli inversi
            • 3.6.1. Gli amminoacidi hanno diverse propensioni a formare alfa eliche, fogli beta e giri beta
            • 3.6.2. Il ripiegamento delle proteine ​​è un processo altamente cooperativo
            • 3.6.3. Le proteine ​​si ripiegano per stabilizzazione progressiva degli intermedi piuttosto che per ricerca casuale
            • 3.6.4. La previsione della struttura tridimensionale dalla sequenza rimane una grande sfida
            • 3.6.5. La modificazione e la scissione delle proteine ​​conferiscono nuove capacità
            • Le proteine ​​sono costruite da un repertorio di 20 aminoacidi
            • Struttura primaria: gli amminoacidi sono collegati da legami peptidici per formare catene polipeptidiche
            • Struttura secondaria: le catene polipeptidiche possono ripiegarsi in strutture regolari come l'alfa elica, il foglio beta e i giri e gli anelli
            • Struttura terziaria: le proteine ​​idrosolubili si ripiegano in strutture compatte con nuclei non polari
            • Struttura quaternaria: le catene polipeptidiche possono assemblarsi in strutture multisubunità
            • La sequenza amminoacidica di una proteina determina la sua struttura tridimensionale
            • Parole chiave
            • Ionizzazione dell'acqua
            • Definizione di acido e base
            • Definizione di pH e pK
            • Equazione di Henderson-Hasselbalch
            • Buffer
            • pKun Valori degli aminoacidi
            • Problema multimediale
            • Dove iniziare
            • libri
            • Conformazione delle proteine
            • Alfa eliche, fogli beta e loop
            • Domini
            • Ripiegamento delle proteine
            • Modificazione covalente delle proteine
            • Grafica molecolare
            • 4.1. La purificazione delle proteine ​​è un primo passo essenziale per comprendere la loro funzione
              • 4.1.1. Il saggio: come riconosciamo la proteina che stiamo cercando?
              • 4.1.2. Le proteine ​​devono essere rilasciate dalla cellula per essere purificate
              • 4.1.3. Le proteine ​​possono essere purificate in base a solubilità, dimensione, carica e affinità di legame
              • 4.1.4. Le proteine ​​possono essere separate mediante elettroforesi su gel e visualizzate
              • 4.1.5. Uno schema di purificazione delle proteine ​​può essere valutato quantitativamente
              • 4.1.6. L'ultracentrifugazione è utile per separare le biomolecole e determinarne la massa
              • 4.1.7. La massa di una proteina può essere determinata con precisione mediante spettrometria di massa
              • 4.2.1. Le proteine ​​possono essere scisse in modo specifico in piccoli peptidi per facilitare l'analisi
              • 4.2.2. Le sequenze di aminoacidi sono fonti di molti tipi di intuizioni
              • 4.2.3. La tecnologia del DNA ricombinante ha rivoluzionato il sequenziamento delle proteine
              • 4.3.1. Possono essere generati anticorpi contro proteine ​​specifiche
              • 4.3.2. Gli anticorpi monoclonali con praticamente qualsiasi specificità desiderata possono essere prontamente preparati
              • 4.3.3. Le proteine ​​possono essere rilevate e quantificate utilizzando un test di immunoassorbimento enzimatico
              • 4.3.4. Il Western Blotting consente la rilevazione delle proteine ​​separate dall'elettroforesi su gel
              • 4.3.5. I marcatori fluorescenti rendono possibile la visualizzazione delle proteine ​​nella cellula
              • 4.5.1. La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare può rivelare le strutture delle proteine ​​in soluzione
              • 4.5.2. La cristallografia a raggi X rivela la struttura tridimensionale in dettaglio atomico
              • La purificazione delle proteine ​​è un passaggio essenziale per comprendere la loro funzione
              • Le sequenze di aminoacidi possono essere determinate dalla degradazione automatizzata di Edman
              • L'immunologia fornisce tecniche importanti con cui studiare le proteine
              • I peptidi possono essere sintetizzati con metodi automatizzati in fase solida
              • La struttura tridimensionale delle proteine ​​può essere determinata mediante spettroscopia NMR e cristallografia a raggi X
              • Parole chiave
              • Problemi di integrazione del capitolo
              • Problemi di interpretazione dei dati
              • Dove iniziare
              • libri
              • Purificazione e analisi delle proteine
              • Ultracentrifugazione e spettrometria di massa
              • Cristallografia e spettroscopia a raggi X
              • Anticorpi monoclonali e molecole fluorescenti
              • Sintesi chimica delle proteine
              • 5.1. Un acido nucleico è costituito da quattro tipi di basi collegate a uno scheletro di zucchero-fosfato
                • 5.1.1. RNA e DNA differiscono nella componente dello zucchero e in una delle basi
                • 5.1.2. I nucleotidi sono le unità monomeriche degli acidi nucleici
                • 5.2.1. La doppia elica è stabilizzata da legami idrogeno e interazioni idrofobiche
                • 5.2.2. La doppia elica facilita la trasmissione accurata delle informazioni ereditarie
                • 5.2.3. La doppia elica può essere sciolta in modo reversibile
                • 5.2.4. Alcune molecole di DNA sono circolari e superavvolte
                • 5.2.5. Gli acidi nucleici a filamento singolo possono adottare strutture elaborate
                • 5.3.1. La DNA polimerasi catalizza la formazione del legame fosfodiestere
                • 5.3.2. I geni di alcuni virus sono fatti di RNA
                • 5.4.1. Diversi tipi di RNA giocano un ruolo chiave nell'espressione genica
                • 5.4.2. Tutto l'RNA cellulare è sintetizzato dalle RNA polimerasi
                • 5.4.3. Le RNA polimerasi prendono istruzioni dai modelli di DNA
                • 5.4.4. La trascrizione inizia nei pressi dei siti promotori e termina nei siti Terminator
                • 5.4.5. Transfer RNA è la molecola adattatrice nella sintesi proteica
                • 5.5.1. Caratteristiche principali del codice genetico
                • 5.5.2. L'RNA messaggero contiene segnali di avvio e arresto per la sintesi proteica
                • 5.5.3. Il codice genetico è quasi universale
                • 5.6.1. L'elaborazione dell'RNA genera RNA maturo
                • 5.6.2. Molti esoni codificano domini proteici
                • Un acido nucleico è costituito da quattro tipi di basi collegate a uno scheletro di zucchero-fosfato
                • Una coppia di catene di acidi nucleici con sequenze complementari può formare una struttura a doppia elica
                • Il DNA viene replicato da polimerasi che prendono istruzioni dai modelli
                • L'espressione genica è la trasformazione delle informazioni sul DNA in molecole funzionali
                • Gli amminoacidi sono codificati da gruppi di tre basi a partire da un punto fisso
                • La maggior parte dei geni eucarioti sono mosaici di introni ed esoni
                • Parole chiave
                • Problemi di integrazione del capitolo
                • Problema multimediale
                • Dove iniziare
                • libri
                • struttura del DNA
                • replicazione del DNA
                • Scoperta dell'RNA messaggero
                • Codice genetico
                • Introni, esoni e geni scissi
                • Ricordi e resoconti storici
                • 6.1. Gli strumenti di base dell'esplorazione genica
                  • 6.1.1. Gli enzimi di restrizione dividono il DNA in frammenti specifici
                  • 6.1.2. I frammenti di restrizione possono essere separati mediante elettroforesi su gel e visualizzati
                  • 6.1.3. Il DNA viene solitamente sequenziato mediante interruzione controllata della replicazione (metodo Sanger Dideoxy)
                  • 6.1.4. Le sonde e i geni del DNA possono essere sintetizzati con metodi automatizzati in fase solida
                  • 6.1.5. Sequenze di DNA selezionate possono essere notevolmente amplificate dalla reazione a catena della polimerasi
                  • 6.1.6. La PCR è una tecnica potente nella diagnostica medica, nella medicina legale e nell'evoluzione molecolare
                  • 6.2.1. Gli enzimi di restrizione e la DNA ligasi sono strumenti chiave nella formazione di molecole di DNA ricombinante
                  • 6.2.2. I plasmidi e il fago lambda sono vettori scelti per la clonazione del DNA nei batteri
                  • 6.2.3. Geni specifici possono essere clonati da digest di DNA genomico
                  • 6.2.4. Lunghi tratti di DNA possono essere analizzati in modo efficiente camminando sul cromosoma
                  • 6.3.1. Il DNA complementare preparato dall'mRNA può essere espresso nelle cellule ospiti
                  • 6.3.2. I livelli di espressione genica possono essere esaminati in modo completo
                  • 6.3.3. Nuovi geni inseriti nelle cellule eucariotiche possono essere espressi in modo efficiente
                  • 6.3.4. Gli animali transgenici ospitano ed esprimono i geni che sono stati introdotti nelle loro linee germinali
                  • 6.3.5. La distruzione genica fornisce indizi sulla funzione genica
                  • 6.3.6. I plasmidi che inducono il tumore possono essere utilizzati per introdurre nuovi geni nelle cellule vegetali
                  • 6.4.1. Le proteine ​​con nuove funzioni possono essere create attraverso cambiamenti diretti nel DNA
                  • 6.4.2. La tecnologia del DNA ricombinante ha aperto nuove prospettive
                  • Gli strumenti di base dell'esplorazione genica
                  • La tecnologia del DNA ricombinante ha rivoluzionato tutti gli aspetti della biologia
                  • Manipolare i geni degli eucarioti
                  • Nuove proteine ​​possono essere ingegnerizzate mediante mutagenesi sito-specifica
                  • Parole chiave
                  • Problema di integrazione del capitolo
                  • Capitolo Problema di integrazione e analisi dei dati
                  • Problema di interpretazione dei dati
                  • Dove iniziare
                  • Libri sulla tecnologia del DNA ricombinante
                  • Sequenziamento e sintesi del DNA
                  • Reazione a catena della polimerasi (PCR)
                  • array di DNA
                  • Introduzione di geni nelle cellule animali
                  • Ingegneria genetica delle piante
                  • 7.1. Gli omologhi discendono da un antenato comune
                  • 7.2. L'analisi statistica degli allineamenti di sequenza può rilevare l'omologia
                    • 7.2.1. Il significato statistico degli allineamenti può essere stimato mescolando
                    • 7.2.2. Relazioni evolutive distanti possono essere rilevate attraverso l'uso di matrici di sostituzione
                    • 7.2.3. È possibile eseguire ricerche nei database per identificare sequenze omologhe
                    • 7.3.1. La struttura terziaria è più conservata della struttura primaria
                    • 7.3.2. La conoscenza delle strutture tridimensionali può aiutare nella valutazione degli allineamenti di sequenza
                    • 7.3.3. Motivi ripetuti possono essere rilevati allineando le sequenze con se stessi
                    • 7.3.4. Evoluzione convergente: soluzioni comuni alle sfide biochimiche
                    • 7.3.5. Il confronto delle sequenze di RNA può essere una fonte di informazioni sulle strutture secondarie
                    • 7.5.1. Il DNA antico può talvolta essere amplificato e sequenziato
                    • 7.5.2. L'evoluzione molecolare può essere esaminata sperimentalmente
                    • Gli omologhi discendono da un antenato comune
                    • L'analisi statistica degli allineamenti di sequenza può rilevare l'omologia
                    • L'esame della struttura tridimensionale migliora la nostra comprensione delle relazioni evolutive
                    • Gli alberi evolutivi possono essere costruiti sulla base delle informazioni sulla sequenza
                    • Le tecniche moderne rendono possibile l'esplorazione sperimentale dell'evoluzione
                    • Parole chiave
                    • Problema multimediale
                    • Prenotare
                    • Allineamento della sequenza
                    • Confronto struttura
                    • Rilevamento del dominio
                    • alberi evolutivi
                    • DNA antico
                    • Evoluzione in laboratorio
                    • Siti web
                    • 8.1. Gli enzimi sono catalizzatori potenti e altamente specifici
                      • 8.1.1. Molti enzimi richiedono cofattori per l'attività
                      • 8.1.2. Gli enzimi possono trasformare l'energia da una forma all'altra
                      • 8.1.3. Gli enzimi sono classificati in base ai tipi di reazioni che catalizzano
                      • 8.2.1. Il cambiamento di energia libera fornisce informazioni sulla spontaneità ma non sulla velocità di una reazione
                      • 8.2.2. La variazione standard di energia libera di una reazione è correlata alla costante di equilibrio
                      • 8.2.3. Gli enzimi alterano solo la velocità di reazione e non l'equilibrio di reazione
                      • 8.3.1. La formazione di un complesso enzima-substrato è il primo passo nella catalisi enzimatica
                      • 8.3.2. I siti attivi degli enzimi hanno alcune caratteristiche comuni
                      • 8.4.1. Il significato di Km e Vmax Valori
                      • 8.4.2. Perfezione cinetica nella catalisi enzimatica: il Kgatto/Km Criterio
                      • 8.4.3. La maggior parte delle reazioni biochimiche include più substrati
                      • 8.4.4. Gli enzimi allosterici non obbediscono alla cinetica di Michaelis-Menten
                      • 8.5.1. L'inibizione competitiva e non competitiva sono distinguibili dal punto di vista cinetico
                      • 8.5.2. Gli inibitori irreversibili possono essere utilizzati per mappare il sito attivo
                      • 8.5.3. Gli analoghi allo stato di transizione sono potenti inibitori degli enzimi
                      • 8.5.4. Gli anticorpi catalitici dimostrano l'importanza del legame selettivo dello stato di transizione all'attività enzimatica
                      • 8.5.5. La penicillina inattiva irreversibilmente un enzima chiave nella sintesi batterica della parete cellulare
                      • 8.6.1. Le vitamine idrosolubili funzionano come coenzimi
                      • 8.6.2. Le vitamine liposolubili partecipano a diversi processi come la coagulazione del sangue e la vista
                      • Gli enzimi sono catalizzatori potenti e altamente specifici
                      • L'energia libera è una funzione termodinamica utile per comprendere gli enzimi
                      • Gli enzimi accelerano le reazioni facilitando la formazione dello stato di transizione
                      • Il modello Michaelis-Menten spiega le proprietà cinetiche di molti enzimi
                      • Gli enzimi possono essere inibiti da molecole specifiche
                      • Le vitamine sono spesso precursori dei coenzimi
                      • Parole chiave
                      • Problemi di interpretazione dei dati
                      • Problemi di integrazione del capitolo
                      • Problema multimediale
                      • Dove iniziare
                      • libri
                      • Stabilizzazione dello stato di transizione, analoghi e altri inibitori enzimatici
                      • Anticorpi catalitici
                      • Cinetica e meccanismi degli enzimi
                      • 9.1. Proteasi: facilitare una reazione difficile
                        • 9.1.1. La chimotripsina possiede un residuo di serina altamente reattivo
                        • 9.1.2. L'azione della chimotripsina procede in due fasi collegate da un intermediario legato covalentemente
                        • 9.1.3. La serina fa parte di una triade catalitica che include anche istidina e acido aspartico
                        • 9.1.4. Le triadi catalitiche si trovano in altri enzimi idrolitici
                        • 9.1.5. La triade catalitica è stata sezionata dalla mutagenesi sito-diretta
                        • 9.1.6. La cisteina, l'aspartile e le metalloproteasi sono altre classi principali di enzimi che scindono i peptidi
                        • 9.1.7. Gli inibitori della proteasi sono farmaci importanti
                        • 9.2.1. L'anidrasi carbonica contiene uno ione zinco legato essenziale per l'attività catalitica
                        • 9.2.2. La catalisi comporta l'attivazione dello zinco dell'acqua
                        • 9.2.3. Uno shuttle protonico facilita la rapida rigenerazione della forma attiva dell'enzima
                        • 9.2.4. L'evoluzione convergente ha generato siti attivi a base di zinco in diverse anidrasi carbonica
                        • 9.3.1. La scissione avviene per spostamento in linea di 3′ ossigeno dal fosforo mediante acqua attivata dal magnesio
                        • 9.3.2. Gli enzimi di restrizione richiedono il magnesio per l'attività catalitica
                        • 9.3.3. L'apparato catalitico completo è assemblato solo all'interno di complessi di molecole di DNA affini, garantendo la specificità
                        • 9.3.4. Gli enzimi di restrizione di tipo II hanno un nucleo catalitico in comune e sono probabilmente correlati dal trasferimento genico orizzontale
                        • 9.4.1. Le chinasi NMP sono una famiglia di enzimi contenenti strutture P-Loop
                        • 9.4.2. I complessi di magnesio (o manganese) di nucleosidici trifosfati sono i veri substrati per essenzialmente tutti gli enzimi NTP-dipendenti
                        • 9.4.3. Il legame dell'ATP induce grandi cambiamenti conformazionali
                        • 9.4.4. I domini P-Loop NTPasi sono presenti in una gamma di proteine ​​importanti
                        • Proteasi: facilitare una reazione difficile
                        • Anidrasi carbonica: rendere più veloce una reazione rapida
                        • Enzimi di restrizione: eseguire reazioni di scissione del DNA altamente specifiche
                        • Chinasi nucleosidici monofosfato: catalizzare lo scambio di gruppi fosforilici senza promuovere l'idrolisi
