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Un filamento non può essere sintetizzato in direzione 5' -> 3'?

Un filamento non può essere sintetizzato in direzione 5' -> 3'?



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Ho risolto alcune domande di biologia, e secondo una di queste (ho anche le risposte) la seguente frase è falso:
"Entrambi i filamenti sono sempre sintetizzati nella direzione da 5' a 3'".
Come può essere? Da quello che so il DNA viene sempre letto da 3' a 5' e sintetizzato da 5' a 3'.
Quando il DNA non viene sintetizzato da 5' a 3'?


Sembra che la tua ipotesi fosse giusta e l'eccezione è il filone in ritardo. La dichiarazione è formulata male, ma sembra che stessero puntando sul filone in ritardo. O volevano che tu pensassi questo
-il filamento in ritardo sta crescendo da 3' a 5'
o, più probabilmente,
-la polimerasi sintetizza solo su un filamento (principale) alla volta

Sebbene tecnicamente il libro fosse corretto, era una domanda trabocchetto e formulata in modo ingiusto.

Hai perfettamente ragione che il DNA è sintetizzato da 5' a 3'. Non conosco eccezioni a questo, ma esito a dire qualcosa di eccessivamente definitivo perché ci sono così tante rare eccezioni nella scienza. Posso dire con una certa sicurezza che DNA polimerasi non può mai sintetizzare nella direzione 3' -> 5'. Se non l'hai già fatto, ti consiglio vivamente di dare un'occhiata all'articolo della Khan Academy, Meccanismo molecolare della replicazione del DNA! Nature Education ha anche un buon articolo sull'argomento, Major Molecular Events of DNA Replication.


Qual è il filamento principale e quello ritardato nella replicazione del DNA?

filamenti di DNA sono antiparalleli. DNA la polimerasi può lavorare continuamente verso il replica forchetta solo su uno filo (il filo conduttore) mentre dall'altro filo (il filo in ritardo) deve procedere lontano dal replica forchetta. Il filo in ritardo lo fa in modo discontinuo in segmenti chiamati frammenti di Okazaki.

qual è il filamento principale nella replicazione del DNA? quando replica inizia, i due genitori filamenti di DNA sono separati. Uno di questi si chiama filo conduttore, e questo è replicato continuamente nella direzione da 3' a 5'. L'altro filo è il ritardo? filo, e questo è replicato discontinuo in brevi tratti.

Proprio così, qual è la differenza tra il filamento principale e il filamento ritardato nel quizlet sulla replicazione del DNA?

Il filo conduttore è correttamente orientato per DNA polimerasi III per aggiungere nucleotidi nel 5' - 3' direzione verso il replica forchetta in un continuo filo mentre il filo in ritardo corre nella direzione opposta (3' - 5') e deve essere replicato indietro, lontano dal replica forchetta.

Perché la replicazione del DNA avviene nella direzione da 5 a 3?

Questi frammenti vengono elaborati dal replica macchinario per produrre un filo continuo di DNA e quindi una figlia completa DNA elica. replicazione del DNA va in da 5' a 3' direzione perché DNA la polimerasi agisce sul 3'-OH del filamento esistente per l'aggiunta di nucleotidi liberi.


Telomerasi e invecchiamento

Le cellule che subiscono la divisione cellulare continuano ad avere i loro telomeri accorciati perché la maggior parte delle cellule somatiche non produce telomerasi. Ciò significa essenzialmente che l'accorciamento dei telomeri è associato all'invecchiamento. Con l'avvento della medicina moderna, dell'assistenza sanitaria preventiva e di stili di vita più sani, la durata della vita umana è aumentata e c'è una crescente domanda per le persone di sembrare più giovani e avere una migliore qualità della vita man mano che invecchiano.

Nel 2010, gli scienziati hanno scoperto che la telomerasi può invertire alcune condizioni legate all'età nei topi. Questo potrebbe avere un potenziale nella medicina rigenerativa. [1] In questi studi sono stati utilizzati topi carenti di telomerasi, questi topi hanno atrofia tissutale, deplezione delle cellule staminali, insufficienza del sistema di organi e risposte alterate alle lesioni tissutali. La riattivazione della telomerasi in questi topi ha causato l'estensione dei telomeri, ridotto il danno al DNA, invertito la neurodegenerazione e migliorato la funzione dei testicoli, della milza e dell'intestino. Pertanto, la riattivazione dei telomeri può avere il potenziale per il trattamento di malattie legate all'età negli esseri umani.

Il cancro è caratterizzato dalla divisione cellulare incontrollata di cellule anormali. Le cellule accumulano mutazioni, proliferano in modo incontrollato e possono migrare in diverse parti del corpo attraverso un processo chiamato metastasi. Gli scienziati hanno osservato che le cellule cancerose hanno telomeri notevolmente accorciati e che la telomerasi è attiva in queste cellule. È interessante notare che solo dopo che i telomeri si sono accorciati nelle cellule cancerose la telomerasi è diventata attiva. Se l'azione della telomerasi in queste cellule può essere inibita dai farmaci durante la terapia del cancro, allora le cellule cancerose potrebbero potenzialmente essere fermate da un'ulteriore divisione.

