Informazione

10.3B: Sviluppo della malattia - Biologia

10.3B: Sviluppo della malattia - Biologia



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Dopo che un agente patogeno invade un ospite, subisce una serie di fasi che alla fine portano alla moltiplicazione dell'agente patogeno.

obiettivi formativi

  • Descrivere le fasi della malattia: periodi di incubazione, prodromica, acuta e convalescenza

Punti chiave

  • La prima fase è caratterizzata da completa mancanza o pochissimi sintomi.
  • Quando l'agente patogeno inizia a riprodursi attivamente, i sintomi si intensificano. Le infezioni batteriche e virali possono entrambe causare gli stessi tipi di sintomi, ma ci sono anche alcune differenze.
  • Le ultime fasi sono caratterizzate dalla diminuzione della gravità dei sintomi fino alla loro scomparsa. Tuttavia, anche se i pazienti si riprendono e tornano alla normalità, possono continuare a essere una fonte di infezione.

Parole chiave

  • subclinico: di una malattia o di una lesione, senza segni e sintomi rilevabili mediante esame fisico o test di laboratorio; non clinicamente manifesto.
  • latenza clinica: Il periodo per il quale un'infezione è subclinica.
  • latenza virale: Una forma di dormienza virale in cui il virus non si replica affatto.

Fasi della malattia

Dopo che un agente infettivo invade un ospite (paziente), subisce una serie di fasi (stadi) che alla fine porteranno alla sua moltiplicazione e al rilascio dall'ospite.

FASE 1: PERIODO DI INCUBAZIONE

Questo si riferisce al tempo trascorso tra l'esposizione a un organismo patogeno e da quando i sintomi ei segni sono per la prima volta evidenti. Può essere da pochi minuti a 30 anni nel caso della variante della malattia di Creutzfeldt-Jakob. Mentre il termine periodo di latenza è usato come sinonimo, a volte viene fatta una distinzione tra periodo di incubazione, il periodo tra l'infezione e l'insorgenza clinica della malattia, e il periodo di latenza, il tempo che intercorre tra l'infezione e l'infettività. Qualunque sia più breve dipende dalla malattia.

Una persona può essere portatrice di una malattia, come Streptococco in gola, senza manifestare alcun sintomo. A seconda della malattia, la persona può o meno essere contagiosa durante il periodo di incubazione. Durante la latenza clinica, un'infezione è subclinica. Per quanto riguarda le infezioni virali, nella latenza clinica il virus si replica attivamente. Questo è in contrasto con la latenza virale, una forma di dormienza in cui il virus non si replica.

FASE 2: PERIODO PRODROMALE

In questa fase, il numero degli agenti infettivi inizia ad aumentare e il sistema immunitario inizia a reagire ad essi. È caratterizzato da sintomi precoci che potrebbero indicare l'inizio di una malattia prima che si manifestino sintomi specifici. I prodromi possono essere sintomi non specifici o, in alcuni casi, possono indicare chiaramente una particolare malattia. Ad esempio febbre, malessere, mal di testa e mancanza di appetito si verificano frequentemente nel prodromo di molte malattie infettive. Si riferisce anche al ciclo iniziale di replicazione virale in vivo.

FASE 3: PERIODO ACUTO

Questa fase è caratterizzata dalla replicazione o moltiplicazione attiva dell'agente patogeno e il suo numero raggiunge un picco esponenziale, abbastanza spesso in un periodo di tempo molto breve. I sintomi sono molto pronunciati, sia specifici per l'organo colpito sia in generale a causa della forte reazione del sistema immunitario.

Le infezioni virali si presentano con sintomi sistemici. Ciò significa che coinvolgono molte parti diverse del corpo o più di un sistema corporeo contemporaneamente; cioè naso che cola, congestione sinusale, tosse, dolori muscolari, ecc. Possono essere locali a volte come nella congiuntivite virale o "occhio rosa" e nell'herpes. Solo poche infezioni virali sono dolorose, come l'herpes. Il dolore delle infezioni virali è spesso descritto come prurito o bruciore.

I classici sintomi di un'infezione batterica sono arrossamento, calore, gonfiore e dolore localizzati. Uno dei segni distintivi di un'infezione batterica è il dolore locale, dolore che si trova in una parte specifica del corpo. Ad esempio, se si verifica un taglio ed è infetto da batteri, il dolore si verifica nel sito dell'infezione. Il mal di gola batterico è spesso caratterizzato da più dolore su un lato della gola. È più probabile che un'infezione all'orecchio venga diagnosticata come batterica se il dolore si verifica in un solo orecchio.

Dopo che l'agente patogeno raggiunge il suo picco nelle cellule o particelle di nuova produzione (per i virus), i numeri iniziano a diminuire drasticamente. I sintomi sono ancora presenti ma non sono così forti come nella fase acuta della malattia.

FASE 4: PERIODO DI CONVALESCENZA

Il paziente si riprende gradualmente e torna alla normalità, ma può continuare a essere una fonte di infezione anche se si sente meglio. In questo senso, “recupero” può essere considerato un sinonimo.


Il pannello di appartenenza è un elenco di soli membri charter.

  • Aspetti strutturali e organizzativi dell'osso e della cartilagine tra cui biologia molecolare e cellulare, biochimica, fisiologia e biomineralizzazione rispetto a osteoblasti, osteoclasti, condrociti, cellule del tessuto connettivo e altre cellule nell'ambiente del midollo in condizioni sia normali che patologiche.
  • Studi di base e clinici su ormoni calciotropici e fattori paracrini coinvolti nella biologia ossea e cartilaginea in modelli umani e animali, malattie metaboliche ossee [ad es., osteoporosi, osteopenia, osteogenesi imperfetta, malattia ossea di Paget e malattia renale cronica (CKD) indotta dal metabolismo osseo malattie (CKD-MBD)] e malattie dell'omeostasi degli ioni minerali associate ad anomalie dell'ormone paratiroideo, della vitamina D, della calcitonina e di altri fattori ormonali e paracrini.
  • Aspetti immunologici delle malattie ossee.
  • Modelli in vitro e animali di patogenesi molecolare e biologia dell'osteosarcoma e del condrosarcoma, valutando gli effetti funzionali dei tumori primari e delle metastasi ossee.
  • Regolazione della biomineralizzazione della matrice extracellulare dei tessuti scheletrici e connettivi struttura e organizzazione dei componenti della matrice interazione e segnalazione della matrice cellulare in condizioni normali e patologiche.
  • Sviluppo del dente e dello smalto.
  • Meccanismi del patterning craniofacciale e scheletrico, sviluppo delle labbra e del palato, compresa la scoperta genica, l'espressione genica e gli studi sul collegamento genetico nell'uomo e nei modelli animali proliferazione cellulare, impegno del lignaggio e differenziazione condrodisplasie, osteodisplasie e aspetti cellulari dell'invecchiamento dello scheletro utilizzando in vitro e in modelli vivi.

10.3B: Sviluppo della malattia - Biologia

Dopo decenni passati a giocare in secondo piano, l'RNA ha ora acquisito il suo ambito ruolo in tutti gli aspetti della ricerca biologica.

Il profilo del trascrittoma ha identificato le caratteristiche chiave uniche della retina, compresi gli RNA non codificanti che sono probabilmente collegati sia allo sviluppo che alla patologia della malattia.

Lo splicing alternativo è un segno distintivo dei trascrittomi della retina dei mammiferi in via di sviluppo e in particolare dei fotorecettori. Almeno il 50% dei geni espressi dalla retina presenta una struttura alterata rispetto al riferimento.

Neuroni diversi e funzionalmente caratterizzati nella retina forniscono un modello unico per sezionare la funzione di distinte molecole di RNA nei processi biologici e valutare nuovi paradigmi terapeutici.

Per decenni, l'RNA ha svolto un ruolo di supporto tra il vettore genetico (DNA) e le molecole funzionali (proteine). È finalmente giunto il momento che l'RNA sia al centro della scena in tutti gli aspetti della biologia. La retina offre un'opportunità unica per sezionare le basi molecolari della diversità neuronale e della malattia. I profili del trascrittoma della retina e dei suoi tipi di cellule residenti hanno svelato caratteristiche uniche del paesaggio dell'RNA. La scoperta di molecole di RNA distinte e il riconoscimento che l'elaborazione dell'RNA è una delle principali cause della neurodegenerazione retinica hanno spinto alla progettazione di biomarcatori e nuovi paradigmi terapeutici. Esaminiamo qui la biologia dell'RNA per quanto riguarda la retina, sottolineando nuove strade per le indagini nello sviluppo e nella malattia.


Mette in risalto

S1P (sfingosina 1-fosfato) e acido lisofosfatidico sono mediatori lipidici secreti prodotti dal metabolismo dei fosfolipidi di membrana.

S1P e acido lisofosfatidico interagiscono con specifici recettori accoppiati a proteine ​​G per regolare lo sviluppo vascolare, la fisiologia e le malattie cardiovascolari.

L'asse di segnalazione dell'acido lisofosfatidico S1P si interseca con i sistemi di sviluppo fondamentali come Wnt (famiglia int/senza ali)/β-catenina.