                        • Parole chiave
                        • Problema del meccanismo
                        • Problemi con i media
                        • Dove iniziare
                        • libri
                        • Chimotripsina e altre serina proteasi
                        • Altre proteasi
                        • Anidrasi carbonica
                        • Enzimi di restrizione
                        • Chinasi NMP
                        • 10.1. L'aspartato transcarbamoilasi è inibita allostericamente dal prodotto finale del suo percorso
                          • 10.1.1. ACTase è costituito da subunità catalitiche e regolatorie separabili
                          • 10.1.2. Le interazioni allosteriche in ATCasi sono mediate da grandi cambiamenti nella struttura quaternaria
                          • 10.1.3. Gli enzimi regolati allostericamente non seguono la cinetica di Michaelis-Menten
                          • 10.1.4. I regolatori allosterici modulano l'equilibrio T-to-R
                          • 10.1.5. Il modello concertato può essere formulato in termini quantitativi
                          • 10.1.6. Anche i modelli sequenziali possono tenere conto degli effetti allosterici
                          • 10.2.1. Il legame dell'ossigeno induce sostanziali cambiamenti strutturali nei siti di ferro nell'emoglobina
                          • 10.2.2. Il legame dell'ossigeno modifica notevolmente la struttura quaternaria dell'emoglobina
                          • 10.2.3. Regolazione dell'affinità dell'ossigeno dell'emoglobina: l'effetto del 2,3-bisfosfoglicerato
                          • 10.2.4.L'effetto Bohr: gli ioni di idrogeno e l'anidride carbonica promuovono il rilascio di ossigeno
                          • 10.4.1. La fosforilazione è un mezzo altamente efficace per regolare le attività delle proteine ​​bersaglio
                          • 10.4.2. L'AMP ciclico attiva la proteina chinasi A alterando la struttura quaternaria
                          • 10.4.3. L'ATP e la proteina bersaglio si legano a una fessura profonda nella subunità catalitica della proteina chinasi A
                          • 10.5.1. Il chimotripsinogeno viene attivato dalla scissione specifica di un singolo legame peptidico
                          • 10.5.2. L'attivazione proteolitica del chimotripsinogeno porta alla formazione di un sito di legame al substrato
                          • 10.5.3. La generazione di tripsina dal tripsinogeno porta all'attivazione di altri zimogeni
                          • 10.5.4. Alcuni enzimi proteolitici hanno inibitori specifici
                          • 10.5.5. La coagulazione del sangue è ottenuta da una cascata di attivazioni di zimogeno
                          • 10.5.6. Il fibrinogeno viene convertito dalla trombina in un coagulo di fibrina
                          • 10.5.7. La protrombina è pronta per l'attivazione da una modifica dipendente dalla vitamina K
                          • 10.5.8. L'emofilia ha rivelato un primo passo nella coagulazione
                          • 10.5.9. Il processo di coagulazione deve essere regolato con precisione
                          • L'aspartato transcarbamoilasi è inibita allostericamente dal prodotto finale del suo percorso
                          • L'emoglobina trasporta l'ossigeno in modo efficiente legando l'ossigeno in modo cooperativo
                          • Gli isoenzimi forniscono un mezzo di regolazione specifico per tessuti distinti e fasi di sviluppo
                          • La modificazione covalente è un mezzo per regolare l'attività enzimatica
                          • Molti enzimi vengono attivati ​​da una specifica scissione proteolitica
                          • Parole chiave
                          • Problemi di interpretazione dei dati
                          • Problema di integrazione del capitolo
                          • Problemi di meccanismo
                          • Problema multimediale
                          • Dove iniziare
                          • Aspartato transcarbamilasi e interazioni allosteriche
                          • Emoglobina
                          • Modifica covalente
                          • Chinasi proteica A
                          • Attivazione dello zimogeno
                          • Inibitori della proteasi
                          • Cascata di coagulazione
                          • 11.1. I monosaccaridi sono aldeidi o chetoni con più gruppi idrossilici
                            • 11.1.1. Pentosi ed esosi ciclizzano per formare anelli furanosi e piranosici
                            • 11.1.2. Conformazione degli anelli piranosici e furanosi
                            • 11.1.3. I monosaccaridi sono uniti ad alcoli e ammine attraverso legami glicosidici
                            • 11.2.1. Saccarosio, lattosio e maltosio sono i comuni disaccaridi
                            • 11.2.2. Il glicogeno e l'amido sono depositi mobili di glucosio
                            • 11.2.3. La cellulosa, il principale polimero strutturale delle piante, è costituita da catene lineari di unità di glucosio
                            • 11.2.4. I glicosaminoglicani sono catene polisaccaridiche anioniche costituite da unità disaccaridiche ripetute
                            • 11.2.5. Enzimi specifici sono responsabili dell'assemblaggio degli oligosaccaridi
                            • 11.3.1. I carboidrati possono essere collegati alle proteine ​​attraverso l'asparagina (n-Linked) o tramite serina o treonina (oh-Linked) Residui
                            • 11.3.2. La glicosilazione proteica avviene nel lume del reticolo endoplasmatico e nel complesso del Golgi
                            • 11.3.3. n-Le glicoproteine ​​legate acquisiscono i loro zuccheri iniziali dai donatori di dolicolo nel reticolo endoplasmatico
                            • 11.3.4. Le vescicole di trasporto trasportano le proteine ​​dal reticolo endoplasmatico al complesso del Golgi per ulteriore glicosilazione e smistamento
                            • 11.3.5. Il mannosio 6-fosfato indirizza gli enzimi lisosomiali alle loro destinazioni
                            • 11.3.6. I residui di glucosio vengono aggiunti e tagliati per favorire il ripiegamento delle proteine
                            • 11.3.7. Gli oligosaccaridi possono essere “Sequencing”
                            • 11.4.1. Le lectine promuovono le interazioni tra le cellule
                            • 11.4.2. Il virus dell'influenza si lega ai residui di acido sialico
                            • I monosaccaridi sono aldeidi o chetoni con più gruppi idrossilici
                            • I carboidrati complessi sono formati dal legame dei monosaccaridi
                            • I carboidrati possono legarsi alle proteine ​​per formare glicoproteine
                            • Le lectine sono proteine ​​specifiche che legano i carboidrati
                            • Parole chiave
                            • Problema di integrazione del capitolo
                            • Dove iniziare
                            • libri
                            • Struttura delle proteine ​​che legano i carboidrati
                            • Glicoproteine
                            • Carboidrati nei processi di riconoscimento
                            • Sequenziamento dei carboidrati
                            • 12.1. Molte caratteristiche comuni sono alla base della diversità delle membrane biologiche
                            • 12.2. Gli acidi grassi sono costituenti chiave dei lipidi
                              • 12.2.1. La denominazione degli acidi grassi
                              • 12.2.2. Gli acidi grassi variano nella lunghezza della catena e nel grado di insaturazione
                              • 12.3.1. I fosfolipidi sono la classe principale dei lipidi di membrana
                              • 12.3.2. Le membrane archeali sono costruite da lipidi eterei con catene ramificate
                              • 12.3.3. I lipidi di membrana possono includere anche porzioni di carboidrati
                              • 12.3.4. Il colesterolo è un lipide basato su un nucleo steroideo
                              • 12.3.5. Un lipide di membrana è una molecola anfipatica contenente una frazione idrofila e una idrofoba
                              • 12.4.1. Le vescicole lipidiche possono essere formate dai fosfolipidi
                              • 12.4.2. I doppi strati lipidici sono altamente impermeabili agli ioni e alla maggior parte delle molecole polari
                              • 12.5.1. Le proteine ​​si associano al doppio strato lipidico in vari modi
                              • 12.5.2. Le proteine ​​interagiscono con le membrane in vari modi
                              • 12.5.3. Alcune proteine ​​si associano alle membrane attraverso gruppi idrofobici legati in modo covalente
                              • 12.5.4. Le eliche transmembrana possono essere previste con precisione dalle sequenze di amminoacidi
                              • 12.6.1. Il modello a mosaico fluido consente il movimento laterale ma non la rotazione attraverso la membrana
                              • 12.6.2. La fluidità della membrana è controllata dalla composizione degli acidi grassi e dal contenuto di colesterolo
                              • 12.6.3. Tutte le membrane biologiche sono asimmetriche
                              • 12.7.1. Le proteine ​​sono mirate a compartimenti specifici da sequenze di segnale
                              • 12.7.2. Il germogliamento e la fusione delle membrane sono alla base di diversi importanti processi biologici
                              • Molte caratteristiche comuni sono alla base della diversità delle membrane biologiche
                              • Gli acidi grassi sono costituenti chiave dei lipidi
                              • Esistono tre tipi comuni di lipidi di membrana
                              • Fosfolipidi e glicolipidi formano facilmente fogli bimolecolari in mezzi acquosi
                              • Le proteine ​​svolgono la maggior parte dei processi di membrana
                              • I lipidi e molte proteine ​​di membrana si diffondono rapidamente nel piano della membrana
                              • Le cellule eucariotiche contengono compartimenti delimitati da membrane interne
                              • Parole chiave
                              • Problemi di interpretazione dei dati
                              • Problema di integrazione del capitolo
                              • Dove iniziare
                              • libri
                              • Lipidi di membrana e dinamica
                              • Struttura delle proteine ​​di membrana
                              • Membrane intracellulari
                              • 13.1. Il trasporto di molecole attraverso una membrana può essere attivo o passivo
                                • 13.1.1. Molte molecole richiedono trasportatori di proteine ​​per attraversare le membrane
                                • 13.1.2. L'energia libera immagazzinata nei gradienti di concentrazione può essere quantificata
                                • 13.2.1. Il reticolo sarcoplasmatico Ca 2+ ATPasi è una proteina di membrana integrale
                                • 13.2.2. Le ATPasi di tipo P sono conservate in modo evolutivo e svolgono un'ampia gamma di ruoli
                                • 13.2.3. La digitale inibisce specificamente la pompa Na + -K + bloccando la sua defosforilazione
                                • 13.5.1. Le misurazioni della conduttanza patch-clamp rivelano le attività dei singoli canali
                                • 13.5.2. Le proteine ​​del canale ionico sono costituite da unità simili
                                • 13.5.3. I potenziali d'azione sono mediati da cambiamenti transitori nella permeabilità di Na + e K +
                                • 13.5.4. Il canale del sodio è un esempio di canale controllato in tensione
                                • 13.5.5. I canali del potassio sono omologhi al canale del sodio
                                • 13.5.6. La struttura di un canale di potassio rivela la base del flusso rapido di ioni con specificità
                                • 13.5.7. La struttura del canale del potassio spiega le sue rapide velocità di trasporto
                                • 13.5.8. Un canale può essere inattivato dall'occlusione del poro: il modello a sfera e catena
                                • Il trasporto di molecole attraverso una membrana può essere attivo o passivo
                                • Una famiglia di proteine ​​di membrana utilizza l'idrolisi dell'ATP per pompare ioni attraverso le membrane
                                • La resistenza multifarmaco e la fibrosi cistica evidenziano una famiglia di proteine ​​di membrana con domini a cassetta che legano l'ATP
                                • I trasportatori secondari utilizzano un gradiente di concentrazione per alimentare la formazione di un altro
                                • Canali specifici possono trasportare rapidamente ioni attraverso le membrane
                                • Le giunzioni gap consentono agli ioni e alle piccole molecole di fluire tra cellule comunicanti
                                • Parole chiave
                                • Problema di integrazione del capitolo
                                • Problema del meccanismo
                                • Problema di interpretazione dei dati
                                • Problema multimediale
                                • Dove iniziare
                                • libri
                                • Canali ionici voltaggio-dipendenti
                                • Canali ionici ligando-dipendenti
                                • Pompe ioniche guidate da ATP
                                • Proteine ​​ATP-binding cassette (ABC)
                                • Symporters e antiporters
                                • giunzioni spaziali
                                • Capitolo 14. Metabolismo: concetti di base e design
                                  • 14.1. Il metabolismo è composto da molte reazioni accoppiate e interconnesse
                                    • 14.1.1. Una reazione termodinamicamente sfavorevole può essere guidata da una reazione favorevole
                                    • 14.1.2. L'ATP è la valuta universale dell'energia gratuita nei sistemi biologici
                                    • 14.1.3. L'idrolisi dell'ATP guida il metabolismo spostando l'equilibrio delle reazioni accoppiate
                                    • 14.1.4. Basi strutturali dell'alto potenziale di trasferimento del fosforo dell'ATP
                                    • 14.1.5. Il potenziale di trasferimento del fosforo è un'importante forma di trasformazione dell'energia cellulare
                                    • 14.2.1. I composti ad alto potenziale di trasferimento del fosforo possono accoppiare l'ossidazione del carbonio alla sintesi dell'ATP
                                    • 14.2.2. I gradienti di ioni attraverso le membrane forniscono un'importante forma di energia cellulare che può essere accoppiata alla sintesi di ATP
                                    • 14.2.3. Fasi nell'estrazione di energia dai prodotti alimentari
                                    • 14.3.1. I vettori attivati ​​esemplificano il design modulare e l'economia del metabolismo
                                    • 14.3.2. Le reazioni chiave vengono ripetute durante tutto il metabolismo
                                    • 14.3.3. I processi metabolici sono regolati in tre modi principali
                                    • 14.3.4. Evoluzione delle vie metaboliche
                                    • Il metabolismo è composto da molte reazioni accoppiate e interconnesse
                                    • L'ossidazione dei combustibili carboniosi è un'importante fonte di energia cellulare
                                    • Le vie metaboliche contengono molti motivi ricorrenti
                                    • Parole chiave
                                    • Problema di integrazione del capitolo
                                    • Interpretazione dei dati
                                    • Problema multimediale
                                    • Dove iniziare
                                    • libri
                                    • Termodinamica
                                    • Bioenergetica e metabolismo
                                    • Regolazione del metabolismo
                                    • Aspetti storici
                                    • 15.1. I recettori a sette transmembrana-elica cambiano conformazione in risposta al legame del ligando e attivano le proteine ​​G
                                      • 15.1.1. Il legame del ligando ai recettori 7TM porta all'attivazione delle proteine ​​G
                                      • 15.1.2. Ciclo di proteine ​​G tra forme legate a PIL e GTP
                                      • 15.1.3. Le proteine ​​G attivate trasmettono segnali legandosi ad altre proteine
                                      • 15.1.4. Le proteine ​​G si ripristinano spontaneamente attraverso l'idrolisi GTP
                                      • 15.1.5. L'AMP ciclico stimola la fosforilazione di molte proteine ​​bersaglio attivando la proteina chinasi A
                                      • 15.2.1. L'inositolo 1,4,5-trifosfato apre i canali per il rilascio di ioni di calcio dai depositi intracellulari
                                      • 15.2.2. Il diacilglicerolo attiva la proteina chinasi C, che fosforila molte proteine ​​bersaglio
                                      • 15.3.1. Gli ionofori consentono la visualizzazione dei cambiamenti nella concentrazione di calcio
                                      • 15.3.2. Il calcio attiva la proteina regolatrice calmodulina, che stimola molti enzimi e trasportatori
                                      • 15.4.1. Alcuni recettori contengono domini tirosin-chinasi all'interno delle loro strutture covalenti
                                      • 15.4.2. Ras, un'altra classe di proteine ​​G di segnalazione
                                      • 15.5.1. Gli inibitori della proteina chinasi possono essere efficaci farmaci antitumorali
                                      • 15.5.2. Il colera e la pertosse sono dovuti all'attività alterata delle proteine ​​G