In sintesi: telomeri

Le estremità dei cromosomi rappresentano un problema durante la replicazione del DNA poiché la polimerasi non è in grado di estenderle senza un primer. La telomerasi, un enzima con uno stampo di RNA incorporato, estende le estremità copiando lo stampo di RNA ed estendendo un'estremità del cromosoma. La DNA polimerasi può quindi estendere il DNA usando il primer. In questo modo vengono protette le estremità dei cromosomi. Questo è importante poiché le prove indicano che la lunghezza dei telomeri può svolgere un ruolo nella regolazione della divisione cellulare e del processo di invecchiamento.


Sia le catene di DNA che di RNA sono prodotte copiando filamenti di DNA modello

Il regolare accoppiamento delle basi nella struttura del DNA a doppia elica ha suggerito a Watson e Crick un meccanismo di sintesi del DNA. La loro proposta che i nuovi filamenti di DNA siano sintetizzati copiando i filamenti di DNA dei genitori si è dimostrata corretta.

Il filamento di DNA che viene copiato per formare un nuovo filamento è chiamato stampo. Le informazioni nel modello sono conservate: sebbene la prima copia abbia una sequenza complementare, non identica, una copia della copia produce nuovamente la sequenza originale (modello). Nella replicazione di un doppio filamento, o bifamiliare, Molecola di DNA, vengono copiati entrambi i filamenti di DNA originali (parentali). Al termine della copia, i due nuovi duplex, ciascuno costituito da uno dei due fili originali più la sua copia, si separano l'uno dall'altro. In alcuni virus, le molecole di RNA a singolo filamento funzionano come modelli per la sintesi di catene complementari di RNA o DNA (Capitolo 7). Tuttavia, la stragrande maggioranza dell'RNA e del DNA nelle cellule è sintetizzata dal DNA duplex preesistente.


Biologia 171

Alla fine di questa sezione, sarai in grado di fare quanto segue:

  • Spiegare il processo di replicazione del DNA nei procarioti
  • Discutere il ruolo di diversi enzimi e proteine ​​nel supportare questo processo

La replicazione del DNA è stata ben studiata nei procarioti principalmente a causa delle piccole dimensioni del genoma e della grande varietà di mutanti disponibili. E. coli ha 4,6 milioni di paia di basi in un singolo cromosoma circolare e tutto viene replicato in circa 42 minuti, partendo da un singolo sito lungo il cromosoma e procedendo attorno al cerchio in entrambe le direzioni. Ciò significa che vengono aggiunti circa 1000 nucleotidi al secondo. Pertanto, il processo è abbastanza rapido e si verifica senza molti errori.

La replicazione del DNA impiega un gran numero di proteine ​​strutturali ed enzimi, ognuno dei quali svolge un ruolo critico durante il processo. Uno degli attori chiave è l'enzima DNA polimerasi, noto anche come DNA pol, che aggiunge nucleotidi uno per uno alla catena di DNA in crescita che è complementare al filamento stampo. L'aggiunta di nucleotidi richiede energia, questa energia è ottenuta dai nucleosidi trifosfati ATP, GTP, TTP e CTP. Come l'ATP, l'altro NTP (nucleosidi trifosfati) sono molecole ad alta energia che possono servire sia come fonte di nucleotidi del DNA sia come fonte di energia per guidare la polimerizzazione. Quando il legame tra i fosfati viene "rotto", l'energia rilasciata viene utilizzata per formare il legame fosfodiestere tra il nucleotide in arrivo e la catena in crescita. Nei procarioti sono noti tre tipi principali di polimerasi: DNA pol I, DNA pol II e DNA pol III. È ormai noto che il DNA pol III è l'enzima richiesto per la sintesi del DNA Il DNA pol I è un importante enzima accessorio nella replicazione del DNA e, insieme al DNA pol II, è principalmente richiesto per la riparazione.

Come fa il macchinario di replicazione a sapere da dove cominciare? Si scopre che ci sono sequenze nucleotidiche specifiche chiamate origini della replica dove inizia la replica. In E. coli, che ha un'unica origine di replicazione sul suo unico cromosoma (come la maggior parte dei procarioti), questa origine di replicazione è lunga circa 245 paia di basi ed è ricca di sequenze AT. L'origine della replicazione è riconosciuta da alcune proteine ​​che si legano a questo sito. Un enzima chiamato elicasi svolge il DNA rompendo i legami idrogeno tra le coppie di basi azotate. Per questo processo è necessaria l'idrolisi dell'ATP. Quando il DNA si apre, le strutture a forma di Y chiamate fork di replica sono formati. All'origine della replica si formano due fork di replica che vengono estesi in modo bidirezionale man mano che la replica procede. Le proteine ​​di legame a singolo filamento rivestono i singoli filamenti di DNA vicino alla forcella di replicazione per impedire che il DNA a filamento singolo ritorni in una doppia elica.