I geni metabolici e di segnalazione nel sistema S1P/acido lisofosfatidico mostrano un'eterogeneità specifica per la malattia cardiovascolare.

L'endotelio è un sistema di organi dinamico ed eterogeneo che risponde e si adatta a vari stimoli durante lo sviluppo embrionale e l'omeostasi postnatale. Durante lo sviluppo iniziale del sistema vascolare, le cellule endoteliali (EC) subiscono la formazione di reti vascolari in risposta a stimoli ipossici e cooperano con altri eventi di sviluppo nell'organogenesi. Arterie, capillari e vene, ciascuno con il proprio repertorio di tipi di cellule costituenti, subiscono una differenziazione EC specifica per vaso. Inoltre, la vascolarizzazione di ciascun sistema di organi mostra eterogeneità nella struttura e nella funzione, un fenomeno denominato specializzazione EC organotipica. Anche all'interno dello stesso segmento vasale o letto vascolare, esiste un'eterogeneità locale nella struttura, nell'espressione genica e nella funzione dell'EC. Ciò consente la plasticità, l'adattabilità e la resilienza del sistema vascolare agli ambienti mutevoli che l'organismo incontra, fornendo così risposte ottimali per la funzione di barriera vascolare, tono (contrazione/rilassamento), infiammazione e risoluzione, formazione di trombi, flusso sanguigno direzionale e il trasporto di molecole e cellule tra sangue e tessuti. 1,2

La diversità dei sottotipi endoteliali è in parte determinata da una moltitudine di recettori sulla superficie cellulare che rispondono a fattori locali o sistemici. I recettori EC ben caratterizzati includono i recettori tirosina chinasi, come il recettore Ang (angiopoietina) TIE2, i recettori VEGF (fattore di crescita endoteliale vascolare) VEGFR (recettore VEGF)1-3, nonché una varietà di GPCR (accoppiati a proteine ​​G recettori). L'espressione di GPCR nei singoli EC varia a seconda del letto vascolare, del tipo di vaso, del flusso e del contesto di sviluppo. 3-6 Tali GPCR rispondono a una varietà di ligandi inclusi piccoli peptidi (endoteline, bradichinina, neuropeptidi, apelina), fattori morfogenetici (proteine ​​Wnt [int/wingless family]), proteasi (trombina, tripsina), ECM (matrice extracellulare), chemochine, 17β-estradiolo, forze meccaniche, metaboliti, protoni (pH) e lipidi bioattivi (lisolipidi, eicosanoidi, ecc.). In questa recensione, ci concentriamo sui GPCR lisolipidi, in particolare quelli che rispondono ai metaboliti dei fosfolipidi di membrana - S1P (sfingosina 1-fosfato) e acido lisofosfatidico (LPA) - come orchestratori centrali dello sviluppo vascolare e bersagli terapeutici trattabili in malattie cardiovascolari, autoimmuni e malattie indotte da agenti patogeni.

Lisolipidi nel sistema vascolare

Metabolismo S1P e LPA

S1P e LPA sono le 2 specie di lisolipidi bioattivi ben caratterizzati. Queste molecole hanno spine dorsali idrofobiche e gruppi di testa di fosfati polari, che le rendono impermeabili alle membrane cellulari. S1P è meno solubile in acqua di LPA, quindi necessita di proteine ​​di trasporto (chiamate chaperon) nei compartimenti extracellulari. 7,8 S1P circola a concentrazioni da 0,7 a 1 µmol/L nella forma associata a chaperone. Le concentrazioni di LPA circolanti sono molto più basse (si stima che siano comprese tra le decine e le centinaia di nM esaminate in Yung et al 7 e Yanagida e Hla 8). La maggior parte dell'S1P circolante (≈65%) è legata all'ApoM sulle particelle HDL (lipoproteine ​​ad alta densità), mentre il resto è associato all'albumina. 9,10 Al contrario, ≈65% di LPA è associato all'albumina mentre il resto è prevalentemente legato all'HDL. 11,12 Pertanto, HDL e albumina sono i principali chaperon sia per S1P che per LPA. In particolare, lo sviluppo e la sopravvivenza murini procedono in assenza sia di ApoM che di albumina, mentre in tali situazioni S1P si associa ad altre macromolecole in vivo, come ApoA4. 13

S1P e LPA legati all'albumina sono in circolazione di breve durata (t1/2 [emivita] <20 minuti), 11,14,15 e le loro concentrazioni nel sangue sono determinate dalla disponibilità del substrato e dalle attività degli enzimi metabolici. 8 Due enzimi sfingosina chinasi, SPHK1 (sfingosina chinasi) e SPHK2, fosforilano la sfingosina intracellulare per generare S1P, 16 sebbene una frazione di SPHK1 secreta sia presente nel plasma. 17 L'esportazione di S1P mediata da eritrociti nel sangue da parte di MFSD2B (trasportatore di famiglia facilitatore principale 2b) rappresenta la maggior parte di S1P legato a chaperone circolatorio. 18 Nel frattempo, S1P sintetizzato nell'EC del vaso sanguigno e linfatico viene trasportato nel sangue o nella linfa da un altro trasportatore: SPNS2 (zitella 2). 19-22 Il trasporto endoteliale di S1P mediato da SPNS2 rappresenta ≈ 10% di S1P 23 plasmatico e almeno l'80% di S1P linfatico. 21,24,25 Pertanto, S1P nella linfa è generato principalmente nell'endotelio linfatico, mentre S1P nel sangue è principalmente derivato dai globuli rossi e, in misura minore, dall'EC. Espressione ristretta di Spns2, Sphk1, e Mfsd2b nei tipi di cellule endoteliali o eritroidi è stata corroborata dal sequenziamento dell'RNA a singola cellula da embrioni di topo (Figura 1).

Figura 1. Espressione dei geni metabolici e di segnalazione dei lisolipidi durante l'embriogenesi e nell'endotelio postnatale.UN e B, Espressione di geni che codificano enzimi metabolici lisolipidi o trasportatori (Sphk1 [sfingosina chinasi], Sphk2, Lpp3, Mfsd2b, Spns2 UN) o recettori (S1pr15, Lpar16 B) in tipi cellulari selezionati e strutture embrionali. I dati sul sequenziamento dell'RNA a cellula singola (RNA-seq) provengono da un database disponibile pubblicamente (https://oncoscape.v3.sttrccer.org/atlas.gs.washington.edu.mouse.rna/landing) fornito dagli autori. 26 C, Espressione di S1P (sfingosina 1-fosfato) e dei recettori dell'acido lisofosfatidico da RNA-seq di cellule endoteliali (CE) appena isolate dal cervello, fegato, polmone o rene di topo del giorno 7 postnatale. 6 TPM indica le trascrizioni per milione.

La sintesi dell'LPA è regolata dall'ATX (autotassina), una fosfolipasi D secreta che rimuove la frazione colina dalla lisofosfatidilcolina per generare LPA. 27 Sebbene gli acidi lisofosfatidici siano derivati ​​da fosfolipidi di lunghezza variabile della catena, la specie più abbondante in circolazione nei mammiferi è l'oleoil-LPA 18:1. 27 Una parte significativa dell'LPA circolante è sintetizzata nel sangue in seguito all'idrolisi catalizzata da ATX dei lisofosfolipidi circolanti, che sono presenti nelle lipoproteine ​​(LDL [lipoproteine ​​a bassa densità] e VLDL [lipoproteine ​​a densità molto bassa]) e in altri vettori. 27 Durante lo sviluppo embrionale, l'ATX è ampiamente espresso e mostra un'espressione particolarmente elevata negli osteoblasti, nei progenitori dei condrociti, nell'endotelio, nel mesenchima precoce e nei megacariociti (Figura 1).

L'influenza della dieta e della composizione del microbioma sui livelli di sfingolipidi e sulla salute del fegato è un'area di ricerca attiva. I latticini e le uova sono arricchiti con precursori S1P come la sfingomielina. 28 Tuttavia, gli enzimi idrolitici nell'intestino tenue e nel colon, tra cui sfingomielinasi, ceramidasi e glucoceramidasi, catabolizzano la maggior parte degli sfingolipidi ingeriti in acidi grassi liberi e sfingosina. Tuttavia, le diete arricchite di sfingolipidi hanno dimostrato di migliorare la salute del fegato, ridurre l'accumulo di lipidi nei tessuti e il colesterolo circolante nei modelli di roditori, 29-31, nonché inibire l'aterosclerosi. 32 batterioidi, il genere principale nell'intestino umano dopo lo svezzamento, 33 esprime enzimi serina palmitoiltransferasi che partecipano alla sintesi de novo degli sfingolipidi. 34 In particolare, gli sfingolipidi di origine batterica si trasferiscono all'epitelio intestinale ospite e al tessuto della vena porta epatica. 34 I collegamenti tra microbiota intestinale, sfingolipidi, dislipidemia e salute cardiovascolare richiedono ulteriori indagini.