                                      • I recettori a sette transmembrana-elica cambiano conformazione in risposta al legame del ligando e attivano le proteine ​​G
                                      • L'idrolisi del fosfatidil inositolo bisfosfato da parte della fosfolipasi C genera due messaggeri
                                      • Lo ione calcio è un messaggero citosolico onnipresente
                                      • Alcuni recettori si dimerizzano in risposta al legame del ligando e al segnale per fosforilazione incrociata
                                      • Difetti nelle vie di segnalazione possono portare al cancro e ad altre malattie
                                      • Le caratteristiche ricorrenti dei percorsi di trasduzione del segnale rivelano le relazioni evolutive
                                      • Parole chiave
                                      • Problema di integrazione del capitolo
                                      • Problema del meccanismo
                                      • Problemi di interpretazione dei dati
                                      • Problema multimediale
                                      • Dove iniziare
                                      • Proteine ​​G e recettori 7TM
                                      • cascata cAMP
                                      • Cascata di fosfoinositide
                                      • Calcio
                                      • Chinasi proteiche, inclusi i recettori tirosin chinasi
                                      • Ras
                                      • Cancro
                                      • 16.1. La glicolisi è una via di conversione energetica in molti organismi
                                        • 16.1.1. L'esochinasi intrappola il glucosio nella cellula e inizia la glicolisi
                                        • 16.1.2. La formazione di fruttosio 1,6-bisfosfato dal glucosio 6-fosfato
                                        • 16.1.3. Lo zucchero a sei atomi di carbonio viene scisso in due frammenti di tre atomi di carbonio da Aldolase
                                        • 16.1.4. La trioso fosfato isomerasi recupera un frammento a tre atomi di carbonio
                                        • 16.1.5. Trasformazione energetica: la fosforilazione è accoppiata all'ossidazione della gliceraldeide 3-fosfato da un intermedio tioestere
                                        • 16.1.6. La formazione di ATP da 1,3-Bisphosphoglycerate
                                        • 16.1.7. La generazione di ATP aggiuntivo e la formazione di piruvato
                                        • 16.1.8. Rendimento energetico nella conversione del glucosio in piruvato
                                        • 16.1.9. Mantenere l'equilibrio redox: i diversi destini del piruvato
                                        • 16.1.10. Il sito di legame per NAD + è simile in molte deidrogenasi
                                        • 16.1.11. L'ingresso di fruttosio e galattosio nella glicolisi
                                        • 16.1.12. Molti adulti sono intolleranti al latte perché carenti di lattasi
                                        • 16.1.13. Il galattosio è altamente tossico se manca la transferasi
                                        • 16.2.1. La fosfofruttochinasi è l'enzima chiave nel controllo della glicolisi
                                        • 16.2.2. Un enzima bifunzionale regolato sintetizza e degrada il fruttosio 2,6-bisfosfato
                                        • 16.2.3. Anche l'esochinasi e la piruvato chinasi determinano il ritmo della glicolisi
                                        • 16.2.4. Una famiglia di trasportatori consente al glucosio di entrare e uscire dalle cellule animali
                                        • 16.2.5. Cancro e glicolisi
                                        • 16.3.1. La gluconeogenesi non è un'inversione della glicolisi
                                        • 16.3.2. La conversione del piruvato in fosfoenolpiruvato inizia con la formazione di ossalacetato
                                        • 16.3.3. L'ossalacetato viene trasportato nel citosol e convertito in fosfoenolpiruvato
                                        • 16.3.4. La conversione del fruttosio 1,6-bisfosfato in fruttosio 6-fosfato e ortofosfato è un passaggio irreversibile
                                        • 16.3.5. La generazione di glucosio libero è un importante punto di controllo
                                        • 16.3.6. Sei gruppi fosforilici ad alto potenziale di trasferimento vengono spesi nella sintesi del glucosio dal piruvato
                                        • 16.4.1. I cicli del substrato amplificano i segnali metabolici e producono calore
                                        • 16.4.2. Il lattato e l'alanina formati dalla contrazione muscolare vengono utilizzati da altri organi
                                        • 16.4.3. La glicolisi e la gluconeogenesi sono interconnesse evolutivamente
                                        • La glicolisi è una via di conversione energetica in molti organismi
                                        • Il percorso glicolitico è strettamente controllato
                                        • Il glucosio può essere sintetizzato da precursori non carboidrati
                                        • La gluconeogenesi e la glicolisi sono regolate reciprocamente
                                        • Parole chiave
                                        • Problema del meccanismo
                                        • Problema di integrazione del capitolo
                                        • Problema di interpretazione dei dati
                                        • Problemi con i media
                                        • Dove iniziare
                                        • libri
                                        • Struttura degli enzimi glicolitici e gluconeogeni
                                        • Meccanismi catalitici
                                        • Regolamento
                                        • Trasportatori di zucchero
                                        • Malattie genetiche
                                        • Evoluzione
                                        • Aspetti storici
                                        • 17.1. Il ciclo dell'acido citrico ossida le unità a due atomi di carbonio
                                          • 17.1.1. La formazione di acetil coenzima A dal piruvato
                                          • 17.1.2. I collegamenti flessibili consentono alla lipoammide di spostarsi tra diversi siti attivi
                                          • 17.1.3. La citrato sintasi forma il citrato da ossalacetato e acetil coenzima A
                                          • 17.1.4. Il citrato viene isomerizzato in isocitrato
                                          • 17.1.5. L'isocitrato viene ossidato e decarbossilato a α-chetoglutarato
                                          • 17.1.6. Il succinil coenzima A è formato dalla decarbossilazione ossidativa del α-chetoglutarato
                                          • 17.1.7. Un composto ad alto potenziale di trasferimento di fosforile viene generato dal succinil coenzima A
                                          • 17.1.8. L'ossalacetato viene rigenerato dall'ossidazione del succinato
                                          • 17.1.9. Stechiometria del ciclo dell'acido citrico
                                          • 17.2.1. Il complesso della piruvato deidrogenasi è regolato allostericamente e mediante fosforilazione reversibile
                                          • 17.2.2. Il ciclo dell'acido citrico è controllato in diversi punti
                                          • 17.3.1. Il ciclo dell'acido citrico deve essere in grado di essere rapidamente reintegrato
                                          • 17.3.2. L'interruzione del metabolismo del piruvato è la causa del beriberi e dell'avvelenamento da mercurio e arsenico
                                          • 17.3.3. Speculazioni sulla storia evolutiva del ciclo dell'acido citrico
                                          • Il ciclo dell'acido citrico ossida le unità a due atomi di carbonio
                                          • L'ingresso nel ciclo dell'acido citrico e il metabolismo attraverso di esso sono controllati
                                          • Il ciclo dell'acido citrico è una fonte di precursori biosintetici
                                          • Il ciclo del gliossilato consente a piante e batteri di crescere su acetato
                                          • Parole chiave
                                          • Problema di integrazione del capitolo
                                          • Problemi di meccanismo
                                          • Interpretazione dei dati
                                          • Dove iniziare
                                          • Complesso della piruvato deidrogenasi
                                          • Struttura degli enzimi del ciclo dell'acido citrico
                                          • Organizzazione del ciclo dell'acido citrico
                                          • Regolamento
                                          • Aspetti evolutivi
                                          • Scoperta del ciclo dell'acido citrico
                                          • 18.1. La fosforilazione ossidativa negli eucarioti avviene nei mitocondri
                                            • 18.1.1. I mitocondri sono delimitati da una doppia membrana
                                            • 18.1.2. I mitocondri sono il risultato di un evento endosimbiotico
                                            • 18.2.1. Elettroni ad alta energia: potenziali redox e cambiamenti di energia libera
                                            • 18.2.2. Una differenza potenziale di 1,14 volt tra NADH e O2 Guida il trasporto di elettroni attraverso la catena e favorisce la formazione di un gradiente di protoni
                                            • 18.2.3. Gli elettroni possono essere trasferiti tra gruppi che non sono in contatto
                                            • 18.3.1. Gli elettroni ad alto potenziale di NADH entrano nella catena respiratoria alla NADH-Q ossidoreduttasi
                                            • 18.3.2. L'ubiquinolo è il punto di ingresso per gli elettroni di FADH2 di Flavoproteine
                                            • 18.3.3. Flusso di elettroni dall'ubichinolo al citocromo C Attraverso Q-citocromo C Ossidoreduttasi
                                            • 18.3.4. Trasporto di protoni transmembrana: il ciclo Q
                                            • 18.3.5. Citocromo C L'ossidasi catalizza la riduzione dell'ossigeno molecolare in acqua
                                            • 18.3.6. I derivati ​​tossici dell'ossigeno molecolare come il radicale superossido vengono eliminati dagli enzimi protettivi
                                            • 18.3.7. La conformazione del citocromo C È rimasto essenzialmente costante per più di un miliardo di anni
                                            • 18.4.1. L'ATP sintasi è composta da un'unità protonica e da un'unità catalitica
                                            • 18.4.2. Il flusso di protoni attraverso la sintasi dell'ATP porta al rilascio di ATP strettamente legato: il meccanismo di modifica del legame
                                            • 18.4.3. Il motore molecolare più piccolo del mondo: catalisi rotazionale
                                            • 18.4.4. Il flusso di protoni attorno all'anello c alimenta la sintesi dell'ATP
                                            • 18.4.5. L'ATP sintasi e le proteine ​​G hanno diverse caratteristiche comuni
                                            • 18.5.1. Gli elettroni del NADH citosolico entrano nei mitocondri tramite navette
                                            • 18.5.2. L'ingresso di ADP nei mitocondri è accoppiato all'uscita di ATP da ATP-ADP Translocase
                                            • 18.5.3. I trasportatori mitocondriali per i metaboliti hanno un motivo tripartito comune
                                            • 18.6.1. L'ossidazione completa del glucosio produce circa 30 molecole di ATP
                                            • 18.6.2. Il tasso di fosforilazione ossidativa è determinato dalla necessità di ATP
                                            • 18.6.3. La fosforilazione ossidativa può essere inibita in molte fasi
                                            • 18.6.4. Il disaccoppiamento regolato porta alla generazione di calore
                                            • 18.6.5. Si scoprono malattie mitocondriali
                                            • 18.6.6. I mitocondri giocano un ruolo chiave nell'apoptosi
                                            • 18.6.7. Trasmissione di potenza per gradienti di protoni: un motivo centrale della bioenergetica
                                            • La fosforilazione ossidativa negli eucarioti avviene nei mitocondri
                                            • La fosforilazione ossidativa dipende dal trasferimento di elettroni
                                            • La catena respiratoria è costituita da quattro complessi: tre pompe protoniche e un collegamento fisico al ciclo dell'acido citrico
                                            • Un gradiente di protoni alimenta la sintesi di ATP
                                            • Molte navette consentono il movimento attraverso le membrane mitocondriali
                                            • La regolazione della fosforilazione ossidativa è governata principalmente dalla necessità di ATP
                                            • Parole chiave
                                            • Problema di integrazione del capitolo
                                            • Problema di interpretazione dei dati
                                            • Problema del meccanismo
                                            • Problema multimediale
                                            • Dove iniziare
                                            • libri
                                            • Catena di trasporto degli elettroni
                                            • ATP sintasi
                                            • traslocatori
                                            • Superossido dismutasi e catalasi
                                            • Malattie mitocondriali
                                            • apoptosi
                                            • Aspetti storici
                                            • 19.1. La fotosintesi avviene nei cloroplasti
                                              • 19.1.1. Gli eventi primari della fotosintesi avvengono nelle membrane tilacoidi
                                              • 19.1.2. L'evoluzione dei cloroplasti
                                              • 19.2.1. I batteri fotosintetici e i centri di reazione fotosintetica delle piante verdi hanno un nucleo comune
                                              • 19.2.2.Una speciale coppia di clorofille avvia la separazione della carica
                                              • 19.3.1. Il fotosistema II trasferisce gli elettroni dall'acqua al plastochinone e genera un gradiente di protoni
                                              • 19.3.2. Citocromo bf Collega Photosystem II a Photosystem I
                                              • 19.3.3. Il fotosistema I utilizza l'energia della luce per generare ferredossina ridotta, un potente riducente
                                              • 19.3.4. Ferredossina-NADP + reduttasi Converte NADP + in NADPH
                                              • 19.4.1. L'ATP sintasi dei cloroplasti assomiglia molto a quella dei mitocondri e dei procarioti
                                              • 19.4.2. Il flusso di elettroni ciclico attraverso il fotosistema I porta alla produzione di ATP invece di NADPH
                                              • 19.4.3. L'assorbimento di otto fotoni produce uno O2, due NADPH e tre molecole di ATP
                                              • 19.5.1. Il trasferimento di energia per risonanza consente all'energia di spostarsi dal sito di assorbimento iniziale al centro di reazione
                                              • 19.5.2. I complessi che raccolgono la luce contengono clorofille e carotenoidi aggiuntivi
                                              • 19.5.3. I ficobilisomi fungono da tubi di luce molecolare nei cianobatteri e nelle alghe rosse
                                              • 19.5.4. I componenti della fotosintesi sono altamente organizzati
                                              • 19.5.5. Molti erbicidi inibiscono le reazioni alla luce della fotosintesi
                                              • La fotosintesi avviene nei cloroplasti
                                              • L'assorbimento della luce da parte della clorofilla induce il trasferimento di elettroni
                                              • Due fotosistemi generano un gradiente di protoni e NADPH nella fotosintesi ossigenica
                                              • Un gradiente di protoni attraverso la membrana tilacoide guida la sintesi dell'ATP
                                              • I pigmenti accessori incanalano l'energia nei centri di reazione
                                              • La capacità di convertire la luce in energia chimica è antica
                                              • Parole chiave
                                              • Problema del meccanismo
                                              • Interpretazione dei dati e problema di integrazione dei capitoli
                                              • Dove iniziare
                                              • Libri e recensioni generali
                                              • Meccanismi di trasferimento di elettroni
                                              • Fotosistema II
                                              • Evoluzione dell'ossigeno
                                              • Fotosistema I e citocromo bf
                                              • ATP sintasi
                                              • Assemblaggi per la raccolta della luce
                                              • Evoluzione
