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3.3: Proteine ​​- Biologia

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3.3: Proteine

Le proteine ​​14-3-3: integratori di diversi segnali di segnalazione che influiscono sul destino cellulare e sullo sviluppo del cancro

La famiglia di proteine ​​14-3-3, altamente conservata, ha assunto una posizione di importanza nella biologia cellulare grazie al suo coinvolgimento in processi cellulari vitali, come il metabolismo, il traffico di proteine, la trasduzione del segnale, l'apoptosi e la regolazione del ciclo cellulare. Le proteine ​​14-3-3 sono proteine ​​leganti fosfo-serina/fosfo-treonina che interagiscono con una vasta gamma di partner di legame. Poiché molte interazioni del 14-3-3 sono dipendenti dalla fosforilazione, il 14-3-3 è stato strettamente integrato nelle principali vie fosfo-regolatrici che sono cruciali per la crescita e lo sviluppo normali e che spesso diventano disregolati negli stati patologici umani come il cancro. Questa recensione esamina i recenti progressi che chiariscono ulteriormente il ruolo delle proteine ​​14-3-3 come integratori di diversi segnali di segnalazione che influenzano le decisioni sul destino cellulare e la tumorigenesi.

Cifre

Funzioni di 14-3-3 in proliferazione,…

Funzioni di 14-3-3 nella segnalazione proliferativa, oncogenica, di sopravvivenza e di stress. (un) Sotto proliferativo...

Funzioni di 14-3-3 in TORC1...

Funzioni di 14-3-3 in segnalazione TORC1. (un) In condizioni di crescita, la chinasi AKT...

Funzioni di 14-3-3 nella citochinesi...

Funzioni di 14-3-3 nella citochinesi. (un) La funzione 14-3-3σ è necessaria per un mitotico...

Funzioni di 14-3-3 nel soppressore del tumore...

Funzioni di 14-3-3 nelle vie oncosoppressori. (un) La via dell'ippopotamo dei mammiferi trasmette segnali...


Le proteine ​​14-3-3 trattengono la nucleasi Exo1 per prevenire la resezione eccessiva

Il processo di resezione finale del DNA determina la risposta cellulare al danno da rottura del doppio filamento del DNA ed è essenziale per il mantenimento del genoma. Sebbene un'insufficiente resezione del DNA ostacoli la riparazione diretta dall'omologia e l'attivazione del checkpoint dipendente da ATR (atassia telangiectasia e Rad3), la resezione eccessiva produce un DNA a singolo filamento eccessivo che potrebbe portare a instabilità genomica. Tuttavia, i meccanismi che controllano la resezione terminale del DNA sono poco conosciuti. Qui mostriamo che la principale nucleasi di resezione Exo1 è regolata sia positivamente che negativamente dalle interazioni proteina-proteina per garantire un adeguato livello di resezione del DNA. Abbiamo dimostrato in precedenza che l'antigene nucleare delle cellule proliferanti (PCNA) del morsetto scorrevole del DNA si associa al dominio C-terminale di Exo1 e promuove l'associazione al danno di Exo1 e la resezione del DNA. In questo rapporto, mostriamo che le proteine ​​14-3-3 interagiscono con una regione centrale di Exo1 e regolano negativamente il reclutamento del danno Exo1 e la successiva resezione. 14-3-3 limitano l'associazione del danno di Exo1, almeno in parte, sopprimendo la sua associazione con PCNA. L'interruzione dell'interazione di Exo1 con le proteine ​​14-3-3 determina un'elevata sensibilità delle cellule al danno del DNA. A differenza di Exo1, il percorso di resezione del Dna2 apparentemente non è regolato da PCNA e 14-3-3. I nostri risultati forniscono approfondimenti critici sul meccanismo e sulla regolazione del processo di resezione finale del DNA e possono avere implicazioni per il trattamento del cancro.

Parole chiave: 14-3-3 proteina Risposta al danno del DNA Riparazione del DNA Resezione del DNA Controllo del checkpoint Exo1 antigene nucleare delle cellule proliferanti (PCNA).

© 2015 di The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.


Proteine ​​leganti 14-3-3 e 14-3-3

La famiglia 14-3-3 di proteine ​​acide da 27 a 32 kDa è espressa nel citoplasma delle cellule eucariotiche. 1 Sette isotipi 14-3-3 sono stati trovati nei mammiferi (α/β, γ, τ/θ, ε, η, σ e ζ/δ), che possono formare tutti omodimeri ed eterodimeri. 1 Tutti gli isotipi 14-3-3 hanno sequenze altamente conservate tra le specie e condividono la caratteristica chiave del legame dipendente dalla fosforilazione a motivi peptidici a base di serina/treonina, che si trovano in >200 diverse fosfoproteine ​​intracellulari. 2 Questi motivi sono classificati come modalità 1 (RSXpSXP), modalità 2 (RXY/FXpSXP), 3 e modalità 3 (pS/TX1-2COOH), 4 dove X rappresenta un residuo amminoacidico intercambiabile e la p minuscola indica la fosforilazione. 5 Tuttavia, le sequenze di amminoacidi in alcuni siti di legame 14-3-3 identificati, sebbene omologhe, non si conformano precisamente a queste modalità e alcune possono essere omologhe alla modalità >1. Ad esempio, i siti di legame C-terminale 14-3-3 sulla piastrina GPIbα contengono il SIRYSGHSL 610 -CO2Sequenza H, che è conforme alla modalità 3, ma mostra anche omologia con le modalità 1 e 2. 6 Inoltre, è stato dimostrato che alcune sequenze peptidiche non fosforilate interagiscono con 14-3-3. 7,8 Sulla base dei motivi di legame noti, strumenti tra cui software, 9,10 database, 11 e server Web, 12 come Scansite, 9 ELM, 10 e A Nnotazione e analisi integrata dell'interattoma 14-3-3 ( ANIA), 11 sono stati sviluppati per aiutare a prevedere le sequenze di peptidi leganti 14-3-3.