Recettori lisolipidi vascolari

S1P e LPA sono ligandi ad alta affinità che legano i rispettivi recettori con apparenti costanti di dissociazione nanomolari. 35–37 Ci sono 6 LPAR known conosciuti1–6 (recettori LPA 1-6) 38 e 5 noti S1PR1–5 (recettori S1P 1-5). 39 Il sequenziamento dell'RNA unicellulare di topi al giorno embrionale (E) da 9,5 a E13,5 ha confermato studi precedenti 3,40-42 che dimostravano che S1pr1 è abbondantemente espresso in EC (Figura 1). S1pr2–5 sono espressi a livelli relativamente bassi nelle EC sia durante l'embriogenesi che dopo la nascita (Figura 1). Tra i topi con deficit di S1PR che sono stati generati, solo S1pr1-animali knockout muoiono embrionale 42 (Tabella).

Tavolo. Fenotipi vascolari osservati in topi con segnalazione di lisolipidi alterati

Atx indica autotassina CAG, alfa actina di pollo Cdh5, caderina 5 DKO, doppio knockout E, EC giorno embrionale, cellule endoteliali GPCR, recettori accoppiati a proteine ​​G KO, knockout LPA, acido lisofosfatidico Lpar, recettori LPA LPP3, lipide fosfato fosfatasi 3 Rac , piccolo GTPasi Rac RBC, globuli rossi RhoA, piccolo GTPasi Rho A S1P, sfingosina 1-fosfato S1pr, recettori S1P Sphk, sfingosina chinasi e Tg, transgenico.

Lpar1, Lpar4, e Lpar6 sono espressi nelle cellule cardiovascolari embrionali comprese le linee endoteliali, muscolari lisce e cardiomiocitarie (Figura 1). Tra questi tipi di cellule, Lpar2 e Lpar5 non sono espressi in modo significativo, e Lpar3 l'espressione è limitata ai lignaggi del muscolo cardiaco. Sebbene i topi privi di un singolo LPAR possano sopravvivere fino al termine, solo Lpar4 −/− i topi mostrano letalità embrionale parzialmente penetrante a causa di un sistema vascolare difettoso. 7,43 Questo fenotipo è completamente penetrante e più grave in Lpar4 −/− Lpar6 −/− topi double-knockout, 44 suggerendo che questi recettori hanno funzioni ridondanti durante l'embriogenesi.

S1P e LPA regolano lo sviluppo vascolare

Le funzioni discrete dei recettori S1P e LPA sono attribuibili in parte alla loro distribuzione unica, alla disponibilità di ligandi, all'accoppiamento eterotrimerico della proteina G e all'attivazione delle piccole GTPasi della famiglia Rho (rivisto in Yung et al 7 e Taha et al 37). Espressione e segnalazione endoteliale di S1PR1 attraverso Gio/Rac (piccolo GTPase Rac) è limitato ai vasi perfusi contenenti S1P ed è essenziale per la stabilizzazione vascolare e l'inibizione dell'ipergermogliazione indotta da VEGF 23,40,41,45,46 (Figura 2). In assenza di segnalazione endoteliale S1P, la maggior parte, se non tutte, le reti vascolari in via di sviluppo mostrano eccessivi germogli, rami e aree emorragiche che sono incompatibili con la vita dopo E14.5. Lo sviluppo di capillari e vene nelle retine carenti di S1PR non riesce a esprimere componenti specializzati del sistema neurovascolare e invece sovraregola i geni associati alla migrazione e alla punta, come Esm1, Angpt2, e Apln. 46 Questi risultati suggeriscono che la segnalazione S1PR è necessaria per la stabilità vascolare, il patterning e la specializzazione organotipica durante lo sviluppo degli organi attraverso percorsi conservati dalla stretta coevoluzione che integrano l'idoneità del segnale, gli input meccanici e metabolici. 47

Figura 2. Schema di segnalazione di acido lisofosfatidico (LPA) e S1P (sfingosina 1-fosfato) durante l'angiogenesi retinica di germogliamento. Il fronte angiogenico di un plesso vascolare in via di sviluppo, composto da ≈6-10 file di cellule endoteliali (EC), è circondato da alti livelli di VEGF (fattore di crescita endoteliale vascolare). 1 Qui, LPA attiva EC LPAR6 (recettore LPA 6 e possibilmente LPAR4), promuovendo la proliferazione e la migrazione a valle di Gα12/13 e GTPasi della famiglia Rho in collaborazione con la segnalazione del recettore VEGF. L'espressione di S1PR1 (recettore S1P 1) è relativamente bassa in questi EC. I contatti cellula-cellula sono più forti nelle regioni vascolari più mature e si ipotizza che siano arricchiti con LPP3 attivo (lipide fosfato fosfatasi 3), che degrada LPA e limita la segnalazione EC LPAR. Nel frattempo, poiché queste regioni vascolari in maturazione acquisiscono S1P dal sangue che scorre (frecce nere), l'EC esprime alti livelli di S1PR1. La segnalazione S1P-S1PR1 contribuisce alla stabilità vascolare (ad es. stabilizzazione delle giunzioni aderenti) e consente la specializzazione vascolare organotipica nella retina. Questi eventi mediati da S1PR1 sono probabilmente a valle dell'attivazione di RAC1. Le reti vascolari in crescita subiscono un rimodellamento per ottimizzare la perfusione tissutale (frecce nere). Ipotizziamo che gli EC scarsamente perfusi siano selezionati per la potatura in parte perché diventano carenti nella segnalazione S1P-S1PR1. L'instabilità vascolare risultante riduce le aderenze cellula-cellula e riduce l'attività di LPP3, creando così microdomini di LPA che attivano LPAR6 sul rimodellamento dell'EC per promuovere l'incorporazione in capillari ben perfusi. Rac indica GTPase RAC1 piccolo.

A differenza della segnalazione S1P/S1PR1, che è generalmente dipendente dalla perfusione per l'espressione del recettore e la disponibilità del ligando, LPA sembra essere più costitutivamente disponibile e particolarmente importante per la segnalazione LPAR nelle EC di germogli vascolari non perfusi 44,48-50 (Figura 2). Attivazione mediata da LPAR4 e LPAR6 di Gα12/13/Rho GTPasi è necessaria per la proliferazione endoteliale, la ramificazione vascolare e l'espansione della rete. 44,48,51 Questi risultati suggeriscono che la segnalazione S1P è impegnata nelle EC in fase di integrazione all'interno dell'endotelio, maturazione e stabilizzazione, mentre la segnalazione LPA si verifica nelle EC in fase di migrazione o proliferazione. Inoltre, la segnalazione LPA sembra essere coinvolta nei vasi in fase di regressione. 49

Prove crescenti dimostrano che la proteina integrale di membrana LPP3 (lipide fosfato fosfatasi 3) inibisce la segnalazione LPAR endoteliale specificamente nelle regioni della membrana cellulare che partecipano al contatto cellula-cellula, 44,48,51-54 limitando così la segnalazione LPAR ai siti senza contatto. 51 Durante lo sviluppo vascolare, le EC carenti nei contatti cellula-cellula si trovano principalmente nei germogli a estremità cieca 55 e nei vasi rimodellanti 56 (Figura 2). LPP3, una fosfatasi lipidica fosfato con una modalità d'azione extracellulare, è probabilmente un regolatore cellulare autonomo essenziale della segnalazione EC LPAR perché gli embrioni LPP3 knockout specifici per l'EC muoiono per E11.5 con gravi difetti vascolari nel sistema vascolare extraembrionale e nell'embrione vero e proprio . 52,57 Alcuni di questi difetti possono essere una conseguenza della perdita della funzione destabilizzante della -catenina di LPP3, che ha dimostrato di variare con la densità cellulare. 58 Poiché la -catenina è un regolatore intracellulare chiave delle giunzioni aderenti e delle vie di segnalazione Wnt, questo nesso può essere il punto in cui le vie di segnalazione lisolipide e Wnt si intersecano.