La DNA polimerasi ha due importanti restrizioni: è in grado di aggiungere nucleotidi solo nella direzione da 5′ a 3′ (un nuovo filamento di DNA può essere esteso solo in questa direzione). Richiede anche un gruppo 3′-OH libero a cui può aggiungere nucleotidi formando un legame fosfodiestere tra l'estremità 3′-OH e il fosfato 5′ del nucleotide successivo. Ciò significa essenzialmente che non può aggiungere nucleotidi se non è disponibile un gruppo 3′-OH libero. Allora come aggiunge il primo nucleotide? Il problema viene risolto con l'aiuto di un primer che fornisce l'estremità libera 3′-OH. Un altro enzima, l'RNA primase, sintetizza un segmento di RNA lungo da cinque a dieci nucleotidi e complementare al DNA stampo. Poiché questa sequenza innesca la sintesi del DNA, è appropriatamente chiamata primer. La DNA polimerasi può ora estendere questo primer di RNA, aggiungendo nucleotidi uno per uno che sono complementari al filamento modello ((Figura)).


Domanda: isoli un ceppo cellulare in cui l'unione dei frammenti di Okazaki è compromessa e sospetti che si sia verificata una mutazione in un enzima trovato alla forcella di replicazione. Quale enzima ha maggiori probabilità di essere mutato?

La forcella di replicazione si muove alla velocità di 1000 nucleotidi al secondo. La topoisomerasi impedisce l'avvolgimento eccessivo della doppia elica del DNA prima della forcella di replicazione mentre il DNA si sta aprendo, provocando tagli temporanei nell'elica del DNA e quindi richiudendola. Poiché la DNA polimerasi può estendersi solo nella direzione da 5′ a 3′, e poiché la doppia elica del DNA è antiparallelo, c'è un piccolo problema al fork di replica. I due filamenti di DNA stampo hanno orientamenti opposti: un filo è nella direzione da 5′ a 3′ e l'altro è orientato nella direzione da 3′ a 5′. Solo un nuovo filamento di DNA, quello complementare al filamento di DNA parentale da 3′ a 5′, può essere sintetizzato continuamente verso la forcella di replicazione. Questo filamento sintetizzato continuamente è noto come il filamento principale. L'altro filamento, complementare al DNA parentale da 5′ a 3′, si estende lontano dalla forcella di replicazione, in piccoli frammenti noti come frammenti di Okazaki, ognuno dei quali richiede un primer per iniziare la sintesi. I nuovi segmenti di primer vengono posizionati nella direzione della forcella di replicazione, ma ciascuno puntato lontano da esso. (I frammenti di Okazaki prendono il nome dallo scienziato giapponese che per primo li scoprì. Il filo con i frammenti di Okazaki è noto come filo in ritardo.)

Il filamento principale può essere esteso da un singolo primer, mentre il filamento ritardato necessita di un nuovo primer per ciascuno dei brevi frammenti di Okazaki. La direzione complessiva del filamento in ritardo sarà da 3′ a 5′ e quella del filamento principale da 5′ a 3′. Una proteina chiamata morsetto scorrevole mantiene in posizione la DNA polimerasi mentre continua ad aggiungere nucleotidi. Il morsetto scorrevole è una proteina a forma di anello che si lega al DNA e tiene in posizione la polimerasi. Man mano che la sintesi procede, i primer dell'RNA vengono sostituiti dal DNA. I primer vengono rimossi dall'attività esonucleasica del DNA pol I, che utilizza il DNA dietro l'RNA come proprio primer e riempie gli spazi lasciati dalla rimozione dei nucleotidi dell'RNA mediante l'aggiunta di nucleotidi del DNA. I nick che rimangono tra il DNA appena sintetizzato (che ha sostituito il primer RNA) e il DNA precedentemente sintetizzato sono sigillati dall'enzima DNA ligasi, che catalizza la formazione di legami fosfodiestere tra l'estremità 3′-OH di un nucleotide e il 5& #8242 estremità fosfatica dell'altro frammento.

Una volta che il cromosoma è stato completamente replicato, le due copie del DNA si spostano in due cellule diverse durante la divisione cellulare.

Il processo di replicazione del DNA può essere riassunto come segue:

  1. Il DNA si svolge all'origine della replicazione.
  2. L'elicasi apre le forcelle di replicazione che formano il DNA, queste sono estese in modo bidirezionale.
  3. Le proteine ​​di legame a singolo filamento rivestono il DNA attorno alla forcella di replicazione per impedire il riavvolgimento del DNA.
  4. La topoisomerasi si lega nella regione a monte della forcella di replicazione per prevenire il superavvolgimento.
  5. Primase sintetizza primer di RNA complementari al filamento di DNA.
  6. La DNA polimerasi III inizia ad aggiungere nucleotidi all'estremità 3′-OH del primer.
  7. L'allungamento sia del filo ritardato che di quello principale continua.
  8. I primer di RNA vengono rimossi dall'attività esonucleasica.
  9. Le lacune sono riempite da DNA pol I aggiungendo dNTP.
  10. Il divario tra i due frammenti di DNA è sigillato dalla DNA ligasi, che aiuta nella formazione di legami fosfodiestere.