Nelle proteine ​​bersaglio, i residui chiave Ser/Thr dei motivi di legame 14-3-3 possono essere fosforilati dalle protein chinasi Ser/Thr, comprese le chinasi AGC (ad es., protein chinasi A), chinasi calcio/calmodulina-dipendenti e chinasi LIM, 13-15 e defosforilata dalle fosfatasi (ad es. PP2A e PP1), 16-18 aumentando o inibendo, rispettivamente, il legame 14-3-3 (Figura 1). 19 In alcune proteine, il residuo di serina >1 può essere fosforilato, con effetti variabili. La fosforilazione di entrambi i residui Ser nella sequenza citoplasmatica RRPS 587 ALS 590 di GPIbα sembra essere necessaria per il legame 14-3-3. Al contrario, nella sequenza di legame 14-3-3 (RRS 216 RS 218 FT) del regolatore della proteina G RGS18, la fosforilazione di Ser 218 è importante per il legame 14-3-3γ ad alta affinità, ma la fosforilazione al vicino S 216 regola negativamente l'interazione. 20,21 Il legame di 14-3-3 ai suoi partner può anche essere regolato negativamente dalla fosforilazione di 14-3-3 a Thr 233 e Ser 185 (Figura 1). 7

Legame regolato dalla fosforilazione tra 14-3-3 e le sue proteine ​​bersaglio. Ciascun monomero 14-3-3 contiene un sito di legame per un motivo di legame 14-3-3 serina/treonina-fosforilato. Dopo la fosforilazione delle proteine ​​bersaglio, un dimero 14-3-3 può legarsi a 2 motivi fosforilati in tandem in 1 proteina bersaglio, modulandone la conformazione/struttura. Un dimero 14-3-3 può anche legarsi a 2 fosfoproteine ​​separate, agendo come adattatore/impalcatura per l'assemblaggio di complessi proteici. La fosforilazione di 14-3-3 a Thr 233 e Ser 185 regola negativamente la sua capacità di interagire con le proteine ​​bersaglio. Queste caratteristiche consentono a 14-3-3 di regolare la funzione proteica o trasmettere segnali in maniera dipendente dalla fosforilazione, che può essere controllata da una singola coppia protein chinasi/fosfatasi o da più protein chinasi/fosfatasi.

Legame regolato dalla fosforilazione tra 14-3-3 e le sue proteine ​​bersaglio. Ciascun monomero 14-3-3 contiene un sito di legame per un motivo di legame 14-3-3 serina/treonina-fosforilato. Dopo la fosforilazione delle proteine ​​bersaglio, un dimero 14-3-3 può legarsi a 2 motivi fosforilati in tandem in 1 proteina bersaglio, modulandone la conformazione/struttura. Un dimero 14-3-3 può anche legarsi a 2 fosfoproteine ​​separate, agendo come adattatore/impalcatura per l'assemblaggio di complessi proteici. La fosforilazione di 14-3-3 a Thr 233 e Ser 185 regola negativamente la sua capacità di interagire con le proteine ​​bersaglio. Queste caratteristiche consentono a 14-3-3 di regolare la funzione proteica o trasmettere segnali in modo dipendente dalla fosforilazione, che può essere controllato da una singola coppia protein chinasi/fosfatasi o da più protein chinasi/fosfatasi.

I membri della famiglia delle proteine ​​14-3-3 sono coinvolti in una varietà di processi cellulari dipendenti dalla fosforilazione, sia fisiologici che patologici. I primi includono proliferazione, 22 differenziazione, 23-25 ​​migrazione, 26-28 riorganizzazione del citoscheletro, apoptosi, 29,30 e controllo del punto di controllo del ciclo cellulare, 31-34 e il secondo, progressione del cancro e metastasi, 33,35 sebbene i meccanismi di l'azione non è del tutto chiara. La natura dimerica delle proteine ​​14-3-3 consente l'associazione con 2 motivi serina/treonina fosforilati nelle stesse o in 2 diverse proteine ​​bersaglio (Figura 1). 8,36 Pertanto, i 14-3-3 dimeri possono agire come adattatori/scaffold dipendenti dalla fosforilazione per influenzare le interazioni tra 2 fosfoproteine, 37-39 o possono anche modulare la conformazione di una singola catena polipeptidica legandosi a 2 siti fosforilati su la stessa catena polipeptidica. 37,38,40 Inoltre, è anche possibile che il legame 14-3-3 inibisca l'interazione del suo partner di legame con altre molecole. 8,41,42