Segnalazione S1P in EC

Nella CE della vena ombelicale umana (HUVEC), il legame di S1P a S1PR1 induce la mobilizzazione del Ca 2+, l'attivazione della GTPasi Rac, la polimerizzazione dell'actina del citoscheletro corticale e l'assemblaggio della giunzione aderente. 59,60 Contemporaneamente, S1PR1 inibisce l'attività dell'adenilato ciclasi accoppiandosi a Gαi, 59 riducendo così i livelli di cAMP intracellulare. Altri bersagli a valle dell'attivazione di S1PR1 includono l'attivazione di PI3K (fosfoinositide 3-chinasi)/Akt, l'attivazione di PLC (fosfolipasi C) e l'aumento di p-Src (fosforilato Src). 37,61

La segnalazione vascolare S1P si traduce in cambiamenti di EC pleiotropici ma protettivi. Il riarrangiamento dell'actina mediato da S1PR1 e l'assemblaggio della giunzione aderente aumentano la funzione di barriera endoteliale in vitro ed è probabilmente un meccanismo chiave attraverso il quale S1PR1 migliora l'integrità vascolare e la perfusione nei tessuti polmonari, tracheali e retinici. 40,46,62-66 Nel cervello postnatale, l'endoteliale S1PR1 limita la fuoriuscita di piccole molecole (<3 kDa) 67 e funziona anche nei progenitori neurali e nelle cellule gliali per inibire l'emorragia postnatale nella matrice germinale. 68 Nelle grandi arterie, S1PR1/GαiL'asse /Akt regola la pressione sanguigna e il tono vascolare tramite l'attivazione dell'NO sintasi endoteliale, che produce NO per indurre vasorilassamento. 66,69-71 Durante lo sviluppo embrionale, l'asse di segnalazione S1PR1/Rac è essenziale poiché il deficit di S1P, il deficit di S1PR1 CE-specifico o il deficit di Rac1 CE-specifico provoca gravi difetti vascolari e letalità embrionale. 16,40,41,45,46,72,73

Embrioni con deficit di S1P privi di sfingosina chinasi (Sphk1 −/− Sphk2 −/− ) mostrano una grave emorragia, vasi sanguigni dilatati e non sopravvivono dopo E13.5. 16 Allo stesso modo, globale o specifico per CE S1pr1 la delezione provoca grave emorragia, rottura delle giunzioni aderenti e iperramificazione dei letti vascolari distali (p. es., vasi cerebrali e retinici) e delle principali arterie prossimali (p. es., aorta dorsale), che non è compatibile con la vita dopo E14.5. 40,41,45,46 Questi animali mostrano anche un'ipergermogliazione vascolare diffusa, che è caratterizzata da un aumento della frequenza delle cellule apicali e della densità dei filopodi nello sviluppo del sistema vascolare coerente con un'incapacità di eliminare le cellule in eccesso. 40,41,46 Cancellazione di Sphk1 nella linea eritroide di Sphk2 −/− i topi hanno rivelato che i globuli rossi generano circa il 95% del contenuto di S1P nel tessuto embrionale, che è necessario per la sopravvivenza dopo E13.5. 23 Oltre a gravi emorragie e malformazioni vascolari nella testa e nell'aorta, i sacchi vitellini di questi embrioni con deficit di S1P mostravano reti capillari disorganizzate e iperramificate. 23 La somministrazione materna dell'agonista S1PR1 SEW2871 ha salvato la letalità negli embrioni privi di S1P derivato dai globuli rossi, dimostrando ulteriormente il ruolo essenziale di S1PR1 nella segnalazione S1P dello sviluppo. 23 Tuttavia, questi embrioni mancano Sphk2 nelle piastrine e analisi più recenti hanno suggerito che i globuli rossi e le piastrine hanno funzioni ridondanti come fornitori di S1P embrionale necessari per un corretto sviluppo vascolare. 74

Informazioni dettagliate sulla segnalazione EC S1PR sono state ottenute utilizzando la retina come modello di formazione e maturazione della rete vascolare. Durante i primi 9 giorni di vita murina postnatale, i vasi crescono radialmente e formano una rete di arterie, capillari e vene che si estendono fino alla periferia della retina. Nei vasi perfusi della rete vascolare nascente, la segnalazione S1P/S1PR1 promuove la maturazione endoteliale e l'assemblaggio della giunzione aderente. 40,41,46 EC sul fronte angiogenico, comprese le cellule apicali dei germogli ciechi, sono molto diverse da quelle nella rete nascente poiché sono scarsamente perfuse e mancano dell'espressione di S1PR1. 40,41,46 Le EC del fronte angiogenico si impegnano nella segnalazione VEGFR che guida l'espressione di JunB, c-Jun e altri geni delle cellule di punta che contribuiscono alla proliferazione, alla migrazione, alla piena integrazione nel monostrato endoteliale e al patterning di EC. 6,46,75-77 L'evidenza suggerisce un meccanismo mediante il quale l'assemblaggio VE-caderina (caderina endoteliale vascolare) dipendente da S1PR promuove la maturazione endoteliale nella rete vascolare nascente attraverso l'assemblaggio della giunzione aderente e la soppressione della trascrizione di AP-1 46 e FOXO1 78 fattori.

Inoltre, la segnalazione EC S1PR supporta la maturazione vascolare attraverso la regolazione positiva delle proteine ​​critiche per la specializzazione neurovascolare (discussa di seguito). 6,46,79-81 Contemporaneamente, la segnalazione EC S1PR sopprime l'espressione dei geni che promuovono la migrazione spesso osservati nelle cellule punta, tra cui Esm1, Igfbp3, e Angpt2. 6,75-77,82 L'espressione ectopica dei geni delle cellule di punta nella rete nascente va di pari passo con l'ipergermoglio. 40,41,46,76 Inversamente, la sovraespressione di S1PR1 inducibile ha soppresso la germinazione vascolare e la frequenza delle cellule di punta, con conseguente ipovascolarizzazione. 40 Studi sul mosaico genetico hanno mostrato che le EC che esprimono S1PR1 tendono a incorporarsi nelle regioni mature della rete vascolare piuttosto che adottare una posizione di cellule apicali, 41 ulteriormente supportando l'idea che S1PR1 faciliti la maturazione vascolare in modo autonomo dalle cellule dipendente dal contesto.

L'espressione dei componenti della via di Notch e dei geni bersaglio, che inibiscono anche l'ipergermogliazione, 76 non è stata influenzata nelle EC retiniche knockout S1PR. 40,41,46 Inoltre, è stata osservata iperramificazione aortica in S1pr1 −/− ed embrioni knockout S1PR1 specifici per CE ma non in Dll4 +/- o specifico per CE Rbpj-embrioni knockout. Questi risultati distinti a valle dell'inibizione di S1P o Notch suggeriscono che questi ligandi inibiscono l'ipergermogliazione attraverso meccanismi discreti. 40,41,46 Tuttavia, le vie di segnalazione S1PR e Notch possono intersecarsi o regolarsi in modo incrociato in contesti biologici aggiuntivi, come la segnalazione biomeccanica. 83,84 Questo quadro può essere compreso anche nel contesto delle interazioni tra diversi percorsi di competizione cellulare, ma solo ora queste ipotesi stanno iniziando a essere testate. 47,85

Segnalazione LPA nello sviluppo vascolare

Le risposte endoteliali a LPA e S1P sono molto diverse, se non in diretta opposizione. Negli HUVEC, l'LPA segnala attraverso LPAR6 e induce rapidamente fibre di stress di actina che riducono l'adesione cellula-cellula e causano gap intercellulari. 51,86 Dopo aver legato LPA, LPAR6 si accoppia con Gα12/13 e attiva la GTPasi RhoA (piccola GTPasi Rho A) e il suo bersaglio ROCKI/II (Rho-chinasi I/II). 51,86 Questo è il meccanismo mediante il quale l'LPA riduce l'integrità della barriera endoteliale e promuove la perdita vascolare. 51,57,86 Inibizione di qualsiasi singolo componente nella segnalazione LPA, inclusi LPAR6, Gα13, RhoA o ROCK abroga l'induzione LPA delle fibre di stress. 51,86 Come LPAR6, LPAR4 attiva il Solα12/13/Rho/ROCK percorso 36 ma può anche accoppiarsi con Gq/11, Gio/o, e GS. 36 Componenti di segnalazione sovrapposti a valle di LPAR4 e LPAR6 nell'endotelio embrionale possono contribuire alla loro ridondanza funzionale durante l'embriogenesi. 44 Infatti, tutti Lpar6 −/− topi e la maggior parte Lpar4 −/− i topi sopravvivono a termine, ma tutti Lpar4 −/− Lpar6 −/− topi double-knockout muoiono per E10.5 a causa di difetti vascolari. 43,44 LPA-carenti Atx −/− topi, G . specifico per la CEα13-knockout, e Rock1 −/− Rock2 −/− muoiono ciascuno embrionale con uno sviluppo vascolare compromesso, 87-91 suggerendo che questi geni codificano componenti essenziali per la segnalazione EC LPAR. La RhoA endoteliale, tuttavia, è superflua poiché gli animali knockout RhoA specifici per l'EC si sviluppano normalmente, 92 suggerendo che gli LPAR dell'EC segnalino attraverso una o più delle ≈18 Rho GTPasi espresse nell'endotelio. 93

Fenotipi associati a Lpar4 −/− gli embrioni includono versamento pericardico, edema grave, fragilità generale, emorragia sottocutanea e mortalità (≈35% penetrante). 43 Lpar4 −/− Lpar6 I fenotipi −/− comprendono versamento pericardico, grave ritardo dello sviluppo, scarsa formazione della rete vascolare nella testa e nelle regioni intersomitiche, assenza di vasi sanguigni nel sacco vitellino e morte per E10.5 (100% penetrante). 44 Sia globale che specifico per CE Gα13topi knockout muoiono tra E9,5 e E11,5 e non riescono a formare una normale vascolarizzazione del sacco vitellino. 87,88 Questo fenotipo è stato visto anche in Rock1 −/− Rock2 −/− embrioni, che muoiono tra E8.5 ed E9.5. 89 Pertanto, la LPAR/Gα13L'asse di segnalazione /ROCK è essenziale per lo sviluppo vascolare precoce.