(Figura) riassume gli enzimi coinvolti nella replicazione del DNA procariotico e le funzioni di ciascuno.

Replicazione del DNA procariotico: enzimi e loro funzione
Enzima/proteina Funzione specifica
DNA poli I Rimuove il primer dell'RNA e lo sostituisce con il DNA appena sintetizzato
DNA poli III Enzima principale che aggiunge nucleotidi nella direzione 5′-3′
Helicase Apre l'elica del DNA rompendo i legami idrogeno tra le basi azotate
ligasi Sigilla gli spazi tra i frammenti di Okazaki per creare un unico filamento di DNA continuo
Primase Sintetizza i primer di RNA necessari per iniziare la replicazione
Morsetto scorrevole Aiuta a mantenere in posizione la DNA polimerasi quando vengono aggiunti nucleotidi
topoisomerasi Aiuta ad alleviare la tensione sul DNA durante lo svolgimento causando rotture e quindi risigillando il DNA
Proteine ​​leganti a filamento singolo (SSB) Si lega al DNA a filamento singolo per impedire al DNA di riavvolgersi.

Guarda la replicazione del DNA (video) per visualizzare il processo completo.

Riepilogo della sezione

La replicazione nei procarioti inizia da una sequenza trovata sul cromosoma chiamata origine della replicazione, il punto in cui il DNA si apre. L'elicasi apre la doppia elica del DNA, determinando la formazione della forcella di replicazione. Le proteine ​​di legame a filamento singolo si legano al DNA a filamento singolo vicino alla forcella di replicazione per mantenere la forcella aperta. Primase sintetizza un primer di RNA per avviare la sintesi da parte della DNA polimerasi, che può aggiungere nucleotidi solo all'estremità 3′ di un filamento di primer precedentemente sintetizzato. Entrambi i nuovi filamenti di DNA crescono secondo le rispettive direzioni 5′-3′. Un filamento viene sintetizzato continuamente nella direzione della forcella di replicazione, questo è chiamato il filamento principale. L'altro filamento è sintetizzato in una direzione lontana dalla forcella di replicazione, in brevi tratti di DNA noti come frammenti di Okazaki. Questo filamento è noto come filamento ritardato. Una volta completata la replicazione, i primer dell'RNA vengono sostituiti da nucleotidi di DNA e il DNA viene sigillato con DNA ligasi, che crea legami fosfodiestere tra il 3′-OH di un'estremità e il 5′ fosfato dell'altro filamento.

Collegamenti artistici

(Figura) Si isola un ceppo cellulare in cui l'unione dei frammenti di Okazaki è compromessa e si sospetta che si sia verificata una mutazione in un enzima trovato alla forcella di replicazione. Quale enzima ha maggiori probabilità di essere mutato?

(Figura) DNA ligasi, poiché questo enzima unisce i frammenti di Okazaki.

Risposta gratuita

La replicazione del DNA è bidirezionale e discontinua spiega la tua comprensione di questi concetti.

All'origine della replicazione si formano due fork di replica che si estendono in due direzioni. Sul filamento in ritardo, i frammenti di Okazaki si formano in modo discontinuo.

Cosa sono i frammenti di Okazaki e come si formano?

Brevi frammenti di DNA si formano sul filamento in ritardo sintetizzato in una direzione lontana dalla forcella di replicazione. Questi sono sintetizzati dal DNA pol.

Se la velocità di replicazione in un particolare procariota è di 900 nucleotidi al secondo, quanto tempo impiegherebbero 1,2 milioni di genomi di coppie di basi per fare due copie?

1333 secondi o 22,2 minuti.

Spiegare gli eventi che si verificano al fork di replica. Se il gene per l'elicasi è mutato, quale parte della replicazione sarà interessata?

Alla forcella di replicazione, gli eventi che si verificano sono l'azione dell'elicasi, il legame di proteine ​​​​leganti a singolo filamento, la sintesi di primer e la sintesi di nuovi filamenti. Se c'è un gene dell'elicasi mutato, la forcella di replicazione non sarà estesa.

Qual è il ruolo di un primer nella replicazione del DNA? Cosa accadrebbe se dimenticassi di aggiungere un primer in una provetta contenente la miscela di reazione per una reazione di sequenziamento del DNA?

Il primer fornisce un gruppo 3′-OH per DNA pol per iniziare ad aggiungere nucleotidi. Non ci sarebbe alcuna reazione nel tubo senza un primer e nessuna banda sarebbe visibile sull'elettroforesi.

Gli antibiotici chinolonici trattano le infezioni batteriche bloccando l'attività della topoisomerasi. Perché questo trattamento funziona? Spiega cosa succede a livello molecolare.

I batteri trattati con chinoloni non saranno più in grado di replicare il loro DNA. La topoisomerasi allevia il superavvolgimento del DNA in eccesso che si verifica prima della forcella di replicazione quando il DNA viene svolto per la replicazione. Se la topoisomerasi è inibita, la DNA elicasi sarà in grado di svolgere il DNA solo per un breve tratto prima che il superavvolgimento diventi troppo avvolto per continuare la replicazione.