Contenuti

Ci sono sette geni che codificano sette distinte proteine ​​14-3-3 nella maggior parte dei mammiferi (vedi geni umani sotto) e 13-15 geni in molte piante superiori, sebbene tipicamente nei funghi siano presenti solo in coppia. I protisti ne hanno almeno uno. Gli eucarioti possono tollerare la perdita di un singolo gene 14-3-3 se sono espressi più geni, tuttavia la delezione di tutti i 14-3-3 (come determinato sperimentalmente nel lievito) provoca la morte. [ citazione necessaria ]

Le proteine ​​14-3-3 sono strutturalmente simili alla superfamiglia Tetratrico Peptide Repeat (TPR), che generalmente hanno 9 o 10 alfa eliche e di solito formano interazioni omo- e/o etero-dimero lungo le loro eliche amino-terminali. Queste proteine ​​contengono una serie di domini di modifica comuni noti, comprese le regioni per l'interazione dei cationi bivalenti, la fosforilazione e l'acetilazione e la scissione proteolitica, tra le altre stabilite e previste. [3]

14-3-3 si lega ai peptidi. Esistono motivi di riconoscimento comuni per le proteine ​​14-3-3 che contengono un residuo di serina o treonina fosforilata, sebbene sia stato riportato anche il legame con ligandi non fosforilati. Questa interazione avviene lungo un cosiddetto solco o fessura di legame che è di natura anfipatica. Ad oggi, le strutture cristalline di sei classi di queste proteine ​​sono state risolte e depositate nel pubblico dominio. [ citazione necessaria ]

I siti dei motivi sono molto più diversi di quanto suggeriscano i modelli qui. Per un esempio con un moderno riconoscitore che utilizza una rete neurale artificiale, vedere l'articolo citato. [5]

Scoperta e denominazione Modifica

Le proteine ​​14-3-3 sono state inizialmente trovate nel tessuto cerebrale nel 1967 e purificate mediante cromatografia ed elettroforesi su gel. Nei campioni di cervello bovino, le proteine ​​14-3-3 sono state localizzate nella 14a frazione eluendo da una colonna di DEAE-cellulosa e in posizione 3.3 su un gel per elettroforesi dell'amido. [6]

Funzione Modifica

Le proteine ​​14-3-3 svolgono un ruolo specifico dell'isoforma nella ricombinazione del cambio di classe. Si ritiene che interagiscano con la deaminasi indotta dall'attivazione della proteina (citidina) nel mediare la ricombinazione del cambio di classe. [7]

La fosforilazione di Cdc25C da parte di CDS1 e CHEK1 crea un sito di legame per la famiglia 14-3-3 di proteine ​​leganti la fosfoserina. Il legame di 14-3-3 ha scarso effetto sull'attività di Cdc25C e si ritiene che 14-3-3 regoli Cdc25C sequestrandolo al citoplasma, prevenendo così le interazioni con CycB-Cdk1 che sono localizzate nel nucleo al G2 /M transizione. [8]

Si dice che l'isoforma eta sia un biomarcatore (nel liquido sinoviale) per l'artrite reumatoide. [9]

  • Raf-1
  • Cattivo – vedi Bcl-2
  • Bax
  • Cdc25
  • Akti
  • SOS1[10] – vedi RSK
  • YWHAB – "14-3-3 beta"
  • YWHAE – "14-3-3 epsilon"
  • YWHAG – "14-3-3 gamma"
  • YWHAH – "14-3-3 eta"
  • YWHAQ – "14-3-3 tau"
  • YWHAZ – "14-3-3 zeta"
  • SFN o YWHAS – "14-3-3 sigma" (Stratifin)

Le proteine ​​14-3-3 alfa e delta (YWHAA e YWHAD) sono forme fosforilate di YWHAB e YWHAZ, rispettivamente.

La presenza di grandi famiglie di geni di proteine ​​14-3-3 nel regno Viridiplantae riflette il loro ruolo essenziale nella fisiologia vegetale. Un'analisi filogenetica di 27 specie di piante ha raggruppato le proteine ​​14-3-3 in quattro gruppi.

Le proteine ​​14-3-3 attivano le ATPasi di tipo P H + autoinibite della membrana plasmatica. Legano il C-terminale delle ATPasi a una treonina conservata. [11]


Ideale per la produzione di proteine ​​su larga scala

Il vettore pcDNA™3.3-TOPO® contiene un promotore CMV modificato e potenziato che consente un'espressione proteica estremamente elevata. Il vettore è ideale per la produzione di proteine ​​su larga scala, soprattutto se utilizzato in combinazione con i nostri sistemi di espressione FreeStyle™ MAX CHO o 293. Abbiamo espresso diverse proteine ​​e osservato 8-30 mg/L di proteine ​​ricombinanti prodotte utilizzando i nostri sistemi FreeStyle™ (Figura 1).