In contrasto con i fenotipi ipergermoglianti nelle retine carenti di S1PR1, il doppio knockout LPAR4/LPAR6 specifico per l'EC (Lpar4:Lpar6 iΔEC) i topi mostrano ipogermogli con ridotta densità vascolare e ramificazione. 44 celle di punta in Lpar4:Lpar6 Le retine iΔEC erano poche e mostravano difetti tra cui una ridotta lunghezza e frequenza dei filopodi. 44 Questo fenotipo ipovascolare è stato riprodotto in Lpar6 −/− retine, suggerendo che LPAR4 e LPAR6 non sono completamente ridondanti durante l'angiogenesi germinativa e che LPAR6 potrebbe essere il principale mediatore della proliferazione di EC indotta da LPA durante lo sviluppo retinico. 48

L'ATX è ampiamente espresso durante l'embriogenesi ed è essenziale per lo sviluppo embrionale. 90,94 Atx −/− i topi sono deficienti di LPA e hanno difetti vascolari nell'embrione propriamente detto, mancano del sistema vascolare del sacco vitellino e muoiono per insufficienza circolatoria entro E10.5. 90,91 Questi fenotipi sono stati riprodotti in embrioni che ospitano una sostituzione biallelica di un singolo amminoacido che rende l'ATX cataliticamente inattivo, suggerendo che la formazione enzimatica di LPA (o di una molecola correlata) è il difetto primario. 95 This is in stark contrast to LPP3, for which there is substantial in vitro and in vivo evidence for an EC-autonomous LPA/LPP3/LPAR axis that controls the subcellular location of LPAR signaling.

Encoded by the gene Ppap2b, LPP3 is a glycoprotein with a channel-like structure composed of 6 putative transmembrane domains. 96 LPP3 is best known for catalyzing dephosphorylation of phosphatidic acid, C1P (ceramide 1-phosphate), S1P, and LPA to generate diacylglycerol, ceramide, sphingosine, and monoacylglycerol, respectively. 96 Biochemical analysis showed that human LPP3 has highest affinity (1/Km) and catalytic efficiency (Vmax/Km) for LPA and PA, whereas these values were 3× to 4× lower for S1P and C1P. 97 Reduction of LPP3 activity can result in local or systemic accumulation of LPA, phosphatidic acid, C1P, and S1P. 98 For example, cardiac-specific LPP3-knockout mice harbor ≈3-fold higher (LPA) in circulation relative to wild-type counterparts. 99

Lpp3 is expressed in many cell types and structures during embryogenesis including, but not limited to, endothelial, cardiac, vascular, nervous, and mesenchymal tissues 100 (Figure 1). Both global and EC-specific LPP3-knockout mice die by E10.5 and exhibit hemorrhage of the embryo proper, defective yolk sac vasculature, and failure to form a chorioallantoic placenta. 52,100

In HUVECs, LPP3 appears to partition LPAR signaling between regions of strong and weak cell-cell contact. 44,48,51–54 LPP3 knockdown enhanced sensitivity to LPA-induced stress fibers. 51 This LPA response was more robust in subconfluent HUVECs, indicating that cell-cell contacts are involved in inhibition of LPAR signaling. After treatment with forskolin to enhance cell-cell adhesion, LPP3 localized to sites of cell-cell contact and the LPA-induced stress fiber response was abolished, suggesting cross-talk with cAMP-regulated signaling pathways. 51 However, forskolin-treated HUVECs deficient in LPP3 were sensitive to LPA, suggesting that LPP3 inhibits LPAR signaling in ECs with strong cell-cell adhesion. 51 In scratch assays, LPP3 localized to sites of cell-cell contact but was absent from noncontact sites in leader cells at the monolayer edge. 51 The leading edges (noncontact sites) of these cells showed robust stress fiber responses after LPA treatment, 51 suggesting that LPAR signaling is permitted in membrane compartments that lack cell-cell contact and, therefore, also lack LPP3 activity. Studies using LPP3-knockout mouse embryonic ECs 52 or LPP3-knockout human aortic ECs 53 reported that LPP3 promotes adherens junction assembly 52,53 and inhibits intercellular gap formation. 53 LPP3-deficient human aortic ECs showed reduced barrier function, 54 suggesting that LPP3 promotes endothelial barrier function, perhaps by attenuating LPA-dependent Rho GTPase activation.

These results demonstrate that LPP3 can localize to sites of EC-cell contact and inhibit LPA/LPAR signaling, restricting high levels of LPAR signaling to non–cell-cell contact sites. Noncontact sites of EC membranes have important migration-associated functions in tip cells and remodeling capillaries undergoing regression, 56 a process promoted by LPA/LPAR signaling 51 (Figure 2).

EC-specific LPP3-knockout embryos die at or before E10.5 with hemorrhagic areas in the embryo proper, abnormalities of the aortic sac, outflow tract, irregular intersomitic vasculature, defective yolk sac vasculature, failure to form a chorioallantoic placenta, as well as decreased cardiac trabeculation and growth of the compact myocardial wall. 52,57,100 These findings suggest that LPP3 function leads to spatial restriction of lysolipid receptor signaling to regulate vascular development (Figure 2).

In summary, mechanistic studies that reveal the in vitro differences between S1P and LPA signaling explain, at least in part, the in vivo functions of these lysolipids. S1P signaling-deficient mice exhibit vascular hypersprouting, which is characterized by hyperbranching, disorganized vascular networks that are poorly perfused and lack barrier integrity. In contrast, LPA signaling-deficient embryos exhibit vascular hyposprouting with notable absence or apparent lack of blood vessels in some tissues, particularly in the yolk sac. Conversely, S1P1/Gio/Rac signaling promotes cell-cell contact, adherens junction assembly, and vascular stability (Figure 2).

Whether endothelial LPARs exhibit spatial expression gradients during vascular development remains to be determined. Our understanding of in vivo LPAR and S1PR distributions, including subcellular localization, has been limited by the lack of widely available high-quality antibodies and the technical challenges associated with precise measurement of lysophospholipid gradients in complex tissues. 101

Developmental Studies Suggest Lysolipid and Wnt Connections

As outlined above, many of the core processes influenced by lysolipid signaling have also been observed to be regulated, to some extent, by the central pathways of early development: Notch, BMP, and in particular Wnt signaling. This is interesting given the dependence of Wnt signals on lipids and lipoproteins, 102 and the intricate relationships between Wnt signals, cell polarity, intercellular junctions, cytoskeletal structure, and metabolism. 85,103,104 Wnt signaling’s role in central decisions is illustrated by the diverse effects of mutations in Wnt pathway genes during development and disease. 105 Importantly, there are often parallels between the effects of Wnt gain of function and loss of function which suggest a tuning of a wide range of signaling pathways, although in many instances, this may simply reflect our limited understanding of the relevant biology. 103,106 There are several key downstream effectors of Wnt including the β-catenin destruction complex, the planar cell polarity pathway, and a complex noncanonical pathway that appears to modulate the multifaceted effects of calcium signals throughout the cell. 103,105

Specific lipids and lipoproteins are required for the transmission of Wnt signals between cells and inability to package Wnt ligands in appropriate lipoprotein essentially abolishes the downstream effects in receiving cells. 102 Classical Wnt effects are restricted to only a few cell diameters in range, but recent evidence of signaling roles for circulating lipoproteins in higher vertebrates raises the possibility that Wnt signals may also operate at a distance. 107,108 The lipid requirements for Wnt signal transduction are poorly understood, but specific lipids or lipoproteins may be necessary for endocytosis in the receiving cell of the ligand-receptor/coreceptor complexes or subsequent gating of the signals by intraorganelle pH or other factors. 104,109–111 The parallels between lysolipid pathways and Wnt in development warrant further studies to elucidate underlying mechanisms. Some recently described mechanisms are discussed in detail below.

S1P and Wnt Signaling in Blood-Retina-Barrier Development

Like lysolipid signaling, Wnt signaling is transduced by a family of receptors with 7 transmembrane domains, some of which have been shown to couple to heterotrimeric G proteins. 112 The protein Norrin (Ndp), a TGF (transforming growth factor)-β family member produced by glia, is a high-affinity Wnt-like ligand for its EC receptor FZD4 (Frizzled4). 113 Norrin/FZD4 signaling increases the activity of β-catenin and TCF/LEF TFs (transcription factors), 114 which leads to induction of proteins that promote a functional blood-retina-barrier (BRB) and suppression of proteins that cause vascular leakage or fenestration. 114,115 The developing BRB becomes dysfunctional upon loss of Norrin, or EC-specific deletion of Fzd4, Cttnb1, e S1pr1. 40,41,46,114,115 There are shared albeit distinct outcomes of endothelial S1P/S1PR and Norrin/FZD4/β-catenin signaling in BRB development, which suggests both convergent and divergent signaling, possibly as a function of underlying metabolic states, microenvironmental, or humoral factors. 104

Wnt-deficient retinas are hypovascular, 114–117 whereas S1PR1 signaling-deficient retinas are hypervascular. Thus, Wnt signaling promotes EC proliferation and vascular branching 117 while S1P signaling stabilizes blood vessels. 40,41,46 An in vivo reporter of canonical Wnt signaling was active throughout the developing retinal vascular ECs, 81 suggesting that β-catenin and TCF/LEF factors are active in blind-ended vascular sprouts as well as in ECs undergoing maturation. Whether Wnt signaling is involved in expression of tip cell genes at the vascular front is not known. However, there is evidence suggesting that both Wnt and S1P signaling suppress a tip cell gene expression program in the nascent vascular network.