Glossario


Replicazione del DNA

Il corpo umano produce miliardi di nuove cellule ogni giorno. Ma prima di subire la divisione cellulare, una cellula deve prima copiare le informazioni genetiche contenute nel nucleo cellulare e il suo DNA. In sole 6-8 ore una cellula è in grado di copiare il suo intero genoma. Per fare ciò, la replicazione del DNA inizia in più posizioni lungo ciascun cromosoma. Quando i due filamenti di DNA vengono separati, la copia inizia alla velocità di circa 50 nucleotidi al secondo!

Il DNA codifica le informazioni necessarie per costruire proteine, regolare i processi fisiologici e mantenere l'omeostasi nei nostri corpi. I componenti chimici di base del DNA sono fosfato, desossiribosio (uno zucchero) e 4 basi azotate: adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T).

Il DNA è una molecola a doppio filamento con i due filamenti distesi antiparallelo tra loro (sono paralleli l'uno all'altro ma corrono in direzioni opposte). I due filamenti di DNA si avvolgono insieme per formare una doppia elica e formano una struttura che sembra simile a una scala a chiocciola.

Figura (PageIndex<1>). la struttura chimica del DNA (CC BY-NC-SA Madprime)

Figura (PageIndex<2>). replica semiconservativa (CC BY-NC-SA Madprime)

I filamenti di DNA sono anche complementari l'uno all'altro a causa dello specifico accoppiamento di basi tra i due filamenti: l'adenina su un filamento si accoppierà sempre con la timina sul filamento opposto e la citosina si legherà sempre alla guanina.

Figura (PageIndex<3>). Replicazione del DNA (CC BY-NC-SA LadyofHats)

Durante il processo di replicazione del DNA, il DNA parentale si srotola e poiché i nucleotidi hanno partner esclusivi, ogni DNA può fungere da modello per la replicazione. Le due nuove molecole di DNA sono costituite ciascuna da un filamento parentale e da un filamento appena creato. Questo è noto come replicazione semiconservativa del DNA.

Figura (PageIndex<4>). Doppia elica del DNA (CC BY-NC-SA Forluvoft)

Attori importanti nella replicazione del DNA

DNA elicasi: rompe i legami idrogeno tra i filamenti di DNA (srotola il DNA)

topoisomerasi: allevia il superavvolgimento positivo (torsione del DNA) prima della forcella di replicazione

Proteine ​​leganti a singolo filamento (SSBP): tiene separati i fili dei genitori

Primase: sintetizza un primer di RNA (fa partire la sintesi di un nuovo filamento)

DNA polimerasi III: sintetizza un filamento figlio di DNA

DNA polimerasi I: asporta i primer di RNA e si riempie di DNA

DNA ligasi: collega covalentemente i frammenti di Okazaki insieme

Meccanismo di replicazione del DNA

Avvio della replica

La replicazione del DNA inizia in siti speciali chiamati origini della replica. I batteri, che hanno cromosomi circolari relativamente piccoli, contengono solo una singola origine di replicazione. I cromosomi eucariotici, che sono lunghi filamenti lineari di DNA, contengono molte origini di replicazione lungo i filamenti di DNA (vedi sotto). Le proteine ​​che riconoscono le origini della replicazione si legano a queste sequenze e separano i due filamenti, aprendo una replica &ldquobubble&rdquo. La replica procede quindi in entrambe le direzioni finché non viene copiata l'intera molecola.

Figura (PageIndex<5>). bolle di replicazione (CC BY-NC-SA Boumphreyfr)

Alla fine di ogni bolla di replica c'è un forcella di replica, una regione a forma di Y in cui i filamenti parentali di DNA vengono svolti in modo che il meccanismo di replicazione possa copiare il DNA. elicasi sono enzimi responsabili della distorsione della doppia elica alle forcelle di replicazione, separando i due filamenti e rendendoli disponibili per fungere da modelli per la replicazione del DNA. La torsione della doppia elica da parte dell'elicasi provoca un'ulteriore torsione della molecola di DNA prima della forcella di replicazione. topoisomerasi è l'enzima che aiuta ad alleviare questo ceppo rompendo, srotolando e ricongiungendo i filamenti di DNA. Dopo che i filamenti parentali sono stati separati dall'elicasi, proteine ​​​​leganti a singolo filamento legarsi ai fili dei genitori per impedire loro di ricostituirsi l'uno con l'altro.

I filamenti parentali srotolati sono ora pronti per essere copiati, ma la DNA polimerasi, l'enzima responsabile della copiatura del DNA, non può avviare la sintesi del DNA, può solo aggiungere nucleotidi a una catena di nucleotidi esistente. Risolvere questo problema, RNA primasi mette giù una breve sequenza di RNA complementare al DNA stampo, chiamata primer che può essere utilizzata per avviare la replicazione del DNA. La DNA polimerasi è quindi in grado di sintetizzare nuovo DNA aggiungendo nucleotidi a questa catena preesistente.