Figura 1. Alte rese di proteine ​​ricombinanti. Abbiamo utilizzato il vettore pcDNA™3.3-TOPO® per clonare ed esprimere livelli di milligrammi di eritropoietina (EPO), Fattore IX (FIX) e IgG nelle cellule FreeStyle™ CHO-S. I costrutti pcDNA™3.3-TOPO® contenenti le sequenze geniche derivate dalla PCR rilevanti sono stati trasfettati in cellule FreeStyle™ CHO-S in volumi di 30 mL. I geni delle catene pesanti e leggere sono stati co-trasfettati per l'espressione delle IgG. Da quattro a sei giorni dopo la trasfezione, EPO e FIX sono stati quantificati utilizzando l'anticorpo IgG anti-umano di capra immobilizzato. Ogni barra mostra la media di due esecuzioni di espressioni.

Figura 2. Mappa vettoriale pcDNA™3.3. L'ultima versione della famiglia di vettori pcDNA, pcDNA™3.3 ti offre la flessibilità di esprimere una proteina nativa o aggiungere il tuo tag di purificazione preferito al gene di interesse prima della clonazione TOPO®.

Il nostro vettore pcDNA™3.3 incorpora la tecnologia di clonazione TOPO®, che rimuove i passaggi inaffidabili e dispendiosi in termini di tempo dal flusso di lavoro di clonazione, consentendo di eseguire reazioni di clonazione da banco in genere in soli 5 minuti. Con un recupero fino al 95% del clone desiderato, hai sempre il clone di cui hai bisogno per gli esperimenti a valle.

Figura 3. Abbiamo clonato e misurato l'espressione di luciferasi (pannello A) e ß-galattosidasi (pannello B) nei vettori pcDNA™3.3-TOPO®, pCI e pCMV-Script®. Dopo la trasfezione transitoria in cellule aderenti GripTite™ 293 MSR, l'attività della ß-galattosidasi e l'attività della luciferasi sono rispettivamente 2 e 5 volte superiori, utilizzando il vettore pcDNA™3.3 rispetto ai vettori concorrenti. Le barre di errore mostrate rappresentano la deviazione standard (n = 6).

Il kit di clonazione PCDNA™3.3 TOPO® TA include cellule competenti One Shot® TOP10 ad alta efficienza per prestazioni di clonazione superiori. Il nostro OptiCHO™ Antibody Express Kit, che include il pcDNA™3.3 TOPO® TA Cloning Kit, consente la creazione di linee cellulari stabili e la produzione di anticorpi in una linea cellulare DG44 priva di siero di diidrofolato reduttasi (DHFR–) ovaio di criceto cinese (CHO).


Risultati

Identificazione e caratterizzazione strutturale della trota iridea 14-3-3 geni

Il primo Omy14-3-3 Il gene è stato trovato nella libreria sottratta preparata da cervelli di trota iridea stressata ed è stato osservato essere simile alla proteina beta dei mammiferi. Per identificare altre isoforme, abbiamo confrontato le sequenze di 47395 EST di trota iridea dalla libreria di trote arcobaleno normalizzata con proteine ​​umane 14-3-3 utilizzando blastx autonomo (Altschul et al., 1997). Blastn ha distribuito i cloni che codificano putativi 14-3-3 geni in 10 cluster, che contenevano sequenze identiche di diversa lunghezza. Inoltre, abbiamo sequenziato 10 cloni le cui estremità 5' includevano i codoni di inizio previsti. Abbiamo analizzato tutti gli EST di pesci salmonidi depositati nel National Center for Biotechnology Information (NCBI) dbEST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/) e The Institute for Genomic Research (TIGR http://www.tigr .org/tdb/tgi/rtgi/) e non ha trovato nuove isoforme. Allineamento di sequenze multiple con ClustalW (Thompson et al., 1994 http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) diviso 10 Omy14-3-3 geni in cinque coppie, che sono state designate come A, B (simile a beta), C, E (simile a epsilon) e G (simile a gamma). Le sequenze di codifica delle proteine ​​erano molto simili in ogni coppia (Fig. 1), mentre i 5'- e 3'-UTR erano divergenti in tutti i geni tranne Omy14-3-3A.

Struttura delle proteine ​​14-3-3 della trota iridea. Le sequenze sono state allineate con ClustalW e gli amminoacidi conservati sono stati evidenziati con Boxshade.

Struttura delle proteine ​​14-3-3 della trota iridea. Le sequenze sono state allineate con ClustalW e gli amminoacidi conservati sono stati evidenziati con Boxshade.