                                              • 20.1. Il ciclo di Calvin sintetizza esosi da anidride carbonica e acqua
                                                • 20.1.1. L'anidride carbonica reagisce con il ribosio 1,5-bisfosfato per formare due molecole di 3-fosfoglicerato
                                                • 20.1.2. Imperfezione catalitica: Rubisco catalizza anche una reazione di ossigenasi dispendiosa
                                                • 20.1.3. I fosfati esosi sono costituiti da fosfoglicerato e il ribosio 1,5-bisfosfato viene rigenerato
                                                • 20.1.4. Tre molecole di ATP e due molecole di NADPH vengono utilizzate per portare l'anidride carbonica al livello di un esoso
                                                • 20.1.5. L'amido e il saccarosio sono i principali depositi di carboidrati nelle piante
                                                • 20.2.1. Rubisco viene attivato dai cambiamenti guidati dalla luce nelle concentrazioni di protoni e ioni di magnesio
                                                • 20.2.2. La tioredossina svolge un ruolo chiave nella regolazione del ciclo di Calvin
                                                • 20.2.3. il C4 Il percorso delle piante tropicali accelera la fotosintesi concentrando l'anidride carbonica
                                                • 20.2.4. Il metabolismo dell'acido crassulaceo consente la crescita negli ecosistemi aridi
                                                • 20.3.1. Due molecole di NADPH vengono generate nella conversione del glucosio 6-fosfato in ribulosio 5-fosfato
                                                • 20.3.2. Il percorso del pentosio fosfato e la glicolisi sono collegati da transchetolasi e transaldolasi
                                                • 20.3.3. La transchetolasi e la transaldolasi stabilizzano gli intermedi carbanionici con diversi meccanismi
                                                • 20.4.1. Il tasso del percorso del fosfato pentoso è controllato dal livello di NADP +
                                                • 20.4.2. Il flusso di glucosio 6-fosfato dipende dalla necessità di NADPH, ribosio 5-fosfato e ATP
                                                • 20.4.3. Attraverso lo specchio: il ciclo di Calvin e la via del fosfato pentoso
                                                • 20.5.1. La carenza di glucosio 6-fosfato deidrogenasi provoca un'anemia emolitica indotta da farmaci
                                                • 20.5.2. Una carenza di glucosio 6-fosfato deidrogenasi conferisce un vantaggio evolutivo in alcune circostanze
                                                • Il ciclo di Calvin sintetizza esosi da anidride carbonica e acqua
                                                • L'attività del ciclo di Calvin dipende dalle condizioni ambientali
                                                • Il percorso del pentosio fosfato genera NADPH e sintetizza zuccheri a cinque atomi di carbonio
                                                • Il metabolismo del glucosio 6-fosfato da parte del percorso del pentoso fosfato è coordinato con la glicolisi
                                                • La glucosio 6-fosfato deidrogenasi svolge un ruolo chiave nella protezione contro le specie reattive dell'ossigeno
                                                • Parole chiave
                                                • Problemi di meccanismo
                                                • Problemi di integrazione del capitolo
                                                • Problema di interpretazione della data
                                                • Dove iniziare
                                                • Libri e recensioni generali
                                                • Enzimi e meccanismi di reazione
                                                • Fissazione dell'anidride carbonica e rubisco
                                                • Regolamento
                                                • Glucosio 6-fosfato deidrogenasi
                                                • Evoluzione
                                                • 21.1. La degradazione del glicogeno richiede l'interazione di diversi enzimi
                                                  • 21.1.1. La fosforilasi catalizza la scissione fosforolitica del glicogeno per rilasciare il glucosio 1-fosfato
                                                  • 21.1.2. È necessario anche un enzima deramificante per la degradazione del glicogeno
                                                  • 21.1.3. La fosfoglucomutasi converte il glucosio 1-fosfato in glucosio 6-fosfato
                                                  • 21.1.4. Il fegato contiene glucosio 6-fosfatasi, un enzima idrolitico assente dal muscolo
                                                  • 21.1.5. Il piridossale fosfato partecipa alla scissione fosforolitica del glicogeno
                                                  • 21.2.1. La fosforilasi muscolare è regolata dalla carica energetica intracellulare
                                                  • 21.2.2. La fosforilasi epatica produce glucosio per l'utilizzo da parte di altri tessuti
                                                  • 21.2.3. La fosforilasi chinasi viene attivata dalla fosforilazione e dagli ioni di calcio
                                                  • 21.3.1. Le proteine ​​G trasmettono il segnale per l'inizio della degradazione del glicogeno
                                                  • 21.3.2. La degradazione del glicogeno deve essere in grado di essere rapidamente disattivata
                                                  • 21.3.3. La regolazione della glicogeno fosforilasi è diventata più sofisticata con l'evoluzione dell'enzima
                                                  • 21.4.1. UDP-Glucose è una forma attivata di glucosio
                                                  • 21.4.2. La glicogeno sintasi catalizza il trasferimento del glucosio da UDP-glucosio a una catena in crescita
                                                  • 21.4.3. Un enzima ramificato forma α-1,6 collegamenti
                                                  • 21.4.4. La glicogeno sintasi è l'enzima regolatore chiave nella sintesi del glicogeno
                                                  • 21.4.5. Il glicogeno è una forma di conservazione efficiente del glucosio
                                                  • 21.5.1. La fosfatasi proteica 1 inverte gli effetti regolatori delle chinasi sul metabolismo del glicogeno
                                                  • 21.5.2. L'insulina stimola la sintesi del glicogeno attivando la proteina fosfatasi 1
                                                  • 21.5.3. Il metabolismo del glicogeno nel fegato regola il livello di glucosio nel sangue
                                                  • 21.5.4. È possibile una comprensione biochimica delle malattie da accumulo di glicogeno
                                                  • La degradazione del glicogeno richiede l'interazione di diversi enzimi
                                                  • La fosforilasi è regolata da interazioni allosteriche e fosforilazione reversibile
                                                  • L'adrenalina e il glucagone segnalano la necessità di abbattere il glicogeno
                                                  • Il glicogeno viene sintetizzato e degradato da diversi percorsi
                                                  • La scomposizione e la sintesi del glicogeno sono regolate in modo reciproco
                                                  • Parole chiave
                                                  • Problema del meccanismo
                                                  • Capitolo Problemi di integrazione e interpretazione dei dati
                                                  • Problema multimediale
                                                  • Dove iniziare
                                                  • Libri e recensioni generali
                                                  • Studi cristallografici a raggi X
                                                  • Innesco della sintesi del glicogeno
                                                  • Meccanismi catalitici
                                                  • Regolazione del metabolismo del glicogeno
                                                  • Malattie genetiche
                                                  • Evoluzione
                                                  • 22.1. I triacilgliceroli sono depositi di energia altamente concentrati
                                                    • 22.1.1. I lipidi alimentari vengono digeriti dalle lipasi pancreatiche
                                                    • 22.1.2. I lipidi alimentari sono trasportati nei chilomicroni
                                                    • 22.2.1. I triacilgliceroli vengono idrolizzati da lipasi cicliche regolate da AMP
                                                    • 22.2.2. Gli acidi grassi sono collegati al coenzima A prima di essere ossidati
                                                    • 22.2.3. La carnitina trasporta gli acidi grassi attivati ​​a catena lunga nella matrice mitocondriale
                                                    • 22.2.4. Acetil CoA, NADH e FADH2 Vengono generati in ogni ciclo di ossidazione degli acidi grassi
                                                    • 22.2.5. L'ossidazione completa del palmitato produce 106 molecole di ATP
                                                    • 22.3.1. Un'isomerasi e una reduttasi sono necessarie per l'ossidazione degli acidi grassi insaturi
                                                    • 22.3.2. Gli acidi grassi a catena dispari producono propionil coenzima A nella fase finale di tiolisi
                                                    • 22.3.3. Il propionil CoA viene convertito in succinil CoA in una reazione che richiede vitamina B12
                                                    • 22.3.4. Anche gli acidi grassi vengono ossidati nei perossisomi
                                                    • 22.3.5. I corpi chetonici si formano dall'acetil coenzima A quando predomina la disgregazione del grasso
                                                    • 22.3.6. I corpi chetonici sono un combustibile importante in alcuni tessuti
                                                    • 22.3.7. Gli animali non possono convertire gli acidi grassi in glucosio
                                                    • 22.4.1. La formazione del malonil coenzima A è il passo obbligato nella sintesi degli acidi grassi
                                                    • 22.4.2. Gli intermedi nella sintesi degli acidi grassi sono legati a una proteina trasportatrice di acile
                                                    • 22.4.3. Il ciclo di allungamento nella sintesi degli acidi grassi
                                                    • 22.4.4. Gli acidi grassi sono sintetizzati da un complesso enzimatico multifunzionale negli eucarioti
                                                    • 22.4.5. L'unità fosfopanteteinile flessibile dell'ACP trasporta il substrato da un sito attivo all'altro
                                                    • 22.4.6. La stechiometria della sintesi degli acidi grassi
                                                    • 22.4.7. Il citrato trasporta i gruppi acetile dai mitocondri al citosol per la sintesi degli acidi grassi
                                                    • 22.4.8. Fonti di NADPH per la sintesi di acidi grassi
                                                    • 22.4.9. Gli inibitori della sintasi degli acidi grassi possono essere farmaci utili
                                                    • 22.4.10. Variazioni su un tema: le sintetasi dei polichetidi e dei peptidi non ribosomiali assomigliano alla sintasi degli acidi grassi
                                                    • Regolamento globale
                                                    • Regolamento locale
                                                    • Risposta alla dieta
                                                    • 22.6.1. Gli enzimi legati alla membrana generano acidi grassi insaturi
                                                    • 22.6.2. Gli ormoni eicosanoidi derivano dagli acidi grassi polinsaturi
                                                    • I triacilgliceroli sono depositi di energia altamente concentrati
                                                    • L'utilizzo di acidi grassi come combustibile richiede tre fasi di lavorazione
                                                    • Alcuni acidi grassi richiedono passaggi aggiuntivi per la degradazione
                                                    • Gli acidi grassi vengono sintetizzati e degradati da percorsi diversi
                                                    • L'acetil coenzima A carbossilasi svolge un ruolo chiave nel controllo del metabolismo degli acidi grassi
                                                    • L'allungamento e l'insaturazione degli acidi grassi sono raggiunti da sistemi di enzimi accessori
                                                    • Parole chiave
                                                    • Problemi di meccanismo
                                                    • Problemi di integrazione del capitolo
                                                    • Problema di interpretazione dei dati
                                                    • Problema multimediale
                                                    • Dove iniziare
                                                    • libri
                                                    • Ossidazione degli acidi grassi
                                                    • Sintesi degli acidi grassi
                                                    • Acetil CoA carbossilasi
                                                    • Eicosanoidi
                                                    • Malattie genetiche
                                                    • 23.1. Le proteine ​​vengono degradate ad aminoacidi
                                                      • 23.1.1. La digestione e l'assorbimento delle proteine ​​alimentari
                                                      • 23.1.2. Le proteine ​​cellulari vengono degradate a velocità diverse
                                                      • 23.2.1. L'ubiquitina tagga le proteine ​​per la distruzione
                                                      • 23.2.2. Il proteasoma digerisce le proteine ​​etichettate con l'ubiquitina
                                                      • 23.2.3. La degradazione delle proteine ​​può essere utilizzata per regolare la funzione biologica
                                                      • 23.2.4. La via dell'ubiquitina e il proteasoma hanno controparti procariotiche
                                                      • 23.3.1. I gruppi alfa-amminici vengono convertiti in ioni di ammonio dalla deaminazione ossidativa del glutammato
                                                      • 23.3.2. Il piridossal fosfato forma intermedi di base di Schiff nelle aminotransferasi
                                                      • 23.3.3. L'aspartato aminotransferasi è un membro di una famiglia ampia e versatile di enzimi dipendenti dal piridossale
                                                      • 23.3.4. La serina e la treonina possono essere deaminate direttamente
                                                      • 23.3.5. I tessuti periferici trasportano l'azoto al fegato
                                                      • 23.4.1. Il ciclo dell'urea inizia con la formazione di carbamoil fosfato
                                                      • 23.4.2. Il ciclo dell'urea è collegato al ciclo dell'acido citrico
                                                      • 23.4.3. L'evoluzione del ciclo dell'urea
                                                      • 23.4.4. Difetti ereditari del ciclo dell'urea causano iperammonemia e possono portare a danni cerebrali
                                                      • 23.4.5. L'urea non è l'unico mezzo per smaltire l'azoto in eccesso
                                                      • 23.5.1. Piruvato come punto di ingresso nel metabolismo
                                                      • 23.5.2. Ossalacetato come punto di ingresso nel metabolismo
                                                      • 23.5.3. Alfa-chetoglutarato come punto di ingresso nel metabolismo
                                                      • 23.5.4. Il succinil coenzima A è un punto di ingresso per diversi amminoacidi non polari
                                                      • 23.5.5. La degradazione della metionina richiede la formazione di un donatore chiave di metile, la S-adenosilmetionina
                                                      • 23.5.6. Gli aminoacidi a catena ramificata producono acetil CoA, acetoacetato o propionil CoA
                                                      • 23.5.7. Le ossigenasi sono necessarie per la degradazione degli amminoacidi aromatici
                                                      • Le proteine ​​vengono degradate ad aminoacidi
                                                      • Il fatturato delle proteine ​​è strettamente regolamentato
                                                      • Il primo passo nella degradazione degli aminoacidi è la rimozione dell'azoto
                                                      • Lo ione ammonio viene convertito in urea nella maggior parte dei vertebrati terrestri
                                                      • Gli atomi di carbonio degli amminoacidi degradati emergono come principali intermedi metabolici
                                                      • Errori congeniti del metabolismo possono interrompere la degradazione degli aminoacidi
                                                      • Parole chiave
                                                      • Problemi di meccanismo
                                                      • Problemi di integrazione del capitolo
                                                      • Problema di interpretazione dei dati
                                                      • Dove iniziare