Deficiency of either Wnt or S1P signaling results in vascular leakage and hemorrhage, 40,46,114 which can increase the concentration of VEGF and activation of VEGFRs. In fact, EC VEGFR signaling is required for expression of the prototypical tip cell genes Esm1, Apln, e Igfbp3, 75 which are induced in retinal ECs that lack Wnt or S1P signaling (Figure 3). Although tissue hypoxia and high VEGF might contribute to ectopic expression of tip cell genes in Ndp-knockout and S1pr-knockout retinal ECs, it is also possible that VEGFR-independent mechanisms contribute to S1P- and Wnt signaling-mediated suppression of these genes in the nascent vascular network. Indeed, tissue hypoxia might be anticipated to interrupt Wnt signaling, possibly explaining some of the selective phenomena observed. 104,110

Figura 3. Gene expression in Norrin-deficient and S1PR (sphingosine 1-phosphate receptor)-deficient retinal endothelial cells (EC).A–E, Expression of selected genes in Norrin knockout (Ndp-KO) and wild-type (WT) retinal EC were acquired from https://jacobheng.shinyapps.io/cnshypoxia/. 118 For control and S1PR-deficient retinal EC, data were acquired from GEO accession GSE141440. 46 UN e B, Expression of neurovascular-enriched transcripts that encode tight junction components (UN), transporters or transcription factors (B). C, Expression of genes that are enriched in tip cells. D, Expression of Plvap. E, S1pr1 o Fzd4 expression in Ndp-KO or S1PR-deficient retinal EC, respectively. FACS indicates fluorescence-activated cell sorting and scRNA-seq, single-cell RNA-sequencing.

Yanagida et al 46 reported that 97 neurovasculature-enriched transcripts were down-regulated in S1PR-deficient retinal ECs. Ndp-knockout retinal ECs also down-regulated many of these transcripts (Figure 3A and 3B). 118 For example, both Wnt and S1P signaling are required for normal expression of tight junction components (Lsr, Ocln), transporters (Mfsd2a, Tfrc), and transcription factors (Lef1, Tcf7, Zic3) that are enriched in the vasculature of the central nervous system 46 (Figure 3). Espressione di Cldn5 e Plvap, well-characterized targets of Wnt signaling in the BRB, were not significantly affected in S1PR signaling-deficient retinal ECs (Figure 3A and 3D). 46 Therefore, S1P and Wnt signaling regulate common and distinct gene sets that determine neurovascular structure and function. For example, suppression of Plvap (fenestrae) and induction of Cldn5 (tight junctions) are likely 2 mechanisms by which Wnt signaling, but not S1P signaling, promote BRB integrity (Yanagida et al 46 and Figure 3). However, S1PR1 signaling is upstream of CLDN5 expression in lymphatic ECs during developmental lymphangiogenesis. 119 Thus, S1PR1 and other EC surface receptors do not exhibit a one-size-fits-all model of signaling and transcriptional outputs but rather have unique functions according to developmental stage, vascular bed, microenvironmental context, and EC subtype.

Any epistatic relationship between endothelial Wnt and S1P signaling is anticipated to be multifaceted and insights will likely require analysis of novel mouse strains, 103 such as Ctnnb1 flex3/+ S1p1 f/f Cdh5-Cre ERT2 , which would address whether increasing β-catenin activity is sufficient to rescue maturation defects in S1PR1-knockout retinal ECs. Il Ctnnb1 flex3 allele encodes a β-catenin protein that resists degradation and is sufficient for induction of a BRB-like endothelial phenotype (MFSD2A+, LEF1+, CLDN5+, PLVAP−) in the vasculature of circumventricular (eg, neuroendocrine) organs. 81 Additionally, R26-8xTCF/LEF-LSL-H2B-GFPS1p1 f/f Cdh5-Cre ERT2 mice would likely address the effect of EC-specific S1pr1-knockout on β-catenin and TCF/LEF transcriptional activity in retinal ECs. 81

Mosaic deletion of Fzd4 in BRB and BBB vasculature showed that induction of CLDN5 and suppression of PLVAP occurs in an FZD4-dependent, cell-autonomous fashion and is unlikely secondary to hypoxia or high VEGF levels. 81 Similar mosaic experiments in S1PR signaling-deficient mice might reveal cell-autonomous S1PR versus hypoxia-dependent effects on expression of BRB-enriched genes, such as Mfsd2a, Tfrc, e Lef1. Alternatively, sFlt1 (fms-like tyrosine kinase-1) that blocks VEGF signaling may be a useful reagent to investigate the role of this pathway in Wnt- and S1P signaling reporter mice. Because VEGF itself can induce vascular leak, 120 adherens junctions (VE-cadherin) should also be examined to determine the role of aberrant VEGF signaling in junctional breakdown observed in S1PR-knockout retinal vasculature. 40,41,46 These experiments may provide novel mechanistic insights into S1PR- versus VEGFR-mediated gene expression and vascular function during BRB development in the context of Wnt signaling.

LPP3, Lysolipids, and Wnt Signaling in Gastrulation and Axial Patterning

Alcuni Lpp3 −/− embryos exhibited defective gastrulation with axis duplication at E7.5 (30% penetrance), a phenotype reminiscent of ectopic Wnt signaling. 100 Over-expression of Xwnt3a o Xwnt8 induces axis duplication in Xenopus embryos, 100 as does over-expression of Cwnt8C 121 or ablation of the Wnt signaling inhibitor Axin 122 in mouse embryos. At E7.0, expression of brachyury, a WNT3 target gene, is restricted to the primitive streak 100 however, Lpp3 −/− embryos with axis duplication have 2 brachyury-expressing primitive streak structures. 100 In addition, expression of the Wnt signaling antagonist Dkk1 is markedly reduced in Lpp3 −/− embryos. 100 Importantly, axis duplication induced by injection of Xwnt3a o Xwnt8 mRNA was inhibited by coinjection with mouse Lpp3 mRNA, demonstrating that LPP3 can inhibit signaling by these Wnt ligands. 100

There are several open questions related to LPP3-mediated axial patterning, including whether specific lysolipid receptors are involved. To date, axis duplication has not been reported in S1PR- or LPAR-deficient mice, suggesting that LPP3-mediated axial patterning does not require signaling by individual lysolipid receptors. This notion is supported by insights from Drosophila, which lack orthologs of vertebrate G-protein–coupled lysolipid receptors but express 2 LPP3 homologs, Wun and Wun2 (wunen and wunen-2) that are essential for gastrulation. 96,100 In somatic cells, wun and wun2 produce phospholipid metabolites that serve as guidance cues by repelling germ cells (GCs), a process that is required for bilateral sorting of GCs away from the ventral midline. 96,123 Wun-deficient embryos have scattered GCs and high frequency of GC death. 124 Interestingly, a Drosophila GPCR called Tre1 is required for GC migration towards high concentrations of Wun-generated phospholipids in a Gαo-dependent manner. 125 In support of the notion that Tre1 binds Wun metabolites, the human Tre1 homolog, GPR84, binds medium-chain fatty acids. 126 Thus, Tre1 might be the primary receptor for Wun-generated phospholipids, though this would require confirmation by receptor signaling assays.

Tre1, in addition to guiding GC migration, is required for Rho-mediated protein polarization in GCs. 125 Drosophila Tre1 may have conserved functions that are split among multiple proteins in vertebrates. 125 The presence of compensatory mechanisms in vertebrates may explain why defective gastrulation is ≈30% penetrant in Lpp3 −/− mice but 100% penetrant in Wun-null Drosophila embrioni. In addition, the phosphatase activity of wun2 is essential for GC survival. 127 Human LPP3 can rescue GC death in wun2-deficient embryos, suggesting an evolutionarily conserved phosphatase function for LPP3 in gastrulation. 127

Evidence to date strongly suggests that the phospholipids metabolized by LPP3 must be spatially compartmentalized to ensure normal axial patterning. Given that lipoprotein-derived precursors feed into lysolipid metabolic pathways, LDL, VLDL, and other lipoproteins may be involved in spatial control of lysolipid signaling. However, identification of the specific lipids, the means of compartmentalization, and clarification of downstream signaling mechanisms all remain a major challenge. Isolation of these molecules will provide mechanistic insight into Wun and LPP3-mediated axial patterning, cell survival and may also reveal how phospholipids regulate Wnt signaling in vertebrates or invertebrates. 128 A detailed mechanistic understanding of embryonic Wun and LPP3 metabolites and cognate receptors may inform exploration of LPP3-mediated endothelial functions during development, postnatal homeostasis, and disease.