Per le analisi filogenetiche, abbiamo utilizzato 14-3-3 proteine ​​di pesci teleostei (Fundulo e Danio) e mammiferi le cui sequenze sono state recuperate da Swiss-Prot (http://us.expasy.org/sprot/) l'outroot proveniva dall'ascidia (Ciona intestinale). Oltre a cinque proteine ​​Dr14-3-3 di Swiss-Prot, cinque sequenze erano disponibili da Ensembl (http://www.ensembl.org/) e altre quattro sono state trovate confrontando i cluster UniGene EST (http://www .ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=unigene)con proteine ​​umane 14-3-3 utilizzando blastx (Tabella S2 nel materiale supplementare). Il numero totale di putativi Dr14-3-3 geni era 14, tuttavia, due brevi sequenze non sono state incluse nelle analisi. Lo studio filogenetico ha fornito ulteriori prove per la duplicazione dei geni ancestrali della trota iridea, poiché 10 proteine ​​Omy14-3-3 sono state divise in cinque cladi separati (Fig. 2). Dieci di 12 Dr14-3-3 i geni erano duplicati e tre Dr14-3-3G geni potrebbero derivare da due successive duplicazioni. Alcuni ciprinidi sono, come i salmonidi, tetraploidi, e la possibilità di un'antica duplicazione del genoma nel pesce zebra è dibattuta. Tutti i tipi di proteine ​​Omy14-3-3 sono stati trovati nel pesce zebra. Nella trota iridea, non c'era un ortologo per il Fundulo(F) gene tuttavia, questo è stato assegnato al clade che include Dr14-3-3F1 e F2. Tre dei sei tipi di proteine ​​14-3-3 di pesce (E, G e B) sono stati raggruppati con proteine ​​epsilon, gamma e beta di mammiferi ad alti valori bootstrap. I tipi A, C e F erano specifici per i pesci, mentre le proteine ​​zeta, sigma, eta e tau 14-3-3 sono state trovate esclusivamente nei mammiferi. È interessante notare che in quattro delle cinque coppie di proteine ​​Omy14-3-3 (B, C, G ed E), un gene è stato assegnato a un clade contenente il secondo gene e l'ortologo di mammifero o di pesce zebra. Il cladogramma 14-3-3 era nettamente diverso dall'albero organismico e questo suggeriva una rapida divergenza di duplicati Omy14-3-3 geni. Per verificare questo risultato, abbiamo confrontato sinonimi (KS) e non sinonimo (Kun) divergenza nella trota iridea e nei mammiferi (umani e topi) 14-3-3 geni (tabella 1). il mezzo KS nei geni dei pesci era 1,65 volte maggiore che nei mammiferi 14-3-3 geni, mentre Kun è aumentato di 10,5 volte.

Cladogramma delle proteine ​​14-3-3 dei vertebrati. È stata calcolata la matrice proteica distante e l'albero è stato costruito utilizzando il metodo di unione dei vicini. I valori bootstrap per 1000 repliche sono indicati in corrispondenza dei nodi dei cladi che includono le proteine ​​della trota iridea. I numeri di accesso delle proteine ​​utilizzate nelle analisi filogenetiche sono riportati nelle Tabelle S2, S3 (materiale supplementare.

Cladogramma delle proteine ​​14-3-3 dei vertebrati. È stata calcolata la matrice proteica distante e l'albero è stato costruito utilizzando il metodo di unione dei vicini. I valori bootstrap per 1000 repliche sono indicati in corrispondenza dei nodi dei cladi che includono le proteine ​​della trota iridea. I numeri di accesso delle proteine ​​utilizzate nelle analisi filogenetiche sono riportati nelle Tabelle S2, S3 (materiale supplementare.

Geni. KS . Kun .
trota iridea
14-3-3A0.182 0.0074
14-3-3G0.624 0.0243
14-3-3 MI1.023 0.0266
14-3-3B0.689 0.0539
14-3-3C1.038 0.0866
Mammiferi
14-3-3 gamma0.437 0
14-3-3 epsilon0.127 0
14-3-3 tempo0.704 0.0035
14-3-3 tau0.322 0.0035
14-3-3 zeta0.391 0.007
14-3-3 beta0.597 0.0087
Geni. KS . Kun .
trota iridea
14-3-3A0.182 0.0074
14-3-3G0.624 0.0243
14-3-3 MI1.023 0.0266
14-3-3B0.689 0.0539
14-3-3C1.038 0.0866
Mammiferi
14-3-3 gamma0.437 0
14-3-3 epsilon0.127 0
14-3-3 tempo0.704 0.0035
14-3-3 tau0.322 0.0035
14-3-3 zeta0.391 0.007
14-3-3 beta0.597 0.0087

Espressione di trota iridea 14-3-3 geni

Espressione di 14-3-3 geni nei tessuti della trota iridea è stata analizzata mediante RT-PCR. I primer per PCR sono stati progettati per distinguere tra i geni duplicati, tuttavia, non siamo stati in grado di separare i Omy14-3-3A1e la2 isoforme a causa della loro elevata somiglianza di sequenza. Distribuzione di 14-3-3 geni era onnipresente e le trascrizioni di sei geni (Omy14-3-3B1, B2, C1, C2, G1 e G2) sono stati trovati in 10 degli 11 tessuti analizzati (Fig. 3). Cervello, ovaio e testicolo ospitavano un set completo di Omy14-3-3 geni. Il numero di isoforme espresse in altri tessuti è classificato da otto (branchie e reni) a due (pelle). Espressione di Omy14-3-3 i geni sono stati studiati anche negli embrioni. Omy14-3-3B1 e B2 sono stati espressi in tutti gli stadi di sviluppo analizzati (Fig. 4). Altri tre geni (Omy14-3-3C1, C2 e UN) erano rilevabili nelle blastule. Ciò potrebbe essere dovuto alla persistenza dei trascritti materni, poiché l'espressione di questi geni è stata interrotta nelle successive fasi di sviluppo. Sei su nove analizzati Omy14-3-3 i geni erano già espressi nelle gastrule tardive. Espressione di Omy14-3-3E2 e do2 ha avuto inizio all'inizio della somitogenesi (15 somiti), mentre G2 era l'ultima isoforma (34 somiti).