Creare un nuovo filamento di DNA

Come menzionato sopra, DNA polimerasi catalizzare la sintesi di nuovo DNA aggiungendo nucleotidi al primer dell'RNA che è stato depositato da RNA Primase. Va detto che in E.coli ci sono diverse DNA polimerasi diverse, ma due sembrano svolgere un ruolo importante: DNA Pol III e DNA Pol I. Negli eucarioti la situazione è più complessa, con almeno 11 diverse DNA polimerasi scoperte così lontano, ma i principi generali di cui parleremo in questo tutorial sono applicabili a entrambi i sistemi.

In E.coli, DNA Pol III aggiunge un nucleotide di DNA all'estremità 3' del primer di RNA e poi continua ad aggiungere nucleotidi di DNA complementari al filamento stampo. Come accennato in precedenza, le due estremità di un filamento di DNA sono diverse, in quanto sono antiparallele l'una all'altra. Questa direzionalità è importante per la sintesi del DNA, perché la DNA polimerasi può aggiungere nucleotidi solo all'estremità 3' di un filamento di DNA in crescita (non all'estremità 5'). Così, un nuovo filamento di DNA può essere creato solo nella direzione da 5' a 3'.

Filamenti principali e in ritardo

Se osserviamo il fork di replica, vediamo che questa direzionalità da 5" a 3" rappresenta un problema. Lungo uno dei filamenti stampo, DNA Pol III può sintetizzare un filamento complementare continuamente allungando il nuovo DNA nella direzione da 5" a 3". Questo si chiama filo conduttore e richiede solo un primer di RNA per iniziare la replicazione. Tuttavia, per allungare l'altro filamento nella direzione da 5" a 3", DNA Pol III deve allungare il nuovo filamento di DNA in una direzione opposta al movimento della forcella di replicazione. Questo filo è noto come filo in ritardo. Man mano che la forma di replicazione procede ed espone una nuova sezione dello stampo del filamento ritardato, l'RNA Primase deve posare un nuovo primer affinché il DNA Pol III si allunghi. In questo modo, il filamento in ritardo è completato in a discontinuo maniera. I frammenti di DNA sintetizzati sul filamento in ritardo sono chiamati Frammenti di Okazaki. Un'altra DNA polimerasi, DNA Pol I è responsabile della rimozione dei primer dell'RNA e della loro sostituzione con il DNA. DNA ligasi quindi sigilla gli spazi tra i frammenti di Okazaki per completare il filamento ritardato di nuova sintesi.

Figura (PageIndex<8>). (CC BY-NC-SA)

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Tutorial sulla replicazione del DNA di Dott.ssa Katherine Harris è concesso in licenza con a Licenza Creative Commons Attribuzione-Non commerciale-Condividi allo stesso modo 3.0 Unported.


Nozioni di base sulla replicazione del DNA

Figura 1. I tre modelli suggeriti di replicazione del DNA. Il grigio indica i filamenti di DNA originali e il blu indica il DNA appena sintetizzato.

La delucidazione della struttura della doppia elica ha fornito un suggerimento su come il DNA si divide e fa copie di se stesso. Questo modello suggerisce che i due filamenti della doppia elica si separino durante la replicazione e ciascun filamento funge da modello da cui viene copiato il nuovo filamento complementare. Quello che non era chiaro era come avvenisse la replica. Sono stati suggeriti tre modelli: conservatore, semiconservativo e dispersivo (vedi Figura 1).

In replica conservativa, il DNA parentale rimane insieme e i filamenti figlia appena formati sono insieme. Il semi-conservatore Il metodo suggerisce che ciascuno dei due filamenti di DNA parentale agisca come stampo per il nuovo DNA da sintetizzare dopo la replicazione, ciascun DNA a doppio filamento include un filamento parentale o "vecchio" e un filamento "nuovo". Nel modello dispersivo, entrambe le copie di DNA hanno segmenti a doppio filamento di DNA parentale e DNA di nuova sintesi intervallati.

Meselson e Stahl erano interessati a capire come si replica il DNA. sono cresciuti E. coli per diverse generazioni in un mezzo contenente un isotopo "pesante" di azoto ( 15 N) che viene incorporato nelle basi azotate, ed eventualmente nel DNA (Figura 2).

Figura 2. Meselson e Stahl hanno sperimentato con E. coli cresciuto prima in azoto pesante ( 15 N) poi in 14 N. Il DNA cresciuto a 15 N (banda rossa) è più pesante del DNA cresciuto a 14 N (banda arancione) e sedimenta a un livello inferiore nella soluzione di cloruro di cesio in un'ultracentrifuga. Quando il DNA cresciuto in 15 N viene passato a un supporto contenente 14 N, dopo un ciclo di divisione cellulare il DNA sedimenta a metà tra i livelli di 15 N e 14 N, indicando che ora contiene il cinquanta per cento di 14 N. Nelle successive divisioni cellulari, un aumento quantità di DNA contiene solo 14 N. Questi dati supportano il modello di replica semi-conservativo. (credit: modifica dell'opera di Mariana Ruiz Villareal)