                                                      • libri
                                                      • Ubiquitina e il proteasoma
                                                      • Enzimi piridossal fosfato dipendenti
                                                      • Enzimi del ciclo dell'urea
                                                      • Degradazione degli aminoacidi
                                                      • Malattie genetiche
                                                      • Aspetti storici e processo di scoperta
                                                      • Capitolo 24. La biosintesi degli aminoacidi
                                                        • 24.1. Fissazione dell'azoto: i microrganismi usano l'ATP e un potente riducente per ridurre l'azoto atmosferico in ammoniaca
                                                          • 24.1.1. Il cofattore ferro-molibdeno dell'azoto si lega e riduce l'azoto atmosferico
                                                          • 24.1.2. Lo ione ammonio viene assimilato in un amminoacido attraverso glutammato e glutammina
                                                          • 24.2.1. Gli esseri umani possono sintetizzare alcuni amminoacidi ma devono ottenerne altri dalla dieta
                                                          • 24.2.2. Un passaggio comune determina la chiralità di tutti gli amminoacidi
                                                          • 24.2.3. È necessario un intermedio adenilato per formare l'asparagina dall'aspartato
                                                          • 24.2.4. Il glutammato è il precursore di glutammina, prolina e arginina
                                                          • 24.2.5. Serina, cisteina e glicina sono formate da 3-fosfoglicerato
                                                          • 24.2.6. Il tetraidrofolato trasporta unità a un carbonio attivo a diversi livelli di ossidazione
                                                          • 24.2.7. S-L'adenosilmetionina è il principale donatore di gruppi metilici
                                                          • 24.2.8. La cisteina viene sintetizzata da serina e omocisteina
                                                          • 24.2.9. Livelli elevati di omocisteina sono associati a malattie vascolari
                                                          • 24.2.10. Shikimate e Chorismate sono intermedi nella biosintesi degli amminoacidi aromatici
                                                          • 24.2.11. La triptofano sintetasi illustra la canalizzazione del substrato nella catalisi enzimatica
                                                          • 24.3.1. I percorsi ramificati richiedono una regolamentazione sofisticata
                                                          • 24.3.2. L'attività della glutammina sintetasi è modulata da una cascata enzimatica
                                                          • 24.4.1. Il glutatione, un peptide gamma-glutamil, funge da tampone sulfidrilico e antiossidante
                                                          • 24.4.2. L'ossido nitrico, una molecola segnale di breve durata, è formato dall'arginina
                                                          • 24.4.3. Le porfirine dei mammiferi sono sintetizzate dalla glicina e dal succinil coenzima A
                                                          • 24.4.4. Le porfirine si accumulano in alcuni disturbi ereditari del metabolismo delle porfirine
                                                          • Fissazione dell'azoto: i microrganismi usano l'ATP e un potente riducente per ridurre l'azoto atmosferico in ammoniaca
                                                          • Gli amminoacidi sono costituiti da intermedi del ciclo dell'acido citrico e da altre vie principali
                                                          • La biosintesi degli aminoacidi è regolata dall'inibizione del feedback
                                                          • Gli amminoacidi sono precursori di molte biomolecole
                                                          • Parole chiave
                                                          • Problemi di meccanismo
                                                          • Problemi di integrazione del capitolo
                                                          • Capitolo Problema di integrazione e interpretazione dei dati
                                                          • Dove iniziare
                                                          • libri
                                                          • Fissazione dell'azoto
                                                          • Regolazione della biosintesi degli aminoacidi
                                                          • Biosintesi degli aminoacidi aromatici
                                                          • Glutatione
                                                          • Etilene e ossido nitrico
                                                          • Biosintesi delle porfirine
                                                          • 25.1. Nella sintesi de Novo, l'anello pirimidinico è assemblato da bicarbonato, aspartato e glutammina
                                                            • 25.1.1. Il bicarbonato e altri composti di carbonio ossigenato vengono attivati ​​dalla fosforilazione
                                                            • 25.1.2. La catena laterale della glutammina può essere idrolizzata per generare ammoniaca
                                                            • 25.1.3. Gli intermedi possono spostarsi tra i siti attivi tramite la canalizzazione
                                                            • 25.1.4. L'orotato acquisisce un anello ribosio dal PRPP per formare un nucleotide pirimidinico e viene convertito in uridilato
                                                            • 25.1.5. I nucleotidi mono-, di- e trifosfati sono interconvertibili
                                                            • 25.1.6. CTP è formato da Amination of UTP
                                                            • 25.2.1. I percorsi di salvataggio economizzano la spesa energetica intracellulare
                                                            • 25.2.2. Il sistema ad anello purinico è assemblato su ribosio fosfato
                                                            • 25.2.3. L'anello purinico è assemblato in fasi successive di attivazione per fosforilazione seguite da spostamento
                                                            • 25.2.4. AMP e GMP sono formati da IMP
                                                            • 25.3.1. Il timidilato è formato dalla metilazione del desossiuridilato
                                                            • 25.3.2. La diidrofolato reduttasi catalizza la rigenerazione del tetraidrofolato, un trasportatore di un carbonio
                                                            • 25.3.3. Diversi preziosi farmaci antitumorali bloccano la sintesi del timidilato
                                                            • 25.6.1. Le purine sono degradate a urato negli esseri umani
                                                            • 25.6.2. La sindrome di Lesch-Nyhan è una drammatica conseguenza delle mutazioni in un enzima della via di salvataggio
                                                            • Nella sintesi de Novo, l'anello pirimidinico è assemblato da bicarbonato, aspartato e glutammina
                                                            • Le basi delle purine possono essere sintetizzate ex novo o riciclate mediante percorsi di salvataggio
                                                            • I desossiribonucleotidi sono sintetizzati dalla riduzione dei ribonucleotidi attraverso un meccanismo radicale
                                                            • I passaggi chiave nella biosintesi dei nucleotidi sono regolati dall'inibizione del feedback
                                                            • NAD +, FAD e coenzima A sono formati da ATP
                                                            • Le interruzioni nel metabolismo dei nucleotidi possono causare condizioni patologiche
                                                            • Parole chiave
                                                            • Problemi di meccanismo
                                                            • Problemi di integrazione del capitolo
                                                            • Dove iniziare
                                                            • Biosintesi delle pirimidine
                                                            • Biosintesi delle purine
                                                            • Ribonucleotide reduttasi
                                                            • timidilato sintasi e diidrofolato reduttasi
                                                            • Malattie genetiche
                                                            • 26.1. Il fosfatidato è un comune intermedio nella sintesi di fosfolipidi e triacilgliceroli
                                                              • 26.1.1. La sintesi dei fosfolipidi richiede un intermedio attivato
                                                              • 26.1.2. I plasmalogeni e altri eteri fosfolipidi vengono sintetizzati dal diidrossiacetone fosfato
                                                              • 26.1.3. Gli sfingolipidi sono sintetizzati dalla ceramide
                                                              • 26.1.4. I gangliosidi sono sfingolipidi ricchi di carboidrati che contengono zuccheri acidi
                                                              • 26.1.5. Gli sfingolipidi conferiscono diversità alla struttura e alla funzione dei lipidi
                                                              • 26.1.6. La sindrome da distress respiratorio e la malattia di Tay-Sachs derivano dall'interruzione del metabolismo dei lipidi
                                                              • 26.2.1. La sintesi del mevalonato, che viene attivato come isopentenil pirofosfato, avvia la sintesi del colesterolo
                                                              • 26.2.2. Squalene (C30) è sintetizzato da sei molecole di isopentenil pirofosfato (C5)
                                                              • 26.2.3. Lo squalene ciclizza per formare il colesterolo
                                                              • 26.3.1. Le lipoproteine ​​trasportano colesterolo e triacilgliceroli in tutto l'organismo
                                                              • 26.3.2. I livelli ematici di alcune lipoproteine ​​possono servire a scopi diagnostici
                                                              • 26.3.3. Le lipoproteine ​​a bassa densità svolgono un ruolo centrale nel metabolismo del colesterolo
                                                              • 26.3.4. Il recettore LDL è una proteina transmembrana con cinque diverse regioni funzionali
                                                              • 26.3.5. L'assenza del recettore LDL porta a ipercolesterolemia e aterosclerosi
                                                              • 26.3.6. La gestione clinica dei livelli di colesterolo può essere compresa a livello biochimico
                                                              • Sali biliari
                                                              • Ormoni steroidei
                                                              • 26.4.1. La nomenclatura degli ormoni steroidei
                                                              • 26.4.2. Gli steroidi sono idrossilati dalle monoossigenasi del citocromo P450 che utilizzano NADPH e O2
                                                              • 26.4.3. Il sistema Cytochrome P450 è molto diffuso e svolge una funzione protettiva
                                                              • 26.4.4. Il pregnenolone, un precursore di molti altri steroidi, è formato dal colesterolo dalla scissione della sua catena laterale
                                                              • 26.4.5. La sintesi di progesterone e corticosteroidi da pregnenolone
                                                              • 26.4.6. La sintesi di androgeni ed estrogeni da pregnenolone
                                                              • 26.4.7. La vitamina D è derivata dal colesterolo dall'attività di divisione dell'anello della luce
                                                              • 26.4.8. L'isopentenil pirofosfato è un precursore di un'ampia varietà di biomolecole
                                                              • Il fosfatidato è un comune intermedio nella sintesi di fosfolipidi e triacilgliceroli
                                                              • Il colesterolo viene sintetizzato dall'acetil coenzima A in tre fasi
                                                              • La complessa regolazione della biosintesi del colesterolo avviene a diversi livelli
                                                              • Importanti derivati ​​del colesterolo includono sali biliari e ormoni steroidei
                                                              • Parole chiave
                                                              • Problema del meccanismo
                                                              • Interpretazione dei dati e problemi di integrazione dei capitoli
                                                              • Dove iniziare
                                                              • libri
                                                              • Fosfolipidi e sfingolipidi
                                                              • Biosintesi di colesterolo e steroidi
                                                              • Lipoproteine ​​e loro recettori
                                                              • Attivazione dell'ossigeno e catalisi del P450
                                                              • 27.1. Il DNA può assumere una varietà di forme strutturali
                                                                • 27.1.1. A-DNA è una doppia elica con caratteristiche diverse da quelle del più comune B-DNA
                                                                • 27.1.2. Le scanalature maggiori e minori sono allineate da gruppi di legame idrogeno specifici della sequenza
                                                                • 27.1.3.I risultati degli studi sui singoli cristalli di DNA hanno rivelato variazioni locali nella struttura del DNA
                                                                • 27.1.4. Z-DNA è una doppia elica sinistrorsa in cui i fosfati della spina dorsale zigzagano
                                                                • 27.2.1. Tutte le DNA polimerasi hanno caratteristiche strutturali in comune
                                                                • 27.2.2. Due ioni metallici legati partecipano alla reazione della polimerasi
                                                                • 27.2.3. La specificità della replicazione è dettata dal legame a idrogeno e dalla complementarità della forma tra le basi
                                                                • 27.2.4. Molte polimerasi correggono le basi appena aggiunte e gli errori delle accise
                                                                • 27.2.5. La separazione dei filamenti di DNA richiede elicasi specifiche e idrolisi dell'ATP
                                                                • 27.3.1. Il numero di collegamento del DNA, una proprietà topologica, determina il grado di superavvolgimento
                                                                • 27.3.2. La torsione elicoidale e la torsione superelica sono correlate tra loro attraverso il numero di collegamento
                                                                • 27.3.3. Le topoisomerasi di tipo I rilassano le strutture superavvolte
                                                                • 27.3.4. Le topoisomerasi di tipo II possono introdurre superavvolgimenti negativi attraverso l'accoppiamento all'idrolisi dell'ATP
                                                                • 27.4.1. Un primer di RNA sintetizzato da Primase consente l'inizio della sintesi del DNA
                                                                • 27.4.2. Un filamento di DNA viene prodotto continuamente, mentre l'altro filamento viene sintetizzato in frammenti
                                                                • 27.4.3. La DNA ligasi unisce le estremità del DNA nelle regioni duplex
                                                                • 27.4.4. La replicazione del DNA richiede polimerasi altamente processive
                                                                • 27.4.5. I filoni principali e in ritardo vengono sintetizzati in modo coordinato
                                                                • 27.4.6. La sintesi del DNA è più complessa negli eucarioti che nei procarioti
                                                                • 27.4.7. I telomeri sono strutture uniche alle estremità dei cromosomi lineari
                                                                • 27.4.8. I telomeri vengono replicati dalla telomerasi, una polimerasi specializzata che trasporta il proprio modello di RNA
                                                                • 27.5.1. Le reazioni di ricombinazione procedono attraverso gli intermedi di giunzione di Holliday
                                                                • 27.5.2. Le ricombinasi sono evolutivamente correlate alle topoisomerasi
                                                                • 27.6.1. Alcuni mutageni chimici sono piuttosto specifici
                                                                • 27.6.2. La luce ultravioletta produce dimeri di pirimidina
                                                                • 27.6.3. Viene utilizzata una varietà di percorsi di riparazione del DNA
                                                                • 27.6.4. La presenza di timina al posto dell'uracile nel DNA permette la riparazione della citosina deaminata