(A) Espressione di Omy14-3-3 geni è stato analizzato con RTPCR in trota iridea milza (sp), rene (k), intestino (i), fegato (l), branchie (g), pelle (sk), cuore (h), muscolo scheletrico (sm), ovaio (o), testicolo (t) e cervello (b). In ogni campione, l'RNA è stato raccolto da tre individui e le analisi sono state ripetute due volte. (B) L'immagine del gel presenta un'espressione differenziale di duplicato Omy14-3-3 geni.

(A) Espressione di Omy14-3-3 geni è stato analizzato con RTPCR in trota iridea milza (sp), rene (k), intestino (i), fegato (l), branchie (g), pelle (sk), cuore (h), muscolo scheletrico (sm), ovaio (o), testicolo (t) e cervello (b). In ogni campione, l'RNA è stato raccolto da tre individui e le analisi sono state ripetute due volte. (B) L'immagine del gel presenta un'espressione differenziale di duplicato Omy14-3-3 geni.

(A) Espressione di Omy14-3-3 geni in embrioni di trota iridea è stato determinato con RT-PCR a diversi stadi di sviluppo: blastula (b), gastrula precoce (es), gastrula tardiva (es), 15 somiti (15 sp) e 34 somiti (34 sp). In ogni campione, l'RNA è stato raccolto da 10 embrioni e le analisi sono state ripetute due volte. (B) L'immagine del gel presenta un'espressione differenziale di duplicato Omy14-3-3 geni.

(A) Espressione di Omy14-3-3 geni in embrioni di trota iridea è stato determinato con RT-PCR a diversi stadi di sviluppo: blastula (b), gastrula precoce (es), gastrula tardiva (es), 15 somiti (15 sp) e 34 somiti (34 sp). In ogni campione, l'RNA è stato raccolto da 10 embrioni e le analisi sono state ripetute due volte. (B) L'immagine del gel presenta un'espressione differenziale di duplicato Omy14-3-3 geni.

Abbiamo analizzato l'espressione differenziale di Omy14-3-3 geni in 31 esperimenti di microarray che si sono occupati della risposta della trota iridea allo stress, agli inquinanti ambientali e agli antigeni batterici. Le isoforme sono state confrontate mediante correlazione dei profili di espressione con altri geni presentati sulla diapositiva ei dati sono stati analizzati con ridimensionamento multidimensionale. Le metriche della distanza sono state calcolate per ogni coppia di geni duplicati e le differenze dei profili di espressione erano chiaramente correlate alla divergenza non sinonima dei duplicati (Fig. 5 Tabella 1). Tuttavia, è possibile che la differenza di espressione tra A1 e la2isoforme è stata sottovalutata. A differenza di altri Omy14-3-3 geni, le sequenze 3′-UTR di questi mRNA sono altamente conservate e l'ibridazione incrociata potrebbe influenzare i risultati delle analisi di microarray. Abbiamo osservato uno stretto coordinamento dell'espressione di 10 isoforme negli studi sulla risposta allo stress nel cervello della trota arcobaleno. Tutto Omy14-3-3 i geni sono stati downregolati dopo 1 giorno, a cui è seguito un successivo aumento dei livelli di espressione (Fig. 6). Abbiamo selezionato geni con profili significativamente simili (Pearson r,P<0.05) e analizzato la sovrarappresentazione delle classi funzionali di Gene Ontology (Ashburner et al.,2000) in questo gruppo (Tabella 2). Questo risultato ha suggerito che Omy14-3-3 i geni potrebbero condividere meccanismi regolatori con proteine ​​nucleari, chaperon e proteine ​​coinvolte nella trasduzione del segnale, nel legame dei nucleotidi e nel metabolismo.

duplicato Omy14-3-3 i geni sono stati confrontati per somiglianza dei profili di espressione in 31 esperimenti di microarray. Le distanze sono state determinate con scaling multidimensionale.

duplicato Omy14-3-3 i geni sono stati confrontati per somiglianza dei profili di espressione in 31 esperimenti di microarray. Le distanze sono state determinate con scaling multidimensionale.

Espressione di Omy14-3-3 geni nel cervello della trota iridea stressata. I pesci di un anno sono stati stressati con reti (2 min) e confinamento (20 min) e questo trattamento è stato ripetuto per 5 giorni. I campioni di cervello sono stati raccolti 1, 3 e 5 giorni dopo la prima esposizione allo stress. In ogni campione, l'RNA è stato raccolto da quattro individui. Per l'ibridazione è stato utilizzato un design a scambio di colore e l'espressione dei geni è stata misurata in 12 repliche.

Espressione di Omy14-3-3 geni nel cervello della trota iridea stressata. I pesci di un anno sono stati stressati con reti (2 min) e confinamento (20 min) e questo trattamento è stato ripetuto per 5 giorni. I campioni di cervello sono stati raccolti 1, 3 e 5 giorni dopo la prima esposizione allo stress. In ogni campione, l'RNA è stato raccolto da quattro individui. Per l'ibridazione è stato utilizzato un design a scambio di colore e l'espressione dei geni è stata misurata in 12 repliche.