Il E. coli la coltura è stata quindi spostata in un terreno contenente 14 N e lasciata crescere per una generazione. Le cellule sono state raccolte e il DNA è stato isolato. Il DNA è stato centrifugato ad alta velocità in un'ultracentrifuga. Ad alcune cellule è stato permesso di crescere per un altro ciclo di vita in 14 N e di essere nuovamente filate. Durante la centrifugazione in gradiente di densità, il DNA viene caricato in un gradiente (tipicamente un sale come cloruro di cesio o saccarosio) e filato ad alte velocità da 50.000 a 60.000 rpm. In queste circostanze, il DNA formerà una banda in base alla sua densità nel gradiente. Il DNA cresciuto in 15 N si bandirà in una posizione di densità maggiore rispetto a quello cresciuto in 14 N. Meselson e Stahl hanno notato che dopo una generazione di crescita in 14 N dopo che erano stati spostati da 15 N, la singola banda osservata era in posizione intermedia in tra il DNA di cellule cresciute esclusivamente in 15 N e 14 N. Ciò suggeriva una modalità di replicazione semiconservativa o dispersiva. Il DNA raccolto da cellule cresciute per due generazioni in 14 N formava due bande: una banda di DNA si trovava in posizione intermedia tra 15 N e 14 N, e l'altra corrispondeva alla banda di DNA 14 N. Questi risultati potrebbero essere spiegati solo se il DNA si replica in modo semiconservativo. Pertanto, le altre due modalità sono state escluse.

Durante la replicazione del DNA, ciascuno dei due filamenti che compongono la doppia elica funge da modello da cui vengono copiati i nuovi filamenti. Il nuovo filone sarà complementare al filone parentale o "vecchio" . Quando si formano due copie di DNA figlie, hanno la stessa sequenza e sono divise equamente nelle due cellule figlie.

Il modello per la replicazione del DNA suggerisce che i due filamenti della doppia elica si separino durante la replicazione e ciascun filamento funga da stampo da cui viene copiato il nuovo filamento complementare. Nella replicazione conservativa, il DNA parentale viene conservato e il DNA figlia viene nuovamente sintetizzato. Il metodo semiconservativo suggerisce che ciascuno dei due filamenti di DNA parentale funge da stampo per il nuovo DNA da sintetizzare dopo la replicazione, ciascun DNA a doppio filamento include un filamento parentale o "vecchio" e un filamento "nuovo". La modalità dispersiva suggeriva che le due copie del DNA avrebbero avuto segmenti di DNA parentale e DNA appena sintetizzato. Le prove sperimentali hanno mostrato che la replicazione del DNA è semi-conservativa.


Mancata corrispondenza, danneggiamento e riparazione del DNA dopo la replica

Sebbene la DNA polimerasi abbia un tasso di errore molto basso, in parte dovuto alla sua attività di correzione di bozze, alcune coppie di basi non corrispondenti sfuggono alla correzione durante la replica. Inoltre, il DNA può essere danneggiato in altri modi che alterano la sequenza del DNA. Queste discrepanze e danni del DNA, se non corretti o riparati, si tradurranno in un mutazione(un cambiamento permanente nel DNA) nel successivo ciclo di replicazione, che può essere dannoso per la cellula. Ad esempio, la malattia genetica dell'anemia falciforme deriva da un cambiamento di un singolo nucleotide (adenina modificata in timina) nel gene che codifica per una delle due proteine ​​globiniche che compongono l'emoglobina. Questo cambiamento del nucleotide provoca un cambiamento nella sequenza amminoacidica e di conseguenza un cambiamento nella forma della proteina mutante nei globuli rossi. Queste alterazioni della proteina ne fanno aggregare, formando grandi complessi che distorcono la forma dei globuli rossi. Queste cosiddette "cellule falciformi" sono più fragili dei normali globuli rossi e hanno maggiori probabilità di rompersi nel flusso sanguigno, con conseguente riduzione dei globuli rossi (anemia).

Fortunatamente, le cellule possiedono meccanismi per ripristinare coppie di basi non corrispondenti e riparare i danni al DNA. Il sistema di riparazione della mancata corrispondenza del DNA corregge il 99% delle coppie di basi non corrispondenti che non sono state rimosse dalla DNA polimerasi durante la replicazione. Le proteine ​​di riparazione del disadattamento riconoscono e si legano alla coppia di basi non corrispondenti, i nucleotidi dal filamento di DNA appena sintetizzato vengono asportati, una DNA polimerasi di riparazione riempie lo spazio vuoto e quindi la DNA ligasi ricongiunge questo tratto di nucleotidi al resto del filamento di DNA. È importante che il sistema di riparazione del disadattamento del DNA distingua tra il filamento modello di DNA e il filamento di DNA appena sintetizzato, tuttavia il meccanismo completo per questo non è del tutto compreso.