                                                                • 27.6.5. Molti tumori sono causati da una riparazione difettosa del DNA
                                                                • 27.6.6. Alcune malattie genetiche sono causate dall'espansione delle ripetizioni di tre nucleotidi
                                                                • 27.6.7. Molti potenziali agenti cancerogeni possono essere rilevati dalla loro azione mutagena sui batteri
                                                                • Il DNA può assumere una varietà di forme strutturali
                                                                • Le DNA polimerasi richiedono un modello e un primer
                                                                • Il DNA a doppio filamento può avvolgersi su se stesso per formare strutture superavvolte
                                                                • La replicazione del DNA di entrambi i filamenti procede rapidamente da specifici siti di inizio
                                                                • Molecole di DNA a doppio filamento con sequenze simili a volte si ricombinano
                                                                • Le mutazioni sono prodotte da diversi tipi di cambiamenti nella sequenza di basi del DNA
                                                                • Parole chiave
                                                                • Problemi di meccanismo
                                                                • Interpretazione dei dati e problemi di integrazione dei capitoli
                                                                • Problema multimediale
                                                                • Da dove cominciare
                                                                • libri
                                                                • struttura del DNA
                                                                • Topologia del DNA e topoisomerasi
                                                                • Meccanismo di replica
                                                                • DNA polimerasi e altri enzimi di replicazione
                                                                • ricombinasi
                                                                • Mutazioni e riparazione del DNA
                                                                • Riparazione difettosa del DNA e cancro
                                                                • 28.1. La trascrizione è catalizzata dalla RNA polimerasi
                                                                  • 28.1.1. La trascrizione viene avviata nei siti promotori sul modello del DNA
                                                                  • 28.1.2. Le subunità Sigma della RNA polimerasi riconoscono i siti promotori
                                                                  • 28.1.3. L'RNA polimerasi deve srotolare la doppia elica del modello affinché la trascrizione abbia luogo
                                                                  • 28.1.4. Le catene di RNA si formano de Novo e crescono nella direzione 5′-to-3′
                                                                  • 28.1.5. L'allungamento avviene nelle bolle di trascrizione che si muovono lungo il modello del DNA
                                                                  • 28.1.6. Una forcina di RNA seguita da diversi residui di uracile interrompe la trascrizione di alcuni geni
                                                                  • 28.1.7. La proteina Rho aiuta a terminare la trascrizione di alcuni geni
                                                                  • 28.1.8. I precursori del trasferimento e l'RNA ribosomiale vengono scissi e modificati chimicamente dopo la trascrizione
                                                                  • 28.1.9. Inibitori antibiotici della trascrizione
                                                                  • 28.2.1. L'RNA nelle cellule eucariotiche è sintetizzato da tre tipi di RNA polimerasi
                                                                  • 28.2.2. Elementi cis e trans-acting: serrature e chiavi di trascrizione
                                                                  • 28.2.3. La maggior parte dei promotori per l'RNA polimerasi II contiene una scatola TATA vicino al sito di inizio della trascrizione
                                                                  • 28.2.4. La proteina legante la scatola TATA avvia l'assemblaggio del complesso di trascrizione attivo
                                                                  • 28.2.5. Più fattori di trascrizione interagiscono con i promotori eucariotici
                                                                  • 28.2.6. Le sequenze di potenziamento possono stimolare la trascrizione nei siti iniziali a migliaia di basi di distanza
                                                                  • 28.3.1. Le estremità del trascritto pre-mRNA acquisiscono un cappuccio 5′ e una coda Poly(A) 3′
                                                                  • 28.3.2. L'editing dell'RNA modifica le proteine ​​codificate dall'mRNA
                                                                  • 28.3.3. I siti di giunzione nei precursori dell'mRNA sono specificati da sequenze alle estremità degli introni
                                                                  • 28.3.4. Lo splicing consiste in due reazioni di transesterificazione
                                                                  • 28.3.5. Piccoli RNA nucleari negli spliceosomi catalizzano lo splicing dei precursori dell'mRNA
                                                                  • 28.3.6. Alcune molecole di pre-mRNA possono essere unite in modi alternativi per produrre diversi mRNA
                                                                  • La trascrizione è catalizzata dalla RNA polimerasi
                                                                  • La trascrizione e la traduzione eucariotiche sono separate nello spazio e nel tempo
                                                                  • Vengono elaborati i prodotti di trascrizione di tutte e tre le polimerasi eucariotiche
                                                                  • La scoperta dell'RNA catalitico è stata rivelatrice per quanto riguarda sia il meccanismo che l'evoluzione
                                                                  • Parole chiave
                                                                  • Problema del meccanismo
                                                                  • Problemi di integrazione del capitolo
                                                                  • Problemi di interpretazione dei dati
                                                                  • Da dove cominciare
                                                                  • libri
                                                                  • RNA polimerasi
                                                                  • Iniziazione e allungamento
                                                                  • Promotori, potenziatori e fattori di trascrizione
                                                                  • Cessazione
                                                                  • 5′-Formazione del cappuccio e poliadenilazione
                                                                  • Modifica dell'RNA
                                                                  • Splicing dei precursori dell'mRNA
                                                                  • Auto-splicing e catalisi dell'RNA
                                                                  • 29.1. La sintesi proteica richiede la traduzione delle sequenze nucleotidiche in sequenze di amminoacidi
                                                                    • 29.1.1. La sintesi di proteine ​​lunghe richiede una bassa frequenza di errore
                                                                    • 29.1.2. Le molecole di RNA di trasferimento hanno un design comune
                                                                    • 29.1.3. L'amminoacido attivato e l'anticodone del tRNA sono alle estremità opposte della molecola a forma di L
                                                                    • 29.2.1. Gli amminoacidi vengono prima attivati ​​dall'adenilazione
                                                                    • 29.2.2. Le sintetasi delle amminoacil-tRNA hanno siti di attivazione degli amminoacidi altamente discriminanti
                                                                    • 29.2.3. La correzione di bozze da parte delle sintetasi dell'aminoacil-tRNA aumenta la fedeltà della sintesi proteica
                                                                    • 29.2.4. Le sintetasi riconoscono i loop dell'anticodone e gli steli accettori delle molecole di RNA di trasferimento
                                                                    • 29.2.5. Le sintetasi di aminoacil-tRNA possono essere suddivise in due classi
                                                                    • 29.3.1. Gli RNA ribosomiali (5S, 16S e 23S rRNA) svolgono un ruolo centrale nella sintesi proteica
                                                                    • 29.3.2. Le proteine ​​sono sintetizzate nella direzione ammino-carbossilica
                                                                    • 29.3.3. L'RNA del messaggero viene tradotto nella direzione 5′-to-3′
                                                                    • 29.3.4. Il segnale di inizio è AUG (o GUG) preceduto da diverse basi che si accoppiano con 16S rRNA
                                                                    • 29.3.5. La sintesi delle proteine ​​batteriche viene avviata dall'RNA di trasferimento del formilmetionile
                                                                    • 29.3.6. I ribosomi hanno tre siti di legame del tRNA che collegano le subunità 30S e 50S
                                                                    • 29.3.7. La catena polipeptidica in crescita viene trasferita tra i tRNA durante la formazione del legame peptidico
                                                                    • 29.3.8. Solo le interazioni codone-anticodone determinano l'amminoacido che è incorporato
                                                                    • 29.3.9. Alcune molecole di RNA di trasferimento riconoscono più di un codone a causa dell'oscillazione nell'accoppiamento delle basi
                                                                    • 29.4.1. Formilmetionil-tRNAF Viene posizionato nel sito P del ribosoma durante la formazione del complesso di iniziazione degli anni '70
                                                                    • 29.4.2. I fattori di allungamento forniscono l'aminoacil-tRNA al ribosoma
                                                                    • 29.4.3. La formazione di un legame peptidico è seguita dalla traslocazione guidata da GTP di tRNA e mRNA
                                                                    • 29.4.4. La sintesi proteica viene interrotta dai fattori di rilascio che leggono i codoni di stop
                                                                    • 29.5.1. Molti antibiotici agiscono inibendo la sintesi proteica
                                                                    • 29.5.2. La tossina difterica blocca la sintesi proteica negli eucarioti inibendo la traslocazione
                                                                    • La sintesi proteica richiede la traduzione delle sequenze nucleotidiche in sequenze amminoacidiche
                                                                    • Le sintetasi dell'RNA di trasferimento di aminoacil Leggi il codice genetico
                                                                    • Un ribosoma è una particella ribonucleoproteica (70S) composta da una subunità piccola (30S) e una grande (50S)
                                                                    • I fattori proteici giocano un ruolo chiave nella sintesi proteica
                                                                    • La sintesi proteica eucariotica differisce dalla sintesi proteica procariotica principalmente nell'inizio della traduzione
                                                                    • Parole chiave
                                                                    • Problemi di meccanismo
                                                                    • Problemi di integrazione del capitolo
                                                                    • Problema di interpretazione dei dati
                                                                    • Problema multimediale
                                                                    • Dove iniziare
                                                                    • libri
                                                                    • Aminoacil-tRNA sintetasi
                                                                    • Trasferimento RNA
                                                                    • Ribosomi e RNA ribosomiali
                                                                    • Fattori di inizio
                                                                    • Fattori di allungamento
                                                                    • Formazione e traslocazione del legame peptidico
                                                                    • Cessazione
                                                                    • Fedeltà e correzione di bozze
                                                                    • Sintesi proteica eucariotica
                                                                    • Antibiotici e tossine
                                                                    • 30.1. Il metabolismo consiste in percorsi altamente interconnessi
                                                                      • 30.1.1. Motivi ricorrenti nella regolazione metabolica
                                                                      • 30.1.2. Principali vie metaboliche e siti di controllo
                                                                      • 30.1.3. Giunti chiave: glucosio 6-fosfato, piruvato e acetil CoA
                                                                      • 30.3.1. Gli adattamenti metabolici nella fame prolungata riducono al minimo la degradazione delle proteine
                                                                      • 30.3.2. Gli squilibri metabolici nel diabete derivano dall'insufficienza relativa di insulina e dall'eccesso di glucagone
                                                                      • 30.3.3. Omeostasi calorica: un mezzo per regolare il peso corporeo
                                                                      • Il metabolismo consiste in percorsi altamente interconnessi
                                                                      • Ogni organo ha un profilo metabolico unico
                                                                      • L'assunzione di cibo e la fame inducono cambiamenti metabolici
                                                                      • La scelta del carburante durante l'esercizio è determinata dall'intensità e dalla durata dell'attività
                                                                      • L'etanolo altera il metabolismo energetico nel fegato
                                                                      • Parole chiave
                                                                      • Dove iniziare
                                                                      • libri
                                                                      • Metabolismo del carburante
                                                                      • Adattamenti metabolici nella fame
                                                                      • Diabete mellito
                                                                      • Esercitare il metabolismo
                                                                      • Metabolismo dell'etanolo
                                                                      • 31.1. Le proteine ​​procariotiche che legano il DNA si legano specificamente ai siti di regolamentazione negli operoni
                                                                        • 31.1.1. Un operone è costituito da elementi regolatori e geni che codificano le proteine
                                                                        • 31.1.2. Il lacca L'operatore ha una sequenza di base simmetrica
                                                                        • 31.1.3. Il lacca La proteina repressore in assenza di lattosio si lega all'operatore e blocca la trascrizione
                                                                        • 31.1.4. Il legame del ligando può indurre cambiamenti strutturali nelle proteine ​​regolatrici
                                                                        • 31.1.5. L'operone è un'unità di regolamentazione comune nei procarioti
                                                                        • 31.1.6. La trascrizione può essere stimolata dalle proteine ​​che contattano l'RNA polimerasi
                                                                        • 31.1.7. Il motivo elica-giro-elica è comune a molte proteine ​​procariotiche che legano il DNA
                                                                        • 31.2.1. I nucleosomi sono complessi di DNA e istoni
                                                                        • 31.2.2. Il DNA eucariotico viene avvolto intorno agli istoni per formare nucleosomi
                                                                        • 31.2.3. Il controllo dell'espressione genica richiede il rimodellamento della cromatina
                                                                        • 31.2.4. I potenziatori possono stimolare la trascrizione perturbando la struttura della cromatina