Classi funzionali significativamente sovrarappresentate (esatto test di Fisher, P<0.05) nell'elenco dei geni la cui espressione era correlata con Omy 14-3-3 geni nel cervello della trota iridea stressata

Classi funzionali. Numero di geni.
Nucleo 47
Comunicazione cellulare 39
Trasduzione del segnale 33
Legame nucleotidico 28
Cascata di segnalazione intracellulare 17
Attività di accompagnatore 12
Piccola trasduzione del segnale mediata da GTPasi 7
Recettore che segnala l'attività della proteina 6
Biosintesi del ribonucleotide purinico 4
Legame della cromatina 4
Classi funzionali. Numero di geni.
Nucleo 47
Comunicazione cellulare 39
Trasduzione del segnale 33
Legame nucleotidico 28
Cascata di segnalazione intracellulare 17
Attività di accompagnatore 12
Piccola trasduzione del segnale mediata da GTPasi 7
Recettore che segnala l'attività della proteina 6
Biosintesi del ribonucleotide purinico 4
Legame della cromatina 4

Espressione di sei Omy14-3-3 geni (A1, A2, E1, E2, G1 e G2) in embrioni somitici (40 somiti) e postsomitici è stata analizzata con sul posto ibridazione. Per separare le isoforme strettamente correlate, abbiamo utilizzato i 3′-UTR amplificati dalla PCR come modelli per la preparazione delle sonde. Non siamo stati in grado di trovare alcuna differenza marcata nei modelli di espressione di Omy14-3-3 geni quindi Omy14-3-3B1 è mostrato come esempio (Fig. 7). Negli embrioni somitici (Fig. 7A,B), i trascritti sono stati trovati nella cresta neurale, negli occhi, nel sincizio del tuorlo, nella gemma della coda e nei somiti caudali. È interessante notare che l'espressione di 14-3-3 geni nella gemma della coda e nei somiti caudali sono stati osservati in alcuni degli embrioni analizzati. Negli embrioni postsomitici (Fig. 7C,D), le trascrizioni sono state rilevate nella cresta neurale, nei coperchi branchiali e negli archi branchiali e nelle pinne pettorali, tuttavia, non c'era espressione nella coda e negli occhi.

Espressione di Omy14-3-3B1 è stata analizzata in embrioni di trota iridea somitica (A,B) e postsomitica (C,D) con sul posto ibridazione. Sono stati analizzati 15 embrioni in ogni fase dello sviluppo e sono mostrati esempi rappresentativi. Le trascrizioni sono state rilevate nella cresta neurale (nc), occhi (e), strato di tuorlo sincizio (ysl), somiti caudali (s), gemma della coda (tb), opercoli branchiali (gc), archi branchiali (ga) e pinne pettorali ( pf). Le aree di espressione attiva sono mostrate a maggiore ingrandimento in B e D.

Espressione di Omy14-3-3B1 è stata analizzata in embrioni di trota iridea somitica (A,B) e postsomitica (C,D) con sul posto ibridazione. Sono stati analizzati 15 embrioni in ogni fase dello sviluppo e sono mostrati esempi rappresentativi. Le trascrizioni sono state rilevate nella cresta neurale (nc), occhi (e), strato di tuorlo sincizio (ysl), somiti caudali (s), gemma della coda (tb), opercoli branchiali (gc), archi branchiali (ga) e pinne pettorali ( pf). Le aree di espressione attiva sono mostrate a maggiore ingrandimento in B e D.


Sfondo

È noto che le proteine ​​14-3-3 regolano diversi processi legando proteine ​​bersaglio fosforilate in tutti gli eucarioti [1-5]. Sebbene siano state identificate centinaia di potenziali proteine ​​interagenti con 14-3-3 [1, 5], ci sono stati studi limitati che confermano in vivo interazioni e/o chiarire le funzioni di regolazione delle proteine ​​14-3-3 [6-10]. Le proteine ​​bersaglio 14-3-3 maggiormente caratterizzate sono la nitrato reduttasi e l'H + -ATPasi. Le proteine ​​14-3-3 attivano la H+ -ATPasi [11] e inibiscono l'attività della nitrato reduttasi [12]. Il nostro precedente studio suggerisce che tre isoforme 14-3-3 (kappa, chi e psi) svolgono anche ruoli importanti nei processi metabolici dell'azoto e dello zolfo regolando le attività della fosfoenolpiruvato carbossilasi e dell'O-acetilserina liasi [13].