Lysolipids in Cardiovascular Disease

Insights From Human Studies

In the 1970s, landmark studies reported negative correlations between coronary artery disease (CAD) severity and circulating HDL levels. 129–131 Subsequent biochemical analyses of HDL particles have uncovered significant heterogeneity. 132 For example, on a stoichiometric basis, 1 in 10 HDL particles contains S1P. 133 Although only a minority of studies in the HDL field have focused on lysolipids, recent work has linked HDL-S1P to CAD. For example, HDL-S1P (1) correlates inversely with the severity of coronary atherosclerosis, 134 (2) is an independent predictor of coronary in-stent restenosis, 135 (3) is lower in patients with stable CAD than in healthy individuals, 136,137 and (4) correlates negatively with the occurrence of CAD independently of HDL-cholesterol 137 (reviewed in Levkau 138 ). In HUVECs, HDL isolated from CAD patients was ineffective at stimulating S1PR1-dependent vasoprotective signaling events, including vasodilation, which was rescued by providing exogenous S1P. 139

Lipoprotein(a), which is highly predictive of cardiovascular diseases (CVD) in humans, was shown to supply autotaxin and therefore involved in local signaling of LPA via its receptors. In calcific aortic valve disease, lipoprotein(a)-derived autotaxin directly induces valve fibrosis and calcification, presumably via a Rho GTPase signaling pathway. 140,141 Inhibitors of this signaling axis may be useful in the medical management of aortic valve diseases.

S1PR1 genomic heterogeneity may contribute to CVD risk. For example, single-nucleotide polymorphisms (SNPs) in the N-terminal cap region of S1PR1 were associated with multivessel CVD in a patient cohort, suggesting a potential regulatory function of this receptor. 142 Asthma is characterized by a chronic inflammatory process with increased vascular permeability. Several SNPs (rs2038366, rs3753194, rs59317557) in the putative enhancer and promoter regions of S1pr1 associate with increased risk of asthma development. 143 The SNP rs2038366 was notable for conferring S1pr1 downregulation by luciferase assay in human pulmonary artery ECs. 143

S1PR1: Pharmacological considerations

The Food and Drug Administration–approved S1PR functional antagonist FTY720 (fingolimod) is prescribed as an immunomodulatory agent to treat relapse-remitting multiple sclerosis. 144 This drug’s mechanism of action is downregulation of lymphocyte S1PR1 in lymphoid tissue, which sequesters lymphocytes by preventing chemotaxis towards high (S1P) in circulation. 145 Although this lymphocyte-targeted drug has clear immunologic benefits, endothelial S1PR1 is also being explored as a therapeutic target in autoimmune and fibrotic conditions. Studies using experimental disease models (discussed below) suggest that endothelial S1PR1 agonism mitigates inflammation through at least 2 mechanisms: (1) enhancing the vascular barrier and (2) attenuating endothelial inflammatory responses, each limiting leukocyte recruitment to tissue parenchyma. 146

The notion that pharmacological or endogenous agents elicit varying degrees of biased engagement of S1PR1 with either Gio/Rac or β-arrestin pathways has both clarified and added complexity to our understanding of S1P signaling. 39,107,147 For example, arterial ECs of the thoracic aorta express S1PR1 mRNA 148 and protein 107 in a homogenous manner and are exposed to circulatory S1P. However, S1PR1/β-arrestin coupling is heterogeneous in aortic arterial endothelium of adult mice, 107,148 and the frequency of S1PR1/β-arrestin coupling increases with temporal transition from early postnatal to young adult, which coincides with upregulation of thrombospondin-1. 107,148 Despite high expression and the functional importance of S1PR1 in early postnatal mouse retinal ECs, we observed relatively low levels of S1PR1/β-arrestin coupling in these cells (unpublished observation). In contrast, developing embryonic lymphatic vessels show high levels of S1PR1/β-arrestin coupling. 119 Although these data suggest a spectrum of S1PR1/β-arrestin signaling among ECs, we lack in vivo evidence for such a spectrum of S1PR1/Gio signaling. We can hypothesize that cells highly engaged in β-arrestin signaling are relatively low in S1PR1/Gio attività. Endogenous mechanisms that skew S1PR1 towards β-arrestin versus Gio are unclear but may involve concomitant signaling pathways, such as LPARs, 149 VEGFRs, junctional signals, shear force responses, or S1PR1 association with presently unknown cofactors. A prototypical example of cofactor-dependent signaling in vascular endothelium occurs in the central nervous system when ECs respond to WNT7 ligands with the multi-protein complex of FZD4/GPR124/RECK/LRP6. 150–153

Patients taking FTY720 risk complications from lymphopenia, which is a direct result of β-arrestin–mediated S1PR1 internalization in lymphocytes. 145,154 A similar mechanism in ocular endothelium may underpin macular edema that occurs in a small subset (0.8%–1.5%) of patients. 155 Vascular development is apparently unaffected in mice expressing 2 mutant S1PR1 alleles (S1pr1 S5A/S5A ) that encode a β-arrestin coupling- and internalization-defective receptor. 154 Furthermore, S1pr1 S5A/S5A mice are more resistant to FTY720-induced lung vascular leakage and S1PR1 degradation. 62 Therefore, endothelium-targeted S1PR1 agonists would likely provide maximal therapeutic benefit if biased towards activation of Gαi/Rac to limit β-arrestin recruitment (ie, mimic S1pr1 S5A/S5A ) and avoid receptor degradation and lymphopenia. A compound matching these criteria was recently described and showed therapeutic efficacy in preclinical models of coronary endothelial damage and renal ischemia/reperfusion injury. 147 In a recent phase 1 clinical study of diabetics, this compound, SAR247799 stimulated myocardial perfusion without inducing lymphopenia in diabetics. 156

Taken together, these studies of S1PR1 signaling highlight an important consideration for drug development and remind us that S1P measurement in patient fluids or tissue does not inform on S1PR1 expression or the extent of β-arrestin versus Gio/Rac signaling, which may have more functional significance than S1P levels alone.

S1P in Experimental Disease Models

Rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus, although etiologically complex, share the pathophysiologic mechanisms of neutrophil activation and immune complex deposition in tissues with resultant end-organ damage. S1PR1 agonism limits vascular barrier leakage associated with immune complex deposition. 65 Inversely, genetic inactivation of EC S1PR1 or pharmacological S1PR1 antagonism resulted in more vascular leak and pulmonary neutrophil accumulation relative to control animals. 65

After organ damage, endothelial S1PR1 promotes recovery, regeneration, and limits fibrosis. In a hydrochloric acid-induced model of lung injury, EC S1PR1 protected against vascular leak and limited fibrosis. 157 Following partial hepatectomy, EC S1PR1 protected against fibrosis and improved liver vascular function, perfusibility, tissue regeneration, and animal survival. 158 Perhaps it is not surprising that S1PR1 is important for tissue regeneration as the vasculature is a critical component of most major organ systems and S1PR1 is a central regulator of vascular network formation, but other roles for lysolipid signals in endothelial or epithelial biology may be involved.

In the murine Apoe −/− high-fat diet model, EC-specific S1PR1 deficiency exacerbated disease severity and macrophage infiltration into atherosclerotic plaques. 107 Although S1P signaling in ECs seems protective in the context of atherosclerosis, S1P regulation of macrophage phenotypes is more complex. S1PR2 159 or S1PR3 160 deficiency attenuated foam cell accumulation into lesions—an effect that is myeloid cell-intrinsic, as evidenced by bone marrow chimera experiments. In contrast, S1PR1-specific agonists confer an anti-inflammatory macrophage phenotype in vitro. 161 Thus, we propose a model describing pro- and anti-inflammatory effects of S1P as first compartmentalized among cell types (vascular versus myeloid), 162 secondarily compartmentalized between different S1P receptors (S1PR1 versus S1PR2/3), and at a tertiary level when considering S1PR1 association with Gio/Rac versus β-arrestin pathways.

S1PR1 signaling is engaged in arterial ECs of the aorta intima as well as in adventitial lymphatic endothelium. 148 In homeostasis, S1PR1 attenuates expression of proinflammatory transcripts in arterial (eg, Cx3cl1/fractalkine, Vcam1, Ptgs2) and lymphatic ECs (Ccl21, Irf8, Il7). Furthermore, S1PR1 is a critical regulator of developmental lymphangiogenesis. 119 Therefore, future studies might parse out blood vascular versus lymphatic S1PR1 signaling in mitigation of inflammation.

Consistent with an anti-inflammatory S1PR1 function, Teijaro et al 163 demonstrated that the S1PR1 agonist CYM-5442 mitigates influenza virus–induced pulmonary cytokine storm and leukocyte infiltration. These effects of CYM-5442 were observed in Rag2 −/− mice, which lack mature B and T cells, suggesting a minor role for lymphocyte S1PR1. 163 Lung ECs from influenza virus–infected mice showed reduced CCL2 and CXCL10 expression in response to CYM-5442, 163 suggesting that EC S1PR1 attenuates cytokine amplification during influenza virus infection. The expression of cytokines has been linked to Wnt-Ca 2+ signaling in ECs, and there is initial evidence of bidirectional cross-talk between TLR2/4, inflammasome activation, and canonical Wnt signals, 164–166 although the detailed molecular mechanisms have not been studied.