Le mutazioni possono insorgere nel DNA attraverso un danno che altera la struttura chimica del nucleotide. Questo può verificarsi spontaneamente o in risposta a qualche fattore ambientale. I due tipi più comuni di danno che derivano da reazioni spontanee sono depurazione (la perdita della base dai nucleotidi purinici adenina o guanina) e deaminazione(tipicamente la conversione della citosina in uracile). La depurinazione risulta in un nucleotide privo di base di conseguenza, la DNA polimerasi salterà questo nucleotide durante la sintesi del filamento complementare durante la replicazione. Ciò porta a una perdita di nucleotidi nel successivo ciclo di replicazione. In alcuni casi il nucleotide depurinato è accoppiato con un nucleotide non corrispondente sull'altro filamento, con conseguente cambio di coppia di basi. La deaminazione provoca un cambiamento della sequenza nucleotidica nel successivo ciclo di replicazione, da una coppia di basi C-G a una coppia di basi AT. Un altro tipo comune di danno al DNA è dimero di timinaformazione. Questo è più spesso indotto dall'esposizione alla luce ultravioletta e consiste in un legame covalente tra le basi delle timine adiacenti in un filamento di DNA. Ciò provoca un blocco nella replicazione del DNA e può provocare mutazioni. Il tasso di questi tipi di danno è molto alto (ad esempio la depurinazione avviene 500 volte per cellula al giorno), tuttavia, ci sono numerosi percorsi per riparare il DNA danneggiato e, di conseguenza, il tasso di mutazione ereditabile non è così alto. La riparazione avviene generalmente in tre fasi: il DNA danneggiato viene riconosciuto e rimosso, una DNA polimerasi di riparazione riempie il vuoto e la DNA ligasi risigilla il filamento di DNA. La riparazione del DNA è un percorso complesso, che coinvolge molte proteine ​​e attività diverse che non sono completamente comprese dai biologi. Tuttavia, l'importanza di queste proteine ​​è evidenziata in diversi disturbi umani che hanno proteine ​​​​di riparazione del DNA difettose e che mostrano un'incidenza molto più elevata di cancro a causa dell'incapacità delle cellule di riparare in modo efficiente il DNA danneggiato o non corrispondente. La maggior parte dei tumori deriva da mutazioni nei geni chiave che regolano la crescita che si accumulano durante la vita dell'individuo. Gli individui con riparazione del DNA difettosa hanno una probabilità molto maggiore di mutazioni nei geni che causano il cancro.


Telomeri e invecchiamento cellulare

I telomeri sono importanti, quindi il loro costante restringimento con ogni mitosi potrebbe imporre una durata di vita limitata alle cellule. Questo, in effetti, è il caso. Le cellule normali (non cancerose) non crescono indefinitamente quando poste in coltura.

Vedi Cancer Cells in Culture per una discussione sulle differenze tra cellule normali e cancerose coltivate in coltura.

Le cellule rimosse da un neonato e poste in coltura continueranno a dividersi quasi 100 volte. Ben prima della fine, tuttavia, il loro tasso di mitosi diminuisce (a meno di una volta ogni due settimane). Se le mie cellule fossero coltivate (ho 81 anni), riuscirebbero a gestire solo un paio di dozzine di mitosi prima che smettessero di dividersi e si estinguessero.

Questo fenomeno si chiama senescenza replicativa [Di più]. Il restringimento dei telomeri potrebbe essere un orologio che determina la longevità di una linea cellulare e quindi è responsabile della senescenza replicativa?

Prova:

Si scopre che queste cellule sono in grado di mantenere la lunghezza dei loro telomeri. Lo fanno con l'aiuto di un enzima telomerasi.


La replicazione nei procarioti inizia da una sequenza trovata sul cromosoma chiamata origine della replicazione, il punto in cui il DNA si apre. L'elicasi apre la doppia elica del DNA, determinando la formazione della forcella di replicazione. Le proteine ​​di legame a filamento singolo si legano al DNA a filamento singolo vicino alla forcella di replicazione per mantenere la forcella aperta. Primase sintetizza un primer di RNA per avviare la sintesi da parte della DNA polimerasi, che può aggiungere nucleotidi solo all'estremità 3' di un filamento di primer precedentemente sintetizzato. Entrambi i nuovi filamenti di DNA crescono secondo le rispettive direzioni 5'-3'. Un filamento viene sintetizzato continuamente nella direzione della forcella di replicazione, questo è chiamato il filamento principale. L'altro filamento viene sintetizzato in una direzione lontana dalla forcella di replicazione, in brevi tratti di DNA noti come frammenti di Okazaki. Questo filamento è noto come filamento ritardato. Una volta completata la replicazione, i primer dell'RNA vengono sostituiti da nucleotidi di DNA e il DNA viene sigillato con DNA ligasi, che crea legami fosfodiestere tra il 3'-OH di un'estremità e il 5' fosfato dell'altro filamento.

Figura Si isola un ceppo cellulare in cui l'unione dei frammenti di Okazaki è compromessa e si sospetta che si sia verificata una mutazione in un enzima trovato alla forcella di replicazione. Quale enzima ha maggiori probabilità di essere mutato?

Figura DNA ligasi, poiché questo enzima unisce i frammenti di Okazaki.


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