                                                                        • 31.2.5. La modifica del DNA può alterare i modelli di espressione genica
                                                                        • 31.3.1. Gli steroidi e le molecole idrofobiche correlate passano attraverso le membrane e si legano ai recettori che legano il DNA
                                                                        • 31.3.2. I recettori ormonali nucleari regolano la trascrizione reclutando coattivatori e corepressori nel complesso di trascrizione
                                                                        • 31.3.3. I recettori degli ormoni steroidei sono bersagli per i farmaci
                                                                        • 31.3.4. La struttura della cromatina è modulata attraverso modifiche covalenti delle code degli istoni
                                                                        • 31.3.5. Le deacetilasi istoniche contribuiscono alla repressione trascrizionale
                                                                        • 31.3.6. Il legame del ligando ai recettori di membrana può regolare la trascrizione attraverso cascate di fosforilazione
                                                                        • 31.3.7. La struttura della cromatina riduce efficacemente le dimensioni del genoma
                                                                        • 31.4.1. L'attenuazione è un meccanismo procariotico per la regolazione della trascrizione attraverso la modulazione della struttura secondaria dell'RNA nascente
                                                                        • 31.4.2. I geni associati al metabolismo del ferro sono regolati in modo traslazionale negli animali
                                                                        • Le proteine ​​procariotiche che legano il DNA si legano specificamente ai siti di regolamentazione negli operoni
                                                                        • La maggiore complessità dei genomi eucariotici richiede meccanismi elaborati per la regolazione genica
                                                                        • L'attivazione e la repressione trascrizionali sono mediate dalle interazioni proteina-proteina
                                                                        • L'espressione genica può essere controllata a livelli post-trascrizionali
                                                                        • Parole chiave
                                                                        • Problema del meccanismo
                                                                        • Problema di integrazione del capitolo
                                                                        • Problema di interpretazione dei dati
                                                                        • Dove iniziare
                                                                        • libri
                                                                        • Regolazione del gene procariotico
                                                                        • Nucleosomi e istoni
                                                                        • Recettori ormonali nucleari
                                                                        • Rimodellamento della cromatina e della cromatina
                                                                        • Regolazione post-trascrizionale
                                                                        • Aspetti storici
                                                                        • Capitolo 32. Sistemi sensoriali
                                                                          • 32.1. Un'ampia varietà di composti organici viene rilevata dall'olfatto
                                                                            • 32.1.1. L'olfatto è mediato da un'enorme famiglia di recettori a sette transmembrana-elica
                                                                            • 32.1.2. Gli odori vengono decodificati da un meccanismo combinatorio
                                                                            • 32.1.3. L'imaging a risonanza magnetica funzionale rivela regioni del cervello che elaborano informazioni sensoriali
                                                                            • 32.2.1. Il sequenziamento del genoma umano ha portato alla scoperta di una grande famiglia di recettori amari 7TM
                                                                            • 32.2.2. Una famiglia di recettori 7TM quasi certamente risponde ai composti dolci
                                                                            • 32.2.3. I sapori salati vengono rilevati principalmente dal passaggio degli ioni di sodio attraverso i canali
                                                                            • 32.2.4. Sapori aspri derivano dagli effetti degli ioni idrogeno (acidi) sui canali
                                                                            • 32.2.5. Umami, il gusto del glutammato, viene rilevato da una forma specializzata di recettore del glutammato
                                                                            • 32.3.1. La rodopsina, un recettore 7TM specializzato, assorbe la luce visibile
                                                                            • 32.3.2. L'assorbimento della luce induce una specifica isomerizzazione del legato 11-cis-Retina
                                                                            • 32.3.3. Abbassamento indotto dalla luce del recupero delle coordinate del livello di calcio
                                                                            • 32.3.4. La visione dei colori è mediata da tre recettori conici che sono omologhi della rodopsina
                                                                            • 32.3.5. I riarrangiamenti nei geni per i pigmenti verde e rosso portano a 𠇌olor Blindness”
                                                                            • 32.4.1. Le cellule ciliate utilizzano un fascio connesso di stereocilia per rilevare piccoli movimenti
                                                                            • 32.4.2. I canali meccanosensoriali sono stati identificati in Drosophila e batteri
                                                                            • 32.5.1. Gli studi sulla capsaicina, l'ingrediente attivo nei peperoni “Hot”, rivelano un recettore per rilevare le alte temperature e altri stimoli dolorosi
                                                                            • 32.5.2. I sottili sistemi sensoriali rilevano altri fattori ambientali come il campo magnetico terrestre
                                                                            • L'olfatto, il gusto, la vista, l'udito e il tatto si basano su percorsi di trasduzione del segnale attivati ​​da segnali provenienti dall'ambiente
                                                                            • Un'ampia varietà di composti organici viene rilevata dall'olfatto
                                                                            • Il gusto è una combinazione di sensi che funzionano con meccanismi diversi
                                                                            • Le molecole dei fotorecettori nell'occhio rilevano la luce visibile
                                                                            • L'udito dipende dalla rapida rilevazione degli stimoli meccanici
                                                                            • Il tocco include il rilevamento di pressione, temperatura e altri fattori
                                                                            • Parole chiave
                                                                            • Problema di integrazione del capitolo
                                                                            • Problema del meccanismo
                                                                            • Problemi con i media
                                                                            • Dove iniziare
                                                                            • Olfatto
                                                                            • Gusto
                                                                            • Visione
                                                                            • Udito
                                                                            • Ricezione del tatto e del dolore
                                                                            • Altri sistemi sensoriali
                                                                            • 33.1. Gli anticorpi possiedono distinte unità leganti l'antigene ed effettore
                                                                            • 33.2. Il ripiegamento dell'immunoglobulina consiste in un framework beta-sandwich con loop ipervariabili
                                                                            • 33.3. Gli anticorpi legano molecole specifiche attraverso i loro anelli ipervariabili
                                                                              • 33.3.1. Le analisi a raggi X hanno rivelato come gli anticorpi legano gli antigeni
                                                                              • 33.3.2. Grandi antigeni legano gli anticorpi con numerose interazioni
                                                                              • 33.4.1. I geni J (unione) e i geni D (diversità) aumentano la diversità anticorpale
                                                                              • 33.4.2. Più di 10 8 anticorpi possono essere formati da associazione combinatoria e mutazione somatica
                                                                              • 33.4.3. L'oligomerizzazione degli anticorpi espressi sulla superficie delle cellule B immature innesca la secrezione di anticorpi
                                                                              • 33.4.4. Diverse classi di anticorpi sono formate dal salto di Vh geni
                                                                              • 33.5.1. I peptidi presentati dalle proteine ​​MHC occupano una scanalatura profonda affiancata da alfa eliche
                                                                              • 33.5.2. I recettori delle cellule T sono proteine ​​simili agli anticorpi contenenti regioni variabili e costanti
                                                                              • 33.5.3. CD8 sulle cellule T citotossiche agisce di concerto con i recettori delle cellule T
                                                                              • 33.5.4. Le cellule T helper stimolano le cellule che mostrano peptidi estranei legati alle proteine ​​MHC di classe II
                                                                              • 33.5.5. Le cellule T helper si affidano al recettore delle cellule T e al CD4 per riconoscere i peptidi estranei sulle cellule che presentano l'antigene
                                                                              • 33.5.6. Le proteine ​​MHC sono altamente diversificate
                                                                              • 33.5.7. I virus dell'immunodeficienza umana sovvertono il sistema immunitario distruggendo le cellule T helper
                                                                              • 33.6.1. Le cellule T sono soggette a selezione positiva e negativa nel timo
                                                                              • 33.6.2. Le malattie autoimmuni derivano dalla generazione di risposte immunitarie contro gli auto-antigeni
                                                                              • 33.6.3. Il sistema immunitario gioca un ruolo nella prevenzione del cancro
                                                                              • Gli anticorpi possiedono distinte unità leganti l'antigene ed effettore
                                                                              • Il ripiegamento dell'immunoglobulina consiste in un framework beta-sandwich con loop ipervariabili
                                                                              • Gli anticorpi legano molecole specifiche attraverso i loro anelli ipervariabili
                                                                              • La diversità è generata da riarrangiamenti genici
                                                                              • Le proteine ​​del complesso maggiore di istocompatibilità presentano antigeni peptidici sulle superfici cellulari per il riconoscimento da parte dei recettori delle cellule T
                                                                              • Le risposte immunitarie contro gli auto-antigeni vengono soppresse
                                                                              • Parole chiave
                                                                              • Problema del meccanismo
                                                                              • Problema di integrazione del capitolo
                                                                              • Problema di interpretazione dei dati
                                                                              • Dove iniziare
                                                                              • libri
                                                                              • Struttura degli anticorpi e dei complessi antigene-anticorpo
                                                                              • Generazione di diversità
                                                                              • Proteine ​​MHC e processamento dell'antigene
                                                                              • Recettori delle cellule T e complessi di segnalazione
                                                                              • HIV e AIDS
                                                                              • Scoperta dei concetti principali
                                                                              • 34.1. La maggior parte delle proteine ​​​​motrici molecolari sono membri della superfamiglia P-Loop NTPase
                                                                                • 34.1.1. Una proteina del motore è costituita da un nucleo di ATPasi e da una struttura estesa
                                                                                • 34.1.2. Il legame e l'idrolisi dell'ATP inducono cambiamenti nella conformazione e nell'affinità di legame delle proteine ​​motorie
                                                                                • 34.2.1. Il muscolo è un complesso di miosina e actina
                                                                                • 34.2.2. L'actina è un polimero polare, autoassemblante e dinamico
                                                                                • 34.2.3. I movimenti delle singole proteine ​​motorie possono essere osservati direttamente
                                                                                • 34.2.4. Il rilascio di fosfato innesca il colpo di potenza della miosina
                                                                                • 34.2.5. La lunghezza del braccio della leva determina la velocità del motore
                                                                                • 34.3.1. I microtubuli sono polimeri cilindrici cavi
                                                                                • 34.3.2. Il movimento di Kinesin è altamente processivo
                                                                                • 34.3.3. Piccole modifiche strutturali possono invertire la polarità del motore
                                                                                • 34.4.1. I batteri nuotano ruotando i loro flagelli
                                                                                • 34.4.2. Il flusso di protoni guida la rotazione dei flagelli batterici
                                                                                • 34.4.3. La chemiotassi batterica dipende dall'inversione della direzione della rotazione flagellare
                                                                                • La maggior parte delle proteine ​​del motore molecolare sono membri della superfamiglia P-Loop NTPase
                                                                                • Le miosine si muovono lungo i filamenti di actina
                                                                                • Kinesin e Dynein si muovono lungo i microtubuli
                                                                                • Un motore rotativo guida il movimento batterico
                                                                                • Parole chiave
                                                                                • Problema del meccanismo
                                                                                • Problema di integrazione del capitolo
                                                                                • Problema di interpretazione dei dati
                                                                                • Dove iniziare
                                                                                • libri
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                                                                                • Kinesin, dineina e microtubuli
                                                                                • Movimento batterico e chemiotassi
                                                                                • Aspetti storici
                                                                                • Appendice A: Costanti fisiche e conversione delle unità
                                                                                • Appendice B: Costanti di acidità
                                                                                • Appendice C: lunghezze standard delle obbligazioni