Si ritiene che le proteine ​​vegetali 14-3-3 siano principalmente regolatrici del metabolismo del carbonio e dell'azoto [2]. Tuttavia, questa ipotesi si basa su studi di solo poche proteine ​​bersaglio, come la nitrato reduttasi e la saccarosio-fosfato sintasi [14]. La nitrato reduttasi è fosforilata al buio dalla proteina chinasi calcio-dipendente (CDPK) e dalla chinasi 1 non fermentante il saccarosio (SnRK1) che avvia l'interazione dell'enzima con le proteine ​​14-3-3 e la sua inattivazione. Alla luce, la nitrato reduttasi è defosforilata da una proteina fosfatasi 2A, portando alla dissociazione del 14-3-3 e all'attivazione della nitrato reduttasi [15-18]. Nel metabolismo del carbonio, alcuni enzimi metabolici del carbonio come la saccarosio fosfato sintasi [19] e la proteina a doppia funzione 6-fosfofrutto-2-chinasi/fruttosio-2,6-bisfosfatasi [20], sono stati identificati come bersagli interagenti di 14- 3-3 proteine. La rilevanza funzionale delle proteine ​​14-3-3 nel meccanismo di regolazione dei loro bersagli, tuttavia, non è ancora chiara. Considerando le centinaia di possibili proteine ​​bersaglio 14-3-3 rivelate attraverso molteplici studi di screening, è probabile che i ruoli finora descritti siano solo una piccola parte delle funzioni delle proteine ​​14-3-3 [5, 13, 21].

Il profilo dei metaboliti è un potente strumento che ha contribuito alla comprensione della fisiologia vegetale, comprese le differenze fenotipiche, le annotazioni geniche, la regolazione dei metaboliti e la caratterizzazione delle risposte allo stress [22, 23]. Inoltre, l'integrazione della metabolomica con altre "omiche", come la genomica, l'enzimatica e l'interattomica, porta non solo alla costruzione di reti metaboliche ma anche alla comprensione dei ruoli che particolari proteine ​​svolgono all'interno della rete metabolica [24, 25]. In questo studio, combinando metabolomica e approcci genetici, enzimatici, biochimici e molecolari, siamo stati in grado di tracciare una mappa completa dei ruoli funzionali che le proteine ​​14-3-3 svolgono nei processi metabolici essenziali.

Il nostro studio conferma inoltre che le proteine ​​14-3-3 sono importanti regolatori dei processi metabolici sia dell'azoto che del carbonio. In particolare, mostriamo che le proteine ​​14-3-3 giocano un ruolo per controllare il ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA) e la via dello shikimate.


Per studenti e insegnanti

Solo per insegnanti

COMPRENSIONE PERMANENTE
ENE-1
L'organizzazione altamente complessa dei sistemi viventi richiede un apporto costante di energia e lo scambio di macromolecole.

OBIETTIVO DI APPRENDIMENTO
ENE-1.F
Spiega come le modifiche alla struttura di un enzima possono influire sulla sua funzione.

ENE-1.G
Spiega come l'ambiente cellulare influenza l'attività enzimatica.

CONOSCENZE ESSENZIALI
ENE-1.F.1
La modifica della struttura molecolare di un componente in un sistema enzimatico può comportare una modifica della funzione o dell'efficienza del sistema –

  1. La denaturazione di un enzima si verifica quando la struttura proteica viene interrotta, eliminando la capacità di catalizzare le reazioni.
  2. Temperature ambientali e pH al di fuori dell'intervallo ottimale per un dato enzima causeranno modifiche alla sua struttura, alterando l'efficienza con cui catalizza le reazioni.

ENE-1.F.2
In alcuni casi, la denaturazione dell'enzima è reversibile, consentendo all'enzima di riprendere l'attività.

ENE-1.G.1
Il pH ambientale può alterare l'efficienza dell'attività enzimatica, anche attraverso l'interruzione dei legami idrogeno che forniscono la struttura enzimatica.

ENE-1.G.2
Le concentrazioni relative di substrati e prodotti determinano l'efficienza con cui procede la reazione enzimatica.

ENE-1.G.3
Temperature ambientali più elevate aumentano la velocità di movimento delle molecole in una soluzione, aumentando la frequenza delle collisioni tra enzimi e substrati e quindi aumentando la velocità di reazione.

ENE-1.G.4
Le molecole inibitorie competitive possono legarsi in modo reversibile o irreversibile al sito attivo dell'enzima. Gli inibitori non competitivi possono legare i siti allosterici, modificando l'attività dell'enzima.


14-3-3 Proteine: Regolatori di numerose proteine ​​eucariotiche

Le proteine ​​14-3-3 formano una famiglia di proteine ​​altamente conservate in grado di legarsi a più di 200 diverse proteine ​​per lo più fosforilate. Sono presenti in tutti gli organismi eucarioti indagati, spesso in più isoforme, fino a 13 in alcune piante. I partner di legame 14-3-3 sono coinvolti in quasi tutti i processi cellulari e le proteine ​​14-3-3 svolgono un ruolo chiave in questi processi. Le proteine ​​14-3-3 interagiscono con i prodotti codificati dagli oncogeni, con le proteine ​​che formano i filamenti coinvolte nella malattia di Alzheimer e molte altre proteine ​​legate alle malattie umane. Disturbance of the interactions with 14-3-3 proteins may lead to diseases like cancer and the neurological Miller-Dieker disease. The molecular consequences of 14-3-3 binding are diverse and only partly understood. Binding of a protein to a 14-3-3 protein may result in stabilization of the active or inactive phosphorylated form of the protein, to a conformational alteration leading to activation or inhibition, to a different subcellular localization or to the interaction with other proteins. Currently genome- and proteome-wide studies are contributing to a wider knowledge of this important family of proteins. IUBMB Life, 57: 623-629, 2005


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