The primary Mendelian forms of atherosclerosis result from mutations in a small number of genes which cause familial dyslipidemias and premature vasculopathy. These genes (Ldlr, ApoB, Lrp6, Ldlrap, Pcsk9) not only all share the defining vascular phenotypes but also participate in different aspects of Wnt signaling, implying some commonality to the underlying mechanisms of atherosclerosis, but to date defining any shared mechanism has proven elusive. 109,167,168 Activation of canonical Wnt signaling has been observed in the endothelium of murine models before the emergence of focal atherosclerotic lesions and has been attributed to flow effects. 169 Disruption of physiological endothelial-smooth muscle interactions with proliferation of subjacent smooth muscle is associated with local canonical Wnt activation in reporter mice. 170 In later stages of the atherosclerotic process, several aspects of Wnt signaling have been directly implicated in vascular calcification, including evidence that LRP6 mitigates calcification in Ldlr −/− diabetic mice. 171 Ongoing work exploring the role of Wnt and lysolipids in the pathophysiology of atherosclerosis spans the full repertoire of Wnt signaling, but unifying generalizable insights have yet to emerge. 172

LPA and Vascular Disease

In patients with acute coronary syndromes, culprit coronary arteries showed elevated LPA levels relative to the peripheral circulation. 173 LPA accumulates in the lipid core region of human and mouse atherosclerotic lesions, 174–176 and unstable plaques show high frequency of ATX immunostaining in the necrotic core. 177

In addition to disruption of endothelial junctions (discussed above), LPA also induces NFκB signaling and expression of downstream proinflammatory molecules in ECs. 178 Furthermore, LPA has been shown to positively regulate monocyte/macrophage uptake of oxidized-LDL, 179,180 expression of the proinflammatory molecule IL (interleukin)-1β, 180 and inhibit apoptosis, 181 which may inhibit macrophage clearance from subendothelial space. These effects are likely mediated by LPAR1 or LPAR2. 182,183 Importantly, the LPA/LPAR5 signaling axis induces platelet activation, which may contribute to atherothrombosis. 184,185 Finally, a pharmacological inhibitor of LPAR1/3 reduced plaque burden and myeloid infiltrate 186,187 in 2 different models of murine atherosclerosis, whereas injection with LPA20:4 increased plaque burden and myeloid infiltrate. 187 Collectively, these data imply that LPA enhances atherothrombosis and subendothelial foam cell accumulation, although careful studies of signaling events intrinsic to specific cell types are lacking in this field.

Consistent with human genetic studies suggesting a protective role for LPP3 in endothelium, 54,188–190 EC LPP3 expression protects against lung vascular leakage in homeostatic and endotoxemic conditions in mice. 57 Global reduction of LPP3 in the postnatal period accelerates atherosclerosis development in a mouse model, which is largely attributable to the role of LPP3 in smooth muscle cells but unlikely related to LPP3 function in myeloid cells. 191 Inhibition of LPA signaling by an ATX inhibitor or pan-LPAR inhibitor rescued the exacerbated lung vascular leakage in EC-specific LPP3-knockout animals. Conversely, mice with low levels of circulating ATX (and likely reduced LPA content) were resistant to LPS-induced lung vascular leakage. 57 Intradermal LPA injection–induced permeability of skin vasculature in a dose-dependent fashion, 57 consistent with HUVEC responses to LPA. 51,86 In endotoxemia models, EC-specific LPP3-knockout mice showed ≈3-fold increases in plasma (IL-6) and peritoneal leukocyte recruitment after thioglycolate injection, suggesting that EC LPP3 attenuates inflammatory responses. 57 Collectively, these data suggest that endothelial LPP3 attenuates LPA/LPAR-mediated vascular permeability and inflammation.

Several multiethnic genome-wide association studies found evidence of a strong association between CAD and an SNP (rs17114036) in intron 5 of Ppap2b (which encodes the LPP3 protein). 188–190 In human aortic ECs, rs17114036 is within a ≈1.2 kb peak of high chromatin accessibility and histone modification (H3K27ac, H3K4me2 [dimethyl modified histone H3 at lysine 4]) associated with active enhancers. 54 Other cell types (K562, GM12878, NHEK [normal human epidermal keratinocytes]) lacked indications of active chromatin, suggesting a unique role for this ciselement in ECs. 54 Luciferase assays demonstrated significant enhancer activity for the ≈1.2 kb region at rs17114036. 54 CRISPR-Cas9–mediated deletion of a ≈66 bp region enclosing rs17114036 attenuated LPP3 expression. 54 Consistently, mutagenesis of the risk allele (T/T) to the protective genotype (T/C) resulted in a ≈6-fold increase in enhancer activity, establishing a causal relationship between the T/T variant and attenuated LPP3 expression. 54 Taken together with information from genome-wide association studies, these experiments suggest that strategies that promote endothelial LPP3 activity or expression may have therapeutic benefit in CVD.

Outstanding Questions and Perspectives for Future Research

S1P and LPA receptors, and molecules that regulate lysolipid bioavailability, are emerging as tractable targets for a range of pathologies that stem from autoimmune diseases, tissue injury, and pathogen infection. Animal models have yielded insights regarding downstream outcomes of single and collective receptor signaling, namely, S1PR1 as the primary endothelial S1PR promoting stabilization and maturation, whereas LPAR4 and LPAR6 promote EC proliferation and vascular front expansion. Further studies of subcellular location-specific LPAR activation, such as LPP3-regulated restriction of signaling to regions devoid of cell-cell contacts, warrant further study. Similarly, we lack mechanisms to describe S1PR1 biased signaling towards Gio/Rac or β-arrestin pathways. Understanding of these pathways may facilitate rational drug design as well as development of assays that, in addition to lipid measurements, will more precisely inform on the lysolipid signaling status of patients.

We lack a mechanism to explain why the rs17114036 SNP, which appears to regulate EC LPP3 expression, is strongly correlated with CVD risk. Is the mechanism as straightforward as aberrant LPAR signaling in coronary arteries downstream of increased local LPA levels? or do individuals with this genetic variant have developmental defects, perhaps involving Wnt signaling, that compound with other factors and manifest as CVD? As we learn more about the basic science of lysolipid signaling using biochemical, cell culture, and animal models, we will be better prepared for rational design of therapeutic agents and evaluation of their efficacy.

Post-transcriptional regulation of lysolipid receptors in cell type-specific contexts is an active area of investigation. Several studies have identified microRNAs that directly or indirectly downregulate S1pr1 expression in human cancer cell lines, including miR (micro RNA)-148a in ovarian cancer, 192 miR-149 in hepatocellular carcinoma, 193 and miR-133b in nasopharyngeal carcinoma. 194 At least 2 studies have shown that miR-155 targets S1pr1 in lymphocytes. 195,196 miR-24 downregulates S1pr1 expression in HUVECs and human kidney epithelial cells, 197 miR-24 antagonism improved survival and tissue vascularization in a model of renal ischemia/reperfusion injury. 197 Similarly, the miR-17–92 cluster negatively regulates normal and ischemia-responsive arteriogenesis around mouse limbs, likely via inhibition of Wnt signaling components including FZD4 and LRP6. 198 As compared to vascular S1P receptors, less is known about microRNA regulation of Lpar4 e Lpar6, though one study showed miR-139-5p targets Lpar4 in human umbilical cord mesenchymal stem cells. 199 MicroRNA signaling in vascular biology has been reviewed elsewhere, 200–202 and additional insights are likely to arise from unbiased profiling in a human 3-dimensional–culture angiogenesis model. 203 Currently, data indicate that antagonism of endothelial microRNAs that downregulate S1pr1 may improve vascular function after tissue injury.

The enzyme SPL (S1P lyase) irreversibly catabolizes S1P to phosphoethanolamine and hexadecenal. 204 Along with LPP3 205 and SPNS2, 20 SPL is critical for T-cell egress from lymphoid organs to circulation. 206 Mechanistically, SPL expressed by thymic dendritic cells causes parenchymal S1P sinks that promote T-cell chemotaxis towards relatively high (S1P) in the bloodstream. 207 Ongoing research aims to determine whether SPL-targeted therapies may provide immunomodulatory benefits similar to those of FTY720 (fingolimod) without inhibiting vascular-protective S1P signaling. 207–210

Finally, understanding the complex and often contradictory effects of Wnt and lysolipid signaling in vascular biology is likely to require a much deeper exploration of the developmental effects of these convergent pathways on endothelial biology. Accumulating evidence suggests that the potential to connect mechanotransduction, metabolism, cell polarity, and intercellular communication or competition with the fundamental processes of aging remains high, but mechanistic molecular models will require unraveling many of the most complex temporal and regional signaling hierarchies in development. 85,103,105