                                                                                Previo accordo con l'editore, questo libro è accessibile tramite la funzione di ricerca, ma non può essere sfogliato.


                                                                                Fosforilazione ossidativa inversa? - Biologia

                                                                                Reattività in chimica

                                                                                PS1. Introduzione alla fotosintesi

                                                                                In biologia, l'energia è necessaria per guidare tutti i tipi di processi biochimici. L'energia è necessaria per rimanere in vita. Ci sono molte fonti di energia sulla terra. Le forze tettoniche rilasciano enormi quantità di calore e guidano la conversione di alcuni minerali in prodotti gassosi, ad esempio i solfuri metallici come la zincblenda possono essere convertiti in idrogeno solforato gassoso, H2S. A volte, tutto quel calore e quel gas si fanno strada sulla superficie terrestre sotto forma di vulcani. Negli oceani, alcuni organismi marini ottengono la loro energia dai gas rilasciati dalle bocche vulcaniche, come il metano e l'idrogeno solforato. Tuttavia, la luce solare è una fonte di energia ancora più abbondante su gran parte della superficie terrestre. Nella fotosintesi, l'energia luminosa viene assorbita e utilizzata per produrre ATP.Ricorda, l'ATP è come un pacco batteria portatile in biologia che può viaggiare in diverse parti di una cellula dove può essere utilizzato per alimentare le fasi in salita nelle reazioni biochimiche.

                                                                                Figura PS1.1. L'assorbimento dei fotoni dal sole è accoppiato alla produzione di ATP, il pacco batterie biologico.

                                                                                Piante, alghe e alcuni batteri sono in grado di svolgere la fotosintesi. Potrebbero ottenere il beneficio immediato delle molecole di ATP portatili per guidare le reazioni biochimiche. Tuttavia, la produzione di ATP nella fotosintesi è anche collegata alla cattura del carbonio. L'anidride carbonica dell'aria viene incorporata nelle molecole di carboidrati. Questa conversione avviene in una serie di reazioni chiamate "reazioni oscure", perché continuano a verificarsi anche senza luce solare. I carboidrati possono essere immagazzinati, a lungo termine, e successivamente possono essere utilizzati come fonti di energia tramite la glicolisi e il ciclo dell'acido citrico.

                                                                                Figura PS1.1. Nella fotosintesi, l'ATP viene deviato alla produzione di carboidrati per l'immagazzinamento di energia a lungo termine.

                                                                                Gli animali, ovviamente, beneficiano indirettamente di questo processo perché possono anche utilizzare i carboidrati come fonte di energia. La scomposizione dei carboidrati rilascia energia attraverso il solito compromesso: i legami C-H e C-C leggermente più deboli vengono rotti e vengono creati legami OH e C-O leggermente più forti, il che significa che c'è un rilascio generale di energia. Mangiando le piante, possiamo accedere immediatamente a questi carboidrati senza tutto il trambusto di stare al sole tutto il giorno per farli noi stessi.

                                                                                Se ricordi qualche biologia vegetale di base, potresti avere familiarità con un altro aspetto della fotosintesi. La "reazione bilanciata" per la fotosintesi comporta anche la conversione dell'acqua in ossigeno molecolare, come segue:

                                                                                L'ossigeno è un attore chiave nella fosforilazione ossidativa, in cui la glicolisi e il ciclo TCA sono resi ancora più efficienti aumentando la quantità di ATP prodotta per ogni molecola di glucosio scomposta. La maggior parte degli organismi (inclusi noi) non può sopravvivere senza quell'ATP extra di cui dipendiamo dalle piante per la nostra sopravvivenza in più di un modo.

                                                                                Ma contrariamente a quanto suggerito dalla reazione bilanciata, la produzione di ossigeno da parte delle piante viene effettivamente svolta separatamente dalla sintesi dei carboidrati. La produzione di ossigeno è in realtà parte della "reazione alla luce", insieme alla sintesi di ATP.

                                                                                Figura PS1.3. La fotosintesi è anche associata alla produzione di ossigeno molecolare.

                                                                                Nella fotosintesi, l'acqua viene ossidata per produrre ossigeno molecolare. Le piante prendono gli elettroni che hanno strappato alle molecole d'acqua e li deviano in una catena di trasporto degli elettroni. L'energia imbrigliata da quella catena di trasporto degli elettroni viene utilizzata per convertire l'ADP in ATP. Nella fosforilazione ossidativa, gli organismi (comprese le piante) prendono gli elettroni dal NADH e li succinano e li deviano in una catena di trasporto degli elettroni, depositandoli infine su una molecola di ossigeno per produrre acqua. L'energia imbrigliata da quella catena di trasporto degli elettroni viene utilizzata per convertire l'ADP in ATP.

                                                                                Ciò significa che abbiamo due processi opposti che entrambi sono sfruttati per produrre ATP. In un processo, gli elettroni corrono verso il basso energicamente e vengono depositati sull'ossigeno per produrre acqua. Questa è la fosforilazione ossidativa. La fotosintesi è in realtà una fosforilazione ossidativa che si svolge al contrario: gli elettroni iniziano sull'acqua e da lì procedono attraverso una catena di elettroni. Ma se la fosforilazione ossidativa va in discesa, allora la fotosintesi deve andare in salita.

                                                                                È qui che entra in gioco la luce. La luce assorbita nella fotosintesi viene utilizzata per sollevare gli elettroni verso l'alto in energia da lì, possono iniziare a rotolare verso il basso attraverso la catena di trasporto degli elettroni, rilasciando energia lungo il percorso che può essere sfruttata per la formazione di ATP.

                                                                                Tutti questi eventi hanno luogo in uno speciale organello della pianta chiamato cloroplasto. I cloroplasti sono un po' come i mitocondri, dove avvengono importanti processi metabolici come il ciclo TCA e la fosforilazione ossidativa. Come i mitocondri, i cloroplasti contengono il proprio DNA e ribosomi per la produzione di proteine ​​e vengono trasmessi direttamente dalla cellula madre alla cellula figlia. I cloroplasti hanno una doppia membrana e sono riempiti con un mezzo acquoso chiamato stroma.

                                                                                Figura PS1.4. Schema semplificato di un cloroplasto.

                                                                                All'interno del cloroplasto ci sono strutture chiamate tilacoidi. Un tilacoide è come un palloncino d'acqua complesso, ha una membrana ed è riempito con un mezzo acquoso chiamato lume. A differenza di un semplice palloncino d'acqua, però, il tilacoide ha parti che sono profondamente piegate, in modo che assomiglino a dischi impilati a strati. Queste parti del tilacoide sono chiamate grana. Le porzioni regolari e non piegate sono chiamate lamelle.

                                                                                Figura PS1.5. Schema semplificato della struttura tilacoide.

                                                                                Il tilacoide svolge un ruolo molto importante nella fotosintesi. Un gruppo di complessi proteici legati alla membrana tilacoide effettuano l'assorbimento dell'energia luminosa, la conversione dell'acqua in diossigeno e la produzione di ATP, nonché di un vettore di elettroni, NADPH. L'ATP e il NADPH vengono rilasciati nello stroma circostante. Una proteina solubile nello stroma, chiamata ribulosio bisfosfato carbossilasi (RuBisCo), cattura l'anidride carbonica e la lega in modo covalente a una molecola di carboidrati. Altre proteine ​​utilizzano quindi l'ATP e il NADPH per ridurre il gruppo carbossilato (dalla CO2) in una parte regolare della catena dei carboidrati. In questo modo, invece di cercare di unire sei molecole di anidride carbonica in un glucosio, il problema è semplificato semplicemente prendendo un'anidride carbonica alla volta, aggiungendola a uno zucchero preesistente.

                                                                                L'ATP è prodotto da un'ATP sintasi, che è molto simile al complesso utilizzato per lo stesso scopo durante la fosforilazione ossidativa. Proprio come l'ATP sintasi nei mitocondri, questa è guidata da un gradiente di protoni. Il gradiente protonico viene creato attraverso un percorso di trasporto degli elettroni, proprio come quello nei mitocondri. In effetti, molte delle caratteristiche della fotosintesi sono piuttosto simili alla fosforilazione ossidativa. Una differenza cruciale è che la catena di trasporto degli elettroni nella fosforilazione ossidativa inizia con NADH e termina con l'acqua, mentre nella fotosintesi è il contrario: la catena inizia con l'acqua e termina con NADPH. La catena di trasporto degli elettroni nella fosforilazione ossidativa è esotermica, in calo di energia. La catena di trasporto degli elettroni nella fotosintesi sarebbe endotermica, ma può essere sostenuta dall'apporto di energia sotto forma di luce.

                                                                                Figura PS1.6. Schema semplificato dei principali partecipanti alla fotosintesi.

                                                                                Vedi la sezione sulla fotosintesi su Biochemistry Online di Henry Jakubowski.

                                                                                Questo sito è stato scritto e mantenuto da Chris P. Schaller, Ph.D., College of Saint Benedict / Saint John's University (con contributi di altri autori come notato). È disponibile gratuitamente per uso didattico.

                                                                                />
                                                                                Struttura e reattività in chimica organica, biologica e inorganica di Chris Schaller è concesso in licenza con a Licenza Creative Commons Attribution-NonCommercial 3.0 Unported.

                                                                                Invia le correzioni a [email protected]

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                                                                                Eventuali opinioni, risultati e conclusioni o raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni della National Science Foundation.


                                                                                Quali sono le somiglianze e le differenze tra la fotofosforilazione e la fosforilazione ossidativa?

                                                                                Entrambi i processi operano sullo stesso principio di base passando gli elettroni lungo una catena per creare a protone (H + ) pendenza, consentendo il formazione di ATP. La differenza più grande è dove si verificano. Fotofosforilazione si verifica nella membrana tilacoide dei cloroplasti durante la fase della fotosintesi dipendente dalla luce. Luce sotto forma di fotoni fornisce l'energia necessaria per eccitare due e - s in PSII (fotosistema II), che vengono poi fatti passare lungo la catena di trasporto. ossidativo fosforilazionesi verifica nella membrana dei mitocondri christae durante la respirazione cellulare. Qui, le e - s sono fornite da NAD e FAD, con ossigeno agendo come l'ultimo accettore di elettroni, portando alla formazione di H2O. Durante la fotofosforilazione, NADP agisce come ultimo e-accettore, portando alla formazione di NADPH.

                                                                                In entrambi i processi e - s vengono tramandati una catena di agenti di trasferimento di elettroni in una serie di reazioni redox. In entrambe le reazioni, mentre e - s passano lungo il complesso del citocromo, gli ioni H + sono pompato da un'area di bassa ad alta concentrazione, creando a gradiente protonico. Durante la fotofosforilazione e - s vengono pompati dallo stroma in il tilacoide, mentre nella fosforilazione ossidativa e - s sono pompati dalla matrice in lo spazio intermembranale. Il chemiosmosi di ioni H+ lungo il gradiente di concentrazione attraverso i pori di ATPsintasi quindi fornisce l'energia necessaria per fosforilare ADP in ATP, che è il "vettore di energia" primario nelle cellule.


                                                                                Guarda il video: Fosforilasi Oksidatif (Dicembre 2021).